Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / The aim of this study were to evaluate the effect of different concentrations of Concanavalin A (Con A) and FSH on activation, and survival in vitro growth of goat primordial follicles, as well as investigating the effects of Con A and FSH on the expression of mRNA for PCNA, KL, c-Kit, BMP-15 and GDF-9. For this, ovarian cortex fragments were in vitro cultured for 1 to 6 days in &#945;-MEM+ supplemented with 0, 5, 10, 20 or 40 &#956;g/mL of Con A lectin (experiment 1). At the end of the growing period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Next, we evaluated the percentage of primordial follicles or under development. After determination of the concentration of Con A more efficient (10 &#956;g/mL), fragments of ovarian cortex were cultured in situ for 6 days in &#945;-MEM+ alone or supplemented with 50 ng/mL of FSH, 10 &#956;g/mL of Con A or both (experiment 2). Tissues from the control uncultured or after culture in different treatments were fixed for histology or stored at -80ÂC to assess the expression profile of mRNA for PCNA, KL, c-Kit, BMP-15 and GDF-9. The results of Experiment 1 demonstrated that after 6 days of culture, the percentage of developing follicles was significantly higher in samples cultured with &#945;-MEM+ supplemented with 10 and 40 &#956;g/mL Con A, when compared to the other treatments (P <0.05). In experiment 2, the presence of FSH, or both Con A promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase developing follicles compared to control medium (&#945;-MEM+). After 6 days of culture, the presence of FSH promoted an increase in mRNA levels for PCNA, but this effect was blocked by Con A. Moreover, the Con A increased mRNA levels for c-KIT compared to the control not grown, but Con A or Con A and FSH both reduced the levels of mRNA for KL. Furthermore, a reduction of BMP-15 mRNA was observed in follicles cultured in control medium, but the presence of FSH inhibited this reduction. Furthermore, Con A promoted an increase in levels of GDF-9 mRNA after in vitro culture. In conclusion, the Con A alone or in combination with FSH promote activation of primordial follicles goat after 6 days of in vitro culture and regulate the expression of mRNA for PCNA, KL, c-Kit, BMP-15 and GDF-9 / Os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito de diferentes concentraÃÃes de Concanavalina A (Con A) e do FSH sobre a ativaÃÃo, sobrevivÃncia e crescimento in vitro de folÃculos primordiais caprinos, bem como investigar os efeitos da Con A e do FSH sobre a expressÃo de RNAm para PCNA, KL, c-Kit, BMP-15 e GDF-9. Para isto, fragmentos de cÃrtex ovariano foram cultivados in vitro por 1 ou 6 dias em &#945;-MEM+ suplementado com 0, 5, 10, 20 ou 40 &#956;g/mL da lectina Con A (experimento 1). No final do perÃodo de cultivo, os fragmentos de cÃrtex ovariano foram fixados para histologia clÃssica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folÃculos primordiais ou em desenvolvimento. ApÃs a determinaÃÃo da concentraÃÃo de Con A mais eficiente (10 &#956;g/mL), os fragmentos do cÃrtex ovariano foram cultivados in situ por 6 dias em &#945;-MEM+ sozinho ou suplementado com 50 ng/mL de FSH, 10 &#956;g/mL de Con A ou ambos (experimento 2). Os tecidos provenientes do controle nÃo cultivado ou apÃs cultivo nos diferentes tratamentos foram fixados para histologia clÃssica ou armazenados a -800C para avaliar o perfil de expressÃo de RNAs mensageiros para PCNA, KL, c-Kit, BMP-15 e GDF-9. Os resultados do experimento 1 demonstraram que apÃs 6 dias de cultivo, a percentagem de folÃculos em desenvolvimento foi significativamente maior nos fragmentos cultivados com &#945;-MEM+ suplementado com 10 e 40 &#956;g/mL de Con A, quando comparado aos demais tratamentos (P <0,05). No experimento 2, a presenÃa de FSH, Con A ou ambos promoveram uma reduÃÃo na percentagem de folÃculos primordiais e aumento de folÃculos em desenvolvimento em relaÃÃo ao meio controle (&#945;-MEM+). ApÃs 6 dias de cultivo, a presenÃa de FSH promoveu um aumento nos nÃveis de RNAm para PCNA, mas este efeito foi bloqueado pela Con A. Por outro lado, a Con A aumentou os nÃveis de RNAm para c-kit em comparaÃÃo ao controle nÃo cultivado, mas Con-A ou ambos Con A e FSH reduziram os nÃveis de RNAm para KL. AlÃm disso, uma reduÃÃo dos RNAm para BMP-15 foi observado em folÃculos cultivados no meio controle, mas a presenÃa de FSH inibiu esta reduÃÃo. AlÃm disso, a Con A promoveu um aumento nos nÃveis de RNAm para GDF-9 apÃs cultivo in vitro. Em conclusÃo, a Con A sozinha ou em combinaÃÃo com FSH promovem a ativaÃÃo de folÃculos primordiais caprinos apÃs 6 dias de cultivo in vitro e regulam a expressÃo de RNAm para PCNA, KL, c-Kit, BMP-15 e GDF-9.