Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

Dentre os diversos processos de formação de mineral em organismos vivos, a formação do tecido ósseo é um exemplo particular, uma vez que fosfatos de cálcio, na forma de hidroxiapatita, são produzidos em meio a fibrilas de colágeno na matriz extracelular de células osteogênicas; processo este regulado por um complexo enzimático. A fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) desempenha um papel fundamental na histogênese óssea, responsável principalmente pela produção de fosfato inorgânico necessário para a formação dos minerais. Diversas abordagens experimentais permitem a reconstituição desta enzima em sistemas miméticos de membrana celular, dentre os quais, os filmes Langmuir-Blodgett (LB), que possibilitam a formação de materiais com propriedades osteoindutoras. No presente estudo, foi investigada a imobilização desta enzima em filmes LB sobre suportes de Ti. O ácido dimiristoil fosfatídico foi o fosfolipídeo utilizado na confecção dos filmes LB, obtendo um regime de deposição linear de massa em função do número de camadas depositadas em subfases de CaCl2. A TNAP foi imobilizada nos filmes através de duas metodologias: a partir da adsorção física da enzima aos filmes LB pré-transferidos a um suporte sólido, ou ainda por meio da construção do filme a partir de uma monocamada mista de DMPA/Ca2+/TNAP. Em ambas as metodologias adotadas, foi obtida uma diminuição drástica da atividade fosfohidrolítica da forma imobilizada da enzima, em relação à sua atividade obtida em meio homogêneo. Ao expor suportes de Ti modificados com os filmes LB em uma solução contendo íons Ca2+ e ATP como fonte de fosfato inorgânico, foi observada a formação de uma maior quantidade de mineral para as amostras contendo a TNAP imobilizada; atribuída a uma maior supersaturação local de íons fosfato devido a maior hidrólise de ATP na presença da enzima, demonstrando a capacidade desta em conferir à superfície modificada uma maior capacidade na indução de formação de mineral. Após este ensaio de mineralização in vitro, foi obtida uma maior hidrofilicidade das superfícies recobertas com os filmes LB na presença da TNAP, tornando estas superfícies modificadas mais bioativas. A presença dos filmes LB mistos de lipídeo/TNAP nas superfícies permitiram a adesão, proliferação e recobrimento homogêneo de células osteogênicas, que posteriormente promoveram o extravasamento de fibrilas proteicas e a formação de nódulos de mineralização. Estes resultados são importantes na confecção de materiais que acelerem o processo de osteoindução. / Among all the processes of mineral formation in living organisms, the osseous tissue formation is a particular example, since that calcium phosphates as hydroxyapatite are produced among collagen fibrils at the extracellular matrix of osteogenic cells, being this process regulated by an enzymatic complex. The tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) plays a central role on the osseous histogenesis, responsible mainly for the inorganic phosphate production necessary for mineral formation. Various experimental approaches allows this enzyme reconstitution in cellular membrane mimetic systems, among which, the Langmuir-Blodgett films (LB), that allows the formation of materials with osteoinductive properties. With that in mind, the immobilization of that enzyme in titanium supports modified with LB films was investigated. The dimyristoyl phosphatidic acid was the phospholipid used in the LB film construction, obtaining a linear deposition-layer numbers relation in CaCl2 subphases. The TNAP was immobilized at the films through two main methodologies: from the physical adsorption of the enzyme to the LB film pre-constructed on a solid support, or through the film construction from the mixed DMPA/Ca2+/TNAP monolayer. At both the adopted methodologies, it was obtained a diminishment at the phosphohidrolytic activity of the immobilized enzyme, comparing to its activity at homogeneous media. Exposing the Ti supports with the LB films in a solution containing Ca2+ ions and ATP as a phosphate source, it was observed a higeher mineral formation to the samples containing the immobilized TNAP, possibly due to a higher phosphate ions supersaturation from the higher ATP hydrolysis at the presence of the enzyme, demonstrating the capacity of the TNAP in promoting a higher mineral formation induction to the modified surface. After this in vitro mineralization assay, it was obtained surfaces more hydrophilic at presence of the LB films containing TNAP, making those modified surfaces more bioactive. The mixed LB films presence at the surfaces allowed the adhesion, proliferation and homogeneous covering of osteogenic cells, that posteriorly promoted the production of proteic fibrils and mineralization nodules. Those results are important in order to construct materials more osteointegrative.

