Le traitement du cancer par thérapie génique nécessite d’une part des gènes suicides efficaces et, d’autre part, l’adressage spécifique de ces gènes aux cellules cancéreuses. J'ai d'abord caractérisé un nouveau gène suicide dérivé de la désoxycytidine kinase humaine (dCK) : le M36. Comparé à la dCK, le M36 permet une meilleure sensibilisation des certaines cellules cancéreuses aux traitements avec différents chimiothérapeutiques comme la gemcitabine et la cytarabine. Ces résultats sont particulièrement encourageants pour l'élimination des cellules cancéreuses résistantes à ces traitements du fait d’un défaut de la dCK. Dans une deuxième partie, je me suis intéressée à l'adressage spécifique des transgènes aux cellules cancéreuses par les vecteurs lentiviraux. J'ai travaillé à la preuve de concept qu’une enveloppe (Env) VIH modifiée peut permettre un tel ciblage. J'ai généré une Env qui a fortement diminué son tropisme naturel et qui comporte un motif liant le marqueur tumoral modèle HER2. / Cancer gene therapy requires the use of an effective suicide gene and the specific targeting of cancer cells. In my PhD work, I have first characterized a new potential suicide gene derived from human deoxycytidine kinase (dCK): M36. Compared to dCK, M36 improves sensitization of certain cancer cells to treatment with chemotherapeutic compounds as gemcitabine and AraC. These results are particularly encouraging for the elimination of cancer cells resistant to the treatment because of a defect with dCK. In a second part, I have worked at the proof of concept that a modified HIV envelope can allow specific targeting of cancer cells by lentiviral vectors. During this work, I have generated a CD4i envelope with a strongly diminished natural tropism and that carries a motif known to bind the model cell surface cancer marker HER2. This envelope constitutes a good starting material to be improved by evolution in cell culture to obtain specific targeting of HER2+ cells.

Le travail de recherche de cette thèse consiste en le développement de nouveaux matériaux hybrides organiques-inorganiques pour des applications en nanotechnologie, nanomédicine et diagnostic. Dans ce contexte, des cristaux poreux de zéolite-L ont été utilisé comme nano-vecteur pour faire de la transfection d’ADN et d’ANP, en combinaison avec le relargage de molécules hôtes placées dans les pores. Des nanoparticules de silice mesoporeuses multifonctionnelles ont été utilisées pour traiter le glioblastome, en combinant la thérapie génique avec l’administration durable d’un principe actif. Des nano-coquilles hybrides biodégradables ont été encore développés pour encapsuler des protéines et les relâcher dans les cellules vivantes. Dans le domaine de la détection d’acides nucléiques, des fibres optiques à cristal photonique, fonctionnalisées avec des sondes d’ANP, ont été exploitées comme plateformes optiques pour faire de la détection ultra-sensible d’oligonucléotides ou d’ADN génomique. Enfin, la squelette de l’ANP a été modifié à créer des sondes fluorescentes pour reconnaître et détecter la présence des séquences cibles spécifiques. / The research work presented throughout this thesis focuses on the development of novel organic-inorganichybrid materials for applications in nanotechnology, nanomedicine and diagnostics. In such a context, porous zeolite-L crystals have been used as nanocarriers to deliver either DNA or PNA in live cells, in combination with the release of guest molecules placed into the pores. Multifunctional mesoporous silica nanoparticles have been designed to treat glioblastoma, combining gene therapy with the sustained delivery of a chemotherapy agent. Biodegradable hybrid nano-shells have been furthermore created to encapsulate proteins and release them in living cells upon degradation of the outer structure in reductive environment. In the field of nucleic acid detection, photonic crystal fibers, functionalized with specific PNA probes, have been exploited as optical sensing devices to perform ultra-sensitive detection of DNA oligonucleotides or genomic DNA. Eventually, the PNA backbone has served as scaffold to synthesize fluorescent switching probes able to recognize and to detect the presence of specific target sequences.

