Orientador: Prof. Dr. Jorge Eduardo Fouto Matias / Co-orientadora: Profª. Drª. Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica. Defesa: Curitiba, 16/12/2016 / Inclui referências : f.52-59 / Resumo: Avaliar os efeitos benéficos da administração tópica do metronidazol no depósito de colágeno, na diferenciação de fibroblastos e na contração da ferida durante a cicatrização experimental por segunda intenção em 108 ratos machos Wistar, com peso de 300 a 350g, que foram submetidos a uma ferida circular, com dois centímetros de diâmetro, da espessura total de pele do dorso. Os animais foram divididos em cinco grupos (18 animais por grupo) de acordo com a concentração da solução do metronidazol utilizada (4%, 6%, 8%,10% e 12%) durante o curativo realizado diariamente durante todo o período de experimento subdividido em três tempos de análise (após 3, 7 e 14 dias de observação). A contração da ferida foi avaliada por planimetria digital, a coloração Sirius Red foi utilizada para quantificar os tipos de colágeno I e III, os miofibroblastos e protomiofibroblastos foram identificados usando técnicas de imunoistoquímica CD34 e ?-SMA. A análise estatística, incluindo comparações de intergrupos e intragrupos, foi calculada por teste não paramétrico de Kruskal-wallis usando o software SSPS e valor de p de 0,05, significância estatística de 95%. A contração da ferida não apresentou diferença entre os grupos e o controle. Os grupos de metronidazol apresentaram melhores depósitos de colágeno tipo I e III após 3 (p=0,013 e p=0,003) e 7 dias (p=0,008 e p=0,001) independentemente da concentração da solução. Os protomiofibroblastos foram significativamente mais numerosos aos 7 dias (p=0,022) nos grupos metronidazol de 4%, 6% e 8%. Após 14 dias, nos mesmos grupos, os miofibroblastos predominaram significativamente (p=0,01). A administração tópica de solução de metronidazol em feridas de pele com cicatrização por segunda intenção foi capaz de melhorar deposição local de colágeno e a diferenciação de fibroblastos. Apesar destes efeitos benéficos, a fase de contração da cicatrização de feridas permaneceu inalterada, sem redução significativa da contração avaliada pela planimetria digital. Essas descobertas podem ser potencialmente utilizadas em favor do processo de cicatrização de feridas. Descritores: Cicatrização. Metronidazol. Administração Tópica. Absorção Cutânea. Colágeno. Fibroblastos. Miofibroblastos. Ratos. / Abstract: In order to address beneficial effects of metronidazole topical administration on collagen deposit, fibroblasts differentiation and wound contraction during experimental second-intention healing, 108 Wistar male rats, weighing 300-350g were submmited to a circular, 2 cm diameter, total deep back skin wound. Animals were divided into five groups (18 each group) according to the metronidazole solution concentration used (4%, 6%, 8%, 10% and 12%) during the dressing performed daily all over the period of experiment which was subdivided into three times of analysis (after 3, 7 and 14 days of observation). Wound contraction was assessed by digital planimetry, Sirius Red staining was used to quantified collagen types I and III, and myofibroblasts/protomyofibroblasts were identified using CD34 and ?-SMA immunohistochemistry techniques. Statistical analysis, including intergroups and intragroups comparisons was calculated by non-parametric Kruskal-Wallis test using SSPS software and p value of 0,05, statistical significance of 95%. Wound contraction wasn't different between groups and control. Metronidazole groups showed better types I and III collagen deposits after 3 (p=0,013 and p=0,003) and 7 days (p=0,008 and p=0,001) regardless the solution concentration. Protomyofibroblasts were significantly more numerous at 7 days (p=0,022) in metronidazole groups of 4% 6% and 8%. After 14 days, at the same groups, myofibroblasts predominated significantly (p=0,01). Topical administration of metronidazole solution in experimental secondintention skin wounds was able to improve local collagen deposit and fibroblasts differentiation. Despite these beneficial effects, contraction phase of wound healing remained unchanged, without significant reduction of contraction phase as assessed by digital planimetry. These findings can be potentially used in favor of the wound healing process. Keywords: Wound Healing. Metronidazole. Administration, Topical. Skin Absorption. Collagen. Fibroblasts. Myofibroblasts. Rats.