A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

O fenômeno da bio- e quimiluminescência tem atraído o interesse da comunidade científica nas últimas décadas não só pelo seu inerente interesse acadêmico, mas também devido as incontáveis aplicações analíticas que dele têm surgido. A maior parte do trabalho acadêmico que tem sido desenvolvido está relacionado ao estudo do mecanismo de geração de estados excitados e a eficiência de desativação radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicações tecnológicas, as metodologias para análise de enzimas, drogas e metabólitos, aplicadas à imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em quimiluminescência, estão entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em laboratórios. O desenvolvimento de substratos e, conseqüentemente, novas técnicas quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que utilizam rótulos radioativos. Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias quimiluminescentes para a determinação de atividade enzimática. O princípio químico é a geração de peróxidos cíclicos instáveis, conhecidos como 1,2-dioxetanos, após a hidrólise de substratos específicos, catalisada pela enzima objeto de estudo. Anéis dioxetânicos são conhecidos pela sua propriedade de gerar produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emissão de luz pode ser relacionada à atividade enzimática. Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissódico de 2-metil-1-propenila, NA-MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via a ação catalítica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase ácida (ACP). Este enol é oxidado, sob ação catalítica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP), gerando acetona em estado excitado triplete. A emissão de luz direta ou sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da ALP ou ACP. A determinação da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicação em tecnologias de diagnóstico, seja como um marcador de diversas doenças, seja como uma sonda em ensaios imuno-enzimáticos (EIA). A sensibilidade alcançada com este substrato foi de 10-15 mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluições de até 300.000 de um conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Também foi possível correlacionar a atividade de ALP à velocidade de consumo do oxigênio dissolvido no meio de reação, que é uma característica dessa oxidação. Partindo do mesmo princípio delineado no parágrafo anterior, desenvolveu-se um composto para determinação de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligação amídica geraria uma enamina, que também pode ser oxidada pela ação catalítica da HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto não é reconhecido como substrato das proteases. Tomando como base a bem conhecida característica de gerar uma fraca emissão de luz quando derivados indólicos são oxidados por agentes oxidantes clássicos, como KMnO4, K2S2O4, etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de alguns derivados indólicos quando submetidos ao sistema HRP/H2O2/O2. Como era esperado, detectou-se quimiluminescência de baixa intensidade para a maioria dos derivados indólicos. Também neste caso a clivagem do anel indólico, via um intermediário dioxetânico, parece ser a responsável pela emissão observada na maioria dos compostos testados. Além disso, a oxidação do composto 2-metilindol (III) mostrou uma eficiência de quimiluminescência com cerca de 3 ordens de grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento diferenciado desse composto estava relacionado à exclusiva formação de um composto secundário. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuída ao 2,2\'-dimetil-2,2\'-diindoxil. Então, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se uma metodologia analítica para determinação de HRP livre ou ligada em anticorpos (conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo HRP-IgG são largamente utilizados em EIA. Também com base nas características quimiluminescentes de \'alfa\'-hidroperóxi-cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial substrato para análise de esterases. A hidrólise catalisada por esterase de 2-peracetoxiadamantano-2-carboxialdeído (IV) geraria um \'alfa\'-hidroperóxi-aldeído, que por um ataque nucleofílico intramolecular, levaria a um intermediário dioxetânico. Este composto mostrou-se instável, gerando quimiluminescência mesmo na ausência da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado. / The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme, drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most applied techniques in routine laboratory procedures. The development of chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels. This thesis reports the development of new chemiluminescent methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The light emission can be related to enzymatic activity. It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays (EIA). The sensibility reached with this substrate was 10-15 mols to ALP, 0,0027 u/mL to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may be performed by following the oxygen uptake rate. By applying the same principle above delineated, it was synthesized a compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However, our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases. Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are oxidized by classical oxidants like KMnO4, K2S2O4, etc., it was studied the chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H2O2/O2 oxidant system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives. Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore, the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3 orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially attributed to 2,2\'-dimethyl-2,2\'-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most important labels. From the also known chemiluminescent characteristics of \'alpha\'-hidroperoxy-ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2-acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an \'alpha\'-hidroperoxy-aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane intermediate. This compound showed to be unstable and it generated chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as planned.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação do ultra-som (US) de 1 MHz comparando as freqüências de repetição de pulso de 100 Hz e 16 Hz na recuperação da fratura de fíbula, por análise morfológica e bioquímica, entre animais tratados e não-tratados. Foram utilizados 60 ratos machos albinos Wistar divididos em 4 grupos experimentais: referência, controle, tratados com US com freqüência de repetição de pulso de 16 Hz ou 100 Hz. Os animais dos grupos tratado e controle foram submetidos a uma fratura com perda óssea da fíbula direita. O tratamento teve início 24 h após a fratura, durante 5 dias por semana, com intensidade de 0,5 W/'CM POT.2', modo pulsado 1/5, freqüência de repetição de pulso a 100 Hz ou 16 Hz, por 3 min/dia. No 7°, 14º e 21º dia após a indução da fratura foi realizada coleta do sangue através de punção cardíaca para quantificação dos níveis de fosfatase alcalina e cálcio sérico e em seguida os animais foram submetidos à eutanásia e a fíbula foi removida para análise histológica. Foram determinadas a densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos. Os níveis de fosfatase alcalina e cálcio foram significativamente (P < '10 POT.-7') diferentes nos grupos experimentais. A densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos também foram significativamente diferentes entre os grupos experimentais. O tratamento com US acelerou a regeneração óssea e modulou os níveis sanguíneos de fosfatase alcalina e cálcio, sendo que, o US pulsado com freqüência de repetição de pulso a 100 Hz e freqüência de base da 1 MHz demonstrou ser mais eficaz / The aim of this work was to evaluate the effect of 1 MHz ultrasound application, comparing the 100 Hz and 16 Hz pulse repetition frequency in the recovering of fibula fracture, using morphological and biochemical analysis, between treated and non-treated animals. We used 60 male albino Wistar rats divided into 4 experimental groups: reference; control; treated with 100 Hz or 16 Hz pulse repetition frequency ultrasound. The treatment began 24 h after fracturing, lasted for 5 days per week, with 0.5 W/'CM POT. 2', pulsed mode 1/5, pulse repetition frequency of 100 Hz or 16 Hz, for 3 min a day. In the 7th, 14th and 21st after fracture induction, blood was collected through cardiac punction to alkaline phosphatase and calcium levels quantification and following that, the animals were euthanised and the fibula was removed to histological analysis. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densityes were determined. The levels of alkaline phosphatase and calcium were significantly (P < '10 POT.-7') different among the experimental group. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densities were significantly different among experimental groups. The US treatment accelerated the bone regeneration and modulated the alkaline phosphatase and calcium blood levels, being the pulsed US with 100 Hz pulse repetition frequency and base current 1 MHz the most efficient

O ultra-som pulsado de baixa intensidade é uma onda mecânica com efeitos osteogênicos promisso- res para o tratamento da osteoporose. Baseada neste efeito, a pesquisa tem como objetivo a identificação das mudanças causadas pela aplicação do ultra-som em ossos osteopênicos e a comparação com as mudanças causadas pelos exercícios físicos. Aplicou-se o protocolo experimental em um modelo animal de ratos fêmeas maduras ovariectomizadas. Utilizaram-se 35 ratos fêmeas, divididas em 5 grupos: ovariectomia controle (OVX), pseudo ovariectomia (PSEUDO-OVX), ovariectomia tratado com ultra-som (US), ovariectomia treinado com caminhada (CAMINHADA) e ovariectomia treinado com exercício resistido (SALTO). O protocolo de tratamento estendeu-se por 12 semanas, com aplicação ultra-sônica diária de 20 minutos (seis vezes por semana) e realização de exercício três vezes por semana, sendo 40 minutos para CAMINHADA e três séries de 10 exercícios para o SALTO. Para a identificação dos efeitos do tratamento de ultra-som e dos exercícios em ratos fêmeas osteopênicas utilizaram-se os seguintes parâmetros: massa corporal, dosagem de fosfatase alcalina, área trabecular, histomorfometria e valor de microdureza Vickers. Conclui-se