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referÃncia e a expressÃo das proteÃnas morfogenÃticas Ãsseas (BMP-2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e seus mensageiros intracelulares (SMADs-1, 5 e 8) em folÃculos caprinos antes e apÃs cultivo por 18 dias. Para avaliar a estabilidade dos genes de referÃncia e o nÃvel de expressÃo das BMPs, receptores e SMADs, folÃculos com aproximadamente 0,2, 0,5 e 1 mm foram isolados mecanicamente de ovÃrios caprinos. AlÃm disso, folÃculos com aproximadamente 0,2 mm foram isolados e cultivados por 18 dias em meio de cultura suplementado com FSH. ApÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese de cDNA, foi realizada a quantificaÃÃo do RNAm, por PCR em tempo real, utilizando-se primers especÃficos para genes de referÃncia (&#946;-actina, PGK, GAPDH, &#946;-tubulina, UBQ, RPL-19, rRNA18S), e para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15) receptores de BMPs (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8). Os resultados mostraram que &#946;-tubulina e PGK sÃo os genes de referÃncia mais estÃveis em folÃculos frescos prÃ-antrais e antrais caprinos. Os RNAs mensageiros para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8) sÃo expressos em diferentes nÃveis em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos, sendo que a expressÃo do RNAm para BMP-4, BMP-6 e BMP-7 em folÃculos de 1 mm sÃo significativamente maiores do que em folÃculos de 0,2 e 0,5 mm. Entretanto, os nÃveis de RNAm para BMP-2 foi reduzido em folÃculos de 1 mm, jà os nÃveis de BMP-15 nÃo diferiram entre as categorias foliculares analisadas. Os nÃveis de RNAm para BMPR-IB foram maiores em folÃculos de 0,2 mm do que em folÃculos de 0,5 e 1 mm, enquanto que o RNAm para BMPR-II foi significativamente maior em folÃculos de 0,5 mm do que em folÃculos de 0,2 e 1 mm. Por outro lado, nÃveis de RNAm para BMPR-1A nÃo diferiram entre folÃculos analisados. Os nÃveis de RNAm para SMAD-5 foram significativamente maiores em folÃculos de 0,2 mm do que em folÃculos de 0,5 e 1 mm. Contudo, folÃculos de 0,5 mm mostraram nÃveis maiores de RNAm para SMAD-8 do que folÃculos de 0,2 e 1 mm. Os nÃveis de RNAm para SMAD-1 nÃo diferiram entre os folÃculos. ApÃs as comparaÃÃes dentro de cada categoria folÃcular, BMP-15 foi mais expressa do que BMP-7 em folÃculos de 0,2 e 0,5 mm. Em folÃculos de 0,5 mm a expressÃo do BMPR-IB foi maior do que BMPR-II. Em todas as trÃs categorias foliculares estudadas, a expressÃo da SMAD-5 foi superior a SMAD-8. ApÃs o cultivo, os folÃculos apresentaram reduÃÃo dos nÃveis de RNAm para BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA e SMAD-5. Em conclusÃo, &#946;-tubulina e PGK sÃo os dois genes housekeeping mais estÃveis para folÃculos frescos caprinos com 0,2, 0,5 e 1 mm de diÃmetro. BMPs, seus receptores e SMADs apresentam padrÃes de expressÃo especÃficos em cada categoria folicular estudada. No entanto, em folÃculos cultivados hà uma variaÃÃo na expressÃo dos componentes do sistema BMP, diferindo da expressÃo in vivo de folÃculos com o mesmo tamanho. / The aims this study to evaluate the stability of reference genes and the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and intracellular messengers (SMADs- 1, 5 and 8) in goat follicles before and after culture for 18 days. To evaluate the stability of reference genes and the expression of BMPs, receptors and SMADs, follicles of approximately 0.2, 0.5 and 1 mm were mechanically isolated from goats ovaries. In addition, approximately 0.2 mm follicles were isolated and cultured for 18 days in culture medium supplemented with FSH. Both fresh and cultured follicles were subjected to total RNA extraction and synthesis of cDNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, &#946;-tubulin, &#946;-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S) and BMPs (2, 4, 6, 7 and 15) receptors of BMPs (BMPR-IA, IB and II) and SMADs (1, 5 and 8). Results showed that &#946;-tubulin and PGK are the most stable reference genes in goats preantral and antral follicles. The messengers RNA for BMP (2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and Smads (1, 5 and 8) are expressed at different levels in preantral and antral goats, and mRNA expression for BMP-4, BMP-6 and BMP-7 in 1-mm follicles are significantly higher than in follicles of 0.2 and 0.5 mm. However, the levels of mRNA for BMP-2 were reduced in follicles 1 mm, as BMP-15 did not differ between follicular categories. The levels of mRNA for BMPR-IB were higher in follicles of 0.2 mm than in follicles of 0.5 and 1 mm, whereas the mRNA for BMPR-II was significantly higher in follicles than 0.5 mm in follicles of 0.2 to 1 mm. Moreover, mRNA levels for BMPR-1A did not differ between follicles examined. The levels of mRNA for SMAD-5 were significantly higher in 0.2 mm follicles than in follicles of 0.5 and 1 mm. However, follicles of 0.5 mm showed higher levels of mRNA for SMAD-8 than follicles 0.2 and 1 mm. The levels of mRNA for SMAD-1 did not differ between follicles. After the comparisons within each category follicle, BMP-15 expression was higher than BMP-7 in follicles between 0.2 and 0.5 mm. Follicles 0.5 mm in the expression of BMPR-IB was greater than BMPR-II. In all three follicular categories studied, the expression of SMAD-5 was superior to SMAD-8. After culture, follicles showed reduced levels of mRNA for BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA and SMAD-5. In conclusion, &#946;-tubulin and PGK genes are the two most stable housekeeping for fresh goat follicles 0.2, 0.5 to 1 mm in diameter. BMPs, their receptors and SMADs have specific expression patterns in each category follicular studied. However, in cultured follicles showed a variation in the variation in the expression of BMP system components, differing from in vivo expression of follicles with the same size.