L’expression d’un transgène grâce au vecteur AAV offre une perspective thérapeutique très prometteuse dans le traitement de maladies monogéniques. Malheureusement, il apparait souvent que des réponses immunes contre le vecteur et le transgène conduisent à un rejet des cellules transduites ainsi qu’à la mise en place d’une mémoire immunitaire spécifique empêchant un nouveau traitement ultérieur. Avec la perspective d’éviter tout rejet immun des cellules transduites, j’ai développé deux approches distinctes. D’une part, nous avons développé un système dans lequel l’expression du transgène est déstabilisée dans les cellules présentatrices de l’antigène grâce à l’ajout de cibles du miRNA 142.3p qui est spécifiquement exprimé dans le système hématopoïétique. Nous avons ainsi montré que la réponse immunitaire contre le transgène était favorisée par la transduction des cellules présentatrices de l’antigène par le vecteur, conduisant à la présentation directe du produit du transgène. En comparant l’initiation des réponses immunes contre plusieurs transgènes modèles, nous avons montré que la réponse immune dirigée contre le transgène pouvait être contrôlée mais que celle-ci dépendait étroitement de l’immunogénicité intrinsèque du transgène en question, c'est-à-dire de la présence d’épitopes reconnus par des lymphocytes T CD4 auxiliaires ainsi que par les lymphocytes B. Une autre approche a concerné l’utilisation de lymphocytes T régulateurs exprimant le facteur de transcription Foxp3 (Treg) et plus particulièrement l’étude de leur mode d’induction in vivo. La présence de Treg conférant une tolérance immunitaire spécifique du transgène a été décrite dans diverses situations et les Treg induits à partir de CD4+ matures (pTreg/iTreg) semblent avoir un potentiel thérapeutique important. Cependant, la population précise de lymphocytes CD4+ à même d’être convertie en Treg n’avait pas été identifiée auparavant. Au cours de mes travaux, analysant la capacité de conversion de cellules naïves, mémoires ou de récents émigrants thymiques, j’ai mis en évidence que le potentiel de conversion des lymphocytes CD4 naïfs issus de souris âgées était diminué et que ceci était dû à une caractéristique intrinsèque des lymphocytes T CD4+ provenant de telles souris. Enfin, nous avons montré que cette faible capacité de conversion des lymphocytes CD4 naïfs en Treg était associée à un rejet de greffe accru dans un modèle de transplantation de peau, montrant que la sénescence peut impacter négativement des protocoles d’induction de tolérance faisant appel à l’induction de Treg en périphérie. / Transgene expression through AAVvectors offers a very promising therapeutic perspective in the treatment of monogenic disorders. Unfortunately, it often appears that the immune responses against the transgene and the vector lead to the rejection of transduced cells and to an establishment of a specific immune memory preventing further processing. With a view to avoid immune rejection of transduced cells, I developed two distinct approaches.First, we have developed a system where the transgene expression is destabilized in the antigen presenting cells by addition of the target miRNA 142.3p which is specifically expressed in the hematopoietic system. We have shown that the immune response against the transgene was favored by transduction of antigen presenting cells with the vector, leading to the direct presentation of the transgene product. Comparing the initiation of immune responses against more transgenes models, we showed that the immune response against the transgene could be controlled but it depended greatly on the intrinsic immunogenicity of the transgène: the presence of epitopes recognized by T helper cells and CD4 by B lymphocytes. Another approach has involved the use of regulatory T cells expressing the transcription factor Foxp3 ( Treg ) and more specifically the study of their mode of induction in vivo. The presence of Treg conferring transgene -specific immune tolerance has been described in various situations and induced Treg from CD4 + mature ( pTreg / iTreg ) appear to have a significant therapeutic potential . However, the precise population of CD4 + lymphocytes capable of being converted into Treg was not identified previously. During my work, analyzing the conversion capacity naive, memory cells or thymic recent emigrants, I highlighted that the potential of conversion of naive CD4 lymphocytes from old mice was decreased and this was due to an intrinsic defect of CD4 + T cells from such mice. Finally, we showed that low conversion ability of CD4 naive Treg was associated with an increased graft rejection in a model of skin transplantation, showing that senescence may negatively impact protocols of tolerance induction using induction of Treg in the periphery.