que os três tipos de tratamento executados exerceram um efeito preventivo na perda de massa óssea pós-ovariectomia quando comparados ao OVX, mas não foram capazes de alcançar os valores encontrados no PSEUDO-OVX para os parâmetros analisados. As avaliações da quantidade óssea indicaram que o tratamento mais efetivo foi o SALTO para este parâmetro. Os resultados do US e CAMINHADA foram semelhantes nos parâmetros analisados / The low intensity pulsed ultra-sound is a mechanical wave with promising osteogenics effects for the osteoporosis treatment. Based in these effects, the research aims the identification of changes caused by ultra-sound application and physical exercises in osteopenics bones; and if there are similarity between them. Thus, it was applied an experimental protocol in an animal model of mature ovariectomized rats. It was used 35 rats, divided in 5 groups: control ovariectomized (OVX), pseudo ovariectomized (PSEUDO-OVX), ovariectomized with ultra-sound treatment (US), ovariectomized trained with walk (CAMINHADA) and ovariectomized trained with resisted exercise (SALTO). The protocol of treatment lasted 12 weeks, with the application of ultra-sound daily for 20 minutes (six times per week) and the realization of exercises three times per week, with 40 minutes for CAMINHADA and three sets of 10 exercises for SALTO. It was used the followed parameters to identify the effects of the ultra-sound treatment and the exercises in osteopenic rats: body mass, alkaline phosphatasis dosage, trabecular area, histomorphometry and Vickers microhardness value. The results showed that the three types of applied treatments have a preventive effect in the loss of bone mass after ovariectomy when compared with OVX. However, they could not reach the found values in PSEUDO-OVX for the analysed parameters. The evaluations of bone quantity indicated that the most effective treatment was SALTO for this parameter. The results of US and CAMINHADA were similar in evaluated parameters

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:35:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daniel da Silveira.pdf: 4620671 bytes, checksum: 940d0c2a58ed2267604a5ec3cb5752ba (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Intracranial hypertension causes several complications when installed, it can severely affect the individual afflicted with permanent sequelae, besides the risk of death. In the case of pregnant women, the risk is even greater due to the high complexity involved in physiological pregnancy period. In this context, the evaluation of intracranial pressure (ICP) could provide important information that can detect these problems and thereby prevent these complications. However, the invasive method that this procedure is performed makes the use of this methodology very limited. It’s necessary the use of a method that is capable of generating this information while providing security to the patient, not generating complications such as infections or injuries resulting from its invasive form. The aim of this study was to evaluate a new technology for noninvasively ICP measuring in pregnant women in a municipal health center in Ponta Grossa, relating it to the clinical and laboratory data obtained at the time of the procedure. It was observed that low and high-risk pregnant women showed a high in ICP. There were also significant differences between groups for laboratory parameters, such as serum levels of alkaline phosphatase and ultra-sensitive C-reactive protein (hs-CRP). The existence of changes in the ICP and its relationship with clinical and laboratory data in the population studied, introduces in the monitoring of pregnant women, a parameter with unknown data due to technical limitations, which allows to identify changes even in the absence of symptoms and to prevent complications related to elevation in intracranial pressure. / A hipertensão intracraniana promove diversas complicações quando instalada, podendo afetar gravemente o indivíduo acometido com sequelas permanentes, além do risco de óbito. Em se tratando de gestantes, o risco é maior ainda, devido à alta complexidade fisiológica envolvida no período gestacional. Nesse contexto, a avaliação da pressão intracraniana (PIC) pode fornecer informações importantes capazes de detectar esses problemas e com isso evitar essas complicações. No entanto, a forma invasiva como é realizado esse procedimento faz com que a utilização dessa metodologia seja bastante limitada. O uso de um método que seja capaz de gerar essas informações e ao mesmo tempo dar segurança ao paciente, não gerando complicações como infecções ou lesões decorrentes de sua forma invasiva, se faz necessário. O objetivo desse trabalho foi avaliar uma nova tecnologia para aferição da PIC de forma não invasiva em gestantes num centro municipal de saúde em Ponta Grossa, relacionando-a a dados clínicos e laboratoriais obtidos no momento da realização do procedimento. Observou-se que gestantes de baixo e alto risco apresentaram PIC elevada. Foram, ainda, encontradas diferenças significativas entre os grupos para os parâmetros laboratoriais, tais como nos níveis séricos de fosfatase alcalina e proteína C reativa -ultrassensível (PCR-us). A detecção da existência de alterações na PIC e sua relação com dados clínicos e laboratoriais, na população estudada, introduz no acompanhamento às gestantes, um parâmetro, com dados até então desconhecidos devido a limitações técnicas, que permite identificar alterações mesmo na ausência de sintomatologia e prevenir complicações relacionadas à elevação da pressão intracraniana.