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentraÃÃes de jacalina e da interaÃÃo de jacalina e FSH sobre a sobrevivÃncia, ativaÃÃo e expressÃo gÃnica em folÃculos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do cÃrtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial MÃnimo (MEM) suplementado com diferentes concentraÃÃes de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 &#956;g/mL - experimento I), por um e seis dias. ApÃs o tÃrmino do perÃodo de cultivo, os fragmentos de cÃrtex ovariano foram fixados para histologia clÃssica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folÃculos primordiais ou em desenvolvimento no controle nÃo cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. ApÃs a determinaÃÃo da concentraÃÃo de jacalina mais eficiente (50 &#956;g/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de cÃrtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 &#956;g/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). ApÃs 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clÃssica. AlÃm disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressÃo de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folÃculos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que apÃs seis dias de cultivo, a presenÃa de 50 &#956;g/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folÃculos morfologicamente normais, bem como uma reduÃÃo da percentagem de folÃculos primordiais e aumento de folÃculos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativaÃÃo dos folÃculos e contribuem para a manutenÃÃo da viabilidade, mas nÃo foi observada uma interaÃÃo positiva entres essas duas substÃncias. A expressÃo de RNAm para a BMP-15 e KL apÃs o cultivo in vitro de fragmentos de ovÃrio nos diferentes tratamentos por 6 dias nÃo foi alterada. No entanto, a presenÃa de FSH aumentou os nÃveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressÃo reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusÃo, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais caprinos apÃs 6 dias de cultivo. A presenÃa de FSH aumentou a expressÃo do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presenÃa da jacalina reduziu a expressÃo do GDF-9. / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 &#956;g/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 &#956;g/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 &#956;g/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da artrite encefalite caprina (CAE) sobre a expressÃo de BMP-15, BMPR-IB e GDF-9 em folÃculos ovarianos, bem como os efeitos de fitohemaglutinina (PHA) e EGF na sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais, e na expressÃo de genes para o sistema de TNF-&#945; no tecido ovariano cultivado caprino. Os nÃveis de BMP-15, BMPR-IB e GDF-9 em folÃculos primordiais/primÃrios e secundÃrios, bem como em CCOs e parede folicular de folÃculos antrais foram avaliados por PCR em tempo real (experimento 1). Para os estudos in vitro, fragmentos de tecido ovariano foram cultivados por seis dias em &#945;-MEM sozinho ou suplementado com EGF (100ug), PHA (10&#956;g/mL) ou ambos (experimento 2). Antes e depois do cultivo, o tecido ovariano foi processado para anÃlise morfolÃgica ou armazenado para avaliar a expressÃo de RNAm para TNF-&#945; e seus receptores. Os resultados mostraram que a expressÃo de BMP-15 e GDF-9 em folÃculos primordiais/primÃrios de cabras infectadas foram significativamente maiores do que em animais saudÃveis, mas a expressÃo de GDF-9 em folÃculos secundÃrios de cabras infectadas foi significativamente menor. AlÃm disso, a expressÃo de RNAm para BMP-15 na parede folicular de folÃculos antrais de cabras infectadas foi significativamente maior do que em cabras saudÃveis. ApÃs o cultivo dos fragmentos ovarianos em todos os meios testados, observou-se a reduÃÃo nos percentuais de folÃculos primordiais, e aumento de folÃculos em desenvolvimento quando comparado ao grupo controle nÃo cultivado. AlÃm disso, houve um aumento significativo no diÃmetro folicular apÃs cultivo em meio suplementado com EGF. ApÃs o cultivo de tecido ovariano de cabras infectadas em meio suplementado com PHA, os folÃculos primordiais apresentavam diÃmetros maiores do que os de animais saudÃveis. AlÃm disso, observou-se um aumento nos nÃveis de RNAm para TNF-&#945; apÃs cultivo de tecido ovariano na presenÃa de ambos EGF e PHA em animais saudÃveis, mas este mesmo tratamento proporcionou uma reduÃÃo de RNAm para TNF-&#945; e aumento dos transcritos de TNFR-II em animais infectados. Pode-se concluir que a CAE influencia a expressÃo de RNAm para BMP-15 e GDF-9 em folÃculos ovarianos caprinos e a PHA e o EGF diferencialmente regulam a expressÃo de TNF-&#945; e TNFR-II em tecidos ovarianos. / This study aims to investigate the effects of caprine arthritis encephalitis (CAE) on the expression of BMP-15, BMPR-IB and GDF-9 in ovarian follicles, as well as the effects of phytohemagglutinin (PHA) and EGF on the survival and activation of primordial follicles, and on expression of mRNA for TNF-&#945; and its receptors in cultured goat ovarian tissue. The levels of BMP-15, BMPR-IB and GDF-9 in primordial/primary and secondary follicles, as well as in COCs and follicular walls from antral follicles were evacuated by real-time PCR (experiment 1). Ovarian tissues were cultured for six days in &#945;-MEM+ alone or supplemented with EGF (100Âg/mL), PHA (10Âg/mL) or both (experiment 2). Before and after culture, ovarian fragments were processed for morphological analysis or stored to evaluate the expression of mRNA for TNF&#945; and its receptors. The results showed that the expression of BMP-15 and GDF-9 in primordial/primary follicles from infected goats was significantly higher than in health animals, but the expression of GDF-9 in secondary follicles from infected goats was significantly lower. Additionally, the expression of mRNA for BMP-15 in follicular wall of antral follicles from infected goats was significantly higher than in healthy goats. After