Estudou-se quantitativamente e qualitativamente a citologia, os teores de imunoglobulinas, e a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino contra a Escherichia coli enterotoxigênica (ECET), analisando-se a influência da opsonização prévia destas células. Para tal finalidade foram utilizadas 53 vacas da raça Holandesa, das quais realizou-se a colheita de um total 212 amostras de colostro obtidas antes da primeira e segunda ordenha. As amostras positivas (n=41) ao exame bacteriológico do leite foram excluídas desta pesquisa. Para a análise citológica quantitativa e qualitativa do colostro, foram utilizadas as técnicas de microscopia direta e citocentrifugação, respectivamente. As dosagens das imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) foram realizadas por meio da técnica de imunodifusão radial, utilizando-se Kits comerciais. Para a avaliação da atividade bactericida indireta dos fagócitos e verificação da influência da opsonização prévia da ECET, foram realizados os seguintes ensaios: utilizando somente suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares em meio de cultura (Grupo Controle - C); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET não opsonizada (Grupo NO); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET previamente opsonizada com 10% de sobrenadante de colostro bovino delipidado (Grupo O). A atividade bactericida indireta dos fagócitos foi mensurada por meio da quantidade de nmoles de peróxido de hidrogênio liberado por estas células, nos ensaios C, NO e O. Após as avaliações dos resultados das determinações realizadas, conclui-se que: (1) o colostro bovino de segunda ordenha apresenta maior quantidade de células/mL, que aquele de primeira ordenha; (2) a predominância celular demonstrada com o uso das técnicas de microscopia direta e de citocentrifugação foi de células mononucleares; (3) colostro bovino de segunda ordenha possui maior quantidade de neutrófilos polimorfonucleares, quando comparada àquela da primeira ordenha, utilizando as técnicas de microscópica direta e de citocentrifugação, para a contagem dos tipos leucocitários; (4) os tipos celulares predominantes no colostro bovino de primeira e segunda ordenha foram macrófagos/células epiteliais, seguidos por linfócitos, neutrófilos e eosinófilos, respectivamente, utilizando a técnica de citocentrifugação para diferenciação celular; (5) o colostro bovino de primeira ordenha possui maiores teores de imunoglobulinas das classes G e M, que o da segunda ordenha, havendo predomínio da IgG, sobre a IgM e IgA independente da ordem de ordenha. (6) os fagócitos do colostro bovino de primeira ordenha apresentaram maior atividade celular avaliada pela liberação de peróxido de hidrogênio, que os da segunda ordenha; (7) a estimulação antigênica com ECET não foi suficiente para aumentar a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino; (8) a opsonização da ECET com soro colostral não determinou diferenças significativas na atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino, mensurada pela quantidade de peróxido de hidrogênio liberado por estas células; (9) existe correlação positiva entre os teores de imunoglobulinas da classe M e a quantidade de peróxido de hidrogênio liberado pelos fagócitos do colostro bovino; (10) o comportamento quantitativo observado para as imunoglobulinas e células do colostro bovino, considerando a ordem das ordenhas, sugere que os anticorpos teriam função prioritária na imunidade do neonato, enquanto o aumento de neutrófilos estaria voltado aparentemente para a proteção da glândula mamária. / Bovine collostrum citology, immunoglobulin content and bactericidal activity of phagocytes against enterotoxigenic Escherichia coli were studied qualitatively and quantitatively, analyzing the influence of previous opsonization of the bacterium. In order to achieve this aim, 53 Holstein cows were used to obtain 212 collostrum samples before the first and second milkings. Samples positive (n=41) in the bacteriological examination of milk were excluded from the trial. Direct microscopy and cytocentrifugation were used in the quantitative and qualitative cytological analysis of collostrum, respectively. Immunoglobulin (IgG, IgM and IgA) contents were determined by means of radial immunodiffusion using commercial kits. Indirect bactericidal activity of phagocytes and assessment of the influence of ETEC previous opsonization were carried out as follows: using only a suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes in culture medium (Control group - C); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to a suspension of non-opsonized ETEC (NO group); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to an ETEC suspension previously opsonized with 10% of supernatant of delipidated bovine collostrum (O group). Indirect bactericidal activity of phagocytes was measured by means of the amount of hydrogen peroxide nmoles released by these cells in assays C, NO and O. After results were evaluated, it was concluded that: (1) bovine collostrum obtained in the second milking showed more cells/mL than first milking collostrum; (2) the predominance of mononuclear cells was determined by both direct microscopy and cytocentrifugation; (3) bovine collostrum obtained in the second milking showed greater quantity of polymorphonuclear neutrophils than that of the first milking, as determined in cell type counts by direct microscopy and cytocentrifugation; (4) cell types predominating in bovine collostrum of the first and second milking were macrophages / epithelial cells, followed by lymphocytes, neutrophils and eosinophils, respectively, using cytocentrifugation for cell differentiation; (5) first milking bovine collostrum showed greater levels of immunoglobulins G and M than that of the second milking, with a predominance of IgG compared with IgM and IgA, no matter the milking order; (6) phagocytes in first milking collostrum showed greater cell activity than those in the second milking collostrum, as evaluated by hydrogen peroxide release; (7) antigenic stimulation of ETEC was not enough to increase bactericidal activity of phagocytes in bovine collostrum; (8) ETEC opsonization with collostral serum did not lead to significant differences in bactericidal activity of bovine collostrum phagocytes, as measured by the amount of hydrogen peroxide released by these cells; (9) there was a positive correlation between the contents of immunoglobulin M and the amount of hydrogen peroxide released by phagocytes in bovine collostrum; (10) quantitative behavior observed for immunoglobulins and cells of bovine collostrum considering the milking order, suggest that antibodies would have a essential function in neonate immunity, whereas the increase in neutrophils would apparently be linked to mammary gland protection.