Orientador: José Buratini Júnior / Banca: Fabíola Freitas de Paula-Lopes / Banca: fernanda da Cruz Landim / Resumo: O fator de crescimento dos fibroblastos 8 (FGF8) é expresso pelo oócito bovino, ativa os receptores expressos por células do cumulus e oócitos, e está envolvido na regulação da glicólise e meiose no CCO de murinos. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do FGF8 sobre a expansão das células do cumulus, a progressão da meiose e metabolismo energético em CCOs bovinos submetidos à MIV. Uma vez que foram observadas influências sobre a progressão da meiose e no metabolismo energético, os efeitos de FGF8 sobre a abundância de genes que codificam o RNAm que controlam estes processos foram avaliados. O FGF8 não afetou a expansão do cumulus, mas diminuiu a porcentagem de oócitos que alcançaram a metáfase II, consequentemente houve o aumento da porcentagem de oócitos na metáfase I. Tal efeito foi associado com um efeito inibitório do FGF8 sobre os níveis de RNAm que codifica a Ciclina B1 no oócito. Em contraste com os achados anteriores em murinos, o FGF8 leva à diminuição dos níveis de RNAm de NPR2 nas células do cumulus. O FGF8 tende a diminuir a absorção de glicose e produção de lactato, que foi acompanhada por uma redução significativa nos níveis de RNAm para PFKP em células de cumulus. O FGF8 também tende a diminuir a expressão de RNAm para o LDHA, mas não alterou os níveis de RNAm para GLUT1, GLUT4 e PDHA1 nas células do cumulus, enquanto que aumentou a expressão de RNAm para o PDHA1 no oócito. Este estudo apresenta evidências de que o FGF8 pode retardar a progressão da meiose durante a MIV em bovinos por meio de mecanismos que envolvam redução da expressão de Ciclina B1. Além disso, novamente em contraste com estudos em ratos, os dados sugerem um efeito inibidor modesto de FGF8 sobre o metabolismo glicolítico das células do cumulus durante a maturação in vitro de bovinos / Abstract: Fibroblast growth factor 8 (FGF8) is expressed by the bovine oocyte, activate receptors expressed by cumulus cells and oocytes, and is involved in the regulation of glycolysis and meiosis in the murine COC. The first aim of this study was to assess the effects of FGF8 on cumulus expansion, meiosis progression and energy metabolism in bovine COCs submitted to IVM. Then, once influences on meiosis progression and energy metabolism were observed, effects of FGF8 on abundance of mRNA encoding genes that control these processes were assessed. FGF8 did not affect cumulus expansion but decreased the percentage of oocytes reaching metaphase II, while increasing the percentage of oocytes in metaphase I. This was associated with an inhibitory effect of FGF8 on levels of mRNA encoding Cyclin B1 in the oocyte. In contrast with previous findings in mice, FGF8 decreased mRNA levels of NPR2 in cumulus cells. FGF8 tended to decrease glucose uptake and lactate production, which was accompanied by a significant reduction in PFKP mRNA abundance in cumulus cells. FGF8 also tended to decrease LDHA mRNA expression, but did not change GLUT1, GLUT4 and PDHA1 mRNA levels in cumulus cells, while it increased PDHA1 mRNA abundance in the oocyte. This study presents novel evidence that FGF8 can slow meiosis progression during IVM in cattle through mechanisms involving reduction of Cyclin B1 expression / Doutor

Orientador: Prof. Dr. Antônio Carlos Ligocki Campos / Co-orientador: Prof. Dr. Jorge Eduardo F.Matias / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica. Defesa: Curitiba, 13/07/2015 / Inclui referências f. 54-59 / Área de concentração : Clinica cirurgia / Resumo: Introdução: Tendo em vista o número de cirurgias plásticas no Brasil e a busca por melhores resultados estético-funcionais fazem-se necessárias pesquisas para encontrar meios para melhorar a cicatrização e as cicatrizes. Objetivo: Avaliar os efeitos de três sessões de radiofrequência na cicatrização da pele de ratos no 7º e 14º dia de cicatrização. Método: Quarenta e oito ratos machos foram divididos em 4 grupos (GC7, GR7, GC14 e GR14) conforme ao grupo que pertenciam (GC: grupo controle; GR: grupo radiofrequência) e o dia do sacrifício (7: 7º dia P.O; 14: 14º dia P.O). Sob anestesia com ketamina 80 mg/kg e xilazina 8 mg/kg foi realizado a tricotomia e antissepsia com PVPI. Logo em seguida, foi feita a marcação da ferida excisional com tamanho de 2cm x 2cm (4cm²) e utilizado a lâmina 20 nas bordas laterais do quadrado. Foi feita a dissecação do segmento da pele. Também utilizou-se um punch metálico de 6mm com lâmina cortante na sua borda inferior para a realização de duas feridas excisionais de 0,6cm de diâmetro. Após 24h, foi realizada a aplicação da radiofrequência com o equipamento Spectra® na região dorsal, diretamente sobre as feridas por 7 minutos com temperatura de 38ºC. Esse procedimento foi realizado por três vezes, em dias alternados. No grupo controle foi realizado o procedimento com o aparelho desligado. As feridas foram fotografadas em diferentes tempos pós-operatórios: dia da cirurgia, 1ºdia P.O, no 7º dia P.O e no 14º dia P.O. As áreas cruentas foram calculadas utilizando programa específico de computador. No sacrifício (7º P.O ou 14º P.O), as feridas foram ressecadas e fixadas, para posterior análise histológica com HE. Os resultados foram analisados estatisticamente. Resultados: Foi encontrada área maior na ferida quadrado, no 3º dia pós cirurgia do grupo radiofrequência (GR7 3,3cm² ± 0,7cm² X GC7 2,4cm² ± 0,4cm², p=0,009). A diferença no dia