CICYT (PB95-0695)

ALENCAR, Nara Lídia Mendes. Mobilização de reservas endospérmicas de pinhão-manso durante a germinação e desenvolvimento da plântula sob condições de estresse salino. 2014. 113 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T18:59:30Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T18:41:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T18:41:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) Previous issue date: 2014 / Jatropha curcas L. is an oilseed species belonged to Euphorbiaceae family, whose seeds are recognized as promising source for biodiesel production. Its ability to survive in adverse conditions, such as water stress and poor nutritional soil, is noteworthy, which favors its cultivation in arid and semiarid regions. Here we evaluate the negative effects promoted by NaCl salt stress on seed germination, reserve mobilization of J. curcas through biochemical, physiological and ultrastructural analysis. The seed germination parameters were significantly affected by salt stress, being observed that the main parameters affected were germination percentage and germination speed index. Similarly, the embryo and endosperm dry mass were reduced by Na+ and Cl- increase in the medium. Considering the reserve compounds, the most abundant reserve of these seeds were the lipids, which corresponded to 64.0% of endosperm seed quiescent dry mass. They showed a stronger delay in reserve mobilization under saline conditions. Proteins were the second most important reserve (21.3%), being severally affected by salinity. The starch was detected in little amount (5.5% of quiescent seed dry mass), however there was a transient increase in this contents at 5 DAI (days after imbibition), which was correlated to the intense lipid mobilization, in control conditions. On the other hand, in salinity, it was observed that starch mobilization was reduced. The seed reserve products (mainly non-reducing sugars and free amino acids) were increased in endosperm in control in relation to quiescent seed, during germination, whereas for salt conditions, these products were few changed. Additionally, cytochemical and ultrastructural analyses confirmed the large amount of protein and lipid bodies in endosperm cells, reaching the identification of a huge amount of protein and lipid bodies. Salt stress promoted morphological and ultrastructural changes in endospermic cells, during germination and seedling development confirming the biochemical analyses. The present study also evaluated the lipid metabolism, using the fatty acid composition analysis and enzymatic and expression genic analyses for lipase, isocitrate liase, malate sintase. The unsaturated fatty acids were the most abundant, highlighting oleic (C18:1) and linoleic-linolenic (C18:2; C18:3), showing increase in their contents, in control conditions, during the evaluated period. However, the fatty acids practically were not changed in salinity conditions. Lipase showed increase in their activity during germination, which corresponded to intense mobilization in lipids in control. In similar way, the reduction of this activity happened in salinity, correlating to lipid delay mobilization. The evident delay of protein and oil body mobilization could strongly affect initial seedling development. The liase isocitrate activity did not show significant differences between treatments until 96 hours after imbibition (HAI), however, following this period, it was verified the strongest reduction in salt stress condition. The activity of malate synthase was not significantly higher in control conditions until 144 HAI, however, following this period, this activity was higher in salinity. It were verified reductions in enzymatic activity due to salt stress, which were correlated to gene expression changes of lipase and isocitrate lyase. Therefore, salinity contributed negatively to lipid mobilization, the main reserve of J. curcas seeds, which was correlated to reduction in activity of the enzymes involved in lipid metabolism. / O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma planta oleaginosa, pertencente à família Euphorbiaceae, cujas sementes são reconhecidas como matéria-prima com potencial para a produção de óleo. Essa planta também é considerada tolerante a condições adversas, tais como déficit hídrico e deficiência nutricional do solo, o que favorece o seu cultivo em regiões áridas e semiáridas. Objetivou-se avaliar os efeitos do estresse salino sobre a germinação e a mobilização das reservas de sementes e plântulas de pinhão-manso, por meio de análises bioquímicas, fisiológicas e ultraestruturais. Os parâmetros germinativos foram negativamente afetados pelo estresse salino, observando-se reduções significativas principalmente no percentual de germinação e no índice de velocidade de germinação. Similarmente, a matéria seca, avaliada no eixo embrionário e no endosperma, foi reduzida pela salinidade. Com relação aos compostos de reserva, os lipídios foram os mais abundantes, correspondendo a 64,0% da matéria seca do endosperma da semente quiescente. Estes compostos apresentaram forte retardo em sua mobilização em condição de estresse salino. As proteínas, a segunda reserva mais abundante (21,3%), também tiveram sua mobilização severamente afetada pelo tratamento salino. O amido foi detectado em pequena quantidade (5,5%), porém, verificou-se o aumento transiente de seu teor aos 5 dias após a semeadura (DAS), que coincidiu com a intensa mobilização de lipídios, em condições controle. Entretanto, em condições de estresse salino, o amido foi pouco mobilizado. Os produtos da mobilização das reservas, em condições controle, principalmente os açúcares não-redutores e aminoácidos livres aumentaram no endosperma, enquanto que, sob condições de salinidade, eles foram pouco alterados. Além disso, as análises citoquímicas e ultraestruturais confirmaram a abundante quantidade de lipídios e proteínas, sendo detectados inúmeros corpos proteicos e lipídicos no citoplasma das células endospérmicas dessas sementes. A salinidade também promoveu alterações morfológicas e ultraestruturais nas células endospérmicas durante a germinação e desenvolvimento de plântulas. O presente estudo também avaliou o metabolismo lipídico através da análise da composição dos ácidos graxos do endosperma e da análise da atividade enzimática e da expressão gênica das enzimas lipase, liase do isocitrato e sintase do malato. Os ácidos graxos insaturados foram os mais abundantes, destacando-se o oleico e o linoleico-linolênico, que apresentaram incrementos em seus teores, em condições controle, ao longo do período avaliado, porém, sob estresse salino foram pouco alterados. A lipase apresentou incremento na sua atividade ao longo da germinação, que coincidiu com a intensa mobilização de lipídios observada no controle. Similarmente, a redução dessa atividade foi correspondente ao retardo na mobilização dos lipídios em condição de estresse salino. A atividade enzimática da liase do isocitrato não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos até às 96 horas após a semeadura (HAS), porém após esse período, verificaram-se as maiores reduções na condição de estresse salino, quando comparado ao controle. Já a atividade da sintase do malato foi significativamente maior em condições controle até às 144 HAS, entretanto, a partir desse período, essa atividade se mostrou superior em condições salinas. Verificaram-se reduções na atividade dessas enzimas em decorrência do estresse, o que teve correlação com as mudanças na expressão dos genes da lipase e liase do isocitrato. Portanto, pode-se concluir que a salinidade contribuiu para o retardo na mobilização dos lipídios, a principal reserva encontrada nas sementes de J. curcas, o que foi correlacionado a redução na atividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-01-11T20:43:50Z No. of bitstreams: 1 RicardoVictorMachadoDeAlmeida_DISSERT.pdf: 6652554 bytes, checksum: 6cdb4c4527db5842187ddfa525762e72 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-01-11T20:54:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RicardoVictorMachadoDeAlmeida_DISSERT.pdf: 6652554 bytes, checksum: 6cdb4c4527db5842187ddfa525762e72 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-11T20:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RicardoVictorMachadoDeAlmeida_DISSERT.pdf: 6652554 bytes, checksum: 6cdb4c4527db5842187ddfa525762e72 (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / O metabolismo vegetal ? composto por uma complexa rede de eventos f?sicos e qu?micos que resultam na fotoss?ntese, respira??o, e na s?ntese e degrada??o de compostos org?nicos. Isto s? ? poss?vel gra?as aos diferentes tipos de respostas a in?meras varia??es ambientais que um vegetal pode estar sujeito, adquiridas ao longo da evolu??o, levando tamb?m a conquistas de novos ambientes. O ciclo do glioxilato ? uma via metab?lica localizada nos glioxissomos de plantas, que possui papel ?nico no estabelecimento das pl?ntulas. Considerado como uma varia??o do ciclo do ?cido c?trico esta via utiliza uma mol?cula de acetil-Coenzima A, oriunda da beta-oxida??o de lip?dios para sintetizar compostos que s?o utilizados na s?ntese de carboidratos. As enzimas Malato sintase (MLS) e Isocitrato liase (ICL) s?o exclusivas deste ciclo e essenciais na regula??o da bioss?ntese de carboidratos. Devido ? aus?ncia das etapas de descarboxila??o, como fatores limitantes da velocidade, estudos mais detalhados da filogenia e evolu??o molecular dessas prote?nas permite o esclarecimento dos efeitos da presen?a desta rota nos processos evolutivos envolvidos em esp?cies vegetais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a rela??o entre a evolu??o molecular das enzimas Isocitrato liase e Malato sintase e sua filogenia, nas plantas verdes (Viridiplantae). Para isso, foram utilizadas sequ?ncias de amino?cidos e nucleot?deos dos genes, a partir de reposit?rios online como o Genbank e Uniprot. As sequ?ncias foram alinhadas e, em seguida, submetidos ? an?lise estat?stica dos modelos de melhor ajuste de substitui??o. A filogenia foi reconstru?da por m?todos de dist?ncia (Neighbor-joining) e m?todos discretos (M?xima Verossimilhan?a, M?xima Parcim?nia e An?lise Bayesiana). O reconhecimento de padr?es estruturais na evolu??o das enzimas foi feito por predi??o e modelagem por homologia das estruturas das sequ?ncias das prote?nas obtidas. Com base nas an?lises comparativas entre modelos in silico, das enzimas, e partir dos resultados de infer?ncia filogen?tica, ambas as enzimas apresentam um padr?o de conserva??o relativamente elevado em sua estrutura e geram topologias condizentes com dois processos de sele??o e especializa??o dos seus respectivos genes. Deste modo, confirmando a relev?ncia em se realizar novos estudos para se elucidar o metabolismo vegetal sob uma perspectiva evolutiva das rela??es entre os genes e a