O rompimento eritrocítico característico do ciclo de vida do Plasmodium resulta na liberação de ATP, o qual é reconhecido pelo receptor P2X7. Este estudo da malária experimental causada pelo P. chabaudi em camundongos P2X7-/- mostraram que estes animais são mais suscetíveis à infecção. Tanto in vitro, como ex vivo, as populações celulares fagocíticas mostraram-se sensíveis ao ATP extracelular, de uma forma P2X7 dependente, e a infecção pelo P. chabaudi mostrou ser um fator que aumenta esta sensibilidade. Estudos fenotípicos do baço e do fígado dos animais P2X7-/- indicaram que, com exceção da população CD11b+ Ly6G+, estes animais apresentam número inferior de células fagocíticas quando comparados aos animais C57BL/6. Além disso, há uma leve deficiência na ativação dos fagócitos, na produção de IFN-g e no número de células produtoras de IFN-g, TNF-a e IL-10 no baço dos animais P2X7-/- em relação aos C57BL/6. A maior suscetibilidade dos camundongos P2X7-/- à infecção pelo P. chabaudi deve-se, portanto, a uma resposta imunológica deficiente nestes animais. / The erythrocyte rupture is a step of the life cycle of Plasmodium in which ATP is released and is recognized by the P2X7. This study of experimental malaria caused by P. chabaudi in P2X7-/- mice showed that these mice are more susceptible to the infection. Either in vitro or ex vivo, the phagocyte cell populations were sensible to extracellular ATP in a P2X7-dependent way and the P. chabaudi infection acted as a component that increases this sensitivity. Phenotypic analysis of the spleen and liver from P2X7-/- mice showed that, excepted for the CD11b+ Ly6G+ population, these mice have a lower number of phagocyte cells when compared to C57BL/6 mice. Furthermore, there was a slight deficiency in phagocyte activation, IFN-g production and number of cells that produce important cytokines as IFN-g, IL-10 and TNF-a in P2X7-/- mice in comparison with C57BL/6 mice. The increased susceptibility of P2X7-/- mice to the P. chabaudi infection is due to a deficient immune response.

O rompimento eritrocítico característico do ciclo de vida do Plasmodium resulta na liberação de ATP, o qual é reconhecido pelo receptor P2X7. Este estudo da malária experimental causada pelo P. chabaudi em camundongos P2X7-/- mostraram que estes animais são mais suscetíveis à infecção. Tanto in vitro, como ex vivo, as populações celulares fagocíticas mostraram-se sensíveis ao ATP extracelular, de uma forma P2X7 dependente, e a infecção pelo P. chabaudi mostrou ser um fator que aumenta esta sensibilidade. Estudos fenotípicos do baço e do fígado dos animais P2X7-/- indicaram que, com exceção da população CD11b+ Ly6G+, estes animais apresentam número inferior de células fagocíticas quando comparados aos animais C57BL/6. Além disso, há uma leve deficiência na ativação dos fagócitos, na produção de IFN-g e no número de células produtoras de IFN-g, TNF-a e IL-10 no baço dos animais P2X7-/- em relação aos C57BL/6. A maior suscetibilidade dos camundongos P2X7-/- à infecção pelo P. chabaudi deve-se, portanto, a uma resposta imunológica deficiente nestes animais. / The erythrocyte rupture is a step of the life cycle of Plasmodium in which ATP is released and is recognized by the P2X7. This study of experimental malaria caused by P. chabaudi in P2X7-/- mice showed that these mice are more susceptible to the infection. Either in vitro or ex vivo, the phagocyte cell populations were sensible to extracellular ATP in a P2X7-dependent way and the P. chabaudi infection acted as a component that increases this sensitivity. Phenotypic analysis of the spleen and liver from P2X7-/- mice showed that, excepted for the CD11b+ Ly6G+ population, these mice have a lower number of phagocyte cells when compared to C57BL/6 mice. Furthermore, there was a slight deficiency in phagocyte activation, IFN-g production and number of cells that produce important cytokines as IFN-g, IL-10 and TNF-a in P2X7-/- mice in comparison with C57BL/6 mice. The increased susceptibility of P2X7-/- mice to the P. chabaudi infection is due to a deficient immune response.

Estudou-se quantitativamente e qualitativamente a citologia, os teores de imunoglobulinas, e a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino contra a Escherichia coli enterotoxigênica (ECET), analisando-se a influência da opsonização prévia destas células. Para tal finalidade foram utilizadas 53 vacas da raça Holandesa, das quais realizou-se a colheita de um total 212 amostras de colostro obtidas antes da primeira e segunda ordenha. As amostras positivas (n=41) ao exame bacteriológico do leite foram excluídas desta pesquisa. Para a análise citológica quantitativa e qualitativa do colostro, foram utilizadas as técnicas de microscopia direta e citocentrifugação, respectivamente. As dosagens das imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) foram realizadas por meio da técnica de imunodifusão radial, utilizando-se Kits comerciais. Para a avaliação da atividade bactericida indireta dos fagócitos e verificação da influência da opsonização prévia da ECET, foram realizados os seguintes ensaios: utilizando somente suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares em meio de cultura (Grupo Controle - C); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET não opsonizada (Grupo NO); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET previamente opsonizada com 10% de sobrenadante de colostro bovino delipidado (Grupo O). A atividade bactericida indireta dos fagócitos foi mensurada por meio da quantidade de nmoles de peróxido de hidrogênio liberado por estas células, nos ensaios C, NO e O. Após as avaliações dos resultados das determinações realizadas, conclui-se que: (1) o colostro bovino de segunda ordenha apresenta maior quantidade de células/mL, que aquele de primeira ordenha; (2) a predominância celular demonstrada com o uso das técnicas de microscopia direta e de citocentrifugação foi de células mononucleares; (3) colostro bovino de segunda ordenha possui maior quantidade de neutrófilos polimorfonucleares, quando comparada àquela da primeira ordenha, utilizando as técnicas de microscópica direta e de citocentrifugação, para a contagem dos tipos leucocitários; (4) os tipos celulares predominantes no colostro bovino de primeira e segunda ordenha foram macrófagos/células epiteliais, seguidos por linfócitos, neutrófilos e eosinófilos, respectivamente, utilizando a técnica de citocentrifugação para diferenciação celular; (5) o colostro bovino de primeira ordenha possui maiores teores de imunoglobulinas das classes G e M, que o da segunda ordenha, havendo predomínio da IgG, sobre a IgM e IgA independente da ordem de ordenha. (6) os fagócitos do colostro bovino de primeira ordenha apresentaram maior atividade celular avaliada pela liberação de peróxido de hidrogênio, que os da segunda ordenha; (7) a estimulação antigênica com ECET não foi suficiente para aumentar a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino; (8) a opsonização da ECET com soro colostral não determinou diferenças significativas na atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino, mensurada pela quantidade de peróxido de hidrogênio liberado por estas células; (9) existe correlação positiva entre os teores de imunoglobulinas da classe M e a quantidade de peróxido de hidrogênio liberado pelos fagócitos do colostro bovino; (10) o comportamento quantitativo observado para as imunoglobulinas e células do colostro bovino, considerando a ordem das ordenhas, sugere que os anticorpos teriam função prioritária na imunidade do neonato, enquanto o aumento de neutrófilos estaria voltado aparentemente