culturing ovarian fragments in all tested media, reduced percentages of primordial follicles, and increased of developing follicles was observed when compared to uncultured control. Furthermore, there was a significant increase in follicular diameter after culture in medium supplemented with EGF. Ovarian tissue from infected goats cultured in medium supplemented with PHA had primordial follicles with higher diameters than those from healthy animals. An increase in the levels of mRNAs for TNF-&#945; was observed after culturing ovarian tissue in presence of both EGF and PHA in healthy animals, but this same treatment promoted a reduction of mRNAs for TNF-&#945; and and increase of TNFR-II transcripts in infected animals. In conclusion, CAE influences the expression of mRNA for BMP-15 and GDF-9 in goat ovarian follicles and PHA and EGF differentially regulate the expression of TNF&#945; and TNFR-II in cultured ovarian tissue.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho tem como objetivo 1) avaliar o efeito da BMP-15 e do FSH, sozinhos ou em diferentes associaÃÃes sobre o crescimento, sobrevivÃncia e formaÃÃo de antro em folÃculos secundÃrios bovinos e 2) avaliar os nÃveis de expressÃo do RNAm para os receptores de BMP-15 (BMPR-IB e BMPR-II) em folÃculos crescidos in vitro. Com relaÃÃo ao cultivo, folÃculos secundÃrios foram microdissecados e cultivados por doze dias em &#945;-MEM+ sozinho, ou suplementado com BMP-15 e/ou FSH, sozinhos ou em diferentes associaÃÃes. ApÃs o cultivo, foram avaliados o diÃmetro folicular, a viabilidade e a taxa de formaÃÃo de antro. A anÃlise de expressÃo gÃnica foi realizada por PCR em tempo real, utilizando folÃculos cultivados nos diferentes tratamentos, para comparaÃÃes dos nÃveis de RNAm. ApÃs o perÃodo de cultivo verificou-se que a utilizaÃÃo da BMP+FSH (0-12) estimulou um aumento significativo no diÃmetro folicular em relaÃÃo aos demais tratamentos (p<0,05), bem como estimulou a formaÃÃo da cavidade antral de forma mais efetiva que o controle (MEM) e a BMP-15 sozinha (p<0,05). No entanto, em relaÃÃo à sobrevivÃncia, apÃs12 dias o tratamento BMP+FSH (0-12) reduziu significativamente a viabilidade folicular em relaÃÃo aos demais tratamentos (p<0,05). Os resultados mostraram que os nÃveis de RNAm para o receptor de BMP-15 do tipo I (BMPR-IB) foram significativamente maiores nos folÃculos cultivados com MEM quando comparado aos demais tratamentos, enquanto que os nÃveis de RNAm para o receptor do tipo II (BMPR-II) nÃo diferiram entre os tratamentos. Os maiores nÃveis de RNAm para o receptor de FSH foram detectados em folÃculos cultivados com BMP-15 sozinha. Em conclusÃo, este estudo demonstrou que a combinaÃÃo de BMP-15 + FSH durante todo o perÃodo de cultivo (D0-D12) acelera o crescimento de folÃculos prÃ-antrais bovinos cultivados por 12 dias, mas este efeito reduz a viabilidade folicular, afetando a integridade ultra- estrutural dos folÃculos. AlÃm disso, a adiÃÃo de BMP isoladamente aumentou os nÃveis de expressÃo de RNAm para FSHR apÃs 12 dias de cultivo,mostrando que BMP-15 e FSH podem contribuir significativamente para o desenvolvimento in vitro de folÃculos prÃ-antrais cultivados por 12 dias nesta espÃcie. / This study aims to 1) evaluate the effect of BMP-15 and FSH, alone or in different combinations on the in vitro development, survival and antrum formation of bovine secondary follicles and 2) quantify the levels of mRNA expression for BMP-15 receptors (BMPR-IB and BMPR-II), FSH receptor and Kit Ligand in follicles grown in vivo and in vitro. With regard to culture, secondary follicles were microdissected and cultured for twelve days in &#945;- MEM+ alone, or supplemented with BMP-15 and/or FSH, alone or in various associations. After culture, follicular diameter were evaluated, viability and rate of antrum formation. For the analyzes gene expression, by real time PCR, were used follicles cultured in the different treatments for comparisons of the levels of mRNA. After the culture period it was found that the association of BMP+FSH (0-12) stimulated a significant increase in follicular diameter in relation to other treatments (p<0.05), as well as stimulated the formation of antral cavity more effectively the control (MEM) and BMP-15 alone (p<0.05). However, for survival, after 12 days treatment BMP+FSH (0-12) significantly reduced follicular viability when compared to other treatments (p<0.05). The results showed that the levels of mRNA for BMP receptor type I (BMPR-IB) were significantly higher in follicles cultured with MEM when compared to other treatments, while levels of mRNA for the receptor type II (BMPR-II) did not differ between treatments. The highest levels of mRNA for the FSH receptor were detected in follicles cultured with BMP-15 alone. In conclusion, this study demonstrated that combination of BMP-15+FSH (D0-D12) accelerates the growth of bovine preantral follicles cultured for 12 days, but this effect reduces the follicular viability, affecting the ultrastructural integrity of the follicles. Furthermore, the addition of BMP alone increased expression levels of RNAm for FSHR after 12 days of culture , showing that BMP-15 and FSH may contribute significantly to the in vitro development of preantral follicles cultured for 12 days in this specie.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os caprinos sÃo considerados importantes fontes de carne, leite e pele, e, portanto, desempenham importante papel econÃmico especialmente na regiÃo nordeste do Brasil Diante disso, o desenvolvimento de sistemas de cultivo de folÃculos ovarianos pode otimizar potencial reprodutivo desta espÃcie. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da lectin PHA de Phaseolus vulgaris sobre o desenvolvimento de folÃculos ovarianos caprino cultivados in vitro. FolÃculos secundÃrios (~ 0,2mm) foram isolados de cÃrtex ovariano e individualmente cultivados por seis dias em &#945;-MEM+ suplementado com 0, 1, 10, 50, 100 o 200Âg/mL da lectina PHA. Ao final do perÃodo de cultivo, os nÃveis de RNAm para FSH-R PCNA e NOS1 nestes folÃculos foram quantificados por qRT-PCR . Os resultados mostraram que, apÃs o cultivo, todos os tratamentos foram capazes de manter a sobrevivÃncia folicula AlÃm disso, nÃo foram observadas diferenÃas significativas entre os tratamentos e o control no aumento do diÃmetro folicular durante o cultivo. Entretanto, a PHA na concentraÃÃo de 10Âg/mL promove uma maior taxa de formaÃÃo de antro em relaÃÃo ao controle (&#945;-MEM+ Nessa concentraÃÃo houve maior expressÃo dos nÃveis de RNAm para FSH-R e PCNA. Em conclusÃo, a PHA na concentraÃÃo de 10Âg/mL mostrou aÃÃo biolÃgica na formaÃÃo antro estimulou um aumento nos nÃveis de expressÃo de RNAm para FSH-R e PCNA em folÃculo secundÃrios caprinos cultivados in vitro por 6 dias. / Goats are considered important sources of meat, milk and skin, and therefore play an important economic role, especially in northeastern Brazil. Thus, the development of culture systems can optimize the reproductive potential of this species. This study aimed to evaluate the effect of lectin PHA of Phaseolus vulgaris on the development of caprine secondary follicles cultured in vitro. Secondary follicles (~0,2mm) were isolated from the cortex of caprine ovaries and individually cultured for six days in &#945;-MEM+ supplemented with PHA at concentrations of 0, 1, 10, 50, 100 or 200Âg/mL. The levels of mRNA for R-FSH, PCNA and NOS1 in these follicles were also evaluated. The results showed that, after culture, all treatments were capable of maintaining the follicular survival. Moreover, there was no significant difference among all treatments regarding follicular growth. However, PHA at concentrations of 10Âg/mL increased the antrum formation rate when compared with control. In this concentration, there was a higher expression of mRNA for R-FSH and PCNA. In conclusion, PHA at concentration 10Âg/mL showed a biological action in antro formation and stimulated an increase of levels of expression of RNAm in caprine ovarian follicles cultured for six days.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste estudo foi investigar os nÃveis de RNA mensageiro (RNAm) para ativina-A em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos e os efeitos do hormÃnio folÃculo estimulante (FSH), ativina-A e fator de crescimento e diferenciaÃÃo - 9 (GDF-9) sobre o crescimento e a expressÃo de RNAm para ativina-A, GDF-9, proteÃna morfogenÃtica Ãssea (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 e receptor de FSH (R-FSH) em folÃculos prÃ-antrais caprinos cultivados in vitro. Inicialmente, folÃculos primordiais, primÃrios e secundÃrios, bem como complexos cumulus-oÃcito (COCs) e cÃlulas da granulosa mural/teca de pequenos e grandes folÃculos antrais foram isoladas mecanicamente a partir de ovÃrios de cabra e a expressÃo de RNAm para ativina-A foi avaliada por PCR em tempo real. Para os estudos in vitro, folÃculos secundÃrios caprinos foram isolados e cultivados por 6 dias na presenÃa de FSH sozinho (50 ng/mL) ou em combinaÃÃo com ativina-A (100 ng/mL) ou GDF-9 (200 ng/mL). Isoladamente ou em combinaÃÃo com FSH, a influÃncia de ativina-A na expressÃo de ativina-A e R-FSH, e o efeito do GDF-9 sobre os nÃveis de RNAm para GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4 , -6, -7 e -15 em folÃculos secundÃrios apÃs 6 dias de cultivo foram testados. Para isso, apÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese do cDNA, os nÃveis de RNAm para ativina-A, GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4, -6, -7 e -15 foram quantificados por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que folÃculos secundÃrios apresentavam nÃveis menores de RNAm para ativina-A comparado aos folÃculos primÃrios (p<0,05). NÃo houve diferenÃa nos nÃveis de RNAm para ativina-A entre folÃculos primordial e primÃrio ou secundÃrio (p>0,05). Aliado a isso, nÃo houve diferenÃa entre COCs de pequenos e grandes folÃculos antrais (p>0,05). AlÃm disso, as cÃlulas da granulosa e da teca de grandes folÃculos antrais apresentaram maiores nÃveis de RNAm para ativina-A do que de pequenos folÃculos antrais (p<0,05). Quando comparamos a expressÃo do RNAm para ativina-A entre COCs de pequenos e grandes folÃculos antrais e suas cÃlulas da granulosa e da teca, nenhuma diferenÃa nos nÃveis de expressÃo foi observada (p>0,05). ApÃs o cultivo in vitro de folÃculos secundÃrios, a presenÃa de FSH sozinho ou associado com ativina-A ou GDF-9 aumentou a sobrevivÃncia, crescimento folicular e formaÃÃo de antro (p<0,05). O FSH tambÃm aumentou o RNAm para ativina-A, enquanto os folÃculos cultivados com ativina-A apresentaram nÃveis aumentados de RNAm para R-FSH (p<0,05). AlÃm disso, o GDF-9 diminuiu a expressÃo de RNAm para BMP -2 e -15 (p<0,05), mas nÃo teve efeito sobre a expressÃo de BMP -4, -6 e -7 (p>0,05). Em conclusÃo, durante a transiÃÃo de folÃculo primÃrio para secundÃrio hà uma diminuiÃÃo do RNAm para ativina-A, enquanto ocorre um aumento da expressÃo deste fator durante o crescimento de folÃculos antrais. FSH, ativina-A e GDF-9 estimulam