Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-10. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:18Z : No. of bitstreams: 1 000843662.pdf: 3263526 bytes, checksum: 3834c7b8c2dd7d42cbcbd22ff55f8632 (MD5) / Células-tronco da polpa dentária humana são promissoras no tratamento endodôntico, porém antes de utilizá-las clinicamente, deve-se entender suas propriedades biológicas em resposta a estímulos, como o ácido lipoteicóico (LTA) bacteriano. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento de células SHED (Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth) após exposição ao LTA bacteriano, verificando os efeitos na proliferação e metabolismo celular, atividade da fosfatase alcalina, deposição de cálcio, expressão de genes associados à mineralização, e liberação de citocinas. Foram utilizadas células SHED tratadas com LTA em diferentes concentrações, sem e com indutores da mineralização (IM). O metabolismo e a proliferação celular foram avaliados pelos ensaios de XTT e SRB. As células foram submetidas a um ensaio enzimático da atividade de fosfatase alcalina, para observação da ativação de processos de mineralização. E foi analisada qualitativamente a presença de deposição de cálcio pelas células pelo ensaio de alizarin vermelho (ARS). A expressão dos genes DSPP (Dentin Sialophosphoprotein) e DMP-1 (Dentin Matrix Protein-1) foi avaliada pela técnica do PCR (Polymerase Chain Reaction). O teste ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) foi realizado para detectar e quantificar as citocinas IL-1ß (Interleucina-1ß), IL-6 (Interleucina-6), TNF-α (Fator de Necrose Tumoral-α). Os dados obtidos nos ensaios quantitativos foram analisados estatisticamente por ANOVA complementada pelo teste de Tukey (p<0,05). Foi observado um aumento no metabolismo e proliferação celular com o tempo, não havendo diferenças entre os grupos testados em cada período. Nos grupos sem IM, observou-se um aumento da atividade da fosfatase alcalina das células expostas ao LTA comparados ao controle. Os grupos com indutores de mineralização apresentaram maiores quantidades... / Dental pulp stem cells are promising in endodontics, but before clinical treatment it should be studied to understand its biological properties in response to stimuli such as lipoteichoic acid (LTA). The aim of this study was to evaluate the behavior of Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth (SHED) exposed to LTA, analyzing cell proliferation and metabolism, alkaline phosphatase activity, calcium deposition, gene expression, cytokines production. SHED cells were treated with LTA, in different concentrations, without and with mineralization induction (MI). Cell metabolism and proliferation were evaluated by XTT and SRB. Alkaline phosphatase activity was performed to indicate mineralization process. Also, calcium deposition was observed qualitatively by alizarin red. Gene expression of DSPP (Dentin Sialophosphoprotein) and DMP-1 (Dentin Matrix Protein-1) was evaluated by PCR (Polymerase Chain Reaction). Cytokines IL-1ß (Interleukin-1ß), IL-6 (Interleukin-6), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) were detected and quantified by ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Statistical analysis of quantitative tests were performed by ANOVA and Tukey test (p<0,05). Metabolism and cell proliferation increased with time and no differences were observed between groups in each period. In groups without MI, there was an increase in alkaline phosphatase activity of cells exposed to LTA compared to control. Groups with mineralization induction showed more calcium deposition, compared to the groups without MI. After 3 days, cells treated with LTA showed more areas of calcification compared to control, and after periods of 7 and 14 days were similar. All groups tested expressed genes DSPP and DMP-1, being slightly higher in groups with MI. The expression of IL-1ß and TNF-α by cells of the tested groups were similar, and IL-6 concentration was expressive, with differences between groups and time periods. According to the methodology and analysis ...l

Orientador: Carlos Henrique Ribeiro Camargo / Co-orientador: Bruno das Neves Cavalcanti / Banca: Marcia Carneiro Valera Garakis / Banca: João Eduardo Gomes Filho / Resumo: Células-tronco da polpa dentária humana são promissoras no tratamento endodôntico, porém antes de utilizá-las clinicamente, deve-se entender suas propriedades biológicas em resposta a estímulos, como o ácido lipoteicóico (LTA) bacteriano. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento de células SHED (Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth) após exposição ao LTA bacteriano, verificando os efeitos na proliferação e metabolismo celular, atividade da fosfatase alcalina, deposição de cálcio, expressão de genes associados à mineralização, e liberação de citocinas. Foram utilizadas células SHED tratadas com LTA em diferentes concentrações, sem e com indutores da mineralização (IM). O metabolismo e a proliferação celular foram avaliados pelos ensaios de XTT e SRB. As células foram submetidas a um ensaio enzimático da atividade de fosfatase alcalina, para observação da ativação de processos de mineralização. E foi analisada qualitativamente a presença de deposição de cálcio pelas células pelo ensaio de alizarin vermelho (ARS). A expressão dos genes DSPP (Dentin Sialophosphoprotein) e DMP-1 (Dentin Matrix Protein-1) foi avaliada pela técnica do PCR (Polymerase Chain Reaction). O teste ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) foi realizado para detectar e quantificar as citocinas IL-1ß (Interleucina-1ß), IL-6 (Interleucina-6), TNF-α (Fator de Necrose Tumoral-α). Os dados obtidos nos ensaios quantitativos foram analisados estatisticamente por ANOVA complementada pelo teste de Tukey (p<0,05). Foi observado um aumento no metabolismo e proliferação celular com o tempo, não havendo diferenças entre os grupos testados em cada período. Nos grupos sem IM, observou-se um aumento da atividade da fosfatase alcalina das células expostas ao LTA comparados ao controle. Os grupos com indutores de mineralização apresentaram maiores quantidades... / Abstract: Dental pulp stem cells are promising in endodontics, but before clinical treatment it should be studied to understand its biological properties in response to stimuli such as lipoteichoic acid (LTA). The aim of this study was to evaluate the behavior of Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth (SHED) exposed to LTA, analyzing cell proliferation and metabolism, alkaline phosphatase activity, calcium deposition, gene expression, cytokines production. SHED cells were treated with LTA, in different concentrations, without and with mineralization induction (MI). Cell metabolism and proliferation were evaluated by XTT and SRB. Alkaline phosphatase