para a proteção da glândula mamária. / Bovine collostrum citology, immunoglobulin content and bactericidal activity of phagocytes against enterotoxigenic Escherichia coli were studied qualitatively and quantitatively, analyzing the influence of previous opsonization of the bacterium. In order to achieve this aim, 53 Holstein cows were used to obtain 212 collostrum samples before the first and second milkings. Samples positive (n=41) in the bacteriological examination of milk were excluded from the trial. Direct microscopy and cytocentrifugation were used in the quantitative and qualitative cytological analysis of collostrum, respectively. Immunoglobulin (IgG, IgM and IgA) contents were determined by means of radial immunodiffusion using commercial kits. Indirect bactericidal activity of phagocytes and assessment of the influence of ETEC previous opsonization were carried out as follows: using only a suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes in culture medium (Control group - C); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to a suspension of non-opsonized ETEC (NO group); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to an ETEC suspension previously opsonized with 10% of supernatant of delipidated bovine collostrum (O group). Indirect bactericidal activity of phagocytes was measured by means of the amount of hydrogen peroxide nmoles released by these cells in assays C, NO and O. After results were evaluated, it was concluded that: (1) bovine collostrum obtained in the second milking showed more cells/mL than first milking collostrum; (2) the predominance of mononuclear cells was determined by both direct microscopy and cytocentrifugation; (3) bovine collostrum obtained in the second milking showed greater quantity of polymorphonuclear neutrophils than that of the first milking, as determined in cell type counts by direct microscopy and cytocentrifugation; (4) cell types predominating in bovine collostrum of the first and second milking were macrophages / epithelial cells, followed by lymphocytes, neutrophils and eosinophils, respectively, using cytocentrifugation for cell differentiation; (5) first milking bovine collostrum showed greater levels of immunoglobulins G and M than that of the second milking, with a predominance of IgG compared with IgM and IgA, no matter the milking order; (6) phagocytes in first milking collostrum showed greater cell activity than those in the second milking collostrum, as evaluated by hydrogen peroxide release; (7) antigenic stimulation of ETEC was not enough to increase bactericidal activity of phagocytes in bovine collostrum; (8) ETEC opsonization with collostral serum did not lead to significant differences in bactericidal activity of bovine collostrum phagocytes, as measured by the amount of hydrogen peroxide released by these cells; (9) there was a positive correlation between the contents of immunoglobulin M and the amount of hydrogen peroxide released by phagocytes in bovine collostrum; (10) quantitative behavior observed for immunoglobulins and cells of bovine collostrum considering the milking order, suggest that antibodies would have a essential function in neonate immunity, whereas the increase in neutrophils would apparently be linked to mammary gland protection.

A pele e as mucosas constituem as primeiras barreiras na defesa contra infecções e os macrófagos são componentes essenciais do sistema imune inato, importante neste aspecto. O envolvimento destas células pode ser verificado em grande percentual das imunodeficiências primárias. Desta forma, a avaliação da função fagocitária é de extrema relevância para o reconhecimento dos distúrbios imunológicos que acometem a pele. O objetivo do presente estudo foi avaliar a metodologia laboratorial para a detecção de defeitos funcionais dos fagócitos. Para isto foram estabelecidos os seguintes testes laboratoriais: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), Dihidrorodamina (DHR), quimiotaxia, fagocitose e a aderência de S. aureus e C. albicans por citometria de fluxo (CF), além de morte intracelular de S. aureus e C. albicans (CF). Para verificar a integridade do sistema complemento realizou-se ensaios hemolíticos para as vias clássica e alternativa (CH50 e AP50). A metodologia proposta foi aplicada em indivíduos normais para a padronização dos testes. O burst oxidativo avaliado pelo teste da dihidrorodamina (DHR) foi aplicado em 101 indivíduos saudáveis e em paralelo, 50 indivíduos sadios para o teste do NBT. Os mesmos testes foram realizados em pacientes com Candidíase mucocutânea crônica (CMC) (n=9 ), Candidíase persistente (n=5), Suspeita de distúrbios de fagócitos (SDF) (n=14), Doença Granulomatosa Crônica (DGC)(n= 7) e portadores de DGC (n=5). A quimiotaxia foi padronizada em 34 controles para neutrófilos estimulados com Lipopolissacarídeo de E.Coli (LPS) e 5 com fungo Candida albicans. A técnica de fagocitose e aderência de patógenos foi padronizada com os mesmos estímulos (n=7 para fungos/n=5 para bactéria). Após a padronização, o ensaio foi aplicado em pacientes com candidíase persistente (n=5 para bactéria e n=5 para fungo) e em pacientes com CMC (n= 3 para bactéria e n=4 para fungo). Os ensaios de fagocitose e morte intracelular (capacidade bactericida e fungicida) foram padronizados em 18 indivíduos sadios para bactérias e os ensaios de morte intracelular para S. aureus foi aplicado em pacientes com CMC (n=5), com CP (n=6), com SDF (n =9) e com DGC (n=2), para os ensaios de fagocitose com morte intracelular para fungos foram utilizados 22 indivíduos saudáveis e após a padronização do ensaio foram aplicados em pacientes com CMC (n=8), pacientes com CP ( n= 7), pacientes com DGC (n=2) e indivíduos com SDF (n= 13) O ensaio de DHR foi padronizado e estabelecido em 80% de intensidade de fluorescência para células estimuladas com PMA e 15% de intensidade de fluorescência para células sem estímulo. Nos resultados do DHR encontrou-se diferença significativa no grupo de DGC (n=7)(P= 0,0001), no grupo de portadores (n=5)(P=0,0005) e no grupo de SDF (n=14)(P= 0,0053). O ensaio do DHR foi repetido após 24 horas da coleta (n=7), não se verificando alteração da resposta. A quimiotaxia mostrou diferença significativa entre C (n=4) vs SDF (n=3)(P=0,0001) e pacientes com CMC apresentaram redução da capacidade quimiotática para bactérias (n=3)e fungos (n= 4) com soro autólogo (P= 0,0246 e P=0,0109, respectivamente). Na fagocitose e aderência de bactérias inativadas ,os grupos de CMC, CP E SDF não mostraram diferenças significativas com bactérias não opsonizadas ou opsonizadas com soro AB e apresentaram menor índice de fagocitose (C x CMC)(P=0,0357) quando foram opsonizadas com soro autólogo. Na fagocitose e aderência de fungos inativados, controles e grupos de pacientes apresentaram resposta semelhante com fagocitose preservada. Os ensaios de morte intracelular para bactérias não opsonizadas houve menor expressão de fagocitose no grupo de C x SDF (P=0,0044). Na capacidade bactericida verificou-se diferença significativa entre os grupos CxCMC (P=0,0403). A opsonização das bactérias com soro AB foi significativamente diferente entre os grupos CxCP (P=0,0129) e CxSDF (P=0,0048) e com capacidade bactericida diferente entre grupos CxCP (P=0,0258) e CxSDF (P=0,0205). Na avaliação da fagocitose de bactérias opsonizadas com soro autólogo foi verificada diferença significativa entre os grupos CxCP (P=0,0013) e CxSDF (P=0,0048). Não houve diferença na capacidade bactericida dos grupos de pacientes com o controle. Os ensaios de fagocitose e morte intracelular para fungos sem opsonização não mostrou diferença