Les thérapies anticancéreuses ont connu ces dernières années un développement important ayant pour conséquence une amélioration dans la qualité de vie des patients. Cependant la survenue de résistances et la part significative de cancer sans traitement efficace nous oblige à envisager le développement de nouvelles stratégies anticancéreuses. Nous avons développé une nouvelle technique basée sur le principe du gène suicide en utilisant le gène du cytochrome P450 2B6 associé au cyclophosphamide (CPA). Cette technique qui consiste au transfert d’un gène métabolisant une prodrogue anticancéreuse dans la tumeur permet une sensibilisation des tumeurs à cette prodrogue. Le premier objectif de ce travail a consisté à améliorer le métabolisme de la prodrogue en construisant un gène muté du CYP2B6 en fusion avec la réductase, partenaire indispensable du CYP. Dans un deuxième temps nous avons transféré le gène CYP2B6TM-RED dans des cellules tumorales qui sont devenues sensibles au CPA entrainant une éradication des tumeurs. Ces résultats ont été confirmés in vivo sur des modèles de souris immunocompétentes. Nous avons, en plus de l’effet cytotoxique, mis en évidence un important effet bystander et le développement d’une immunité antitumorale spécifique. Ceci nous laisse penser que cette méthode peut permettre de protéger contre les récidives et les métastases. Les bons résultats obtenus dans le développement de cette nouvelle stratégie anticancéreuse, nous laissent espérer d’un futur passage en clinique. Pour cela de nouveaux modèles animaux devront être mis au point pour optimiser le transfert du transgène dans les tumeurs. / Anticancer therapies had, in recent years, an important development that results in an improvement in the quality of life of patients. However, the occurrence of resistance and the significant proportion of untreated cancer force us to consider the development of new anticancer strategies. We have developed a new technique based on the principle of suicide gene using the gene of cytochrome P450 2B6 associated with cyclophosphamide (CPA). This technique involves the transfer of a gene metabolizing an anticancer prodrug within the tumor allowing tumors sensitization to this prodrug. The first objective of this work was to improve the metabolism of the prodrug in building a mutated CYP2B6 fused with the reductase gene essential partner of CYP. In a second step we transferred the CYP2B6TM-RED gene in tumor cells that have been significantly sensitized. These results were confirmed on in vivo models of immunocompetent mice. In addition to the cytotoxic effect, mice were able to develop a specific anti-tumor immunity. This suggests to us that this method can protect against recurrence and metastasis. The good results obtained in the development of this new anticancer strategy, let us hope for a future transition into clinic. For this, new animal models will be developed to definitively validate the method.

Mycobacterium ulcerans (MU), agent causatif de l'ulcère de Buruli (UB), une maladie infectieuse humaine émergente, est associé aux milieux aquatiques tropicaux, et en particulier ceux modifiés par les activités humaines. L’écologie de cette mycobactérie est encore peu informée, et des interrogations demeurent sur son cycle de transmission au sein des écosystèmes et à l’humain. La tendance observée aujourd’hui en recherche est de montrer l’existence d’une multitude de taxa porteurs du bacille au sein des écosystèmes aquatiques mais aussi terrestres, laissant donc imaginer qu’un ou quelques facteurs en commun puissent expliquer sa présence et son développement. Dans ce contexte, nous avons développé des approches expérimentales au laboratoire pour analyser les effets de paramètres environnementaux, sélectionnés comme être importants dans la définition de la niche écologique de MU, sur le maintien et le développement des populations bactériennes. En tenant compte de gammes de valeurs rencontrées dans des régions endémiques et non endémiques, où sévit, nous avons testé dans un premier temps l'effet de deux polysaccharides très largement présents dans les écosystèmes naturels (la chitine et l’amidon) ainsi que cinq composants chimiques (le fer, le calcium, le zinc, le phosphate et le sulfate), représentant des nutriments indispensables pour les bactéries, sur la croissance de MU. Notre travail montre que la chitine augmente de manière très significative la croissance de MU. A l’inverse, la présence d’amidon ne favorise pas son développement. Le calcium est le seul élément chimique à contribuer à l’augmentation de quantité de cellules de MU avec le temps, mais ce paramètre reste toutefois très marginal. L’absence d’effet joué par le fer, le zinc, le sulfate et le phosphate sur la croissance in vitro de MU tend à indiquer que les valeurs utilisées dans nos expériences correspondent à des valeurs limites pour expliquer la distribution géographique de MU dans les écosystèmes aquatiques tropicaux. Dans un deuxième temps, eu égard au peu d‘informations existant concernant le rôle joué par le pH sur la présence et le développement de MU, nous avons reproduit des environnements pour étudier la croissance de MU