express?o de suas enzimas / The plant metabolism consists of a complex network of physical and chemical events resulting in photosynthesis, respiration, synthesis and degradation of organic compounds. This is only possible due to the different kinds of responses to many environmental variations that a plant could be subject through evolution, leading also to conquering new surroundings. The glyoxylate cycle is a metabolic pathway found in glyoxysomes plant, which has unique role in the seedling establishment. Considered as a variation of the citric acid cycle, it uses an acetyl coenzyme A molecule, derived from lipids beta-oxidation to synthesize compounds which are used in carbohydrate synthesis. The Malate synthase (MLS) and Isocitrate lyase (ICL) enzyme of this cycle are unique and essential in regulating the biosynthesis of carbohydrates. Because of the absence of decarboxylation steps as rate-limiting steps, detailed studies of molecular phylogeny and evolution of these proteins enables the elucidation of the effects of this route presence in the evolutionary processes involved in their distribution across the genome from different plant species. Therefore, the aim of this study was to establish a relationship between the molecular evolution of the characteristics of enzymes from the glyoxylate cycle (isocitrate lyase and malate synthase) and their molecular phylogeny, among green plants (Viridiplantae). For this, amino acid and nucleotide sequences were used, from online repositories as UniProt and Genbank. Sequences were aligned and then subjected to an analysis of the best-fit substitution models. The phylogeny was rebuilt by distance methods (neighbor-joining) and discrete methods (maximum likelihood, maximum parsimony and Bayesian analysis). The identification of structural patterns in the evolution of the enzymes was made through homology modeling and structure prediction from protein sequences. Based on comparative analyzes of in silico models and from the results of phylogenetic inferences, both enzymes show significant structure conservation and their topologies in agreement with two processes of selection and specialization of the genes. Thus, confirming the relevance of new studies to elucidate the plant metabolism from an evolutionary perspective

Os impactos ambientais causados pela queima dos combustíveis fósseis e pela sua manipulação, aliados ao crescente preço dos combustíveis, têm fomentado a procura de novos recursos renováveis e o desenvolvimento de novas tecnologias que suportem as necessidades desse mercado. Os biocombustíveis são recursos biodegradáveis e renováveis, que vêm se revelando uma alternativa economicamente viável. No entanto, a atual geração de biocombustíveis possui alguns pontos negativos, tais como: utilização de solos férteis e competição com a indústria de alimentos, uma vez que utiliza culturas como soja, milho e cana-de-açúcar, produtos de extrema importância econômica para seus países produtores. Por estes motivos, há um crescente interesse em explorar outras matérias-primas possíveis, em especial as voltadas exclusivamente para a geração de energia. Neste contexto, as microalgas vêm se mostrando uma opção bastante interessante. Estes organismos apresentam um alto potencial para tal, pois possuem alta taxa de crescimento e capacidade de produzir grande quantidade de óleo. Além disso, a produção do biocombustível por estes organismos pode ser otimizada tanto pela modificação das condições de cultivo (engenharia bioquímica), como através da manipulação genética das linhagens (engenharia genética). Neste trabalho, ambas as estratégias foram utilizadas com o intuito de se aumentar a quantidade de lipídeo produzido pela linhagem CC424 da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. A via metabólica escolhida para a manipulação genética foi o ciclo do glioxilato, sendo as duas enzimas-chave desse ciclo, isocitrato liase (icl) e malato sintase (ms), os alvos. O plasmídeo pSL18 foi utilizado como vetor da transformação nas microalgas. Seis tipos de linhagens transformantes foram obtidas: duas delas subexpressando os genes icl e ms separadamente, duas subexpressando esses genes e duas contendo duplas transformações, ou seja, uma delas subexpressando ambos os genes ao mesmo tempo e a outra superexpressando os mesmos. Quando se subexpressou ambas as enzimas ao mesmo tempo, houve um aumento significativo na quantidade de lipídeos neutros da célula. Além disso, essa linhagem transgênica foi submetida à escassez de nitrogênio, o que acentuou ainda mais esse resultado. Enquanto em meio normal a diferença entre a quantidade de lipídeos foi de 1,5 vezes, em escassez de nitrogênio essa diferença foi de aproximadamente 3 vezes, corroborada pela diferença nos níveis de expressão gênica, que também foi em torno de 3 vezes. Além disso, a linhagem transgênica também mostrou um aumento em cada um dos ácidos graxos analisados individualmente, revelando uma grande quantidade de todos os tipos de C16 e C18, ácidos graxos importantes para que o biodiesel se adeque ao regulamento da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Apesar de maior quantidade de lipídeos em relação à linhagem selvagem, a nova linhagem transgênica Dupla-ICL-MS-anti não mostrou nenhum efeito deletério crítico. Tanto a produção de biomassa, quanto a quantidade de clorofila a, proteínas totais e carboidratos totais se mantiveram estáveis após a introdução da mutação. Esses