estatisticamente significativa. A morte intracelular mostrou-se diferente para o grupo CxCMC (P=0,0155) e quando opsonizado com soro AB houve diferença CxCP (P=0,0369). A fagocitose com opsonização por soro autólogo significativa no grupo CxSDF (P=0,0001) e um paciente de CMC com sua fagocitose comprometida quando comparado com o controle do dia. A morte intracelular foi diferente nos grupos CxCMC (P=0,0018) e CxCP (p=0,0203). Não houve diferença estatisticamente significativa à avaliação do complemento. O ensaio do DHR mostrou ser sensível e preciso para o diagnóstico de DGC e portadores de DGC, porém pode detectar outras alterações de fagócitos. O ensaio de aderência e fagocitose mostraram-se variáveis dificultando a padronização de valores de normalidade e exclusão de defeitos. Ensaios de fagocitose com morte intracelular mostraram-se como a melhor forma de detectar distúrbios de fagócitos além do diagnóstico de DGC. A aplicação de controles do dia mostrou-se necessária e importante para a detecção de defeitos funcionais. O presente trabalho mostrou que a avaliação de distúrbios de fagócitos por morte intracelular por citometria de fluxo pode ser aplicado em outras situações clínicas com comprometimento imunológico / Skin and mucosa are part of the first barriers in the defense against infections, and the macrophages are essential components of the innate immune system, important when related to this aspect. The involvement of these cells can be seen in a large percentage of the primary immunodeficiencies. Therefore, the assessment of the phagocitary function is extremely important for the recognition of immunological disorders which affect the skin. The present study focus on the evaluation of the laboratorial methodology for the detection of functional defects of phagocytes. For this the following laboratorial tests were established: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), chemotaxis, phagocytosis and adherence of S. aureus and C. albicans through flow cytometry (FC), besides the intracellular death of S. aureus and C. albicans (FC). To assess the integrity of the complement system hemolytic assays were performed for the classic and alternative pathways (CH50 and AP50). The proposed methodology was applied to normal individuals for the standardization of the assays. The oxidative burst evaluated through the dihydrorodamine essay (DHR) was applied to 101 healthy individuals and in parallel, 50 healthy individuals for the NBT assay. The same assays were performed on patients with Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC)(n=9), persistent candidiasis (n=5), Phagocytes disorders suspicious (PDS) (n=14), Chronicle granulomatous disease (CGD)(n=7) and CGD carriers (n=5). Chemotaxis was standardized using 34 controls for neutrophils stimulated by lipopolisacharydes from e. coli (LPS) and 5 by C. albicans. Phagocytosis and adherence of pathogens were standardized using the same stimuli (n=7 for fungi and n=5 for bacteria). Following the standardization, the assay was applied to patients with persistent candidiasis (n=5 for fungi and n=5 for bacteria) and on patients with CMC (n=4 for fungi and n=3 for bacteria). Phagocytosis and intracellular death assays (bactericidal and fungicidal capacity) were standardized using 18 healthy individuals for bacteria and the intracellular death assays for S. aureus were applied on patients suffering from CMC (n=5), from PC (n=6), from PDS (n=9) and from CGD (n=2), for the phagocytosis with fungi intracellular death assays 22 healthy individuals were used, and following the standardization the assay was applied to patients suffering from CMC (n=8), from PC (n=7), from CGD (n=2) and PDS individuals (n=13). The DHR assay was standardized and established according to fluorescence intensity 80% for cells stimulated by PMA and fluorescence intensity 15% for cells without stimuli. In the DHR results a significant difference in the CGD group (n=7)(P= 0,0001), in the carriers group (n=5)(P=0,0005) and in the PDS group (n=14)(P= 0,0053) was found. The DHR assay was performed once again 24 hours after the sample collection (n=7) and no changes in the response were seen. Chemotaxis showed a significant difference between C (n=4) vs PDS (n=3)(P=0,0001) and patients suffering from CMC showed decreased ability in the chemotaxis of bacteria (n=3) and fungi (n=4) with autologous serum (P= 0,0246 e P=0,0109, respectively). In the phagocytosis and adherence of inactivated bacteria, the CMC, PC and PDS groups showed no significant differences with non-opsonizated bacteria or opsonizated with AB serum and presented a lower phagocytosis level (C x CMC)(P=0,0357) when they were opsonizated by autologous serum. In the phagocytosis and adherence of inactivated fungi, controls and patient groups presented a similar response with preserved phagocytosis. In the intracellular death assays for non-opsonizated bacteria there was a lower phagocytosis expression in the C x SDF group (P=0,0044). In the bactericidal ability a significant difference between the groups C x CMC was seen (P=0,0403). The opsonization of bacteria with AB serum showed a significant difference among the groups C x CP (P=0,0129) and C x SDF (P=0,0048) and with different bactericidal ability among the groups C x CP (P=0,0258) and C x SDF (P=0,0205). In the evaluation of the phagocytosis of bacteria opsonizated by autologous serum a significant difference among the groups C x CP (P=0,0013) and C x SDF (P=0,0048) was seen. There was no difference between the bactericidal ability of the patients group and control group. The phagocytosis and intracellular assays for fungi without opsonization presented no significant statistical difference. Intracellular death was different for the C x CMC group (P=0,0155) and when opsonizated by AB serum difference was shown C x CP (P=0,0369). The phagocytosis with opsonization by autologous serum presented significant difference in the C x SDF group (P=0,0001) and in a CMC patient with compromised phagocytosis when compared with the daily control. Intracellular death was different in the C x CMC (P=0,0018) and C x CP (p=0,0203) groups. There was no significant statistical difference according to the complement evaluation. The DHR assay was seen as very sensitive and precise for the diagnosis of CGD, however it can detect other phagocyte alterations. The phagocytosis and adherence assay varied a lot making the standardization of normal values and defects exclusion very difficult. Phagocytosis with intracellular death assays showed the best performance to detect phagocytes disorders besides CGD diagnosis. The use of daily controls was seen as very necessary and important to detect functional disorders. This study demonstrated that phagocytes disorder evaluation through intracellular death using flow cytometry can be applied to other clinical situations which are immunologically compromised