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-05-07T22:56:27Z No. of bitstreams: 1 126110041.pdf: 1662239 bytes, checksum: 4c1751ff15692d571713c45fca07289c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-07T22:56:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 126110041.pdf: 1662239 bytes, checksum: 4c1751ff15692d571713c45fca07289c (MD5) Previous issue date: 2014-03-24 / Células tronco são células indiferenciadas e multipotentes, capazes de se diferenciar nos mais diversos tipos celulares. São definidas por duas características principais, a autorrenovação e o potencial de diferenciação. Devido ao seu potencial de diferenciação, facilidade de isolamento e expansão em cultura, as células tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cell – MSCs) são largamente utilizadas em testes para o tratamento de inúmeras doenças, como doenças cardíacas, mieloma e osteoartrite. O corticosteroide dexametasona é amplamente utilizado como indutor de diferenciação óssea em células tronco e está envolvido no aumento da atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP). Há quatro genes que codificam a ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 e ALPI. A ALPL é um dos principais marcadores de diferenciação óssea promovida pelo tratamento com dexametasona, esse gene possui três diferentes variantes que são geradas por splicing alternativo. Porém, até hoje não se tem conhecimento de qual dessas variantes atua na deposição de matriz óssea. O objetivo do trabalho foi analisar, por PCR quantitativo (qPCR), a atividade das variantes de ALPL durante a diferenciação de MSCs tratadas com dexametasona. Os primers das três variantes do gene ALPL foram desenhados pelo nosso grupo de pesquisa. Para o experimento, aproximadamente 3x10 4 células por mL foram semeadas em placa de cultura. Para o tratamento utilizou-se dexametasona 10 -7 M, tendo como período de tratamento 0, 3 e 7 dias. Os resultados da qPCR mostraram que os primers desenhados possuem uma eficiência superior a 90% e R 2 = 1, sendo os primers da variante 2 mais eficiente que os primers da variante 1, e os primers de ambas as variantes mais eficientes que os primers de ALP atualmente utilizados. Os primers da ALPL/v3 não apresentaram amplificação. Nossa análise estatística indica que a diferença de expressão entre as células tratadas e os controles se mostrou relevante, apontando para um grande aumento de ALPL/v1 nas células tratadas. A expressão de ALPL/v2, apesar de significativa entre os controles e tratados, é baixa quando comparada à ALPL/v1. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a dexametasona, além de aumentar a atividade do promotor de ALPL, também dá preferência ao splicing alternativo que origina o mRNA da variante 1 do gene. / Stem cells are undifferentiated and pluripotent cells that are able to differentiate into several cell types. Stem cells are distinguished from other cell types by two important characteristics: self-renewal and differentiation potential. Due to their differentiation potential and easiness for isolate and growth in vitro, mesenchymal stem cells (MSCs) are widely used in trials for the treatment of numerous diseases such as heart disease, myeloma and osteoarthritis. The corticosteroid dexamethasone is broadly used to induce bone differentiation in stem cells and is involved in the increased activity of alkaline phosphatase (ALPL). There are four genes coding ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 and ALPI. The ALPL is one of the main markers for bone differentiation stimulated by dexamethasone. This gene has three different variants which are generated by alternative splicing. However, to date it is not known which of these variants act in the bone matrix deposition. In this context, the aim of this work was to analyze the activity of ALPL variants during the differentiation of MSCs treated with dexamethasone. Primers for the three ALPL variants were designed by our group. For the experiment, approximately 3x10 4 cells per ml were seeded in culture plate. For treatment, we used 10 -7 M dexamethasone for 0, 3 and 7 days. The qPCR results showed that the primers designed had an amplification efficiency higher than 90% and R 2 = 1; variant 2 (V2) primers was more efficient than the variant 1 (V1) primers and primers of both variants are more efficient than the currently used ALP primers. The primers of ALPL/v3 showed no amplification. Our statistical data showed that the differences in expression between treated and control cells were significant, indicating an expressive increase of ALPL/v1 in treated cells. The expression of ALPL/v2, although significant between controls and treated cells, was low when compared to ALPL/v1. The results of this study indicate that dexamethasone, besides increasing the activity of the ALPL promoter, gives preference to alternative splicing that originates the variant1 mRNA.