activity was performed to indicate mineralization process. Also, calcium deposition was observed qualitatively by alizarin red. Gene expression of DSPP (Dentin Sialophosphoprotein) and DMP-1 (Dentin Matrix Protein-1) was evaluated by PCR (Polymerase Chain Reaction). Cytokines IL-1ß (Interleukin-1ß), IL-6 (Interleukin-6), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) were detected and quantified by ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Statistical analysis of quantitative tests were performed by ANOVA and Tukey test (p<0,05). Metabolism and cell proliferation increased with time and no differences were observed between groups in each period. In groups without MI, there was an increase in alkaline phosphatase activity of cells exposed to LTA compared to control. Groups with mineralization induction showed more calcium deposition, compared to the groups without MI. After 3 days, cells treated with LTA showed more areas of calcification compared to control, and after periods of 7 and 14 days were similar. All groups tested expressed genes DSPP and DMP-1, being slightly higher in groups with MI. The expression of IL-1ß and TNF-α by cells of the tested groups were similar, and IL-6 concentration was expressive, with differences between groups and time periods. According to the methodology and analysis ...l / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-16Bitstream added on 2014-06-13T20:56:53Z : No. of bitstreams: 1 chavesneto_ah_me_araca.pdf: 216462 bytes, checksum: a077ffffb43a7f52121fc844bcf5ba50 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A saliva é coletada através de métodos simples e não invasivos, além de ser facilmente armazenada. A coleta não-traumática é atrativa especialmente para crianças e quando repetidas coletas são requeridas. A desvantagem da saliva como uma ferramenta de diagnóstico é a variabilidade, que ocorre em decorrência dos fatores fisiológicos e do modo de coleta. Numa primeira etapa o trabalho teve por objetivo estudar as atividades das enzimas fosfatase alcalina (FAlc), fosfatase ácida total (FAT) e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) na saliva total não estimulada de crianças, investigando as influências de fatores como sexo, faixa etária e horário de coleta, bem como a correlação das enzimas com a taxa de fluxo salivar. Nesta etapa, 120 crianças saudáveis de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva coletada entre 8:00-10:00 horas ou entre 14:00-16:00 horas. A segunda parte do trabalho teve por objetivo avaliar a correlação das atividades enzimáticas da FAT, TRAP, proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTP-BMr) e FAlc na saliva e no soro de crianças, além de analisar a influência do sexo e da faixa etária na atividade das enzimas, no soro e na saliva total. Para tanto 32 crianças de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 anos e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva e sangue coletadas entre 8:00-10:00 horas. Os resultados da primeira etapa sugerem que as atividades da FAT, TRAP e FAlc são influenciadas, de formas distintas, pelos fatores sexo, faixa etária e horário de coleta e que não existe correlação entre as atividades das enzimas e a taxa de fluxo salivar. / Saliva can be collected by simple, non-invasive methods and is easily stored. The non-traumatic collection is specially appealing for children and when repeated collections are required. The main disadvantage of the saliva as a diagnosis tool is the variability that happens due to the physiologic factors and dependence on mode of the collection. In a first stage the work had for objective to study the activities of the enzymes alkaline phosphatase (ALP), total acid phosphatase (TAP) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the whole unstimulated saliva of children, investigating the influences of factors as sex, age group and time of collection, as well as the correlation of the enzymes with the salivary flow rate. In this stage, 120 healthy children of both sexes, in the age groups of 1-5 and 6-12 years of age had the saliva samples collected between 8:00-10:00 hours or between 14:00-16:00 hours. In a second stage, the work had for objective to evaluate the correlation of the enzymatic activities of TAP, TRAP, low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and ALP in the saliva and in the children's serum, besides analyzing the influence of the sex and of the age group in the activity of the enzymes, in the serum and in the whole unstimulated saliva. For so much 32 children of both sexes, in the 1-5 year-old age groups and 6-12 years of age had the saliva samples and blood collected between 8:00-10:00 hours. The results of the first stage suggest that the activities of TAP, TRAP and ALP are influenced, in different ways, for the factors sex, age group and time of collection and that correlation doesn't exist between the activities of the enzymes and the salivary flow rate.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-14Bitstream added on 2014-06-13T19:07:00Z : No. of bitstreams: 1 shimabucoro_ce_me_araca.pdf: 644965 bytes, checksum: 4c0994e094a9206c065633ccadc5a2cf (MD5) / O osso alveolar, como os demais ossos, é continuamente remodelado por processo que equilibra reabsorção óssea por osteoclastos seguido pela deposição óssea por osteoblastos. A aplicação de forças ortodônticas gera reações locais nos tecidos relacionados com a dentição e oclusão bem como em fatores sistêmicos relacionados com o metabolismo ósseo, como a concentração de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina. O nosso objetivo foi identificar, através de marcadores fluorescentes, a deposição de cálcio no ligamento periodontal e analisar a concentração plasmática de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina antes e após a movimentação dentária experimental. A movimentação foi realizada com aparelhos instalados no primeiro molar superior em ratos machos (Wistar/250g). Os animais receberam três injeções de marcadores ósseos fluorescentes, na seguinte ordem: calceína, alizarina e oxitetraciclina com intervalo de sete dias entre as injeções para análise de 17 (G1), 28 (G2) ou 35 (G3) dias após instalação do aparelho. Sete dias após a última injeção, o sangue foi coletado e centrifugado para a realização posterior das análises bioquímicas. As maxilas foram retiradas, limpas e submetidas aos procedimentos específicos para o preparo das lâminas e leitura posterior em microscópio de epifluorescência. Foi coletado sangue de oito animais que não receberam intervenção ortodôntica, para controle das concentrações plasmáticas. A análise qualitativa evidenciou diferença entre o lado controle e o submetido à movimentação dentária, entretanto, a análise quantitativa não constatou diferença estatisticamente significante. As leituras