A pele e as mucosas constituem as primeiras barreiras na defesa contra infecções e os macrófagos são componentes essenciais do sistema imune inato, importante neste aspecto. O envolvimento destas células pode ser verificado em grande percentual das imunodeficiências primárias. Desta forma, a avaliação da função fagocitária é de extrema relevância para o reconhecimento dos distúrbios imunológicos que acometem a pele. O objetivo do presente estudo foi avaliar a metodologia laboratorial para a detecção de defeitos funcionais dos fagócitos. Para isto foram estabelecidos os seguintes testes laboratoriais: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), Dihidrorodamina (DHR), quimiotaxia, fagocitose e a aderência de S. aureus e C. albicans por citometria de fluxo (CF), além de morte intracelular de S. aureus e C. albicans (CF). Para verificar a integridade do sistema complemento realizou-se ensaios hemolíticos para as vias clássica e alternativa (CH50 e AP50). A metodologia proposta foi aplicada em indivíduos normais para a padronização dos testes. O burst oxidativo avaliado pelo teste da dihidrorodamina (DHR) foi aplicado em 101 indivíduos saudáveis e em paralelo, 50 indivíduos sadios para o teste do NBT. Os mesmos testes foram realizados em pacientes com Candidíase mucocutânea crônica (CMC) (n=9 ), Candidíase persistente (n=5), Suspeita de distúrbios de fagócitos (SDF) (n=14), Doença Granulomatosa Crônica (DGC)(n= 7) e portadores de DGC (n=5). A quimiotaxia foi padronizada em 34 controles para neutrófilos estimulados com Lipopolissacarídeo de E.Coli (LPS) e 5 com fungo Candida albicans. A técnica de fagocitose e aderência de patógenos foi padronizada com os mesmos estímulos (n=7 para fungos/n=5 para bactéria). Após a padronização, o ensaio foi aplicado em pacientes com candidíase persistente (n=5 para bactéria e n=5 para fungo) e em pacientes com CMC (n= 3 para bactéria e n=4 para fungo). Os ensaios de fagocitose e morte intracelular (capacidade bactericida e fungicida) foram padronizados em 18 indivíduos sadios para bactérias e os ensaios de morte intracelular para S. aureus foi aplicado em pacientes com CMC (n=5), com CP (n=6), com SDF (n =9) e com DGC (n=2), para os ensaios de fagocitose com morte intracelular para fungos foram utilizados 22 indivíduos saudáveis e após a padronização do ensaio foram aplicados em pacientes com CMC (n=8), pacientes com CP ( n= 7), pacientes com DGC (n=2) e indivíduos com SDF (n= 13) O ensaio de DHR foi padronizado e estabelecido em 80% de intensidade de fluorescência para células estimuladas com PMA e 15% de intensidade de fluorescência para células sem estímulo. Nos resultados do DHR encontrou-se diferença significativa no grupo de DGC (n=7)(P= 0,0001), no grupo de portadores (n=5)(P=0,0005) e no grupo de SDF (n=14)(P= 0,0053). O ensaio do DHR foi repetido após 24 horas da coleta (n=7), não se verificando alteração da resposta. A quimiotaxia mostrou diferença significativa entre C (n=4) vs SDF (n=3)(P=0,0001) e pacientes com CMC apresentaram redução da capacidade quimiotática para bactérias (n=3)e fungos (n= 4) com soro autólogo (P= 0,0246 e P=0,0109, respectivamente). Na fagocitose e aderência de bactérias inativadas ,os grupos de CMC, CP E SDF não mostraram diferenças significativas com bactérias não opsonizadas ou opsonizadas com soro AB e apresentaram menor índice de fagocitose (C x CMC)(P=0,0357) quando foram opsonizadas com soro autólogo. Na fagocitose e aderência de fungos inativados, controles e grupos de pacientes apresentaram resposta semelhante com fagocitose preservada. Os ensaios de morte intracelular para bactérias não opsonizadas houve menor expressão de fagocitose no grupo de C x SDF (P=0,0044). Na capacidade bactericida verificou-se diferença significativa entre os grupos CxCMC (P=0,0403). A opsonização das bactérias com soro AB foi significativamente diferente entre os grupos CxCP (P=0,0129) e CxSDF (P=0,0048) e com capacidade bactericida diferente entre grupos CxCP (P=0,0258) e CxSDF (P=0,0205). Na avaliação da fagocitose de bactérias opsonizadas com soro autólogo foi verificada diferença significativa entre os grupos CxCP (P=0,0013) e CxSDF (P=0,0048). Não houve diferença na capacidade bactericida dos grupos de pacientes com o controle. Os ensaios de fagocitose e morte intracelular para fungos sem opsonização não mostrou diferença estatisticamente significativa. A morte intracelular mostrou-se diferente para o grupo CxCMC (P=0,0155) e quando opsonizado com soro AB houve diferença CxCP (P=0,0369). A fagocitose com opsonização por soro autólogo significativa no grupo CxSDF (P=0,0001) e um paciente de CMC com sua fagocitose comprometida quando comparado com o controle do dia. A morte intracelular foi diferente nos grupos CxCMC (P=0,0018) e CxCP (p=0,0203). Não houve diferença estatisticamente significativa à avaliação do complemento. O ensaio do DHR mostrou ser sensível e preciso para o diagnóstico de DGC e portadores de DGC, porém pode detectar outras alterações de fagócitos. O ensaio de aderência e fagocitose mostraram-se variáveis dificultando a padronização de valores de normalidade e exclusão de defeitos. Ensaios de fagocitose com morte intracelular mostraram-se como a melhor forma de detectar distúrbios de fagócitos além do diagnóstico de DGC. A aplicação de controles do dia mostrou-se necessária e importante para a detecção de defeitos funcionais. O presente trabalho mostrou que a avaliação de distúrbios de fagócitos por morte intracelular por citometria de fluxo pode ser aplicado em outras situações clínicas com comprometimento imunológico / Skin and mucosa are part of the first barriers in the defense against infections, and the macrophages are essential components of the innate immune system, important when related to this aspect. The involvement of these cells can be seen in a large percentage of the primary immunodeficiencies. Therefore, the assessment of the phagocitary function is extremely important for the recognition of immunological disorders which affect the skin. The present study focus on the evaluation of the laboratorial methodology for the detection of functional defects of phagocytes. For this the following laboratorial tests were established: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), chemotaxis, phagocytosis and adherence of S. aureus and C. albicans through flow cytometry (FC), besides the intracellular death of S. aureus and C. albicans (FC). To assess the integrity of the complement system hemolytic assays were performed for the classic and alternative pathways (CH50 and AP50). The proposed methodology was applied to normal individuals for the standardization of the assays. The oxidative burst evaluated through the dihydrorodamine essay (DHR) was applied to 101 healthy individuals and in parallel, 50 healthy individuals for the NBT assay. The same assays were performed on patients with Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC)(n=9), persistent candidiasis (n=5), Phagocytes disorders suspicious (PDS) (n=14), Chronicle granulomatous disease (CGD)(n=7) and CGD carriers (n=5). Chemotaxis was standardized using 34 controls for neutrophils stimulated by lipopolisacharydes from e. coli (LPS) and 5 by C. albicans. Phagocytosis and adherence of pathogens were standardized using the same stimuli (n=7 for fungi and n=5 for bacteria). Following the standardization, the assay was applied to patients with persistent candidiasis (n=5 for fungi and n=5 for bacteria) and on patients with CMC (n=4 for fungi and n=3 for bacteria). Phagocytosis and intracellular death assays (bactericidal and fungicidal capacity) were standardized using 18 healthy individuals for bacteria and the intracellular death assays for S. aureus were applied on patients suffering from CMC (n=5), from PC (n=6), from PDS (n=9) and from CGD (n=2), for the phagocytosis with fungi intracellular death assays 22 healthy individuals were used, and following the standardization the assay was applied to patients suffering from CMC (n=8), from PC (n=7), from CGD (n=2) and PDS individuals (n=13). The DHR assay was standardized and established according to fluorescence intensity 80% for cells stimulated by PMA and fluorescence intensity 15% for cells without stimuli. In the DHR results a significant difference in the CGD group (n=7)(P= 0,0001), in the carriers group (n=5)(P=0,0005) and in the