en fonction de différentes valeurs de pH rencontrées dans des régions du Cameroun et de Guyane française où la mycobactérie peut être présente ou absente. Nos résultats montrent que le pH présente un effet significatif sur la dynamique de croissance de MU avec un effet plus marqué pour des valeurs de pH proches de 6,0. De plus, il existe une forte interaction entre pH et chitine puisque pour des mêmes valeurs de pH, la croissance bactérienne est 10 fois plus importante en présence de milieu avec chitine. Ces résultats suggèrent aussi que des pH trop acides, inférieurs à 5,0, sont défavorables à la croissance de la mycobactérie.Finalement, nous nous sommes intéressés à l’expression génique de différents isolats de MU générés à partir de différents environnements expérimentaux. Pour ce faire, et en nous servant d’une nouvelle approche de séquençage des ARN, nous avons étudié l’expression de MU dans différents environnements ; Nous nous sommes notamment intéressés à l’expression des gènes impliqués dans les voies métaboliques de production de la mycolactone, le peptide responsable des ulcérations chez l’humain. Des contextes environnementaux spécifiques pourraient conduire à une sur-expression de toxine peptidique traduisant ainsi une écologie et une épidémiologie (micro-)contexte-dépendant ayant des incidences pathologiques et cliniques très particulières.Dans leur ensemble, nos résultats participent à une recherche permettant de mieux comprendre les paramètres clés de la niche écologique de M. ulcerans et au-delà contribue à l’identification des écosystèmes aquatiques favorables, ou non, au maintien et au développement de cette mycobactérie responsable de l’ulcère de Buruli. / Mycobacterium ulcerans (MU), the causative agent of Buruli ulcer (BU), an emerging human infectious disease, is associated with tropical aquatic environments, particularly those modified by human activities. The ecology of this mycobacterium is still poorly understood, and questions remain about its transmission cycle within ecosystems and from nature to humans. Nowadays the research orientation is to show the existence of a multitude of host taxa carrying the bacillus in both aquatic and riparian ecosystems. Thus, it is likely to think that one or a few common factors might contribute and explain the presence and development of this bacillus across distinct localities and regions.In this context, we have developed experimental approaches in the laboratory to analyze the effects of several environmental parameters, selected as being important in the definition of the MU ecological niche and in its growth and persistence in natural ecosystems. Considering ranges of values encountered in endemic and non-endemic regions where BU occurs, we first tested the effect on MU growth of two polysaccharides widely present in nature (chitin and starch) and five chemical components (iron, calcium, zinc, phosphate and sulfate) representing essential nutrients for bacteria. Our work shows that chitin increases significantly the growth of MU. Conversely, the presence of starch does not favor its development with time. Calcium is the only chemical element contributing to increase MU cell number over time, but this effect remains very marginal. The lack of effect exerted by iron, zinc, sulfate and phosphate on the in vitro growth of MU suggests that values used in our experiments correspond to the limit values to explain the geographical distribution of MU in tropical aquatic ecosystems.Secondly, given the few existing information about the role of pH on the presence and development of MU in natural settings, we have reproduced in the lab some environments to study the growth of MU depending on different pH values encountered in regions of Cameroon and French Guiana where the mycobacterium can be present or absent. Our results show that pH has a significant effect on MU growth with a greater effect at pH values close to 6.0. In addition, there is a strong interaction between pH and chitin as to the same pH bacterial growth is 10 times greater in the presence of medium with chitin. These results also suggest that pH too acidic, lower than 5.0 are unfavorable for MU growth.Finally, we looked at gene expression of different MU cultures from different experimental frameworks. Here, and by making use of a new RNA sequencing approach, we studied the genetic expression of MU in differents environments. We are especially interested in the expression of genes implicated in the metabolic pathways of mycolactone production, the peptide toxin responsible of ulcerations in human. Specific environmental contexts could lead to an over-expression of these genes by MU populations, thus pinpointing the fact that MU ecology and epidemiology could be (micro-) context-dependent having some pathological and clinical implications. Taken together, our results participate in a research allowing to better understand the key parameters of the ecological niche of MU, and beyond helping to identify the aquatic ecosystems favorable or not to the maintenance and development of this mycobacterium responsible for Buruli ulcer.