da cirurgia para o dia da eutanásia do GR14 e GC14 foi uma ferida maior no dia da eutanásia no GR14 quando comparado ao GC14 (GR14 1,9cm² ± 0,5cm² X GC14 1,0cm² ± 0,3cm², p=0,001). No 7º e 14º dia de pós-operatório as feridas dos grupos controle e experimento de todos os animais exibiram aspectos diferentes entre si. Houve fechamento de 90% das feridas no GC14. No GR14, 60% dos ratos com feridas de punch foram reepitelizadas, enquanto 40% permaneceram ulceradas. No GC7, 70% das feridas de punch permaneceram ulcerados e 30% foram reepitelizadas. Já no GR7, 8% dos ratos, com feridas de punch foram reepitelizadas e 92% dos ratos permaneceram ulcerados. Conclusão: Pode-se afirmar que a radiofrequência tem influência sobre o processo inflamatório mostrando que, nos ratos que foram aplicados a radiofrequência, o quadrado permaneceu ulcerado. A radiofrequência reduz a contração cicatricial em feridas excisionais. Palavras-chave: Ondas de Rádio. Cicatrização. Fibroblastos / Abstract: Introduction: Considering the number of plastic surgeries in Brazil and the search for better aesthetic-functional results, researches are necessary to find ways to improve the healing process and scars Objective: The objective of this study was to evaluate the effects of 3 sessions of the radiofrequency device in the cicatrization process of rat skins at 7 º and 14 º days of healing. Methods: Forty-eight male rats were divided into 4 groups (GC7, GR7, GR14 and GC14), according to the group (CG: control group; GR: RF group) and the day of sacrifice (7: 7th post-operative day; 14: 14th post-operative day). Under anesthesia with ketamine 80mg/kg and xylazine 8mg/kg, the trichotomy and antisepsis with PVP-I was done on each animal before marking the 2cm x 2cm (4cm²) excisional wound, to finally initiate surgery with No.20 blades on the sides of the marked square, dissecting the skin segment. A 6mm metal punch with a cutting blade at its lower edge was used as well. After 24h, the radio-frequency with Spectra® equipment was applied on the dorsal region for 7 minutes with a temperature of 38 °C. This procedure was performed three times on alternate days. The control group went through the process with Spectra® turned off. The wounds were photographed at different post-operative stages: Surgery day, 1º day PO, 7º day PO and 14º day PO the raw areas were calculated using specific computer program. We reevaluated histologically with HE. Results were statistically analyzed by non-parametric Mann-Whitney test, p<0, 05. Results: Larger area in the wound square was found, on the 3rd day after surgery in radiofrequency group (GR7 3,3cm² ± 0,7cm² x GC7 2,4cm² ± 0,4cm², p=0,009).The difference between surgery day to euthanasia of the GC14 and GR14 is a smaller wound on euthanasia day in C14 compared to R14, (GR14 1,9cm² ± 0,5cm² x GC14 1,0cm² ± 0,3cm², p=0,001).On 7th and 14th postoperative days, wounds of control and experimental groups of all animals exhibit different aspects. There was 90% closure of wounds in the GC14. 60% of the rats in the GR14 had epidermal regeneration while 40% remaining ulcerated. In GC7, 70% of punch wounds remained ulcerated and 30% was healed. The GR7 had 8% rats with punch wounds healed and 92% remained ulcerated. Conclusion: It can be said that the radio has influence on the inflammatory process, showing negative effects applying RF; the Q-square remained ulcerated. This, study have found harmful results about the application of radiofrequency in the initial PO. However, it is necessary to conduct more studies to elucidate the action mechanism of RF in skin wounds healing. Keywords: Radio Waves. Cicatrization. Fibroblasts

Orientador: Denise Madalena Palomari Spolidório / Banca:Juliana Rico Pires / Banca: Shelon Cristina Souza Pinto / Banca: Luciene Cristina Souza Pinto / Banca: Joni Augusto Cirelli / Resumo:Os peptídeos antimicrobianos como por exemplo a catelicina (LL-37) e as defensinas humanas (hBD-1, hBD-2 e a hBD-3) são considerados antibióticos endógenos com importante papel na prevenção das doenças periodontais, devido a sua capacidade de regulação da resposta imune, sendo que os mesmos podem ser degradados pelos periodontopatógenos. Terapias que aumentem a produção destes peptídeos pelas próprias células do organismo, assim como a associação destes peptídeos com compostos naturais os quais possam agir em sinergismo na regulação da resposta imune, podem ser considerados novas estratégias para o melhor controle das doenças periodontais. Portanto os objetivos deste estudo in vitro foram: i) Avaliar a capacidade do extrato do chá verde (Camellia sinensis) e do seu polifenol, o EGCG, sobre a expressão gênica de hBD-1 e hBD-2 pelas células epiteliais gengivais (B11), sobre a degradação das mesmas frente ao P. gingivalis, ii) Através da utilização do modelo 3D de co-cultura celular, avaliar a capacidade antiinflamatória dos peptídeos hBD-3 e LL-37 quando em associação sobre a produção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, iii) Avaliar a capacidade anti-inflamatória da associação do EGCG e do polifenol proveniente do cranberry, o AC-PACs, com o peptídeo LL-37 sobre a produção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento em modelo de co-cultura celular. As células epiteliais gengivais (B11) foram estimuladas com o extrato do chá verde e com o EGCG na presença e ausência de inibidores específicos. A produção e expressão gênica de hBD-1 e hBD-2 foram quantificados respectivamente pelas técnica de ELISA e qPCR. A capacidade do extrato do chá verde e do EGCG em proteger a degradação de hBDs pelo P. gingivalis foi mensurado através da técnica de ELISA. Foi desenvolvido um modelo em 3D de co-cultura de fibroblastos gengivais embebidos em....