o crescimento de folÃculos secundÃrios caprinos apÃs 6 dias de cultivo. ApÃs cultivo folicular, FSH controla a expressÃo de ativina-A e a expressÃo do R-FSH à regulada por ativina-A. Ainda, GDF-9 reduz a expressÃo do RNAm para BMP -2 e -15. / The aim of this study was to investigate the levels of messenger RNA (mRNA) for activin-A on goat preantral and antral follicles and the effects of follicle stimulating hormone (FSH), activin-A and growth and differentiation factor - 9 (GDF-9) on growth and mRNA expression for activin-A, GDF-9, bone morphogenetic protein (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 and FSH receptor (FSH-R) in goat preantral follicles cultured in vitro. Initially, primordial, primary and secondary follicles, as well as cumulus-oocyte complexes (COCs) and mural granulosa/theca cells of small and large antral follicles were isolated mechanically from goat ovaries and the expression of mRNA for activin-A was evaluated by real-time PCR. For in vitro studies, goat secondary follicles were isolated and cultured for 6 days in the presence of FSH alone (50 ng/mL) or in combination with activin-A (100 ng/mL) or GDF-9 (200 ng/mL). Alone or in combination with FSH, the influence of activin-A on expression of activin-A and FSH-R, and the effect of GDF-9 on the levels of mRNA for GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 in secondary follicles after 6 days of culture were tested. For this, after extraction of total RNA and cDNA synthesis, the levels of mRNA for activin-A, GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 were quantified by real time PCR. The results showed that secondary follicles had lower levels of mRNA for activin-A, than compared to primary follicles (p<0.05). There was no difference in levels of mRNA for activin-A between primordial and primary or secondary (p>0.05). Allied to this, there was no difference between COCs of small and large antral follicles (p>0.05). Moreover, granulosa and theca cells of large antral follicles showed higher levels of mRNA for activin-A than in small antral follicles (p<0.05). When comparing mRNA expression for activin-A between COCs from small and large antral follicles and their granulosa and theca cells, no difference in expression levels was observed (p>0.05). After in vitro culture of secondary follicles, the presence of FSH either alone or associated with activin-A or GDF-9 increased survival, follicular growth and antrum formation (p<0.05). The FSH increased mRNA for activin-A, while the follicles cultured with activin-A showed increased levels of mRNA for FSH-R (p<0.05). In addition, GDF-9 decreased mRNA expression for BMP -2 and -15 (p<0.05), but had no effect on expression of BMP -4, -6, and -7 (p>0.05). In conclusion, during the transition from primary to secondary follicles there is a reduction of mRNA for activin-A, whereas there is an increased expression of this factor during the growth of antral follicles. FSH, activin-A and GDF-9 stimulate growth of goat secondary follicles after 6-day culture. After follicle culture FSH controls the expression of activin-A, and the expression of FSH-R is regulated by activin-A. Furthermore, GDF-9 reduces the mRNA expression for BMP-2 and -15.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste estudo foi investigar a expressÃo do sistema interleucina 1 (proteÃnas e RNAm de ligantes e receptores) e sua distribuiÃÃo nos ovÃrios de vacas cÃclicas, bem como avaliar os efeitos da IL-1&#946; na sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais in vitro. Os ovÃrios foram processados para a localizaÃÃo do sistema interleucina 1 em folÃculos prÃ-antrais e antrais utilizando as tÃcnicas de imunohistoquÃmica, qPCR e anÃlise de Western blot. Para os estudos in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados em &#945;-MEM+ suplementado com IL-1&#946; (0, 1, 10, 50 ou 100 ng/mL), e apÃs 6 dias foram processados para anÃlise histolÃgica. Os resultados de imunohistoquÃmica mostraram que a proteÃna para os integrantes do sistema interleucina I (IL-1&#946;, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em diferentes compartimentos foliculares. Infelizmente, o anticorpo testado para localizaÃÃo de IL-1&#945; nÃo reagiu em ovÃrios bovinos. Todas as proteÃnas testadas foram observados no citoplasma dos oÃcitos e nas cÃlulas da granulosa de todas as categorias foliculares, e nas cÃlulas da teca de folÃculos antrais, com a exceÃÃo da IL-1&#945;, que nÃo foi encontrada em nenhuma das cÃlula analisados. Foram observados nÃveis variÃveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. ApÃs 6 dias de cultivo, a presenÃa de IL-1&#946; (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folÃculos normais e de promover a ativaÃÃo dos folÃculos primordiais. Em conclusÃo, os componentes do sistema de interleucina 1 sÃo expressos diferencialmente em cÃlulas ovarianas de acordo com a fase do desenvolvimento folicular. AlÃm disso, a IL-1&#946; promove o desenvolvimento de folÃculos primordiais in vitro. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema interleucina 1 na regulaÃÃo da foliculogÃnese em bovinos. / This study aims to investigate the expression of interleukin 1 system (proteins and mRNA of ligands and receptors) and its distribution in ovaries of cyclic cows, as well as to evaluate the effects of IL-1&#946; on the survival and activation of primordial follicles in vitro. The ovaries were processed for localization of interleukin 1 system in preantral and antral follicles by immunohistochemical, qPCR and western blot analysis. For in vitro studies, ovarian fragments were cultured in &#945;-MEM+ supplemented with IL-1&#946; (0, 1, 10, 50 or 100 ng/mL), and aftes 6 days the tissues cultured were processed for histological analysis. Immunohistochemical results showed that the proteins for interleukin 1 system (IL-1&#946;, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in the various follicular compartments. Unfortunately, IL-1&#945; antibodies tested did not react in bovine ovaries. All the proteins tested were observed in the cytoplasm of oocytes and granulosa cells from all follicular categories, and theca cells of antral follicles, with the exception that IL-1&#945; has not been found in any analyzed cell. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system in the follicular size and classes analysed. After 6 days of culture, the presence of IL-1&#946; (10 or 50 ng/mL) was effective in maintaining the percentage of normal follicles and in promoting primordial follicle activation. In conclusion, interleukin 1 system is differentially expressed in the ovarian cells according to the stage of follicular development. Moreover, IL-1&#946; promotes the development of primordial follicles. These results suggest an important role of the interleukin 1 system in the regulation of folliculogenesis in bovine species.

O objetivo deste estudo foi determinar o papel do GDF-9 sozinho ou em combinaÃÃo com FSH sobre a viabilidade, crescimento e expressÃo do RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, versican e perlecan em folÃculos secundÃrios bovinos cultivados in vitro. Para estudos in vitro, folÃculos secundÃrios bovinos foram isolados e cultivados por doze dias, na presenÃa de MEM sozinho ou suplementado com GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL e de D7-D12: 500 ng/mL) ou ambos. DiÃmetro folicular, viabilidade e formaÃÃo de antro foram avaliados durante o cultivo. Para avaliar os nÃveis de RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, perlecan e versican em folÃculos apÃs 12 dias de cultivo, o RNA total foi extraÃdo e o cDNA foi sintetizado. Os nÃveis de RNAm foram quantificados por PCR em tempo real. O teste Kruskal-Wallis foi usado para comparar o diÃmetro folicular. O teste Qui-quadrado foi utilizado para comparar a porcentagem de viabilidade e formaÃÃo de antro de folÃculos apÃs o cultivo in vitro (p<0,05), enquanto ANOVA seguido pelo teste de Tukey foram utilizados para avaliar os dados de expressÃo do RNAm nos folÃculos cultivados (p<0,05). Os resultados mostram que apÃs 6 dias de cultivo, FSH sozinho ou associado com GDF-9 aumentaram o diÃmetro folicular em relaÃÃo ao meio controle. AlÃm disso, apÃs 12 dias de cultivo, FSH promoveu um aumento no diÃmetro folicular, enquanto a associaÃÃo de FSH com GDF-9 reduziu significativamente o diÃmetro folicular quando comparado com folÃculos cultivados em MEM acrescido de FSH. AlÃm disso, FSH e GDF-9 aumentaram a formaÃÃo de antro apÃs 12 dias de cultivo (P<0,05). Apesar de GDF-9 ter reduzido significativamente os nÃveis de RNA para HAS 1 quando comparado ao MEM, esse fator aumentou os nÃveis de versican e perlecan. AlÃm disso, a presenÃa de ambos FSH e GDF-9 aumentaram os nÃveis de RNAm para HAS 2, porÃm, reduziu os nÃveis de RNAm para PCNA. AlÃm disso, FSH tambÃm atua reduzindo os nÃveis de RNAm para o PCNA. Em conclusÃo, FSH e/ou GDF-9 promovem o crescimento folicular e formaÃÃo de antro, e GDF-9 estimula a expressÃo de versican e perlecan e interage positivamente com FSH para o aumento da expressÃo de HAS 2. / The aim of this study was to determine the role of GDF-9 alone or in combination with FSH on growth, viability and on the mRNA expression of PCNA, HAS 1, HAS 2, versican and perlecan in bovine secondary follicles cultured in vitro. For in vitro studies, bovine secondary follicles were isolated and cultured for twelve days in the presence of MEM alone or supplemented with GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL and of D7-D12: 500 ng/mL) or both. Follicular diameter, viability and antrum formation were evaluated during culture. To evaluate the mRNA levels for PCNA, perlecan, versican, HAS 1 and 2 in follicles after 12 days of culture, total RNA was extracted and cDNA was synthesized. The levels of mRNA were quantified by real time PCR. Kruskal-Wallis test were used to compare the follicular diameter. The chi-square test was used to compare the percentage of viability and antrum formation of follicles after in vitro culture (p<0.05), whereas ANOVA followed by Tukey's test were used to evaluate the mRNA expression data in cultured follicles (p<0.05). The results show that after 6 days of culture, FSH alone or associated with GDF-9 increased follicular diameter in relation to control medium. Moreover, after 12 days of culture, FSH promoted an increase in follicular diameter, while the association of FSH with GDF-9 significantly reduced follicular diameter when compared with follicles cultured in MEM plus FSH. Furthermore, FSH and GDF-9 increased the antrum formation after 12 days of culture (P<0.05). Despite GDF-9 had significantly reduced the levels of mRNA for HAS 1 when compared to MEM, this factor has increased the levels of versican and perlecan. In addition, the presence of both FSH and GDF-9 increased mRNA levels for HAS 2, but reduced level those for PCNA. In addition, FSH also acts by reducing mRNA levels for PCNA. In conclusion, FSH and/or GDF-9 promotes the follicular growth and antrum formation, and GDF-9 stimulates the expression of versican and perlecan and interact positively with FSH to the increased expression of HAS 2