PDS group (n=14)(P= 0,0053) was found. The DHR assay was performed once again 24 hours after the sample collection (n=7) and no changes in the response were seen. Chemotaxis showed a significant difference between C (n=4) vs PDS (n=3)(P=0,0001) and patients suffering from CMC showed decreased ability in the chemotaxis of bacteria (n=3) and fungi (n=4) with autologous serum (P= 0,0246 e P=0,0109, respectively). In the phagocytosis and adherence of inactivated bacteria, the CMC, PC and PDS groups showed no significant differences with non-opsonizated bacteria or opsonizated with AB serum and presented a lower phagocytosis level (C x CMC)(P=0,0357) when they were opsonizated by autologous serum. In the phagocytosis and adherence of inactivated fungi, controls and patient groups presented a similar response with preserved phagocytosis. In the intracellular death assays for non-opsonizated bacteria there was a lower phagocytosis expression in the C x SDF group (P=0,0044). In the bactericidal ability a significant difference between the groups C x CMC was seen (P=0,0403). The opsonization of bacteria with AB serum showed a significant difference among the groups C x CP (P=0,0129) and C x SDF (P=0,0048) and with different bactericidal ability among the groups C x CP (P=0,0258) and C x SDF (P=0,0205). In the evaluation of the phagocytosis of bacteria opsonizated by autologous serum a significant difference among the groups C x CP (P=0,0013) and C x SDF (P=0,0048) was seen. There was no difference between the bactericidal ability of the patients group and control group. The phagocytosis and intracellular assays for fungi without opsonization presented no significant statistical difference. Intracellular death was different for the C x CMC group (P=0,0155) and when opsonizated by AB serum difference was shown C x CP (P=0,0369). The phagocytosis with opsonization by autologous serum presented significant difference in the C x SDF group (P=0,0001) and in a CMC patient with compromised phagocytosis when compared with the daily control. Intracellular death was different in the C x CMC (P=0,0018) and C x CP (p=0,0203) groups. There was no significant statistical difference according to the complement evaluation. The DHR assay was seen as very sensitive and precise for the diagnosis of CGD, however it can detect other phagocyte alterations. The phagocytosis and adherence assay varied a lot making the standardization of normal values and defects exclusion very difficult. Phagocytosis with intracellular death assays showed the best performance to detect phagocytes disorders besides CGD diagnosis. The use of daily controls was seen as very necessary and important to detect functional disorders. This study demonstrated that phagocytes disorder evaluation through intracellular death using flow cytometry can be applied to other clinical situations which are immunologically compromised

Submitted by Luis Guilherme Macena (guilhermelg2004@gmail.com) on 2013-04-08T13:34:24Z No. of bitstreams: 1 Ana Luiza Machado Pinto_Dissertação.pdf: 11575246 bytes, checksum: b2a8644ada3f970b5e35478d390a6c3b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-08T13:34:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Luiza Machado Pinto_Dissertação.pdf: 11575246 bytes, checksum: b2a8644ada3f970b5e35478d390a6c3b (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Ensino. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os fagócitos são elementos fundamentais na resposta imunológica a diversos patógenos. Nas imunodeficiências primárias, defeitos quantitativos ou qualitativos do desenvolvimento do sistema imune, que afetam esta classe de células são responsáveis por um aumento do número de infecções graves ainda na primeira infância, que pode acometer, entre outros sítios, a cavidade oral destes pacientes. Apesar da grande importância clínica, pela gravidade das manifestações e pela cronicidade da doença, as imunodeficiências primárias apresentam dificuldades importantes para o não-especialista, pela sua relativa raridade na população, pela grande heterogeneidade de mecanismos patogênicos, e pela diversidade de apresentações clínicas. Assim, a freqüência e a natureza das manifestações na cavidade oral dependem da natureza do defeito na imunidade, podendo variar consideravelmente de uma doença a outra. No entanto, um estudo detalhado da literatura científica sobre manifestações orais nas diferentes categorias de imunodeficiência primária. Neste trabalho, procuramos suprir parcialmente esta lacuna, fazendo uma revisão sistemática dos relatos de casos das imunodeficiências de células fagocitárias, e estabelecendo a freqüência das manifestações orais e dentárias descrita para esta classe de doenças, com o intuito de aprimorar o olhar do odontólogo na abordagem destes pacientes. Resultados: A presente revisão sistemática do nosso estudo permitiu a avaliação de 1721 pacientes e entre estes pacientes, 653 pacientes (37,9%) apresentaram relato de alguma manifestação oral e/ou dentária na descrição clínica do caso. A doença periodontal foi a manifestação oral mais freqüente (54,5%), seguida da perda precoce de dentes decíduos, encontrada em 142 pacientes (21,7%) e da gengivite, encontrada em 72 pacientes (11,0%), além da presença de aftas (8,1%) e a candidíase oral (7,5%). / Phagocytic cells are essential elements in the host reponse to a wide variety of pathogens. In Primary Immune Deficiency (PID) diseases, quantitative or qualitative defects in the development of the immune system, affecting phagocytes, account for an increase in the number of severe infections in infancy and childhood, which may involve, among other sites, the oral cavity. Despite their great clinical relevance, in view of the diverse manifestations and chronicity of the disease, PID present important practical difficulties for the nonspecialist practicioner, due to their relative scarcity in the general population, great heterogeneity in pathogenetic mechanisms, and diversity of presentation. Therefore, the frequency and nature of oral manifestations depend on the nature of the defect in immunity, varying considerably among specific PID. To our knowledge, there is no systematic study of the existing scientific literature with respect to oral manifestations in different subtypes of PID. In this study, we attempted to fill this gap, by carrying out a systematic review of case reports of PID affecting phagocytes, and establishing the frequency of the different oral and dental manifestations in this group of PID, with the goal of providing dental health professionals with more accurate information concerning these patients. Results: Case reports describing 1721 patients enabled us to detect reports of oral or dental manifestations in the clinical description of 653 pacients (37,9%). Periodontal disease was the most frequent oral manifestation (54,5%), followed by the early loss of decidual teeth, which was found in 142 pacients (21,7%) and gingivitis, found in 72 pacients (11,0%). Ulcerations (8,1%) and oral candidiasis (7,5%) were also reported. This analysis also provided evidence that recent advances in biomedical research, with an increasing focus on molecular analyses, significantly influenced the content of case reports, which are nowadays more often focused on the identification of mutated genes, rather than on the detailed description of clinical findings. As a result, online and computer-assisted information retrieval strategies do not necessarily recover the same references, when articles are searched on the basis of clinical descriptions, or on the basis of well-characterized molecular defects.