(Resumo completo, clicar acesso eletrôni / Abstract: The antimicrobial peptides LL-37, hBD-1, hBD-2 and hBD-3 are considered an endogenous antibiotic, with important role in the prevention of periodontal diseases due to their ability to regulate the immune response. However those peptides could be degraded by periodontal pathogens. Therefore, therapies able to up regulate the secretion of those peptides by human cells, and the association of antimicrobial peptides with natural compounds, which may act in synergism to modulate the immune response, may be a novel approach for effectively controlling periodontal diseases. The aim of this in vitro study were: i) investigate the ability of green tea extract and EGCG to induce hBD-1 and hBD-2 secretion and gene expression by gingival epithelial cells (B11) and to protect hBDs from degradation by P. gingivalis, ii) A 3D co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS (1 μg/ml) were used to investigated the anti-inflammatory properties of the hBD-3, LL-37, ACPACs and EGCG and to determine whether LL-37 acts in synergy with AC-PACs, EGCG and hBD-3. Gingival epithelial cells were stimulated with green tea extract or EGCG in the presence and absence of specific inhibitors. The secretion and gene expression of hBD-1 and hBD-2 was respectively measured by ELISA and qPCR. The ability of green tea extract and EGCG to prevent hBDs degradation by P. gingivalis present in a bacterial culture supernatant was evaluated by ELISA. A 3D co-culture model composed of gingival fibroblasts embedded in a collagen matrix overlaid with gingival epithelial cells had a synergistic effect with respect to the secretion of IL-6 and IL-8 in response to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation compared to fibroblasts and epithelial cells individually. The 3D co-culture model was stimulated with noncytotoxic concentrations of: i) hBD-3 (10 and 20 μM) ...(Complete abstract electronic access below) / Doutor

Orientador: Noeme Sousa Rocha / Banca: Hélio Amante Miot / Banca: Bruno Cogliati / Resumo: O melanoma é uma das neoplasias cutâneas mais comumente diagnosticadas no homem e nos cães. O microambiente tumoral é composto pelas células neoplásicas e células estromais interagindo constantemente para garantir a progressão tumoral. Os fibroblastos associados ao câncer (FAC) representam uma população heterogênea de células caracterizadas pela expressão de diversos marcadores incluindo a proteína α-SMA e S100A4. Acredita-se que estas células originem-se de diversas fontes incluindo a transição endotelial fibroblástica. Neste trabalho, quantificamos a imunoexpressão da prpteína S100A4 nos fibroblastos associados ao câncer em melanomas cutâneos caninos, verificamos a potencial contribuição das células endoteliais na gênese desta população e correlacionamos os achados com parâmetros patológicos, incluindo a microdensidade vascular. Quarenta e oito casos de melanoma dermais caninos (21 epitelióides, 14 fusiformes e 13 mistos) previamente categorizados nos níveis de Clark 4, 5 e até 4 foram submetidos a imunofluorescência dupla utilizando os anticorpos primários α-SMA, fator de Von Willebrand (vWF) e S100A4 objetivando-se caracterizar os fibroblastos associados ao câncer e a contribuição da transição endotelial mesenquimal. Os melanomas não pigmentados foram caracterizados pela imunoistoquímica utilizando-se os anticorpos vimentina, pancitoqueratina, S100 e Melan A. A densidade microvascular foi analisada utilizando-se a técnica de imunofluorescência e o anticorpo primário anti-fator de Von Willebrand. O cálculo do número de vasos foi realizado selecionando-se cinco campos microscópicos de 200x contendo o maior número de vasos. O percentul de expressão da proteína S100A4 foi calculado através da técnica de segmentação de conglomerados de cor. Apenas um caso demonstrou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Skin melanoma is one of the most common skin neoplasm seen in humans and dogs. Tumor microenvironment is composed by cancer cells and stromal cells that interacts to guarantee tumor progression. Cancer associated fibroblasts (CAF) represents a heterogeneous cell population characterized by expression of several markers including α-SMA and S100A4 proteins. These cells are thought to derive from different sources including endothelial-to-fibroblast transition. Here we characterize CAF in canine skin melanomas, verify the potential contribution of the endothelial cells to this population and correlate findings to pathological parameters, including microvascular density (MVD). Forth-eight cases of canine dermal melanomas (21 epithelioid, 14 spindle and 13 mixed) classified under Clark's level 4 and 5 were submitted to a double immunofluorescence assay using primary antibodies α-SMA, Von Willebrand Factor (vWF) and S100A4 in order to characterize cancer associated fibroblasts and verify the contribution of endothelial to fibroblast transition. Non-pigmented samples were characterized by immunohistochemistry using primary antibodies pan-cytokeratin, vimentin, S100 and Melan A. Microvascular density was evaluated by immunofluorescent assay using vWF and by calculating total number of vessels in five 200x fields ("hotspots").S100A4 imunoexpression was calculated using K-means clustering segmentation method. Only one case showed α-SMA and vWF co-expression restricted to myofibroblasts in tumor stroma. The cells were predominantly peritumoral and periadnexal. S100A4 expression was significantly different among three histotypes with mixed melanomas displaying lesser percentage of positive cells. Some neoplastic cells mainly in spindle cell melanomas were also positive for S100A4. There were no significant differences between MVD/histotypes... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introdução: A artrite reumatoide é caracterizada pela invasão de fibroblastos sinoviais no interior da cartilagem e pela erosão do osso ocasionando uma progressiva destruição da articulação. A invasão de fibroblastos in vitro é correlacionada com o dano articular na AR, entretanto pouco é sabido sobre esta regulação. O peptídeo liberador da gastrina (GRP) é um homólogo funcional da bombesina e sua sinalização através de seu receptor está envolvida em diversas funções, incluindo a resposta inflamatória. O GRP e seu receptor (GRPR) têm sido encontrados na membrana sinovial e no fluído de pacientes com AR, mas o envolvimento dos mesmos na AR não está completamente elucidado. Em paralelo, estudos tem mostrado que a sinalização GRP/GRPR está relacionada com a sinalização PI3K/AKT. Esta última, é uma via de sinalização que apresenta um papel chave em diversos processos celulares, como proliferação, migração e invasão celular. O RC-3095 é um antagonista do GRPR. Objetivo: Avaliar o envolvimento do GRP e do GRPR no comportamento invasivo dos FLS de camundongo com artrite, bem como o envolvimento do GRP na sinalização da via PI3K/AKT Métodos: FLS foram isolados das articulações de camundongos com artrite induzida por colágeno. A expressão de GRPR foi investigada por imunocitoquímica e por western blot. A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de sulforodamina B após o tratamento dos FLS com GRP e/ou RC-3095 (antagonista do GRP), e/ou Ly294002 (inibidor da via PI3K/AKT) e a capacidade invasora dessas células após o tratamento com GRP, RC-3095 ou Ly249002 foi avaliada utilizando um ensaio de invasão em matrigel. A fosforilação da AKT foi analisada através de western blot. Resultados: A proteína GRPR foi detectada por imunocitoquímica e western blot. A exposição ao GRP aumentou cerca de duas vezes a invasão comparado com células não tratadas (p<0,05), enquanto que o RC-3095 reverteu este efeito (p<0,001). O GRP também aumentou a expressão de AKT fosforilada. Por fim, quando adicionado Ly294002 com GRP, o mesmo preveniu o aumento da invasão induzida por GRP (p<0.001). Conclusão: Esta é a primeira vez que a expressão de GRPR está sendo demonstrado nos FLS. Além disso, este trabalho sugere que o GRP aumenta o comportamento invasor dos FLS. Este efeito ocorre em parte através da ativação da AKT. Entretanto, mais estudos devem ser realizados sobre a via GRP/GRPR, já que a mesma pode ser relevante para o desenvolvimento de terapias cujo alvo são os FLS. / Introduction: Rheumatoid Arthritis (RA) is characterized by invasion of fibroblast-like synoviocytes (FLS) into de articular cartilage and by bone erosion leading to progressive joint destruction. FLS in vitro invasiveness correlates with articular damage in RA, yet little is known about this regulation. Gastrin-releasing peptide (GRP) is a functional homologue of bombesin, and its receptor signaling is involved in several functions, including the inflammatory response. GRP and its receptor (GRPR) have been found in synovial membrane and fluid of RA patient, but their involvement with RA is not completely elucidated. In parallel, studies have shown that GRP/GRPR is related with PI3K/AKT signaling. This pathway plays a key role in multiple cellular processes such as cell proliferation, migration and invasion. RC-3095 is an antagonist of GRPR. Objective: To examine the role of gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptor (GRPR) on the invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes (FLS) from arthritic mice, as well as to evaluate GRP-induced signaling on PI3K/AKT pathway Methods: FLS were isolated from the joints of mice with collagen-induced arthritis (CIA). Expression of GRPR in FLS was investigated by immunocytochemistry and western blot (WB). FLS treated with GRP and/or RC-3095 (GRP antagonist), and/or Ly294002 (inhibitor of PI3K/AKT pathway) were assessed for proliferation by sulforhodamine B assay over a three-day period, and for invasion using a Matrigel-coated transwell system over 24 hours. Akt phosphorylation was assessed by WB. Results: GRPR protein was detected in FLS by immunocytochemistry and WB. Exposure to GRP increased FLS invasion by nearly two-fold, compared with untreated cells (p<0.05), while RC-3095 reversed that effect (p<0.001). GRP also increased phosphorylated AKT expression in FLS. When Ly294002 was added with GRP, it prevented the GRP-induced increased cell invasiveness (p<0.001). Conclusion: GRPR was expressed on FLS and mediates the GRP-induced increased invasiveness. This effect occurs at least in part through the AKT activation. Further understanding of the GRP/GRPR pathway could be relevant in the development of FLS-targeted therapy for RA.