Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / O envelhecimento é um processo biológico complexo, e o conhecimento deste ainda é limitado. Tem sido proposto que alterações epigenéticas podem estar relacionadas ao envelhecimento e ao declínio de memória. Dentre essas alterações está a acetilação de histonas que podem desempenhar um papel crucial no envelhecimento. Com isso, o presente estudo teve como objetivo padronizar o modelo animal de D-gal e avaliar o efeito do butirato de sódio (BS), um inibidor das histonas deacetilases, na memória, modulação das histonas deacetilases (HDAC) e dano ao DNA em ratos Wistar com 2, 6 ou 16 meses submetidos à administração de D-galactose (D-gal). Foram utilizados ratos Wistar machos com 2, 6 ou 16 meses de idade. Para estabelecer a melhor dose de D-gal para indução do modelo de envelhecimento foi realizada uma curva dose-resposta (100, 200 ou 300 mg/kg) em que a D-gal foi administrada durante 30 dias por via oral em ratos com 2 meses de idade. Após, ratos de diferentes idades (2, 6 e 16 meses) foram administrados com D-gal (200 mg/kg) ou água, durante 30 dias. No 24º dia iniciou-se, juntamente com a D-Gal, o tratamento com BS (600 mg/kg) por via intraperitoneal durante 7 dias. 24 horas após a última administração de D-gal ou BS foi realizado o teste de habituação ao campo aberto, Y-maze e esquiva inibitória. O BS foi capaz de reverter o dano de memória de habituação causado pela D-gal em animais com 2 e 6 meses, mas não com 16 meses. BS também foi capaz de reverter o dano causado pelo envelhecimento natural em animais com 16 meses. No teste de esquiva inibitória o BS melhorou a memória imediata, de curta e de longa duração de animais com 2 meses; a memória imediata de animais com 6 meses e a memória de curta e de longa duração de animais com 16 meses. Adicionalmente, o BS reverteu o dano na memória imediata e de curta duração causado pelo envelhecimento natural em animais com 16 meses. O dano na memória espacial causado pelo envelhecimento natural e pela D-gal não foi revertido pelo BS. Além disso, a D-gal causou aumento na atividade das HDACs em animais com 16 meses e o BS conseguiu reverter parcialmente esse efeito no córtex frontal e hipocampo. Quando avaliado os danos ao DNA no sangue periférico, utilizando o ensaio cometa, foi observado que o envelhecimento natural (animais com 16 meses) causou aumento da frequência de danos ao DNA, e o BS foi capaz de reverter parcialmente este dano. Além disso, a D-gal causou aumento do índice e frequência de danos ao DNA nos animais de 2 e 6 meses de idade, e o tratamento com BS foi capaz de reverter este dano, mas não o dano na frequência em animais com 6 meses. Assim, o presente estudo mostrou o efeito protetor do BS na memória de ratos envelhecidos naturalmente ou induzidos pela administração oral de D-gal. A melhora da memória aversiva causada pelo BS nos animais de 16 meses tratados com D-gal pode ser explicada em parte pela redução da atividade das HDACs. A proteção do BS contra o dano na memória de habituação e aversiva induzida pelo envelhecimento natural pode ser explicado, parcialmente, pela redução da frequência de dano ao DNA. A reversão dos danos nas memórias de habituação e aversiva em animais com 2 e 6 meses tratados com D-gal pode ser explicado pela redução da frequência e índice de dano ao DNA nos animais de 2 meses e pela redução do índice de dano ao DNA nos animais de 6 meses. Portanto, o presente estudo fez novos achados que abrem caminho para a utilização do BS no envelhecimento.