espectrofotométricas nas dosagens dos plasmas destes animais mostraram concentração de cálcio sem diferença estatística entre os grupos. / The alveolar bone, as the other bones, continuously is remodelled by process that balances bone resorption by osteoclasts followed by the bone deposition for osteoblasts. The application of orthodontic forces generates local reactions in tissues related to the teeth and occlusion as well as systemic factors related with the bone metabolism, as the concentration of calcium, phosphorus and alkaline phosphatase. Our objective was to identify, through fluorescent markers, the calcium deposition in the periodontal ligament and to analyze the plasma concentration of calcium, phosphorus and alkaline phosphatase before and after the experimental tooth movement. The movement was performed with apparatus installed on the upper first the molar superior in male rats (Wistar/250g). These animals received three injections of bone fluorescent markers, in the following order: calcein, alizarin and oxytetracycline with interval of seven days between the injections for analysis of 17 (G1), 28 (G2) or 35 (G3) days after installation of the unit. Seven days after the last injection, the blood was collected and centrifuged to the achievement of subsequent biochemical analyses. The jaws had been removed, cleaned and submitted to the specific procedures for the preparation of the slides and posterior reading in the epifluorescence microscopy. Blood of eight animals that had not received intervention orthodontic, for control of the plasmatic concentrations was collected. The qualitative analysis evidenced difference between the side control and the submitted to the tooth movement, however, the quantitative analysis did not evidence significant difference statistical. The spectrophotometric readings in the dosages of plasmas of these animals had shown to calcium concentration without difference statistics between the groups. However, the analysis of the phosphorus evidenced co-relation between the plasmatic concentration and the time of tooth movement.

A observação de que os RNPMBPN alimentados com leite materno ou fórmula láctea não específica para prematuros estão em risco de desenvolvimento de deficiência osteomineral estimulou-nos ao desenvolvimento desse estudo. Nosso objetivo~ foi o de verificar se a adição de Cálcio e Fósforo a dieta oferecida aos RNPMBPN interfere na concentração da F A, levando em conta seu envolvimento no metabolismo ósseo. Foram selecionados 71 neonatos prematuros com PN inferior a 1500g de IO de inferior a 35 semanas divididos em 2 grupos. No OI os neonatos (n 37) receberam leite-matemo ou fórmula para lactentes a termo acrescido de sais de Ca e P; e no 02 (n 34)~ os neonatos receberam apenas leite matemo ou a mesma fórmula. Paralelamente~ selecionou-se um terceiro grupo de neonatos a termo AIO alimentados com LM ou fórmula. Ao ingressar no estudo não houve diferenças significativas entre os grupos G I e 02 com relação ao PN, PCN~ CN~ Sexo e IG. Os dois grupos receberam o mesmo volume de alimentação e taxas calóricoprotéicas semelhantes. Os RNPMBPN foram acompanhados com dosagens séricas quinzenais de Ca., P e FA ate atingirem 2000g. Não houve diferença significativa na média do Ca sérico nos G I e G2, mas em relação ao grupo 3 - a média do Ca sérico foi significativamente mmor do que nos outros 2 grupos. Encontrou-se resultados semelhantes com relação ao P sérico. A média da. concentração da. FA entre Gl e G2 diferiu significativamente a partir da. quarta semana de vida. A comparação das médias da concentração da. F~ nas diversas idades, entre Gl e G3 não mostra diferença significativa; no entanto, há significância. entre as médias de G2 e G3. Em sete neonatos de G2 - que alcançaram a concentração da F A 5 vezes o limite superior considerado como normal iniciou-se a. suplementação de Ca e P. Em todos houve a. diminuição da. concentração da. F A, com diferença estatisticamente significativa considerando-se o grupo. Concluímos que a medida da concentração da FA é um método útil e eficiente para a monitorização da. DOMP nos neonatos. Podemos concluir també~ que o leite humano eJou as fórmulas lácteas não especificas para RNPMBPN são inadequadas para. a sua alimentação, tendo em vista. o deficiente aporte de Ca e P, sendo necessária., a suplementação desses sais na. tentativa. de prevenir a DOMP. / The observation 1hat 1he VLBW infants fed wi1h breast-milk or with a not specified cow milk-based formula for prematures suffer any risk of developping osteomineral deficiency encouraged us to work on this subject Our aim was to prove whether the addition of Calcium and Phosphor to the diet offered,to VLBW infants interferes in the concentration o f AP (phosphatase Alkaline ), taking into accowtt its envolvement in 1he bone metabolism. Seventy one (71) premature newbom with BW ~ 1500 gr and GA ~ 35 weeks were selected and divided into two groups. In G 1 the fullterm newbom (n ± 37) received breast miik or a cow milk-based formula enriched by CA (calcium) and P (phosphorus) salts; and in G2 (n=34) the newbom received only breast milk or the same formula At 1he same time a third group of newborn was selected and fed, apropriate for the gesta:tional age, wi1h breast milk or formula In 1he begirming of this study there were no significant di:fferences between Gl and G2 with relation to PN, PCN, CN, sex and gestational age. The two groups received same volume of nourishment and with similar caloric-proteic rates. The VLBW infants were accompanied by weekly serial doses of CA, P and AP tmtil reaching 2. 000 gr. No significa.tive difference in the average of CA serial in G 1 and G2 appeared, but in rela.tion to G3 the seral CA average was considerably higher than in the other 2 groups. Similar results were found with relation to P (phosphorus) serial. The concentration average o f AP between G 1 and G2 differed considerably from the fourth week of life on. The comparison o f the AP concentration-average does not show significative difference; however, there is a sigficance between the average of G2 and 03. To seven newbom of G2, who reached a FA concentration 5 times higher than the superior Iimit considered normal, an addition of CA and P was given. In ali of them there was a descresse of the FA concentration with a significant statistically proved di.fference considering the group. W e concluded that the FA concentration rate is a useful and efficient method for the monitorization of the MBDP (Metabolic Bone Disease) of newbom. We may also conclude that human milk andlor non specific milk formula for VLBW infants are inadequate for their nourishment, due to the defficient amount of CA and P, a suplementation of these salts being therefore necessary in order to prevent Metabolic Bone Disease of Prematurity (MBDP).