Os efeitos de preparações de plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a atividade osteogênica in vitro e in vivo em contato com biomateriais são divergentes na literatura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão e/ou atividade de marcadores iniciais da diferenciação osteoblástica em culturas de células osteogênicas crescidas sobre titânio (Ti) e expostas a coquetel de fatores de crescimento e proteínas PRP-símile (coquetel de FCs). Células osteoblásticas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram cultivadas em meio osteogênico e expostas, nos 7 primeiros dias, a coquetel de FCs nas diluições 1:1 (FCs), 1:10 (FCs/10), 1:100 (FCs/100) e 1:1000 (FCs/1000). Foram avaliados, nos tempos de 7, 10 e 14 dias: 1) os aspectos morfológicos e a imunomarcação de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN), por epifluorescência; 2) a proliferação celular, por ensaio de MTT; 3) a expressão de RNAm para o fator de transcrição Runx2, BSP e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real; 4) a atividade de ALP, clivada da fração de membrana; 5) quantificação da mineralização, por extração do vermelho de Alizarina. Os resultados mostraram inibição da formação dos nódulos de matriz mineralizada em culturas FCs e atraso em seu desenvolvimento em FCs/10 e FCs/100, em comparação a FCs/1000 e controle. A expressão de Runx2, BSP e ALP era menor em todas as culturas expostas ao coquetel de FCs em 7 dias, sendo que para Runx2 e BSP notava-se o efeito concentração-dependente em 10 dias. Menores valores de atividade de ALP foram observados nas culturas FCs e FCs/10, com efeito concentração-dependente e correlação positiva com a mineralização em 7 dias, mas não em 10 e 14. Os resultados permitem concluir que a exposição ao coquetel de FCs inibe e/ou atrasa a diferenciação osteogênica de culturas primárias sobre Ti. Adicionalmente, a atividade de ALP de membrana pode ser considerada também um marcador inicial de diferenciação osteoblástica, indicativo do potencial osteogênico no modelo in vitro utilizado. / The effects of platelet-rich plasma (PRP) preparations on the in vitro and in vivo osteogenic activity in contact with biomaterials have been subject of debate and controversy in the literature. The aim of the present study was to evaluate the expression and/or activity of early markers of osteoblast differentiation in cultured osteogenic cells grown on titanium (Ti) and exposed to a PRP-like cocktail of growth factors and proteins (GFs cocktail). Primary osteoblastic cells derived from newborn rat calvarial bone were cultured in an osteogenic medium (control group) and exposed during the first 7 days of culture to the following dilutions of GFs cocktail: 1:1 (GFs), 1:10 (GFs/10), 1:100 (GFs/100) and 1:1000 (GFs/1000). At days 7, 10 and 14 of culture, the following parameters were assessed: 1) morphology and immunolabeling for bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) by epifluorescence microscopy; 2) cell proliferation by MTT assay; 3) mRNA expression for the osteoblast markers Runx2, BSP and alkaline phosphatase (ALP) by real time PCR; 4) ALP activity following ALP cleavage from cell membrane; 5) mineralization by Alizarin red extraction. The results showed no mineralized nodules for the GFs group and a delayed nodule formation for GFs/10 and GFs/100 compared with GFs/1000 and control. Whereas Runx2, BSP and ALP mRNA levels were lower for all cultures exposed to the GFs cocktail at day 7, a concentration-dependent effect was noticed only for Runx2 and BSP at day 10. The GFs cocktail showed a concentration-dependent effect on ALP activity, with the lowest values for GFs and GFs/10 cultures and a positive correlation with mineralization at day 7 but not at day 10 or 14. In conclusion, inhibited and/or delayed osteogenic differentiation take place in primary cultures grown on Ti and exposed to the GFs cocktail. In addition, membrane ALP activity can also be considered an early marker of osteoblast differentiation, indicative of the in vitro osteogenic potential in the model used.