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / A galactosemia é um erro inato do metabolismo em que há deficiência no metabolismo da galactose, levando ao acúmulo de galactose e seus metabólitos nos tecidos e líquidos biológicos de pacientes. Os sinais incluem alterações comportamentais e deficiência intelectual, bem como danos hepáticos, renais e musculares, podendo ocasionar a morte. Estudos têm demonstrado que administrações crônicas e com altas concentrações de galactose causam efeitos deletérios em diversos tecidos corporais, incluindo o sistema nervoso central. Entretanto, a fisiopatologia da doença ainda não está totalmente desvendada. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da administração aguda de Dgalactose sobre parâmetros de metabolismo energético e de estresse oxidativo em estruturas cerebrais de ratos jovens. Foram utilizados ratos Wistar machos, de 30 dias de vida, divididos em dois grupos: controle e galactosemia. Para a avaliação de parâmetros de metabolismo energético, os animais do grupo galactosemia receberam uma única administração subcutânea de galactose (5 μmol/g), enquanto os animais controles receberam solução salina no mesmo volume. Uma hora após a administração, os animais sofreram eutanásia e o córtex cerebral, soro e liquido cefalo raquidiano foram isolados e analisados. Para a avaliação de parâmetros de estresse oxidativo, o protocolo de administração foi idêntico ao anterior. Uma, doze e vinte e quatro horas após a administração, os animais sofreram eutanásia e o córtex cerebral e cerebelo foram isolados limpos e analisados. Observou-se que a administração aguda de D-galactose em ratos jovens causou diminuição significativa da succinato desidrogenase (SDH) em córtex cerebral, no período de uma hora. Também houve alteração da homeostase redox em córtex e cerebelo, com danos oxidativos e prejuízo das defesas antioxidantes, em todos os tempos estudados. Além disso, houve aumento significativo do estresse nitrosativo em córtex cerebral em todos os tempos estudados, porém em cerebelo apenas no período de doze horas da admistração de D-galactose. Os resultados do presente trabalho sugerem alterações no metabolismo energético cerebral e danos oxidativos e nitrosativos precoces em cérebro de ratos jovens. Tais achados podem colaborar para o esclarecimento dos danos cerebrais encontrados em pacientes galactosêmicos.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Danielle Cardoso Geraldo Maia / Banca: Ana Paula Ulian de Araújo / Banca: Luis Carlos Spolidorio / Banca: Luciana Simon Pereira Crott / Resumo: O termo "câncer" corresponde ao conjunto de cerca de 100 doenças que têm em comum uma divisão celular desordenada invadindo os tecidos e órgãos, podendo metastatisar para outras regiões do corpo. Os tumores de mama e de colo do útero são os tipos mais frequentes no sexo feminino, e as estimativas para 2012, no Brasil, são de 52.680 e 17.540 novos casos, respectivamente. Abrina, obtida de sementes de Abrus precatorius é uma proteína inativadora de ribossomos (RIPs) do tipo 2, compostas por duas cadeias peptídicas, uma apresentando atividade enzimática N-glicosidase e a outra atividade lectínica com afinidade a β-D-galactose. Neste estudo, avaliamos o potencial antitumoral contra o câncer de mama de abrina em um modelo de câncer mamário murino já estabelecido em nosso laboratório, concomitante à avaliação dos efeitos imunológicos do tumor e da proteína testada no animal. Para isso avaliamos a partir dos tumores e células do sistema imunológico retirados dos animais do estudo, o percentual de inibição do crescimento e angiogênese tumorais, o percentual de células imunes e de células apoptóticas no peritôneo e baço, a produção de citocinas e mediadores químicos produzidos pelas células imunes. Com base nos resultados obtidos, observou-se que o tratamento com abrina (7,5μg/kg) apresentou eficácia similar ao da droga padrão pois apresentou infiltrado inflamatório misto dentro tumor, percentuais de inibição de crescimento e de angiogênese tumorais, e de células NK e NKT esplênicas similares ao tratamento padrão (doxorrubicina - 6mg/kg); em contrapartida apresentou menor quantidade de macrófagos peritoneais e células dendríticas esplênicas ativadas, células T CD8+ citotóxicas e células T regs (CD25+Foxp3+), e maior percentual de células T CD4+, maior produção de H2O2, IL- 1β, IL-6 e IL-12 por células peritoneais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The word "Cancer" corresponds to a group with about 100 diseases which have in common a disordered cell division, resulting in tissues and organs invasion and also metastasis to other body regions. Breast and cervix tumours are the most common type in women and, in Brazil, the estimates for 2012 are of 52,680 and 17,540 new cases respectively. Abrin is obtained from Abrus precatorius seeds being type 2 ribosome inactivating protein (RIP) composed of two peptide chains, one of them possessing N-glycosylase enzyme activity and the other a lectinic activity with affinity for β-D-galactose. In the present work, the antitumour potencial of abrin against breast cancer was evaluated employing a murine breast cancer model already established in our laboratory and concomitantly determining the immunologic effects of the tumour and the protein in mice. From tumours and immune cells isolated from mice belonging to the different experimental groups, the tumour growth inhibition rate and angiogenesis were determined, the percentage of immune and apoptotic cells in the peritoneum and spleen, and also the production of immunologic mediators by immune cells. Based on the results it was found that treatment with abrin (7.5μg/kg) was as effective as the standard drug (doxorubicin - 6 mg/kg) considering that inflammatory tumour infiltrate, tumour growth inhibition and angiogenesis rate, as well as splenic NK and NKT cells percentage were similar. However, abrin-treated animals had a lower percentage of cytotoxic CD8+ and Treg (CD25+Foxp3+) cells as well as activated peritoneal macrophages and splenic dendritic cells accompanied by a higher percentage of CD4+ T cells and increased production of H2O2, IL-1β, IL-6 and Il-12 by peritoneal macrophages and IL-10, IFNγ and TGF-β by splenic lymphocytes. Moreover, abrin-treated animals presented a higher percentage... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.