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características química e de rugosidade da superfície de titânio sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes aos osteoblastos de rato (Osteo-1), cultivados em meio de cultura adicionado de BMP-7. MATERIAL E MÉTODO: Células Osteo-1 foram cultivadas sobre discos de titânio com superfícies:1) lisa, 2) jateada por areia de grânulos grandes e atacada por ácido (SLA) e 3) rugosa SLA e quimicamente modificada e hidrofílica (SLAactive) na presença ou ausência de 20ng/ml de rhBMP- 7 no meio de cultura. A adesão e viabilidade das células Osteo-1 foram analisadas após 24 horas de contato com as superfícies em estudo. A diferenciação celular foi avaliada através da análise do conteúdo de proteína total (PT), conteúdo de colágeno, atividade de fosfatase alcalina (ALPase), em 7, 14 e 21 dias, e da formação de matriz mineralizada, em 21 dias. Os resultados foram comparados pela análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey. RESULTADOS: A adesão (p=0.3485) e a viabilidade (p=0.5516) celular, o conteúdo de colágeno (p=0.1165) e a formação de matriz mineralizada (p=0.5319) não foram afetados pelas diferentes superfícies ou pela adição de rhBMP-7 ao meio. Células Osteo-1 cultivadas sobre superfície SLA apresentaram um aumento significativo no conteúdo de proteína total aos 21 dias. A relação atividade de ALPase/PT (p=0.0000) foi afetada pelos tratamento e tempo. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que a adição de rhBMP- 7 ao meio de cultura não promoveu efeito sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos nas diferentes superfícies testadas. Todas as superfícies de titânio testadas permitiram uma completa expressão do fenótipo de osteoblasto como a mineralização da matriz pela célula Osteo-1. / The aim of the present study was to assess the influence of the chemical characteristics and roughness of titanium surfaces on the attachment, proliferation and differentiation of osteoblast-like cells cultured in medium supplemented with bone morphogenetic protein-7 (BMP-7). METHODS: Osteo-1 cells were grown on titanium discs presenting the following surfaces: 1) machined surface, 2) coarse gritblasted and acid-etched (SLA), and 3) modified SLA (SLAactive) in the absence or presence of 20 ng/ml rhBMP-7 in culture medium. The attachment and viability of osteo-1 cells were evaluated after 24 h. Cell differentiation was evaluated by analysis of total protein content (TP), collagen content and alkaline phosphatase (ALPase) activity at 7, 14 and 21 days and of mineralized matrix formation at 21 days. The results were compared by analysis of variance (ANOVA) and Tukey\'s test. RESULTS: Cell attachment (p=0.3485), cell viability (p=0.5516), collagen content (p=0.1165) and mineralized matrix formation (p=0.5319) were not affected by the different surfaces or by the addition of rhBMP-7 to the medium. Osteo-1 cells cultured on SLA surface presented a significant increase in TP at 21 days. The ALPase/TP ratio (p=0.0000) was affected by treatment and time. CONCLUSION: The results suggest that the addition of rhBMP-7 to the culture medium did not promote any effect on the adhesion, proliferation or differentiation of osteoblast-like cells grown on the different surfaces tested. All titanium surfaces analyzed permitted the complete expression of the osteoblast phenotype such as matrix mineralization by osteo-1 cells.