resultados sugerem que as enzimas do ciclo do glioxilato, sabidamente ligadas ao catabolismo de ácidos graxos, podem ser utilizadas como alvos promissores para a otimização de linhagens já utilizadas comercialmente na produção de biodiesel. / The environmental impacts caused by gases emitted from burning fossil fuels and their manipulation, combined with rising fuel prices, has stimulated demand for new renewable resources and developing new green technologies that support the industry and market needs. Biofuels are biodegradable and renewable resources, which come out to be an economically viable alternative. However, the current generation of biofuels has some disadvantages, such as: use of fertile soils and competition with the food industry, once it uses crops such as soybeans, corn and sugar cane, products of extreme economic importance to the producing countries. For these reasons, there is a growing interest in exploring other possible raw materials, especially those that are geared exclusively for power generation. In this context, microalgae have shown to be a very interesting option. These organisms have a high potential because they have fast growth rate and the ability to produce large amounts of oil. In addition, biofuel production by these organisms can be optimized for both the modification of culture conditions (biochemical engineering), and through the genetic manipulation of microalgae strains (genetic engineering). In this work, the two strategies have been used in order to increase the amount of lipid produced by the strain CC424 from the model organism Chlamydomonas reinhardtii. The metabolic route chosen for genetic manipulation is the glyoxylate cycle, and the two key enzymes of this cycle, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms), the targets. The plasmid pSL18 was used as a vector of transformation in the microalgae. Six types of transformant strains were obtained, two of them overexpressing the ms and icl genes separately, two underexpressing these genes and two double transformations, one of them overexpressing both genes at the same time the other one underexpressing them. The strain underexpressing both enzymes at the same time, showed a significant increase in the amount of neutral lipids. In this mutant, the shortage of nitrogen led to an even greater increase in these lipids. While in normal media the difference between the amount of lipids was 1.5 times, under nitrogen starvation the difference was approximately 3 times, corroborated by the difference in gene expression levels, which was also about 3 times. Moreover, the mutant strain also showed an increase in each of the individual fatty acids analyzed, revealing a large amount in all kinds of C16 and C18 fatty acids, important for biodiesel that suits the regulation of Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Although the mutant Dupla-ICL-MS-anti produces higher amounts of lipids compared to the wild type, the strain showed no critical negative effects. Both the production of biomass and the amount of chlorophylla, total protein and total carbohydrates remained stable after the introduction of the mutation. These results suggest that the enzymes of the glyoxylate cycle, which are linked to the catabolism of fatty acids, can be used as promising targets for the optimization of strains already used commercially in the production of biodiesel.

En el año 2003, nuestro grupo de investigación comenzó a trabajar en el campo de la organocatálisis haciendo uso de prolinamidas como catalizadores. En el presente trabajo se muestra la síntesis y aplicación de varios organocatalizadores quirales derivados de 1,1'-binaftil-2,2'-diamina (Binam) y prolinamidas en la reacción aldólica directa de α-oxoaldehídos como aceptores tales como ácido glioxílico, glioxilato de etilo, metilglioxal y 2,2-dimetoxiacetaldehído, con varios tipos de cetonas y aldehídos como donores, con el fin de obtener derivados de γ-oxo-α hidroxicarboxílicos con un alto nivel de estereocontrol.

En la presente memoria se describe la síntesis de derivados de pirrolidina, pirrolizidina e indolizidina mediante diferentes metodologías que involicruan una cicloadición 1,3-dipolar multicomponente a través de iluros de azometino generados in situ, así como el estudio cinético de esta reacción vía dos componentes. En el Capítulo I, se describen diferentes métodos de estudio cinético para la interpretación y obtención de parámetros mecanísticos de dicha reacción a partir de la información obtenida mediante Análisis Térmico y más concretamente calorimetría diferencial de barrido. En el Capítulo II, dividido en tres partes, se describe la síntesis de pirrolidinas mediante cicloadición 1,3-dipolar multicomponente (a partir de iluros de azometino) térmica y por irradiación por microondas (Parte 1), catalizada por plata(I) (Parte II) y asimétrica mediante catálisis por plata(I) y un ligando quiral (Parte III); así como la posible aplicabilidad en la síntesis de productos naturales o que presenten actividad biológica. En el Capítulo III, se describe la síntesis de pirrolizidinas mediante la cicloadición 1,3-dipolar multicomponente con iluros de azometino con y sin uso de sales de plata(I), así como un ejemplo en la construcción de un esqueleto de indolizidina siguiendo la misma metodología. Finalmente se incluyen las conclusiones junto con otro tipo de anexos como son las referencias, abreviaciones y la biografía.