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Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T09:20:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T09:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) Previous issue date: 2011-04-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Ácido L-ascórbico (L-AA), popularmente conhecido como vitamina C é naturalmente sintetizado pelas plantas a partir de D-glicose por uma via de 10 etapas. L- galactose é o intermediário chave para a biossíntese de L-ascórbico, cuja via de biossíntese foi recentemente elucidada. As leveduras produzem um composto análogo ao L-AA, o ácido D-eritroascórbico, mas em presença de um de seus precursors tais como L-galactose, L galactono-1,4-lactona, ou L-gulono-1 ,4-lactona, as leveduras são capazes de sintetizar o L-AA. Para evitar alimentar a cultura de levedura com o "L" enantiômero, a levedura Kluyveromyces lactis CBS2359 foi engenheirada com genes da via de biossíntese de L-galactose: GDP-manose-3 ,5-epimerase (GME), GDP-L- galactose fosforilase (VTC2) e L-galactose-1-fosfato fosfatase (VTC4) isolados de Arabidopsis thaliana. Com este objetivo plasmídeos foram construídos visando a integração por recombinação homóloga dos cassetes de expressão no Locus LAC4 (beta- galactosidase) Após o processo de transformação, o promotor do gene LAC4 promove a transcrição do gene GME, enquanto que genes VTC2 e VTC4 estão sob o controle dos promotores GPD1 e ADH1 respectivamente provenientes da levedura S. cerevisiae. A expressão dos genes da via de biossíntese de L-galactose em K. lactis foi determinada por RT-PCR e western blot. As leveduras recombinantes foram capazes de produzir cerca de 23 mg.L-1 de ácido L-ascórbico após 48 horas de cultivo, quando cultivados em meio YP suplementado com 2% (p/v) de D-galactose. A biossíntese de L-AA foi também realizada quando as linhagens recombinantes foram cultivadas em meio de soro de queijo, fonte alternativa rica em lactose proveniente da indústria de laticínios. Este trabalho é um dos primeiros relatos de engenharia metabólica na levedura K. lactis visando a biossíntese de ácido L-ascórbico por um processo fermentativo sem a adição de intermediários precursores no meio de cultura. / L-ascorbic acid is naturally synthesized in plants from D-glucose via a ten-step pathway. The branch pathway to synthesize L-galactose, the key intermediate for L- ascorbic biosynthesis, has been recently elucidated. Budding yeast is only able to synthesize L-ascorbic acid if it is cultivated in the presence of one of its precursors: L- galactose, L-galactono-1,4-lactone, or L-gulono-1,4-lactone extracted from plants or animals. To avoid feeding the yeast culture with this “L” enantiomer, we engineered Kluyveromyces lactis with L-galactose biosynthesis pathway genes: GDP-mannose-3,5- epimerase (GME), GDP-L-galactose phosphorylase (VTC2) and L-galactose-1- phosphate phosphatase (VTC4) isolated from Arabidopsis thaliana. Plasmids were constructed to target the cloned plant genes to the K. lactis LAC4 Locus by homologous recombination and the expression was associated to the growth of the cells on D- galactose or lactose. Upon K. lactis transformation, GME was under the control of the native LAC4 promoter while VTC2 and VTC4 genes were transcribed by the S. cerevisiae promoters GPD1 and ADH1 respectively. The expression in K. lactis of the endogenous L-galactose biosynthesis plant genes was determined by RT-PCR and western blotting. The recombinant yeasts were able to produce about 23 mg.L-1 of L- ascorbic acid in 48 hours of cultivation when cultured on rich medium with 2% (w/v) D-galactose. We have also successfully evaluated the L-AA production culturing recombinant strains in cheese whey as an alternative source of lactose and which is a waste product during cheese production. This work is the first attempt to engineering K. lactis cells for L-ascorbic acid biosynthesis through a fermentation process without any trace of “L” isomers precursors in the culture medium.