Le syndrome d’Usher (USH) associe une surdité neurosensorielle congénitale et une perte progressive de la vision par rétinite pigmentaire. Pendant ma thèse, l’essentiel de mon travail a porté sur un gène responsable du syndrome d’Usher de type 2, USH2A. Ce gène code pour l’usherine, une protéine associée aux liens fibreux interstéréociliaires situés à la base de la touffe ciliaire des cellules ciliées de la cochlée. Ces liens transitoires disparaissent autour du 9e jour post-natal (P9), chez la souris et le complexe moléculaire associé à ces liens inclut l’usherine, adgrv1 (un récepteur membranaire couplé aux protéines G), la whirline, et pdzd7 (deux protéines sous-membranaires d’échafaudage contenant des domaines PDZ). Des travaux précédents ont montré que l’interaction de ces quatre protéines était nécessaire à un développement correct de la touffe ciliaire, qui lui-même conditionne la transduction mécano-électrique opérée par les cellules ciliées. Pendant ma thèse, j’ai étudié les effets, à court terme et à long terme, de l’absence de la plus longue des 2 isoformes connues de l’usherine, l’isoforme-b transmembranaire, sur des souris mutantes pour le gène Ush2a (Ush2aΔTM/ΔTM). Chez ces souris, j’ai effectué des mesures de courants de transduction mécano-électrique, des enregistrements des potentiels évoqués auditifs (PEA), des tests de masquage auditif, et une analyse morphologique des cellules ciliées par imagerie au microscope électronique à balayage. Ainsi, j’ai pu montrer que les liens interstéréociliaires basaux étaient présents à P4 et que les courants de transduction mécano-électrique étaient normaux à P7. L’absence de l’isoforme-b de l’usherine n’a, en fait, que très peu de conséquences morphologiques et fonctionnelles sur la touffe ciliaire des cellules ciliées de la cochlée durant les 3 ou 4 premiers mois de vie chez la souris. A partir de l’âge de 4 mois cependant, les souris Ush2aΔTM/ΔTM souffrent d’une perte progressive de l’audition et d’anomalies de la sélectivité dans l’analyse des fréquences du son, dues surtout à un dysfonctionnement des cellules ciliées externes. Ces résultats viennent alimenter le débat sur le caractère progressif de la surdité du syndrome d’Usher de type 2A. La surdité des patients USH2A est considérée comme étant le plus souvent non progressive, mais plusieurs études ont révélé que certains patients souffrent en fait d’une surdité progressive. Mon travail a permis de montrer que chez la souris, la surdité en rapport avec des mutations d’Ush2a peut également être progressive. L’existence potentielle d’une fenêtre temporelle chez les patients USH2A dont la surdité moins sévère à la naissance, va ensuite s’aggraver, pourrait permettre d’envisager dans le futur un traitement curatif précoce du déficit auditif de ces patients, par thérapie génique. / Usher syndrome (USH) is characterised by a sensorineural congenital deafness and a progressive loss of vision by retinitis pigmentosa. During my PhD, my main focus of study was a gene responsible for Usher syndrome type 2, USH2A. This gene codes for usherin, a protein associated with the fibrous links located at the base of the hair bundle of cochlear, and vestibular hair cells. In mice, these transitory links start to disappear as of postnatal day 9 (P9), and the molecular complex with which they are associated is composed of usherin, adgrv1 (an adhesion G protein coupled receptor), whirlin, and pdzd7 (two submembranous PDZ domain-containing scaffold proteins). Previous work has shown that the interaction in between these 4 proteins is essential for the development of the hair bundle, the structure responsible for the initiation of the mechano-electrical transduction (MET) process in the hair cells. During my thesis, I studied the short term and long term effects of the absence of the longest of the 2 usherin isoforms, the transmembrane b-isoform, in mice carrying a mutation in the Ush2a gene (Ush2aΔTM/ΔTM). In these mice, I measured mechano-electrical currents, auditory brainstem responses, undertook auditory masking tests, and analysed scanning electron micrographs of cochlear hair bundles. Through this work, I showed that basal lateral links similar to ankle links could be observed on P4, and that MET currents were normal on P7. The absence of the long b-isoform of usherin actually has very little effect on the morphology or the function of the cochlear hair bundle in mice, until 3 or 4 months of age. As of 4 months old however, Ush2aΔTM/ΔTM mice suffer from a progressive hearing loss, and frequency selectivity defects, mainly cause by a dysfunction of outer hair cells. These results will further add to the debate on whether the hearing loss in Usher syndrome type 2A is progressive or not. Hearing loss in USH2A patients is generally considered non progressive, but several studies have given indication to the contrary. My work has shown that in mice, deafness caused by mutations to the Ush2a gene can also follow a progressive pattern. The potential existence of this temporal window in USH2A patients whose hearing impairment is less severe at birth, but gets worse over time, could allow clinicians to use gene therapy as curative treatment for patients who fall into this category.