Orientadores: Francisco Humberto Nociti Junior, Karina Gonzales Silvério Ruiz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:11:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_Thaisangela_D.pdf: 14210209 bytes, checksum: 51042175513bdc9b288a951af21a21ac (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A formação deficiente do cemento acelular sobre a raiz dentinária de pacientes com hipofosfatasia (HPP) elucida a importância da expressão local da enzima fosfatase alcalina (TNAP) durante a cementogênese. Os objetivos desses estudos foram: i) apresentar dois casos clínicos de perda prematura de dentes decíduos diagnosticados como odonto-HPP; ii) caracterizar diferencialmente o perfil de expressão gênica de células da polpa e ligamento periodontal em indivíduos saudáveis e com HPP em relação a genes envolvidos com o metabolismo do fosfato inorgânico (Pi). iii) caracterizar o reparo e regeneração dos tecidos periodontais em modelo de fenestração periodontal realizado em camundongos com bloqueio do gene da proteína de anquilose (Ank KO). Métodos: i) Pacientes apresentaram esfoliação precoce dos decíduos aos dois anos de idade, mantendo-se em tratamento odontológico rigoroso. Ambos apresentaram baixos níveis séricos de fosfatase alcalina (ALP), porém sem anormalidade esquelética chegando-se ao diagnóstico de odonto-HPP; ii) Análise da expressão de genes associados à homeostasia entre fosfato e pirofosfato (Pi/PPi) foi realizada em tecidos da polpa e ligamento periodontal (PDL) de indivíduos saudáveis. Cultura de células primárias da polpa e PDL obtidas de pacientes saudáveis e com HPP foram estabelecidas para os ensaios de mineralização e expressão gênica; iii) Defeitos de fenestração periodontal (2mm/1mm/0,5mm) foram criados na vestibular de molares mandibulares de camundongos Ank KO e wild-type (WT). Após 15 e 30 dias das cirurgias, as mandíbulas foram coletadas para análise histológica, histomorfometria, avaliação in vivo com marcadores fluorescentes, e imunohitoquímica para proteínas da matriz extracelular. Resultados: i) Cuidados odontopediátricos e terapia periodontal de suporte foram realizados durante 19 anos com o objetivo de prevenir/adiar possíveis perdas de dentes permanentes; ii) Nos tecidos saudáveis, PDL manteve maior e significativa expressão basal para os genes reguladores chaves do PPi quando comparado com a polpa, como fosfatase alcalina (Alpl), proteína de anquilose pregressiva (Ank), e glicoproteína 1 (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 - Enpp1). In vitro, embora as alterações mais dramáticas fossem encontradas nas células do PDL, tanto as células HPP PDL como HPP-polpa exibiram significativamente baixa atividade de ALP, menor mineralização e expressões reduzidas dos genes associados com a mineralização e regulação do Pi/PPi, comparado ao controle; iii) Grande quantidade de novo cemento foi observada nos camundongos Ank KO após 15 e 30 dias da cirurgia. (p<0,05). Os marcadores fluorescentes indicaram maior atividade de deposição cementária nas áreas dos defeitos nos Ank KO vs. WT. Durante os períodos de 15 e 30 dias de cicatrização, regeneração do cemento e células associadas nos Ank KO recapitularam o padrão de expressão gênica mapeada durante o desenvolvimento, incluindo expressão limitada de BSP e forte OPN e DMP1 na matriz cementária, bem como elevada expressão de NPP1 nos cementoblastos. Conclusões: Dentro dos limites desse estudo, podemos concluir que: i) a perda prematura de dentes decíduos na ausência de desordens esqueléticas pode servir como um sinal inicial crítico para o diagnóstico de odonto-HPP e outros subtipos; ii) os dados sugerem que há uma diferença importante no comportamento in vitro entre as células controle e HPP, incluindo a expressão basal dos genes relacionados ao cemento bem como suas capacidades de promoverem a formação de minerais; iii) Dentro dos limites do estudo, os achados sugerem que níveis reduzidos de PPi local pode promover um aumento da regeneração do cemento. Portanto, a modulação entre Pi/PPi pode ser uma potente abordagem terapêutica para alcançar melhoras na regeneração do cemento. / Abstract: The defective formation of acellular cementum along the tooth root in patients with hypophosphatasia (HPP) have been highlighted the importance of local expression of alkaline phosphatase enzyme (TNAP) for cementogenesis. The aims of these studies were: i) to present two clinical cases that premature loss of primary teeth guided to the diagnosis of odontohypophosphatasia (odonto-HPP); ii) to determine factors contributing to the divergent response of the periodontium and dentin to alterations of phosphate (Pi) metabolism; and iii) to analyze tissue repair and regeneration in a periodontal fenestration model in Ank knock-out (KO) mice. Methods: i) Patients had teeth exfoliation at 2 yearsold, and have been under maintenance visits since then. Both exhibited low levels of serum alkaline phosphatase (ALP) activity, but no additional skeletal abnormalities, prompting a diagnosis of odonto-HPP; ii) Constitutive expression of Pi/PPi-associated genes in periodontal ligament (PDL) versus pulp tissues obtained from healthy subjects were analyzed. Primary cell cultures from control and HPP-PDL and pulp tissues were established to assay mineralization and gene expression; iii) Periodontal fenestration defects (2mm/1mm/0.5mm) were created on the buccal aspects of mandibular molars in Ank KO and wild-type (WT) mice. Mandibles were harvested at 15, and 30 days postsurgery for