Objective: While most allergic responses to food are directed against protein epitopes and occur within 30 minutes of ingesting the allergen, recent studies suggest that delayed reactions may occur, sometimes mediated by IgE antibodies directed against carbohydrate moieties. The objective of this review is to summarize the clinical features and management of delayed hypersensitivity reactions to mammalian meat mediated by IgE antibodies to galactose-alpha 1,3-galactose (alpha-gal), an oligosaccharide.Methods: A PubMed search was conducted with MeSH terms: galactosyl-(1,3) galactose, oligosaccharides, cetuximab, allergy/hypersensitivity, and anaphylaxis. Reported cases with alpha-gal-mediated reactions were reviewed. This research study was approved by the Institutional Review Board of East Tennessee State University.Results: Thirty-two cases of adults presenting with red-meat induced allergy thought to be related to oligosaccharides have been reported in the literature so far, making this a rare and evolving syndrome. Most of these patients demonstrated delayed reactions to beef, as was seen in the case reported by us in this manuscript. IgE specific to alpha-gal was identified in most patients with variable response to skin testing with beef and pork. Inhibition studies in some cases showed that the IgE antibodies to beef were directed towards alpha-gal in the meat rather than the protein. The patients often reported history of tick bites, the significance of which is unclear at present. Reactions to cetuximab, a monoclonal antibody, are mediated by a similar mechanism, with IgE antibodies directed against an alpha-gal moiety incorporated in the drug structure.Conclusion: Alpha-gal is an oligosaccharide recently incriminated in delayed anaphylactic reactions to mammalian meats such as to beef, pork, and lamb. It appears that anaphylactic reactions to the anti-cancer biological agent, cetuximab, may be linked mechanistically to the same process. More studies are required to understand the underlying molecular basis for these delayed reactions in specific, and their broader implications for host defense in general.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(薬学) / 甲第23848号 / 薬博第855号 / 新制||薬||242(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科薬学専攻 / (主査)教授 掛谷 秀昭, 教授 高須 清誠, 教授 大野 浩章 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

La reconnaissance moléculaire est un phénomène omniprésent dans les systèmes vivants et intervient dans de nombreux processus biologiques comme la reconnaissance cellulaire ou encore la transmission de signaux par les neurotransmetteurs. L’élaboration de molécules synthétiques capables de mimer l’action des récepteurs naturels en complexant sélectivement un substrat cible est, à l’heure actuelle, très recherchée pour la détection ou le diagnostic en biologie et médecine. Parmi l’ensemble des récepteurs synthétiques, les hémicryptophanes sont des molécules cages composées d’un cyclotribenzylène connecté à une autre unité moléculaire par trois bras espaceurs. Les travaux de cette thèse reposent sur l’élaboration de nouveaux hémicryptophanes et l’étude de leurs propriétés de complexation vis-à-vis de molécules d’intérêt biologique. Dans un premier temps, la chiralité de ces récepteurs a été utilisée pour étudier leurs propriétés de reconnaissance stéréosélective face à différents sucres et analogues de neurotransmetteurs. De bonnes diastéréosélectivités et énantiosélectivités ont ainsi pu être observées en milieu organique pour les substrats étudiés. En parallèle, plusieurs hémicryptophanes hydrosolubles ont été synthétisés et ont permis de reconnaitre sélectivement des neurotransmetteurs comme la choline dans l’eau. Enfin, une dernière partie de cette thèse à été consacrée à la mise en place d’une voie de synthèse pour rendre ces récepteurs fluorescents, dans le but d’élaborer par la suite des sondes moléculaires capables de détecter et de suivre spatio-temporellement des molécules d’intérêt biologique dans les systèmes vivants par fluorescence. / Molecular recognition is a very important phenomenon for living systems as it occurs in many biological processes like cell-cell recognition or transmission of signals by neurotransmitters. Nowadays, the design of synthetic host molecules able to mimic natural receptors by complexing selectively a target substrate, is much sought-after for detection or diagnostic in biology and medicine. Among all the different synthetic receptors, hemicryptophanes are cage-shape molecules which are composed of a cyclotribenzylene moiety connected to another molecular unit by three spacer arms. This thesis is about the synthesis of new hemicryptophanes and the study of their complexation properties toward biologically important molecules. First, the stereoselective recognition of carbohydrates and neurotransmitter analogues by these chiral receptors was investigated in organic solvents and revealed good enantioselectivities and diastereoselectivities. In parallel, several water-soluble hemicryptophanes were synthesized and showed an aptitude for recognizing selectively ammonium substrates like choline in water. The last part was devoted to the development of a synthetic pathway to make hemicryptophanes fluorescent, in order to design molecular probes able to track biologically important molecules in living systems by fluorescence.

Enzymatic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) and its oxidized derivatives was studied using three fungal enzymes: wild-type aryl alcohol oxidase (AAO) from three fungal species, wild-type peroxygenase from Agrocybe aegerita (AaeUPO), and recombinant galactose oxidase (GAO). The effect of pH on different reaction steps was evaluated and apparent kinetic data (Michaelis-Menten constants, turnover numbers, specific constants) were calculated for different enzyme-substrate ratios and enzyme combinations. Finally, the target product, 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA), was prepared in a multi-enzyme cascade reaction combining three fungal oxidoreductases at micro-scale. Furthermore, an oxidase-like reaction is proposed for heme-containing peroxidases, such as UPO, horseradish peroxidase, or catalase, causing the conversion of 5-formyl-2-furancarboxylic acid into FDCA in the absence of exogenous hydrogen peroxide.