Les nématodes à kystes sont l’un des bioagresseurs causant le plus de dégâts sur les cultures de pommes de terre. La résistance trouvée chez l'accession spl88S.329.18, issue de l'espèce Solanum sparsipilum est caractérisée par un déterminisme oligogénique avec un QTL à localisé sur le chromosome V (GpaVspl) et un QTL mineur localisé sur le chromosome XI(GpaXIspl). Pour obtenir une résistance de haut niveau, l'effet du QTL GpaVspl, doit êtrecomplémenté par celui du QTL à effet faible GpaXIspl. Par génomique comparative, le locusGpaV a été localisé dans un intervalle compris entre 16 et 60 kb sur les génomes de la tomateet des espèces apparentées à la pomme de terre, Solanum demissum et Solanum phureja. Deuxgènes ont été annotés dans cet intervalle sur les génomes de la tomate et de S. demissum : lepremier appartient à la famille des TIR-NBS-LRR (TNL), famille de gènes de résistanceclassiques, et le second appartient à la famille des « mitochondrial, transcription terminationfactor » (mTERF), dont l’implication dans des mécanismes de résistance n’a jamais étédémontrée.Les objectifs de ma thèse étaient d'identifier le(s) gène(s) responsable(s) de la résistance àG. pallida, conférée par le locus GpaVspl, et d'étudier sa régulation. Suite à la publication de laséquence du génome de S. phureja, en 2011, nous avons mis en évidence que le locus GpaVétait dupliqué chez S. phureja et que cette duplication était également présente chezS. sparsipilum. Les quatre gènes annotés au locus GpaVspl ont été nommésSpl_mTERF18430, Spl_TNL18429, Spl_mTERF18453 et Spl_TNL18428.L'effet des deux gènes Spl_mTERF18430 et Spl_TNL18428 sur la résistance à G. pallida aété analysé via des expériences de transformation génétique suivies par des tests de résistancesur les plantes transformées. Un effet partiel du gène Spl_TNL18428 sur la résistance àG. pallida a été mis en évidence par complémentation de plantes sensibles. Aucun effetsignificatif n'a été détecté pour le gène Spl_mTERF18430. Des expériences d'extinctiongénique suggèrent que le deuxième gène TIR-NBS-LRR, Spl_TNL18429, qui est égalementexprimé dans les racines et qui présente un fort pourcentage d'identité de séquence avec legène Spl_TNL18428, pourrait également être impliqué dans la résistance à G. pallida.L'expression du gène rapporteur GFP, placé sous le contrôle du promoteur du gèneSpl_TNL18428, est fortement induite dans les cellules situées autour du syncytium. Cecirenforce l'hypothèse d'une implication du gène Spl_TNL18428 dans la résistance à G. pallida,car la localisation de l'expression de la GFP est similaire à celle de la nécrose, qui estcaractéristique de la réaction développée par les plantes résistantes autour du syncytium induitpar les nématodes.En tenant compte des données bibliographiques récentes, montrant que plusieurs gènes NBSLRRpeuvent être indispensables à l'expression d'une résistance, nos résultats suggèrent queles deux gènes Spl_TNL18428 et Spl_TNL18429 sont nécessaires à l'expression de larésistance à G. pallida / Cyst nematodes are one of the pests that cause the most damage to potato cultures. Resistance found in the accession spl88S.329.18 in Solanum sparsipilum is characterized by oligogenic determinism with a strong effect QTL on chromosome V (GpaVspl) and a minor effect QTL on chromosome XI (GpaXIspl). To obtain a high level of resistance, the effect of QTL GpaVspl must be complemented by the low effect QTL GpaXIspl. By comparative genomics, the GpaV locus was located in a range between 16 and 60 kb in genomes of tomato and potato related species: Solanum demissum and Solanum phureja. Two genes were annotated: the first belonging to the TIR -NBS -LRR gene family (TNL) and the second one belonging to the “mitochondrial transcription termination factor” family (mTERF). The effect of both genes -Spl_TNL18428 and Spl_mTERF18430- on resistance to G. pallida were analyzed via genetic transformation experiments followed by resistance tests on transformed plants. A partial effect of Spl_TNL18428 on resistance to G. pallida was identified by complementation of susceptible plants. Gene silencing experiments suggested that Spl_TNL18429, which occurs in roots and presents a high percentage of sequence identity with the gene Spl_TNL18428, is also involved in resistance to G. pallida. The expression of the GFP reporter gene, under the control of the Spl_TNL18428 gene promoter, is strongly induced in cells located around the syncytium. This strengthens the hypothesis of an involvement of Spl_TNL18428 gene in resistance to G. pallida, because the location of GFP expression is similar to necrosis, which is characteristic of resistant plants. Taking into account that recent data showing that several NBS-LRR genes may be essential for the expression of resistance, our results suggest that both Spl_TNL18428 and Spl_TNL18429 genes are necessary for the expression of resistance to G. pallida