A promoção a amamentação representa uma importante estratégia de saúde pública no manejo do sobrepeso e obesidade mundial. É possível que os hormônios reguladores do metabolismo energético, como a adiponectina, leptina e melatonina do colostro humano, possa beneficiar o sistema imunológico do lactente e minimizar os impactos ocasionados pelo excesso de peso materno pré-gestacional. Dado que, esses hormônios também possuem ação imunomoduladora. Assim, mudanças nas concentrações desses hormônios, podem comprometer a atividade funcional das células mononucleares (MN) do colostro humano e contribuir para o aumento de infecções neonatais. Por isto, o objetivo desta pesquisa foi analisar a atividade funcional dos fagócitos MN do colostro de mulheres com excesso de peso pré-gestacional, na ausência e presença de adiponectina, leptina e melatonina. As amostras de colostro foram coletadas de 109 doadoras saudáveis e foram divididas em dois grupos: grupo controle e grupo com excesso de peso. O colostro foi centrifugado para obtenção do botão celular e sobrenadante. O sobrenadante foi utilizado para dosagem de melatonina, quantificada por ELISA. As células MN foram utilizadas no ensaio de fagocitose, por citometria de fluxo, e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS), cálcio intracelular e apoptose foram realizadas por fluorimetria. Foram consideradas diferenças significativas quando p<0,05. O colostro de mulheres com excesso de peso pré-gestacional apresentou uma maior concentração de melatonina (p<0,05). Os fagócitos MN do grupo excesso de peso teve um menor índice de fagocitose (p<0,05). No entanto, os estímulos foram capazes de restaurar a atividade fagocítica para este grupo (p<0,05). A adiponectina+leptina foi o estímulo que desenvolveu uma resposta mais efetiva, com restauração dos níveis de EROS, manutenção do cálcio intracelular e elevação do índice de apoptose para o grupo com excesso de peso (p<0,05). Os dados em conjunto reforçam a hipótese de que amamentação é benéfica para a saúde da criança. A manutenção dos níveis endógenos de adiponectina, leptina e melatonina pode aumentar a proteção e diminuir os índices de infecção neonatais, em filhos de mulheres com excesso de peso. Assim, políticas públicas que apoiam o controle de peso pré-gestacional devem ser encorajadas / Breastfeeding promotion represents an important public health iniciative in worldwide overweight and obesity management strategies. It is possible that the hormones regulating energy metabolism, such as adiponectin, leptin and melatonin of human colostrum can benefit the infant\'s immune system and minimize the impacts caused by pre-gestational maternal overweight. As these hormones also have immunomodulatory action, changes in their concentrations can affect the functional activity of mononuclear cells of human colostrum and contribute to the increase of neonatal infections. Therefore, the aim of this study is to analyze the functional activity of colostrum mononuclear phagocytes in women with pregestational overweight, with absence or presence of adiponectin, leptin and melatonin. Colostrum samples collected from 109 healthy donors were divided into two groups: the control group and the high body mass index (BMI) group. Colostrum samples were centrifuged to obtain the cell button and supernatant. The supernatant was used for melatonin dosing performed by ELISA, mononuclear cells used to phagocytosis assay, by flow cytometry and production of reactive species of oxygen, intracellular calcium and apoptosis assays were performed by fluorimetry using plate reader. Statistically significant differences were considered when p <0.05. Colostrum of pre-gestational high BMI group had higher concentration of melatonin (p <0.05). Mononuclear phagocytes of high BMI group had a lower index of phagocytosis (p <0.05). However, the stimuli restored the phagocytic activity for high BMI group (p <0.05). Adiponectin+leptin was the stimulus that developed a more effective response, with restoration of reactive oxygen species levels, maintenance of intracellular calcium and elevation of apoptosis index (p < 0.05) in the high BMI group. These data reinforce that breastfeeding is beneficial to child\'s health and maintaining endogenous levels of adiponectin, leptin and melatonin may increase protection and decrease neonatal infection rates in children of women with high BMI. Thus, public policies that support pre-gestational weight control should be encouraged.