Os impactos ambientais causados pela queima dos combustíveis fósseis e pela sua manipulação, aliados ao crescente preço dos combustíveis, têm fomentado a procura de novos recursos renováveis e o desenvolvimento de novas tecnologias que suportem as necessidades desse mercado. Os biocombustíveis são recursos biodegradáveis e renováveis, que vêm se revelando uma alternativa economicamente viável. No entanto, a atual geração de biocombustíveis possui alguns pontos negativos, tais como: utilização de solos férteis e competição com a indústria de alimentos, uma vez que utiliza culturas como soja, milho e cana-de-açúcar, produtos de extrema importância econômica para seus países produtores. Por estes motivos, há um crescente interesse em explorar outras matérias-primas possíveis, em especial as voltadas exclusivamente para a geração de energia. Neste contexto, as microalgas vêm se mostrando uma opção bastante interessante. Estes organismos apresentam um alto potencial para tal, pois possuem alta taxa de crescimento e capacidade de produzir grande quantidade de óleo. Além disso, a produção do biocombustível por estes organismos pode ser otimizada tanto pela modificação das condições de cultivo (engenharia bioquímica), como através da manipulação genética das linhagens (engenharia genética). Neste trabalho, ambas as estratégias foram utilizadas com o intuito de se aumentar a quantidade de lipídeo produzido pela linhagem CC424 da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. A via metabólica escolhida para a manipulação genética foi o ciclo do glioxilato, sendo as duas enzimas-chave desse ciclo, isocitrato liase (icl) e malato sintase (ms), os alvos. O plasmídeo pSL18 foi utilizado como vetor da transformação nas microalgas. Seis tipos de linhagens transformantes foram obtidas: duas delas subexpressando os genes icl e ms separadamente, duas subexpressando esses genes e duas contendo duplas transformações, ou seja, uma delas subexpressando ambos os genes ao mesmo tempo e a outra superexpressando os mesmos. Quando se subexpressou ambas as enzimas ao mesmo tempo, houve um aumento significativo na quantidade de lipídeos neutros da célula. Além disso, essa linhagem transgênica foi submetida à escassez de nitrogênio, o que acentuou ainda mais esse resultado. Enquanto em meio normal a diferença entre a quantidade de lipídeos foi de 1,5 vezes, em escassez de nitrogênio essa diferença foi de aproximadamente 3 vezes, corroborada pela diferença nos níveis de expressão gênica, que também foi em torno de 3 vezes. Além disso, a linhagem transgênica também mostrou um aumento em cada um dos ácidos graxos analisados individualmente, revelando uma grande quantidade de todos os tipos de C16 e C18, ácidos graxos importantes para que o biodiesel se adeque ao regulamento da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Apesar de maior quantidade de lipídeos em relação à linhagem selvagem, a nova linhagem transgênica Dupla-ICL-MS-anti não mostrou nenhum efeito deletério crítico. Tanto a produção de biomassa, quanto a quantidade de clorofila a, proteínas totais e carboidratos totais se mantiveram estáveis após a introdução da mutação. Esses resultados sugerem que as enzimas do ciclo do glioxilato, sabidamente ligadas ao catabolismo de ácidos graxos, podem ser utilizadas como alvos promissores para a otimização de linhagens já utilizadas comercialmente na produção de biodiesel. / The environmental impacts caused by gases emitted from burning fossil fuels and their manipulation, combined with rising fuel prices, has stimulated demand for new renewable resources and developing new green technologies that support the industry and market needs. Biofuels are biodegradable and renewable resources, which come out to be an economically viable alternative. However, the current generation of biofuels has some disadvantages, such as: use of fertile soils and competition with the food industry, once it uses crops such as soybeans, corn and sugar cane, products of extreme economic importance to the producing countries. For these reasons, there is a growing interest in exploring other possible raw materials, especially those that are geared exclusively for power generation. In this context, microalgae have shown to be a very interesting option. These organisms have a high potential because they have fast growth rate and the ability to produce large amounts of oil. In addition, biofuel production by these organisms can be optimized for both the modification of culture conditions (biochemical engineering), and through the genetic manipulation of microalgae strains (genetic engineering). In this work, the two strategies have been used in order to increase the amount of lipid produced by the strain CC424 from the model organism Chlamydomonas reinhardtii. The metabolic route chosen for genetic manipulation is the glyoxylate cycle, and the two key enzymes of this cycle, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms), the targets. The plasmid pSL18 was used as a vector of transformation in the microalgae. Six types of transformant strains were obtained, two of them overexpressing the ms and icl genes separately, two underexpressing these genes and two double transformations, one of them overexpressing both genes at the same time the other one underexpressing them. The strain underexpressing both enzymes at the same time, showed a significant increase in the amount of neutral lipids. In this mutant, the shortage of nitrogen led to an even greater increase in these lipids. While in normal media the difference between the amount of lipids was 1.5 times, under nitrogen starvation the difference was approximately 3 times, corroborated by the difference in gene expression levels, which was also about 3 times. Moreover, the mutant strain also showed an increase in each of the individual fatty acids analyzed, revealing a large amount in all kinds of C16 and C18 fatty acids, important for biodiesel that suits the regulation of Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Although the mutant Dupla-ICL-MS-anti produces higher amounts of lipids compared to the wild type, the strain showed no critical negative effects. Both the production of biomass and the amount of chlorophylla, total protein and total carbohydrates remained stable after the introduction of the mutation. These results suggest that the enzymes of the glyoxylate cycle, which are linked to the catabolism of fatty acids, can be used as promising targets for the optimization of strains already used commercially in the production of biodiesel.