histology, histomorphometry, evaluation of in vivo fluorochrome labeling, and immunohistochemistry (IHC) for extracellular matrix proteins. Results: i) Pediatric dental care and supportive periodontal therapy were performed during the subsequent 19 years, aimed at avoiding or delaying loss of permanent teeth. ii) In healthy tissues, PDL maintained significantly higher basal expression of key PPi regulators, liver/bone/kidney alkaline phosphatase (Alpl), progressive ankylosis protein (Ank) and ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (Enpp1), versus pulp. In vitro, although more dramatic changes were found for PDL-harvested cells, both HPP-PDL and HPP-pulp cells exhibited significantly lower alkaline phosphatase activity, mineralization, and depressed expression of genes associated with mineralization and regulation of Pi/PPi, versus control cells. iii) A greater amount of new cementum was observed for Ank KO mice at 15 and 30 days post-surgery (p<0.05). Fluorochrome labeling further indicated a higher appositional activity in the defect areas in Ank KO vs. controls. At days 15 and 30 during healing, regenerating cementum and associated cells in Ank KO recapitulated expression patterns mapped during development, including limited BSP and strong OPN and DMP1 in the cementum matrix, as well as elevated NPP1 in cementoblasts. Conclusions: Within the limits of these studies, we can conclude that: i) premature loss of deciduous teeth in absence of skeletal disorders may serve as a critical trigger sign for diagnosis of odonto- HPP or other subtypes; ii) the data suggest that there are important differences in the in vitro behavior of control versus HPP cells, including basal expression of cementum-related genes as well as their capacity to promote mineral formation; iii) these findings suggest that reduced local levels of PPi can promote increased cementum regeneration. Therefore, local modulation of Pi/PPi may be a potential therapeutic approach for achieving improved cementum regeneration. / Doutorado / Periodontia / Doutor em Clínica Odontológica

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T14:08:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T14:08:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T14:08:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-06T14:08:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) Previous issue date: 2014-03-25 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alkaline phosphatase function is to catalyze the hydrolysis of a phosphomonoester, and thus has the property of removing phosphate groups 5' DNA and RNA, making it an important tool for genetic engineering. Expression of the E. coli alkaline phosphatase gene was obtained by cloning the gene into plasmid pBR322. Subsequently phoA structural gene was transferred to the vector pAC92 derivative of pUC18 where its expression was regulated partly yielding the recombinant plasmid capable of programming in E. coli highest level of expression. But this vector has the need to control the expression with glucose medium, otherwise the excess of the enzyme in the periplasm causes cell death of the host. In work carried out in the Laboratory of Technologies of DNA called a vector UFAM Pula was built from obtaining pAC92 promoter region, restored operator, cloned in a vector called pUN, this being the modified pUC18 lacking the gene for β - galactosidase and without its promoter region / operator of origin. This paper describes the expression of the alkaline phosphatase of E. coli by means of the adjustable jumps expression system and purification of this enzyme. Thus, the phoA gene was subcloned into the vector jumps successfully, yielding the vector pUNF, which appeared stable and functional, regulated by the induction of IPTG. The best expression of the enzyme in the system in question occurred in the middle with a concentration of 0.05 % glucose, with 1 mM IPTG and after 18 hours of induction. / A fosfatase alcalina tem como função catalisar a hidrólise de um fosfomonoéster, e assim, possui a propriedade de remover grupos de fosfatos 5’ de DNA e RNA, o que faz dela uma importante ferramenta para engenharia genética. A expressão do gene da fosfatase alcalina de E. coli foi obtida clonando-se o gene no plasmídeo pBR322. Posteriormente o gene estrutural phoA foi transferido para o vetor pAC92, derivado do pUC18, onde sua expressão ficou parcialmente regulada, originando o plasmídeo recombinante capaz de programar em E. coli maior nível de expressão. Porém este vetor possui a necessidade do controle da expressão com glicose no meio, do contrário, o excesso da enzima no periplasma causa a morte celular das hospedeiras. Em trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Tecnologias de DNA da UFAM um vetor denominado pULA foi construído a partir da obtenção da região promotora do pAC92, com operador restaurado, clonado em um vetor denominado de pUN, este sendo o pUC18 modificado sem o gene de β–galactosidase e sem sua região promotora/operadora de origem. O presente trabalho descreve a expressão da fosfatase alcalina de E. coli por meio do sistema de expressão regulável do pULA, assim como a purificação desta enzima. Dessa forma, o gene phoA foi subclonado no vetor pULA com sucesso, dando origem ao vetor pUNF, que se apresentou estável e funcional, regulado pela indução do IPTG. A melhor expressão da enzima no sistema em questão, ocorreu em meio com concentração de 0,05% de glicose, com um 1mM de IPTG e após 18 horas de indução.