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-06-04T12:50:56Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Giuliana Thaíse Araújo da Silva - 2018.pdf: 1677560 bytes, checksum: fe8891f1722a8a10846220a3a8f2a5e9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-04T13:54:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Giuliana Thaíse Araújo da Silva - 2018.pdf: 1677560 bytes, checksum: fe8891f1722a8a10846220a3a8f2a5e9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-04T13:54:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Giuliana Thaíse Araújo da Silva - 2018.pdf: 1677560 bytes, checksum: fe8891f1722a8a10846220a3a8f2a5e9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-05-03 / The Light Emitting Diode (LED) is a semiconductor device that emits light source and can be used as a tissue modeler by means of the transformation of received photons. Photobiomodulation therapy (PBMT) is a specific term for the therapeutic application of light and acts as therapy, analgesia and anti-inflammatory. The objective of this work was to verify the effectiveness of LED at fixed time in the stimulation of fibroblasts. For this purpose, the L929 cell line submitted to LED irradiation (630 nm) was used, in triplicate, at the potency of 50, 75 and 100 mW, for five seconds and compared with non-irradiated control group. Next, cell viability, proliferation, nitric oxide production and collagen synthesis were observed. The results revealed that there was no cytotoxicity after 24, 48 and 72 hours of irradiation; there was an increase in the production of nitrite between the group of 72 hours and the other experimental groups and increase in the synthesis of collagen, directly proportional to the potencies used. Thus the irradiation allowed the fibroblastic stimulation with increased activity in the healing process. / O Diodo Emissor de Luz (Light Emissor Diode - LED) é um dispositivo semicondutor que emite fonte de luz e pode ser usado como modelador tecidual por meio da transformação de fótons recebidos. A fotobiomodulação (Photobiomodulation therapy - PBMT) é um termo específico para aplicação terapêutica da luz e atua como analgesia e anti-inflamatório. O objetivo deste trabalho foi de verificar a efetividade do LED em tempo fixo na estimulação de fibroblastos. Para tanto, utilizou-se a linhagem celular L929 submetida à irradiação LED (630 nm), em triplicata, nas potências de 50, 75 e 100 mW, por cinco segundos e comparou-se com grupo controle não irradiado. Em seguida, observou-se a viabilidade celular, proliferação, produção de óxido nítrico e síntese de colágeno. Os resultados revelaram que não houve citotoxicidade após 24, 48 e 72 horas de irradiação; houve aumento na produção de nitrito entre o grupo de 72 horas e os outros grupos experimentais e aumento na síntese de colágeno, diretamente proporcionais às potências utilizadas. Assim a irradiação possibilitou a estimulação fibroblástica com aumento de sua atividade no processo de cicatrização.

A polpa dental é formada de tecido conjuntivo frouxo sendo constituída por diversas células, dentre as quais os fibroblastos são as mais numerosas. Ao serem submetidas a agressões diversas, estas células respondem com a liberação de substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no processo inflamatório. Assim sendo, este trabalho teve como proposição: 1. avaliar a capacidade de fibroblastos de polpa dental humana em cultura em produzirem as quimiocinas MIP-l\'alfa\' /CCL3 e SDF-1/CXCL12; 2. avaliar a produção destas quimiocinas pelos fibroblastos quando estimulados por Enterococcus faecalis morto por calor com relação à quantidade de bactérias por célula e 3. avaliar a liberação destas quimiocinas com relação ao tempo de estímulo. Para o estabelecimento das culturas, foi coletada a polpa de terceiro molar hígido de um paciente saudável. O tecido foi extraído, armazenado e picotado em meio de cultura para fibroblastos (DMEM), os quais foram utilizados a partir da quarta passagem. Após adesão das células a placas de 24 poços, o meio de cultura contendo Enterococcus .faecalis morto por calor numa concentração correspondente a 1, 10 e 100 bactérias por fibroblasto foi adicionado aos poços. Após 1, 6 e 24 horas, o sobrenadante das células foi coletado para a análise por ELISA. A análise estatística foi realizada aplicando-se o teste Kruskal-Wallis com nível de significância de 5%. A produção de MIP-l\'alfa\' /CCL3 e SDF-l/CXCL12 pelas células pôde ser detectada por ELISA. Os fibroblastos pulpares se mostraram capazes de produzir SDF-1 constitutivamente sendo que o estímulo bacteriano levou a uma diminuição estatisticamente significativa desta produção. A produção de MIP-l\'alfa\' também foi detectada tanto de maneira constitutiva como em resposta ao desafio microbiano. Enquanto a concentração intermediária de bactéria por fibroblasto (10:1) mostrou uma produção semelhante ao grupo controle, as concentrações de 1 e 100 bactérias por fibroblasto induziram aumento maior na primeira hora de estímulo. Essas diferenças, entretanto, não foram estatisticamente significativas. A capacidade dos fibroblastos secretarem quimiocinas, como MIP-l\'alfa\' e SDF-1, reforça a importância dessas células dentro do contexto de imunidade e inflamação pulpar, principalmente por serem as células mais numerosas deste microambiente. / Dental pulp is a connective tissue structure constituted by many different cell types. Among them, the fibroblasts are the most frequent ones. When challenged by different aggressive agents, these cells are able to release some substances like cytokines and chemokines, which are essential to trigger the inflammatory process. The aims of