Nous avons étudié les mécanismes adaptatifs induits par une surnutrition hyperlipidique (+757 kcal/j) de 56 jours sur le métabolisme énergétique et le muscle squelettique chez des sujets sains. En parallèle, nous avons étudié les mécanismes adaptatifs induits par une surnutrition en fructose de 7 jours sur le métabolisme énergétique et le muscle squelettique chez des sujets apparentés diabétiques de type 2 et nous avons réalisé des études in vitro sur myotubes humains afin d'identifier le médiateur contribuant aux effets du fructose. Ces deux surnutritions contribuent à augmenter le poids corporel. Ces modifications sont accompagnées par l'oxydation préférentielle des glucides au détriment des lipides. La surnutrition hyperlipidique induit, au niveau musculaire, une diminution de l'expression de PDK4 qui pourrait être la conséquence de la diminution de la concentration en NAD+ associée à la baisse de l'activité de SIRT1 comme supportée par l'hyperacétylation de PGC1alpha. Bien que l'activation de la voie SIRT1/PGC1alpha semble réduite, la surnutrition hyperlipidique est associée à une augmentation de l'expression des gènes liés à la mitochondrie. La surnutrition riche en fructose induit quant à elle, au niveau musculaire, une baisse de l'expression de nombreux gènes liés à l'oxydation des lipides et à la mitochondrie comme CPT1 et MLYCD. Les études in vitro suggèrent que le fructose agit de manière indirecte sur le muscle squelettique. Ce travail de thèse met en lumière les conséquences d'une balance énergétique positive induite par la surconsommation de lipides ou de fructose sur le métabolisme énergétique et l'expression génique du muscle squelettique / We studied the effects of a high-fat overfeeding (+757 kcal/d) during 56 days on energy metabolism and skeletal muscle of healthy subjects. ln parallel, we studied the effects of high fructose overfeeding during 7 days on energy metabolism and skeletal muscle of first-degree relatives of type 2 diabetic patients and we performed in vitro studies with human myotubes to identify the mediator contributing to the fructose effects. High-fat and high-fructose overfeeding both contribute to increase body. These changes are associated with a preferential oxidation of carbohydrates instead of lipid. High-fat overfeeding induces in skeletal muscle, a decrease in PDK4 expression that could be the consequences of decreased NAD+ concentration associated with a decreased SlRT1 activity as supported by the hyperacetylation of PGC1alpha. Although this reduction of the SlRT1/PGC-1alpha pathway appears, the high-fat overfeeding is associated with increased mitochondrial gene expression. The high-fructose overfeeding induces in skeletal muscle a decrease in many genes expression related to lipid oxidation and mitochondria as CPT1 and MLYCD. ln vitro experiments suggest an indirect action of fructose in skeletal muscle. This thesis highlights the consequences of a positive energy balance induced by over- consumption of lipid or fructose, which we can find in the general population, on energy metabolism and skeletal muscle gene expression

La croissance fœtale et postnatale est un processus finement régulé par des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux complexes. Le système des IGFs (insulin-like growth factors) est l’un des acteurs principaux jouant un rôle crucial dans le développement fœtal et postnatal. Chez l’humain, plusieurs mutations des gènes IGF1 et IGF-1R ainsi qu’une mutation d’origine paternelle d’IGF2 ont été rapportées chez des patients ayant un retard de croissance intra-utérin (RCIU) qui peut persister et/ou s’aggraver en postnatal. Par ailleurs, les phénomènes épigénétiques comme la méthylation de l’ADN et le code histone jouent également un rôle prépondérant dans le développement fœtal et postnatal. L’empreinte parentale, mise en place grâce à des marques épigénétiques, est un des mécanismes important pour le développement fœtal. Chez l’humain, une anomalie de régulation de gènes soumis à empreinte parentale est associée à plusieurs syndromes de retard de croissance intra-utérin et postnatal ou à l’inverse de croissance excessive. Ce travail comporte deux parties: nous nous sommes dans un premier temps particulièrement intéressés à l’étude génétique et épigénétique de la région 11p15.5 et de son centre d’empreinte régulant le domaine IGF2/H19 dans une population de patients ayant une croissance excessive ou bien un RCIU (syndromes de Beckwith-Wiedemann et Silver-Russell respectivement), afin de mieux comprendre la régulation de ce domaine. Puis, la deuxième partie de notre étude a porté sur l’identification de nouvelles causes génétiques et épigénétiques de syndrome de Silver-Russell, altérant l’expression d’IGF2 mais n’étant pas directement secondaires à un défaut moléculaire de la région 11p15.5. / Fetal and postnatal growth is a process finely regulated by genetic, epigenetic and environmental complex. The IGFs system (insulin-like growth factors) is one of the main actors playing a crucial role in fetal and postnatal development. In humans, several mutations of IGF1 and IGF-1R genes and a paternal IGF2 mutation have been reported in patients with intrauterine growth restriction (IUGR), which can persist and/or worsen in postnatal life. Moreover, epigenetic phenomena such as DNA methylation and histone code also play a major role in fetal and postnatal development. Genomic imprinting, established due to epigenetic marks, is one of the major mechanisms for fetal development. In humans, abnormal regulation of genes subject to imprinting is associated with several syndromes of intrauterine and postnatal growth restriction or conversely excessive growth. This work has two parts: we initially particularly interested in the genetic and epigenetic study of the 11p15.5 region and its imprinting control region regulating the IGF2/H19 domain in a population of patients with overgrowth or IUGR (Beckwith-Wiedemann syndrome and Russell-Silver respectively), to better understand the regulation of this area. Then, the second part of our study focused on the identification of new genetic and epigenetic causes of Silver-Russell syndrome, altering the expression of IGF2, without being directly caused by a molecular defect of 11p15.5 region.