A produção e emissão de poluentes é geralmente derivada da alta atividade humana, por meio da utilização dos recursos naturais, desenvolvimento de infraestrutura e construção, atividades agrícolas, desenvolvimento industrial, urbanização, turismo e uma série de outras atividades. Poluente é tudo o que é introduzido pelo homem, de forma direta ou indireta, de substâncias ou energia que resultem ou possam resultar em efeitos adversos a vida. As principais classes de poluentes são os pesticidas, poluentes orgânicos, nutrientes, óleos, isótopos radioativos, metais pesados, patogênicos, sedimentares, lixo e escombros entre outros. O descarte em efluentes aquáticos é uma prática antiga no modo como lidamos com nossos dejetos e em consequência disso, a maioria dos ambientes aquáticos encontram-se poluídos em maior ou menor grau. Dentre os poluentes orgânicos, encontramos uma classe de moléculas denominadas de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA). Os HPAs são uma grande família de compostos derivados da fusão de anéis benzênicos que contém dois anéis benzeno fundidos e seus derivados, até estruturas contendo 10 anéis. A toxicidade dos HPAs é resultado de sua hidrofobicidade. Estes compostos podem induzir mudanças conformacionais na estrutura de biomembranas resultando em aumento em sua permeabilidade. Como consequência, a capacidade fotossintética desses organismos é prejudicada podendo levar a sérios distúrbios na cadeia de transporte de elétrons e desacoplamento da fosforilação oxidativa. O Antraceno (ANT) é uma molécula formada pela fusão de 3 anéis benzênicos e é um dos 16 HPAs prioritários segunda a US EPA, e é classificado como muito tóxico para organismos aquáticos e que pode causar efeitos adversos de longo prazo no ambiente aquático. Além disso, ANT é facilmente fotoxidado a produtos ainda mais tóxicos, especialmente quinonas, que interferem na respiração e na fotossíntese, causando problemas no desenvolvimento das algas levando a falência do ecossistema devido à diminuição da biomassa, deficiência de oxigênio e inibição de processos de desintoxicação. A quantidade de informações referentes aos efeitos causados ao metabolismos destes organismos fotossintetizantes é bastante limitada e para suprir esta carência, utilizamos a microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii com a finalidade de ampliar o conhecimento dos efeitos tóxicos de antraceno no metabolismo destes organismos utilizando uma abordagem de metabolômica que utiliza GC-MS. Como resposta metabólica a exposição de ANT, ácidos graxos acumularam em C. reinhardtii. De forma semelhante, outra resposta encontrada foi acumulo de aminoácidos. Com exceção de valina, todos os aminoácidos encontrados em nossa análise por GC-MS se acumularam nas culturas expostas a ANT. Outra molécula importante encontrada em nossas análises foi a glutationa, possivelmente causada pela produção de EROs. Muitos ácidos carboxílicos foram encontrados em nossas análises e entre estes, a via metabólica mais impactada foi o ciclo do glioxilato. Juntamente com acumulo de glioxilato, muitos intermediários do ciclo do ácido cítrico foram encontrados tais como succinato e malato. Para tanto, o acumulo de malato é dependente de glioxilato e acetato, presente no meio de cultura. O produto deste gene catalisa a reação entre glioxilato e acetil-CoA formando malato como produto final. Com estes dados, podemos sugerir que para compensar pela fotossíntese deficiente, o metabolismo heterotrófico de acetato produzindo acetil-CoA é uma fonte importante de energia, e a via de glioxilato tem um papel central durante o estresse causado por ANT. Além disso, a incorporação de carbonos através do ciclo do glioxilato pode permitir a síntese de outras moléculas mais complexas como aminoácidos, lipídeos e carboidratos. / The production and emission of pollutant are often derived from human activities, such as utilizing natural resources, developing infrastructure, agriculture and industry among others. Pollutant is defined as substances or energy introduced into the environment by man, directly or indirectly that may result in adverse effects on life. Pollutants can be divided into various classes including organic, nutrients, oils, radioactive isotopes, heavy metals, pathogenic, sediments, garbage among others. Disposal of sewage on water bodies is an old habit of how we deal with our wastes. Consequently, great part of the aquatic environment becomes polluted in various extents. Among the organic pollutants, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) represents a class of molecules consisting from two or more fused benzene rings and its by-products. Members of this class of compounds have been identified as exhibiting toxic and hazardous properties. Their toxicity is also due to its hydrophobic property that induces conformational changes on membranes, increasing their permeability. Consequently, the photosynthetic capacity of exposed organisms can be harmed, leading to serious imbalances