this study were: 1. to evaluate the ability of fibroblasts to produce the chemokines MIP-l\'alfa\'/CCL3) and SDF-1/CXCL12; 2. to evaluate the expression of these chemokines by fibroblasts when challenged by heat killed Enterococcus. faecalis in gradual concentrations and 3. to evaluate the production of these chemokines in a time course manner. The dental pulp from non-carious third molar was collected from a healthy patient. Explants were made and stocked in culture medium (DMEM) for fibroblasts growth. The cells were used since passage four. In a 24-well plate and after reaching confluence, culture medium alone or containing heat killed E. faecalis at proportion 1:1, 10:1 and 100:1 bacteria:fibroblast, were added to the fibroblasts. After 1, 6 and 24 hours, the supernatants were collected for analysis. The protein detection of MIP-l\'alfa\'/CCL3 and SDF-1/CXCL12 was performed by ELISA. For statistical analysis, data were assessed by Kruskal-Wallis followed by Miller post-test. Significance levels of 5% were adopted. Production of both chemokines was detected by ELISA. Pulp fibroblasts were able to produce SDF-1 constitutively. This production decreased with the increase in the number of heat killed E. faecalis increased (p < 0.05). Production of MIP-l\'alfa\' was detected in unchallenged and challenged cells. The median bacterial concentration (10:1) presented a profile production similar to that of unstimulated cells. Bacterial concentrations of 1 and 100 microrganisms/cell showed a highly enhanced production of MIP-l\'alfa\' at the first hour of stimulum; however, these data were not statistically significant (p > 0.05). Fibroblasts ability to produce chemokines, like MIP-l\'alfa\' and SDF-1, confirms their importance at immune and inflammatory events in dental pulp, specially being fibroblasts the most abundant cells at this microenvironment .

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células no contráctiles presentes en el miocardio. Su función principal es preservar la estructura y el buen funcionamiento cardiaco, lo cual se realiza a través de la síntesis y secreción de componentes de la matriz extracelular. Después de un daño tisular, los fibroblastos cardiacos son células claves, del proceso reparativo y de cicatrización. Si este proceso se exacerba, se llega a fibrosis cardiaca rigidizando el corazón e incrementando el riesgo de arritmias, alterando fuertemente la función cardiaca. En este sentido, se ha demostrado que el aumento de AMPc, contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración, secreción de colágeno y la diferenciación celular. En fibroblastos cardiacos se ha descrito que isoproterenol, un agonista de los receptores β-adrenérgicos, actúa vía Gs y estimula la producción de AMPc. Por otro lado, BK agonista del receptor B2 de cininas, activa su receptor vía Gq, y por sí mismo, no altera la producción de AMPc. Sin embargo, BK en combinación con isoproterenol potencia la respuesta adrenérgica aumentando de manera sinérgica la producción de AMPc en relación a la activación solo por isoproterenol. El objetivo de este trabajo fue estudiar in vitro, en cultivos primaros de fibroblastos cardiacos de ratas neonatas, el cross-talk entre las vías de señalización Gs-Gq y determinar si el aumento en los niveles de AMPc modula la adhesión, migración, síntesis de colágeno y diferenciación en fibroblastos cardiacos. BK tiene un efecto sinérgico en los niveles de AMPc aumentados por isoproterenol. Del mismo modo, BK potencia la adhesión de fibroblastos cardiacos estimulada por Isoproterenol; sin embargo, BK no tiene efectos sobre la migración en los fibroblastos cardiacos inducida por isoproterenol. Por otro lado, BK e isoproterenol por separado disminuyen la síntesis de colágeno; sin embargo, la administración conjunta de ISO+BK induce una mayor disminución de la síntesis. El efecto sinérgico de BK sobre el aumento de AMPc inducido por ISO potencia la inhibición de la diferenciación celular de fibroblasto a miofibroblasto estimulada por TGF-β1. Finalmente, determinamos que el efecto sinérgico de BK sobre la señalización de ISO es gatillada vía Gq-PLC-CaMK-II, conduciendo al aumento sinérgico en la producción de AMPc / Cardiac fibroblasts are the major non-contractile cells present in the myocardium. Its main function is to preserve the structure and the proper functioning of the heart, which is done through the synthesis and secretion of extracellular matrix components. After tissue injury, cardiac fibroblasts are key cells of the reparative process and healing. If this process is exacerbated cardiac fibrosis is reached, stiffening the heart and increasing the risk of arrhythmia, altering strongly the heart function In this regard, it has been shown that the increase of cAMP, helps to reduce the degree of cardiac fibrosis, by regulating processes such as adhesion, migration, collagen secretion and cell differentiation. In cardiac fibroblasts has been reported that isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, acts via Gs and stimulates the production of cAMP. On the other hand, BK an agonist of B2 kinin receptor, activates its receptor Gq, and by itself does not alter cAMP production. However, in combination with isoproterenol enhances the adrenergic response, increasing the levels of cAMP in a synergistic manner, in relation to activation by isoproterenol alone. The aim of this work was to study in vitro, in cultured of neonatal rat cardiac fibroblasts, the cross-talk