Nesse trabalho, estudou-se a incorporação da fosfatase alcalina de placa óssea de ratos em dois tipos de sistemas modelo que mimetizassem uma membrana celular: as monocamadas de Langmuir e os filmes Langmuir-Blodgett (LB), ambos formados com fosfolipídios. No intuito de se investigar o papel da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GFI), covalentemente ligada ao grupo carboxi-terminal da cadeia polipeptídica, duas formas da enzima foram estudadas: uma com a âncora GFI intacta, solubilizada por ação de um tensoativo não-iônico, e a outra sem a parte hidrofóbica dessa âncora, clivada por ação de uma fosfolipase específica. A primeira forma enzimática foi chamada de FAT (fosfatase alcalina solubilizada por tensoativo), e a segunda de FAC (fosfatase alcalina clivada). Diferenças marcantes na atividade superficial foram observadas entre as duas formas. Comparativamente, a forma FAT adsorve mais rapidamente à interface ar/água que a forma FAC, que mostra um tempo de indução significativo. A incorporação da forma FAT às monocamadas de ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) também ocorre mais rapidamente que a forma FAC. No entanto, o uso de alta força iônica acelerou a adsorção da forma FAC à interface ar/água (com ou sem DMPA). Uma pressão de superfície de exclusão de 20mN/m foi encontrado para a forma FAC, enquanto para a forma FAT, essa pressão representa uma mudança no perfil das curvas pressão x tempo. Isso revelou que, devido à presença da âncora GFI, essa forma enzimática é capaz de incorporar às monocamadas de DMPA, mesmo em altas pressões de superfície. Isotermas superficiais de monocamadas mistas de DMPA e fosfatase alcalina também mostraram diferentes perfis para duas formas enzimáticas estudadas. Enquanto a forma FAT provoca uma alteração na compressibilidade em pressões de até 20mN/m, a forma FAC desloca a curva pressão x área para áreas mais elevadas. Tal fato foi explicado pelo fato da forma FAT incorporar na monocamada preferencialmente com a âncora GFI posicionada entre as cadeias apolares do DMPA, enquanto a forma FAC deva incorporar a cadeia polipeptídica à interface lipídica . Microscopias de fluorescência e no ângulo de Brewster revelaram que a forma FAT provoca agregação espontânea do DMPA na interface ar/água, levando a uma microeterogeneidade, na qual três fases distintas podem ser observadas. A obtenção de espectros de infravermelho na interface ar/água, associada com medidas de atividade catalítica in situ, revelou que a atividade da fosfatase alcalina é modulada pela capacidade de empacotamento interfacial, medida pelo módulo de compressibilidade superficial. Em 20mN/m, há uma reorganização molecular na interface, o que vai restringir a flexibilização da cadeia polipeptídicia, que estará voltada para a interface ar/água. No entanto, ao menos até 30mN/m, nenhuma alteração conformacional foi detectada, como revelada pelos espectros de infravermelho. Filmes LB mistos de DMPA e as duas formas de fosfatase alcalina revelaram que o empacotamento máximo de proteína depende da presença da âncora GFI. Dados usando microgravimetria, atividade enzimática, infravermelho, elipsometria, e microscopia de força atômica mostraram que a adsorção da âncora na interface posiciona o eixo maior do elipsóide, formador da cadeia polipeptídica, paralelamente à matriz lipídica. Na ausência da âncora GFI, o posicionamento da cadeia polipeptídica na interface é aleatório, e para um alto grau de empacotamento, as interações entre os resíduos de aminoácidos intermoleculares favorecerão o posicionamento do eixo maior do elipsóide em uma posição mais perpendicular à interface lipídica / Não consta

A fosfatase alcalina é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação, e é denominada \"alcalina\" por sua habilidade de efetuar estas reações mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para a obtenção de uma fração de membrana rica em fosfatase alcalina a partir de culturas de células osteoblásticas, provenientes de medula óssea de rato, sem a utilização de solventes orgânicos, colagenase ou outras proteases. O procedimento padronizado é simples e reprodutível, com a vantagem da considerável redução do tempo necessário para se obter esta fração de membrana, o que contribui para um menor efeito desnaturante sobre a enzima. A fosfatase alcalina é inserida à membrana plasmática por uma âncora GPI e foi solubilizada tanto com polidocanol (1%, p/v) quanto com PIPLC (0,2 U/mL), hidrolisando diversos substratos (PNFF, ATP, PPi, ADP, ?-glicerofosfato, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato) e sendo inibida por inibidores clássicos deste grupo de enzimas (levanisol, teofilina, ZnCl2, vanadato, fosfato e arsenato). Os efeitos de lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:DPPS (9:1 e 8:2, razão molar) e DPPC:DODAB (9:1 e 8:2, razão molar) na habilidade tanto de inserção da enzima nos sistemas vesiculares, bem como de modulação da atividade da enzima reconstituída, também foram avaliados. A reconstituição da fosfatase alcalina nos lipossomos mistos constituídos de DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) e DPPC:DODAB (8:2) proporcionou máxima incorporação da atividade PNFFase da enzima (cerca de 90%, 75% e 90%, respectivamente) após 4 horas, 5 horas e 40 minutos, respectivamente, de incubação dos diversos lipossomos com a proteína. No entanto, utilizando lipossomos de DPPC:DODAB (9:1), apenas cerca de 50% da atividade PNFFase da enzima foi incorporada aos sistemas mesmo após 5 horas de incubação. Para os lipossomos com carga positiva, uma maior proporção de DODAB nos sistemas de DPPC favoreceu a inserção da fosfatase alcalina aos sistemas após um curto período de incubação. Para os lipossomos com carga negativa, as diferentes proporções de DPPS utilizadas não exerceram grande influência tanto na velocidade de incorporação quanto na quantidade de enzima incorporada aos sistemas. Para todos os sistemas utilizados, o processo de incorporação é tempo dependente. A eletroforese dos proteolipossomos de DPPC revelou a presença de uma única banda protéica bem intensa, com massa molecular ao redor de 60 kDa (quando desnaturada), que apresentou atividade de fosfomonohidrolase em condição não-desnaturante, com massa molecular de 120 kDa. Assim, com esta estratégia, foi possível obter proteolipossomos ricos em fosfatase alcalina devido à inserção preferencial da âncora de GPI às bicamadas lipídicas, em detrimento das outras proteínas que não interagem favoravelmente com os sistemas vesiculares, comprovando que a metodologia de reconstituição padronizada pode ser usada eficientemente