on their electron chain transport and uncoupling oxidative phosphorylation. Anthracene (ANT) is a PAH formed by three fused benezenic rings and is one of the 16 prioritary PAH according to American and European regulatory agencies. ANT is classified as highly toxic for aquatic organisms causing long term effects on environment. Besides, ANT can be easily photooxidated and its products can be even more toxic, specially quinones, that can interfere on respiration and photosynthesis, leading to problems on algae development and ecosystem collapse caused by low biomass, oxygen deficiency and inhibition of detoxification processes. The amount of information about the effects on metabolism of the photosynthetic organisms is limited. Therefore our main goal was to use the model organism Chlamydomonas reinhardtii in order to gain insights on the toxic effects caused by ANT through GC-MS metabolomics approach. A metabolic response to ANT exposure, lipid accumulates in C. reinhardtii. Similarly to fatty acids, another marked physiological response was amino acids accumulation. With the exception of valine, all amino acids found in our GC-MS analysis showed a marked relative accumulation in cultures exposed to ANT. Another important finding was the high level of glutathione, possibly caused by ROS production. Carboxylic acids were also found in our analysis and among them a highly impacted pathway found was glyoxylate cycle. Toghether with the increase accumulation of glyoxylate, many TCA cycle intermediates, like succinate and malate were found. Furthermore, malate accumulation is dependent of glyoxylate and acetate, present in culture media. The product of this gene catalyse the reaction between glyoxylate and acetyl-CoA forming malate as a final product. Taken all together, our findings suggest that to compensate the photosynthesis inhibition, heterotrophic acetate metabolism was activated producing acetyl-CoA an important energy source, and glyoxylate cycle plays a central role during stress caused by ANT. Furthermore, incorporation of carbon through glyoxylate cycle can enable synthesis of more complex molecules like amino acids, lipids and carbohydrates.

A produção e emissão de poluentes é geralmente derivada da alta atividade humana, por meio da utilização dos recursos naturais, desenvolvimento de infraestrutura e construção, atividades agrícolas, desenvolvimento industrial, urbanização, turismo e uma série de outras atividades. Poluente é tudo o que é introduzido pelo homem, de forma direta ou indireta, de substâncias ou energia que resultem ou possam resultar em efeitos adversos a vida. As principais classes de poluentes são os pesticidas, poluentes orgânicos, nutrientes, óleos, isótopos radioativos, metais pesados, patogênicos, sedimentares, lixo e escombros entre outros. O descarte em efluentes aquáticos é uma prática antiga no modo como lidamos com nossos dejetos e em consequência disso, a maioria dos ambientes aquáticos encontram-se poluídos em maior ou menor grau. Dentre os poluentes orgânicos, encontramos uma classe de moléculas denominadas de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA). Os HPAs são uma grande família de compostos derivados da fusão de anéis benzênicos que contém dois anéis benzeno fundidos e seus derivados, até estruturas contendo 10 anéis. A toxicidade dos HPAs é resultado de sua hidrofobicidade. Estes compostos podem induzir mudanças conformacionais na estrutura de biomembranas resultando em aumento em sua permeabilidade. Como consequência, a capacidade fotossintética desses organismos é prejudicada podendo levar a sérios distúrbios na cadeia de transporte de elétrons e desacoplamento da fosforilação oxidativa. O Antraceno (ANT) é uma molécula formada pela fusão de 3 anéis benzênicos e é um dos 16 HPAs prioritários segunda a US EPA, e é classificado como muito tóxico para organismos aquáticos e que pode causar efeitos adversos de longo prazo no ambiente aquático. Além disso, ANT é facilmente fotoxidado a produtos ainda mais tóxicos, especialmente quinonas, que interferem na respiração e na fotossíntese, causando problemas no desenvolvimento das algas levando a falência do ecossistema devido à diminuição da biomassa, deficiência de oxigênio e inibição de processos de desintoxicação. A quantidade de informações referentes aos efeitos causados ao metabolismos destes organismos fotossintetizantes é bastante limitada e para suprir esta carência, utilizamos a microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii com a finalidade de ampliar o conhecimento dos efeitos tóxicos de antraceno no metabolismo destes organismos utilizando uma abordagem de metabolômica que utiliza GC-MS. Como resposta metabólica a exposição de ANT, ácidos graxos acumularam em C. reinhardtii. De forma semelhante, outra resposta encontrada foi acumulo de aminoácidos. Com exceção de valina, todos os aminoácidos encontrados em nossa análise por GC-MS se acumularam nas culturas expostas a ANT. Outra molécula importante encontrada em nossas