As infecções fúngicas se tornaram um grande problema de saúde pública, especialmente em ambientes hospitalares. Candida spp. são os principais patógenos em infecções fúngicas invasivas. A produção de aspartato proteases secretadas (Sapp) por Candida spp. pode estar relacionado com o aumento do número de infecções e resistência aos medicamentos. A produção de proteases é codificada por uma família de 10 genes SAP1-10, sendo SAP2 o gene mais comumente expresso em Candida albicans. A expressão de SAP4 está associada à produção de enzimas Sap4p e formação de hifas que podem contribuir para a invasão dos tecidos hospedeiros e destruição de macrófagos em processos infecciosos. Este trabalho avaliou a expressão dos genes SAP2 e SAP4 em C. albicans ATCC 10231 cultivadas na presença ou ausência de macrófagos e expostas a concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Candida albicans foi cultivada em ágar Sabouraud Dextrose a 37ºC por 24 h, e posteriormente em caldo carbono levedura base enriquecido com soro-albumina bovina (YCB-BSA), e na ausência ou presença de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. A linhagem celular monocítica humana de origem leucemia (THP-1) foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml) a 37ºC, sob atmosfera de 5% de CO2 durante 10 dias. Para a indução da diferenciação das células, 106 monócitos foram cultivados em meio RPMI-1640 suplementado e forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) 100 nM durante 48 h. Foram utilizadas amostras de 5x106 C. albicans cultivadas na presença ou ausência de 106 macrófagos e expostas ou não a concentrações subinibitórias de antifúngicos. A amostras foram cultivadas em placas de cultura celular com 6 poços por 1 h a 37 °C, sob atmosfera de 5% de CO2. O RNA total foi extraído das amostras utilizando o reagente TRIzol®, após a purificação do RNA com DNase I, este foi convertido em cDNA, e, em seguida, a quantificação do gene SAP4 foi realizada por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (qPCR) utilizando ACT1 como gene normalizador. Candida albicans cultivada na presença de macrófagos apresentou regulação positiva na expressão de SAP2 e SAP4 (p < 0,01), respectivamente, na ordem de 4,83 e 10,34 vezes maior se comparada com amostras da levedura cultivada sem contato com macrófagos. E ainda, a exposição de C. albicans a concentrações subinibitórias de fluconazol aumentou a expressão de SAP2 e diminuiu a expressão de SAP4, já a exposição da levedura a concentrações subinibitórias de anfotericina B diminuiu a expressão de SAP2 e SAP4. Os genes SAP2 e SAP4 são relacionados como fatores de virulência de C. albicans e sua expressão pode ser regulada pelo contato com fagócitos ou exposição a antifúngicos. Portanto, compreender a expressão desses genes na patogênese fúngica pode ajudar na pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da candidíase, contribuindo assim para a redução da incidência de morbidade e mortalidade associada a infecções fúngicas. / Fungal infections have become a major public health problem especially in hospital settings. Candida spp. are considered the main pathogen in invasive fungal infections. The production of secreted aspartic proteinases (Sapp) by Candida spp. can be related to the increase in the number of infections and drug resistance. The production of proteinases is encoded by a family of 10 genes known as SAP1-10, of which, SAP2 is the most commonly expressed gene in Candida albicans. The expression of SAP4-6 is associated to the production of Sap4-6p enzymes and hyphae formation which can contribute to the invasion of host tissues and destruction of macrophages during infectious processes. This study evaluates SAP2 and SAP4 gene expression in C. albicans ATCC 10231 grown in the presence or absence of macrophages and exposed to subinibitory concentrations of fluconazole and amphotericin B. C. albicans was grown in Sabouraud Dextrose Agar for 24 h at 37ºC and after in yeast carbon base more 0.2% bovine serum albumin (YCB-BSA) in the absence or presence of subinibitory concentrations of Fluconazole and Amphotericin B. The human monocytic leukemia cell line (THP-1) was grown in RPMI-1640 Medium supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin (100U/ml) and streptomycin (100μg/ml) at 37 °C and atmosphere of 5% CO2 during 10 days. For the induction of cell differentiation, 106 cells were seeded in RPMI-1640 medium supplemented and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 100 nM for 48 h. The samples of 5x106 C. albicans were cultured in the presence or absence of 106 macrophages and these was exposed or not to subinibitory concentrations of antifungals. All samples were incubated in culture test plates with 6 flat-botton wells for 1 h at 37 °C and atmosphere of 5% CO2. Total RNA was extracted from the samples using TRIzol® reagent, after RNA purification with DNaseI it was converted to cDNA, and then, the relative quantification of the SAP4 gene was performed by Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) using ACT1 gene as normalizing endogenous gene. Candida albicans grown in the presence of macrophages showed upregulation in the expression of SAP2 and SAP4 (p < 0.01), respectively, in the order of 4.83 and 10.34 fold higher as compared to yeast samples grown without contact with macrophages. Concerning exposure to antifungal agents, C. albicans exposed to subinhibitory concentrations of amphotericin B showed downregulation in expression of SAP2 and SAP4. However, the yeast's exposure to subinhibitory concentrations of fluconazole caused upregulation in SAP2 expression and downregulation in SAP4 expression. SAP2 and SAP4 genes are related to virulence factors of C. albicans and its expression can be regulated by contact with phagocytes or exposure to antifungals. Therefore, understanding the expression of these genes in fungal pathogenesis may aid in research and development of new drugs for treating candidiasis, thus contributing to reducing the incidence of morbidity and mortality associated with fungal infections. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O formaldeído (FA) é um poluente ambiental gerado pela indústria, originando-se também pela queima de tabaco, gasolina, álcool e GLP. É irritante de vias aéreas; a exposição ao FA pode contribuir para mediar a inflamação alérgica pulmonar (IAP) a outros antígenos. Neste estudo analisamos o estado funcional de fagócitos do pulmão e da medula óssea de ratos Wistar machos após inalação de FA (1%, 90 min/dia, 3 dias) e a seguir submetidos a IAP (sensibilizados e desafiados com ovoalbumina), bem como a expressão de moléculas de adesão. Sobrenadantes de culturas de pulmão, de fagócitos pulmonares e da medula óssea foram coletados após 1, 4 ou 24 h. Verificou-se em ratos submetidos a IAP que, no pulmão, a exposição prévia ao FA aumentou NO2, H2O2, LTB4, TXB2, PGE2, IL-1<font face=\"symbol\">b, TNF-<font face=\"symbol\">a e diminuiu IL-10; na medula óssea, aumentou NO2 e PGE2, e diminuiu H2O2, LTB4, TXB2, IL-1<font face=\"symbol\">b e IL-10. A interação FA/OVA reduziu a expressão de ICAM-1, VCAM-1 e PECAM-1. Em conclusão, o FA medeia alterações na atividade funcional de fagócitos envolvidos com o desenvolvimento da asma. / Formaldehyde (FA) is an ambiental pollutant generated in industry and by burning of tobacco, alcohol, gasoline and LPG. As an airways irritant agent, the exposure to it may affect the modulation of allergic lung inflammation (ALI) triggered by unrelated antigens. We studied the functional activity of lung phagocytes and bone marrow cells from male Wistar rats previously subjected to FA inhalation (1%, 90 min/day, 3 days) and then subjected to ALI (ovalbumin sensitized and challenged), as well as the expression of adhesion molecules. Supernatants of lung explants, lung phagocytes and bone marrow cells were collected after 1, 4 or 24 h upon or not LPS or PMA stimulation. After FA inhalation, ALI increased NO2, H2O2, LTB4, TXB2, PGE2, IL-1<font face=\"symbol\">b, TNF-<font face=\"symbol\">a and decreased IL-10 in the lung, whereas enhanced NO2 e PGE2 and reduced H2O2, LTB4, TXB2, IL-1<font face=\"symbol\">b and IL-10 in bone marrow cells. The interaction FA/OVA decreased the expression of ICAM-1, VCAM-1 e PECAM-1. In conclusion, FA significantly alters the functional activity of phagocytes involved with asthma induction.