na obtenção de sistemas de proteolipossomos sem a necessidade de uma etapa de purificação prévia da enzima solubilizada, de modo a se obter um máximo de incorporação da enzima às vesículas com mínima perda em atividade. A reconstituição da enzima empregando-se células ghost resseladas foi obtida incubando-se volumes iguais de enzima (23 ?g/mL) e células ghost (0,22 mg/mL), por 2 horas, a 25ºC, com cerca de 40% da atividade PNFFase da fosfatase alcalina incorporada às vesículas. Para verificar o efeito do microambiente da membrana sobre a atividade da enzima reconstituída, foram determinados os parâmetros cinéticos de hidrólise para diferentes substratos (ATP, PPi e PNFF). Para todos os substratos, uma única classe de sítios de hidrólise foi observada, com valores de K0,5 que variaram de 0,14 a 2,7 mM. Excesso de PPi e ATP no meio reacional inibiu as atividades PPase e ATPase da enzima reconstituída, respectivamente, em todos os sistemas estudados. A hidrólise de PPi apresentou efeitos cooperativos positivos para todos os sistemas, enquanto que para a hidrólise de ATP, uma pequena cooperatividade positiva foi observada apenas para os sistemas constituídos de DPPC e contendo DPPS em sua composição. Assim, a enzima não perdeu a habilidade de hidrolisar nenhum dos substratos quando reconstituída nos diferentes sistemas vesiculares, e todos os dados obtidos reforçam a hipótese de que a composição lipídica do microambiente onde a fosfatase alcalina se encontra exerce grande influência na modulação tanto da atividade da enzima quanto da interação da mesma com os sistemas vesiculares. Assim, os resultados obtidos fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão dos mecanismos de interação da fosfatase alcalina com a membrana, quanto para estudos da função da enzima durante o processo de biomineralização. / Alkaline phosphatase is a multifunctional enzyme, capable of hydrolyzing phosphate monoesters, pyrophosphate, phosphodiesters, as well as catalyzing transphosphorylation reactions, and it is named \"alkaline\" due to its ability to perform these reactions more efficiently in pH above the neutral (pH 8-11). The aim of this work was to standardize a methodology to obtain a membrane fraction rich in alkaline phosphatase from osteoblastic cells cultures, originated from rat bone marrow, without the use of organic solvents, collagenase or others proteases. The standardized procedure is simple and easy to reproduce, with the advantage of considerable reduction in the time needed to obtain this membrane fraction, which contributes to a smaller denaturing effect on the enzyme. Alkaline phosphatase is a membrane-bound enzyme attached to the cell membrane via a GPI anchor and was solubilized with both polidocanol (1%, w/v) and PIPLC (0,2 U/mL), hydrolyzing several substrates (PNPP, ATP, PPi, ADP, beta-glycerophosphate, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate) and being inhibited by some classical inhibitors of this group of enzymes (levamisole, theophylline, ZnCl2, vanadate, phosphate and arsenate). The effect of liposomes constituted by DPPC, DPPC:DPPS (9:1 and 8:2, molar ratio) and DPPC:DODAB (9:1 and 8:2, molar ratio) on the enzyme insertion ability in the vesicular systems and activity modulation of the reconstituted enzyme were also evaluated. The alkaline phosphatase reconstitution in the mixed liposomes constituted by DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) and DPPC:DODAB (8:2) presented maximum incorporation of the PNPPase enzyme activity (about 90%, 75% and 90%, respectively) after 4 hours, 5 hours and 40 minutes, respectively, of incubation of the several liposomes with the protein. However, using DPPC:DODAB (9:1) liposomes, only about 50% of the PNPPase enzyme activity was incorporated in the systems, even after 5 hours of incubation. For positive charged liposomes, a higher proportion of DODAB in the DPPC systems favored the alkaline phosphatase insertion into it after a short period of incubation. For negative charged liposomes, the different proportions of DPPS used did not have a big influence in both, incorporation velocity and quantity of incorporated enzyme into the systems. For all the systems used, the incorporation process is time dependent. SDS-PAGE of the DPPC proteoliposomes revealed only a single protein band, with molecular mass of about 60 kDa (when denaturated), which presented phosphomonohydrolase activity under non-denaturing conditions, with molecular mass of about 120 kDa. Thus, using this strategy, it was possible to obtain proteoliposomes rich in alkaline phosphatase due to the preferential insertion of the GPI anchor in the lipid bilayers, since the other proteins do not interact favorably with the vesicular systems. This proves that the standardized methodology for reconstitution can be used efficiently to obtain proteoliposomes systems without prior purification of the solubilized enzyme, with its maximum incorporation in the vesicles and a minimum loss of activity. The reconstitution of the enzyme using resealed ghost cells was obtained by incubating equal volumes of enzyme (23 microg/mL) and ghost cells (0,22 mg/mL), for 2 hours, at 25ºC, with about 40% of the alkaline phosphatase PNPPase activity being incorporated into the vesicles. To verify the effect of the membrane microenvironment on the activity of the reconstituted enzyme, the kinetic parameters for the hydrolysis of different substrates (ATP, PPi and PNPP) were determined. For all the substrates, only one class of hydrolysis sites was observed, with K0,5 values that varied from 0,14 to 2,7 mM. Excess of PPi and ATP in the reaction medium inhibited the PPase and ATPase activities of the reconstituted enzyme, respectively, in all systems studied. PPi hydrolysis presented positive cooperative effects for all systems, while for ATP hydrolysis a small positive cooperativity was observed only for the systems constituted by DPPC and containing DPPS in its composition. Thus, the enzyme did not lose the ability to hydrolyse any of the studied substrates when reconstituted in the different vesicular systems and all the data obtained strengthen the hypothesis that the lipid composition of the microenvironment where the alkaline phosphatase is located plays a great influence on the modulation of both enzyme activity and enzyme interaction with the vesicular systems. Thus, the results obtained provide new information that could contribute to the comprehension of the interaction mechanisms of the alkaline phosphatase with the membrane, as well as to studies of the enzyme function during the biomineralization process.