Os efeitos de preparações de plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a atividade osteogênica in vitro e in vivo em contato com biomateriais são divergentes na literatura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão e/ou atividade de marcadores iniciais da diferenciação osteoblástica em culturas de células osteogênicas crescidas sobre titânio (Ti) e expostas a coquetel de fatores de crescimento e proteínas PRP-símile (coquetel de FCs). Células osteoblásticas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram cultivadas em meio osteogênico e expostas, nos 7 primeiros dias, a coquetel de FCs nas diluições 1:1 (FCs), 1:10 (FCs/10), 1:100 (FCs/100) e 1:1000 (FCs/1000). Foram avaliados, nos tempos de 7, 10 e 14 dias: 1) os aspectos morfológicos e a imunomarcação de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN), por epifluorescência; 2) a proliferação celular, por ensaio de MTT; 3) a expressão de RNAm para o fator de transcrição Runx2, BSP e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real; 4) a atividade de ALP, clivada da fração de membrana; 5) quantificação da mineralização, por extração do vermelho de Alizarina. Os resultados mostraram inibição da formação dos nódulos de matriz mineralizada em culturas FCs e atraso em seu desenvolvimento em FCs/10 e FCs/100, em comparação a FCs/1000 e controle. A expressão de Runx2, BSP e ALP era menor em todas as culturas expostas ao coquetel de FCs em 7 dias, sendo que para Runx2 e BSP notava-se o efeito concentração-dependente em 10 dias. Menores valores de atividade de ALP foram observados nas culturas FCs e FCs/10, com efeito concentração-dependente e correlação positiva com a mineralização em 7 dias, mas não em 10 e 14. Os resultados permitem concluir que a exposição ao coquetel de FCs inibe e/ou atrasa a diferenciação osteogênica de culturas primárias sobre Ti. Adicionalmente, a atividade de ALP de membrana pode ser considerada também um marcador inicial de diferenciação osteoblástica, indicativo do potencial osteogênico no modelo in vitro utilizado. / The effects of platelet-rich plasma (PRP) preparations on the in vitro and in vivo osteogenic activity in contact with biomaterials have been subject of debate and controversy in the literature. The aim of the present study was to evaluate the expression and/or activity of early markers of osteoblast differentiation in cultured osteogenic cells grown on titanium (Ti) and exposed to a PRP-like cocktail of growth factors and proteins (GFs cocktail). Primary osteoblastic cells derived from newborn rat calvarial bone were cultured in an osteogenic medium (control group) and exposed during the first 7 days of culture to the following dilutions of GFs cocktail: 1:1 (GFs), 1:10 (GFs/10), 1:100 (GFs/100) and 1:1000 (GFs/1000). At days 7, 10 and 14 of culture, the following parameters were assessed: 1) morphology and immunolabeling for bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) by epifluorescence microscopy; 2) cell proliferation by MTT assay; 3) mRNA expression for the osteoblast markers Runx2, BSP and alkaline phosphatase (ALP) by real time PCR; 4) ALP activity following ALP cleavage from cell membrane; 5) mineralization by Alizarin red extraction. The results showed no mineralized nodules for the GFs group and a delayed nodule formation for GFs/10 and GFs/100 compared with GFs/1000 and control. Whereas Runx2, BSP and ALP mRNA levels were lower for all cultures exposed to the GFs cocktail at day 7, a concentration-dependent effect was noticed only for Runx2 and BSP at day 10. The GFs cocktail showed a concentration-dependent effect on ALP activity, with the lowest values for GFs and GFs/10 cultures and a positive correlation with mineralization at day 7 but not at day 10 or 14. In conclusion, inhibited and/or delayed osteogenic differentiation take place in primary cultures grown on Ti and exposed to the GFs cocktail. In addition, membrane ALP activity can also be considered an early marker of osteoblast differentiation, indicative of the in vitro osteogenic potential in the model used.