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referÃncia e a expressÃo de fatores de crescimento e de receptores de hormÃnios em folÃculos secundÃrios de caprinos. AlÃm disso, visa quantificar a expressÃo dos RNA mensageiros para BMP-6 e BMP-7 em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos e avaliar os efeitos de FSH, BMP-6 e BMP-7 sobre o crescimento e expressÃo gÃnica em folÃculos secundÃrios caprinos durante 6 dias de cultivo. Para avaliar a estabilidade dos genes de referÃncia, folÃculos secundÃrios (150-200 Âm) foram isolados mecanicamente de ovÃrios caprinos. ApÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese de DNA complementar, realizou a quantificaÃÃo dos mRNA, por PCR em tempo real, utilizando-se primers especÃficos para genes de referÃncia (GAPDH, &#946;-tubulina, &#946;-actina, PGK, UBQ, RPL-19, rRNA18S), fatores de crescimento (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL e IGF-1) e receptores de hormÃnio (FSH-R, LH-R e GH-R). Para avaliar a expressÃo de BMP-6 e BMP-7, folÃculos primordiais, primÃrios e secundÃrios, bem como pequenos e grandes folÃculos antrais foram obtidos e os nÃveis de mRNA de BMP-6 e 7 foram quantificados. Nos estudos in vitro, os efeitos da BMP-6 (50 ng/mL) e BMP-7 (50 ng/mL) na presenÃa ou ausÃncia de FSH (50 ng/mL) sobre o desenvolvimento in vitro de folÃculos secundÃrios e sobre a expressÃo de mRNA para BMP-6 e 7 e FSH-R foi avaliada apÃs 6 dias de cultivo. Os resultados mostraram que UBQ e &#946;-actina sÃo os genes de referÃncia mais estÃveis em folÃculos prÃ-antrais caprinos fresco cultivados por 12 dias. Os RNAs mensageiros para os fatores de crescimento (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 e KL) e os receptores de FSH, LH e GH sÃo expressos em diferentes nÃveis em folÃculos prÃ-antrais de caprinos, sendo que o IGF-1 e o EGF apresentaram, respectivamente, o maior e o menor nÃvel de mRNA. O nÃvel de mRNA para BMP-6 em folÃculos primÃrios e secundÃrios foi significativamente maior do que aqueles em primordial, enquanto que os nÃveis de mRNA para BMP-7 foi maior nas cÃlulas da granulosa/teca de grandes do que nos pequenos folÃculos antrais. ApÃs o cultivo de folÃculos secundÃrios durante 6 dias, FSH aumentou o diÃmetro folicular e FSH e BMP-7 aumentou significativamente os nÃveis de mRNA para BMP-7 e FSH-R. Jà a BMP-6 na presenÃa ou ausÃncia de FSH aumentou o diÃmetro dos folÃculos secundÃrios. AlÃm disso, FSH aumentou os nÃveis de mRNA para BMP-6, enquanto ambos BMP-6 e FSH e aumentaram os nÃveis de mRNA para FSH-R, apÃs o perÃodo de cultivo. Em conclusÃo, UBQ e &#946;-actina sÃo os dois genes mais estÃveis para folÃculos secundÃrios caprinos e o FSH e as BMPs dos tipos 6 e 7 estimulam o crescimento de folÃculos prÃ-antrais in vitro durante 6 dias de cultivo. / This study aims to evaluate the stability of reference genes and the expression of growth factors and hormone receptors in goat secondary follicles. It also seeks to quantify the expression of messenger RNA for BMP-6 and BMP-7 in goat preantral follicles and to evaluate the effects of FSH, BMP-6 and BMP-7 on growth and gene expression in secondary follicles goats after 6 days of culture. To evaluate the stability of reference genes, secondary follicles (150-200 &#956;m) were mechanically isolated from goat ovaries. After extraction of total RNA and synthesis of complementary DNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, &#946;-tubulin, &#946;-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S), growth factors (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL and IGF-1) and hormone receptor (FSH-R, LH-R and GH-R). To evaluate expression of BMP-6 and BMP-7, primordial follicles, primary and secondary as well as small and large antral follicles were obtained and the mRNA levels of BMP-6 and 7 were measured. For in vitro studies, the effects of BMP-6 (50 ng / mL) and BMP-7 (50 ng / mL) in the presence or absence of FSH (50 ng / mL) on the development of secondary follicles and on the expression of mRNA for BMP-6 and 7 and FSH-R was evaluated after 6 days of culture. Results showed that mRNA for growth factors (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 and KL) and the receptors for FSH, LH and GH are expressed in at different levels in preantral follicles of goats. Moreover, among the growth factors studied, IGF-1 and EGF had higher and lower levels or RNA, respectively. UBQ and &#946;-actin genes were the mostr stable reference in fresh and cultured preantral follicles. The level of mRNA for BMP-6 in primary and secondary follicles was significantly higher than those in primordial follicles, while the levels of mRNA for BMP-7 was higher in granulosa cells / theca in large antral follicles than in small antral follicles. After culture of secondary follicles for 6 days, FSH increased follicular diameter and FSH and BMP-7 significantly increased the levels of mRNA for BMP- 7 and FSH-R. In addition, BMP-6 in the presence or absence of FSH increased the diameter of secondary follicles after 6 days of culture. Real-time PCR shoed that FSH increased the levels of mRNA for BMP-6, while both BMP-6 and FSH and increased levels of mRNA for FSH-R, after a period of 6 days of culture. In conclusion, UBQ and &#946;-actin are the two most stable genes for secondary follicles goats and FSH and BMPs of types 6 and 7 stimulate the growth of preantral follicles after 6 days of in vitro culture.