Le facteur bactérien Rho est une ARN hélicase toroïdale utilisant l’énergie issue de l’hydrolyse d’ATP pour transloquer le long de brins ARN et dissocier les obstacles moléculaires se trouvant sur son chemin. La fonction majeure de Rho est de provoquer la terminaison de la transcription. Les nombreuses études du facteur Rho d’E. coli (EcRho) ont montré que l’enzyme se fixe aux régions nues des transcrits naissants au niveau de sites Rut (Rho utilization) et utilise son activité de translocase ATPase-dépendante pour rattraper l’ARN polymérase et provoquer la dissociation du complexe d’élongation de la transcription. EcRho est impliquée dans 20 à 50 % des évènements de terminaison de la transcription chez E. coli et contribue à la régulation globale ainsi qu’à la protection du génome bactérien via divers mécanismes complexes. Le spectre d’activité restreint de la Bicyclomycine (BCM) – un antibiotique inhibant la fonction ATPase de Rho – suggère que Rho, bien qu’essentielle chez la plupart des espèces Gram- comme E. coli, est superflue chez la plupart des espèces Gram+. Pour vérifier cette hypothèse et mieux comprendre l’importance de Rho au sein de la diversité bactérienne, nous avons évalué la distribution et la conservation phylogénétique de Rho en utilisant les banques publiques de données génomiques et protéomiques. Nous avons observé que ~92% des espèces analysées (représentant la plupart des phyla bactérien) possèdent Rho (ou un gène rho) et que la présence de ce dernier semble être corrélée avec la complexité du génome, du programme de régulation et de l’écosystème de la bactérie. Cette complexité est illustrée par notre découverte que la protéine régulatrice CsrA contrôle la terminaison Rho-dépendante dans la partie 5’ UTR de l’opéron pgaABCD dont l’expression est critique pour la formation de biofilms par E. coli. En parallèle de ce travail, nous avons testé la proposition récente que le facteur Rho de Mycobacterium tuberculosis (MtbRho) opère par un mécanisme atypique indépendant de son activité ATPase, ce qui le rendrait insensible à la BCM. Nos résultats réfutent cette hypothèse et démontrent sans équivoque que MtbRho utilise un mécanisme similaire à celui de EcRho, pouvant être inhibé par la BCM (mais nécessitant des doses particulièrement élevées). L’ensemble de ces travaux apporte de nouvelles informations illuminant le rôle, le mécanisme et l’importance de Rho au sein de la biodiversité et conforte Rho comme cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques. / The bacterial Rho factor is a ring-shaped, hexameric RNA helicase which uses the energy derived from ATP hydrolysis to translocate along RNA strands, disrupting molecular roadblocks in its way. A major function of Rho is to induce termination of transcription. Extensive studies of the prototypical Rho factor from E. coli (EcRho) indicate that the enzyme binds naked regions of nascent RNA transcripts at the level of Rut (Rho utilization) sites and, then, uses its ATPase-dependent translocase activity to catch up with RNA polymerase and to trigger dissociation of the transcription elongation complex. EcRho is implicated in 20 to 50 % of all transcription termination events in E. coli and contributes to the global regulation and protection of the bacterial genome through various sophisticated mechanisms. The limited spectrum of activity of the antibiotic Bicyclomycin (BCM) – an inhibitor of Rho’s ATPase – suggests that Rho, while critical in many Gram- species such as E. coli, is dispensable in most Gram+ species. To verify this assumption and better understand the importance of Rho across the biodiversity, we assessed the phylogenetic distribution and conservation of Rho using public ‘omics’ databases. We found Rho (or a rho ORF) in ~92% of analyzed species (representing most bacterial phyla), its presence seemingly related to the complexity of the bacterial genome, regulatory program, and ecosystem. An illustration of this complexity is our discovery that regulatory protein CsrA mediates Rho-dependent termination in the 5’UTR of the pgaABCD operon whose expression is critical for biofilm formation by E. coli. In parallel, we tested the recent proposal that the Rho factor of Mycobacterium tuberculosis (MtbRho) operates by an atypical, ATPase-independent mechanism that would make it immune to BCM. Our results rule out this possibility and unambiguously show that MtbRho uses a mechanism similar to that of EcRho, one that can be inhibited by BCM (albeit at unusually high concentrations). Overall, this work provides key, new information to better understand the role, mechanism, and importance of Rho across the bacterial diversity and endorses Rho as a promising target for the development of new antibiotics.