between signaling pathways Gs-Gq and determine if the increase in cAMP modulates adhesion, migration, collagen secretion and differentiation in cardiac fibroblasts. BK has a synergistic effect on cAMP levels increased by isoproterenol. Similarly, BK enhances the adhesion of cardiac fibroblasts stimulated by isoproterenol, but BK has no effect on migration in cardiac fibroblasts induced by isoproterenol. Furthermore, BK and isoproterenol separately decrease collagen synthesis, but the co-administration of ISO+ BK induces a greater decrease in the synthesis. The synergistic effect of BK in the cAMP levels induced by ISO, showed inhibit the cellular differentiation of fibroblasts into myofibroblasts stimulated by TGF-β1 Finally, we determined that the synergistic effect of BK on ISO signaling is triggered via Gq-PLC-CaMK-II, leading to the synergistic increase in cAMP production

Tesis para optar el titulo de Doctor en Farmacología / Se ha propuesto el empleo de factores solubles derivados de plaquetas con el objeto de promover la reparación de tejidos. A pesar que diversos estudios han evaluado la respuesta de células gingivales y periodontales a fracciones derivadas de plaquetas, existe un fuerte debate acerca de los efectos ejercidos por estos factores sobre respuestas celulares relacionadas con la reparación tisular. En la presente tesis hemos evaluado la respuesta de cultivos primarios de fibroblastos gingivales de origen humano (FG) estimulados con Plasma rico (PRP) y pobre en plaquetas (PPP). Se evaluaron diferentes respuestas celulares que incluyen la contracción de geles de colágeno, migración celular, diferenciación miofibroblástica, producción de moléculas de matriz extracelular (MEC) y de enzimas proteolíticas. Para la contracción de geles se utilizaron cultivos tridimensionales de fibroblastos incorporados en colágeno en presencia de inhibidores de mateloproteasas de matriz y de la polimerización de actina. La producción de moléculas de matriz y de proteasas fue evaluada mediante Western-blot. La actividad de la GTPasa RhoA fue evaluada mediante un ensayo de “pull-down”. La distribución de actina y de contactos focales fue analizada mediante inmunofluorescencia. Los niveles de TGF-beta1 fueron cuantificados mediante ELISA. Tanto el PRP como PPP estimularon la contracción de geles de colágeno, proceso que fue revertido por los inhibidores de MMPs y de la polimerización de actina. PRP y PPP estimularon los niveles de MT1-MMP y TIMP-2, la activación de RhoA y la remodelación del citoesqueleto de actina. Ambas formulaciones estimularon la migración celular evaluado mediante tres ensayos funcionales tales como la migración desde explantes de tejido gingival, la migración en nido y en sistemas bi-camerales. PRP y PPP estimularon la diferenciación miofibroblástica, medida a través de la producción de α-SMA, Fibronectina EDA, colágeno tipo I y periostina. A pesar que TGF-beta1 se encontró más concentrado en PRP en comparación con PPP, la via de señalización Smad fue similarmente activada por ambos preparados. El presente estudio muestra que los factores solubles derivados de PRP y PPP pueden ejercer respuestas celulares similares compatibles con la promoción de la reparación tisular gingival. Más aun, estos resultados sugieren que PPP podría tener una acción terapéutica que debería ser estudiada en el futuro. / Platelet derived soluble factors have been proposed as a therapeutic agent to promote tissue repair. Although several studies have assessed the response of gingival and periodontal cells to platelet derived fractions, there still strong debate about the specific role played by these agents on cell responses involved in wound healing. In the present thesis we have evaluated the response of primary cultures of human gingival fibroblasts (GF) stimulated with Platelet rich (PRP) and poor plasma (PPP). Different cells responses including collagen matrix contraction, cell migration, myofibroblastic differentiation, production of matrix molecules and proteolytic enzymes were evaluated. Collagen matrix contraction was assessed using fibroblasts-populated collagen lattices in the presence of matrix metalloproteinases and actin polymerization inhibitors. Production of matrix molecules and proteinases was assessed through Western-blot. RhoA activity was evaluated by means of a pull-down assay. Actin distribution and focal adhesions were assessed through immunofluorescence. TGF-beta1 levels were quantified through ELISA. Both PRP and PPP stimulated gingival fibroblasts-populated collagen gel contraction. Moreover, Ilomastat and cytochalasin D inhibited this response. PRP and PPP stimulated MT1-MMP and TIMP-2 production, RhoA activation and actin cytoskeleton remodeling. Both formulations stimulated cell migration as assessed through gingival tissue explants immersed within collagen gels, nested cell migration assays and Transwell migration experiments. PRP and PPP stimulated myofibroblastic differentiation determined through α-SMA, EDAFN, type I collagen and periostin production. Although TGF-beta1 was more concentrated in PRP when compared to PPP, the Smad pathway was similarly activated by both formulations. The present study shows that soluble factors derived from PRP and PPP may exert a similar cellular response compatible with the promotion of wound remodeling in gingival fibroblasts. Moreover, our results suggest that PPP may be studied as a useful therapeutic agent to modulate gingival tissue healing.