análises foi a glutationa, possivelmente causada pela produção de EROs. Muitos ácidos carboxílicos foram encontrados em nossas análises e entre estes, a via metabólica mais impactada foi o ciclo do glioxilato. Juntamente com acumulo de glioxilato, muitos intermediários do ciclo do ácido cítrico foram encontrados tais como succinato e malato. Para tanto, o acumulo de malato é dependente de glioxilato e acetato, presente no meio de cultura. O produto deste gene catalisa a reação entre glioxilato e acetil-CoA formando malato como produto final. Com estes dados, podemos sugerir que para compensar pela fotossíntese deficiente, o metabolismo heterotrófico de acetato produzindo acetil-CoA é uma fonte importante de energia, e a via de glioxilato tem um papel central durante o estresse causado por ANT. Além disso, a incorporação de carbonos através do ciclo do glioxilato pode permitir a síntese de outras moléculas mais complexas como aminoácidos, lipídeos e carboidratos. / The production and emission of pollutant are often derived from human activities, such as utilizing natural resources, developing infrastructure, agriculture and industry among others. Pollutant is defined as substances or energy introduced into the environment by man, directly or indirectly that may result in adverse effects on life. Pollutants can be divided into various classes including organic, nutrients, oils, radioactive isotopes, heavy metals, pathogenic, sediments, garbage among others. Disposal of sewage on water bodies is an old habit of how we deal with our wastes. Consequently, great part of the aquatic environment becomes polluted in various extents. Among the organic pollutants, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) represents a class of molecules consisting from two or more fused benzene rings and its by-products. Members of this class of compounds have been identified as exhibiting toxic and hazardous properties. Their toxicity is also due to its hydrophobic property that induces conformational changes on membranes, increasing their permeability. Consequently, the photosynthetic capacity of exposed organisms can be harmed, leading to serious imbalances on their electron chain transport and uncoupling oxidative phosphorylation. Anthracene (ANT) is a PAH formed by three fused benezenic rings and is one of the 16 prioritary PAH according to American and European regulatory agencies. ANT is classified as highly toxic for aquatic organisms causing long term effects on environment. Besides, ANT can be easily photooxidated and its products can be even more toxic, specially quinones, that can interfere on respiration and photosynthesis, leading to problems on algae development and ecosystem collapse caused by low biomass, oxygen deficiency and inhibition of detoxification processes. The amount of information about the effects on metabolism of the photosynthetic organisms is limited. Therefore our main goal was to use the model organism Chlamydomonas reinhardtii in order to gain insights on the toxic effects caused by ANT through GC-MS metabolomics approach. A metabolic response to ANT exposure, lipid accumulates in C. reinhardtii. Similarly to fatty acids, another marked physiological response was amino acids accumulation. With the exception of valine, all amino acids found in our GC-MS analysis showed a marked relative accumulation in cultures exposed to ANT. Another important finding was the high level of glutathione, possibly caused by ROS production. Carboxylic acids were also found in our analysis and among them a highly impacted pathway found was glyoxylate cycle. Toghether with the increase accumulation of glyoxylate, many TCA cycle intermediates, like succinate and malate were found. Furthermore, malate accumulation is dependent of glyoxylate and acetate, present in culture media. The product of this gene catalyse the reaction between glyoxylate and acetyl-CoA forming malate as a final product. Taken all together, our findings suggest that to compensate the photosynthesis inhibition, heterotrophic acetate metabolism was activated producing acetyl-CoA an important energy source, and glyoxylate cycle plays a central role during stress caused by ANT. Furthermore, incorporation of carbon through glyoxylate cycle can enable synthesis of more complex molecules like amino acids, lipids and carbohydrates.

Os fungos dermatófitos são caracterizados pela capacidade de invadir os tecidos queratinizados, usando queratina como principal fonte de nutrientes. Ao invadirem os tecidos hospedeiros eles causam um tipo de micose chamada de dermatofitose. Dentre os dermatófitos, a espécie Trichophyton rubrum é o causador mais comum de tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris e tinea corporis, sendo considerado um fungo antropofílico e cosmopolita. Entretanto, o conhecimento da interação deste patógeno com o hospedeiro é escasso. Devido à importância clínica de T. rubrum, este trabalho analisou a composição de aminoácidos de proteínas queratinas oriundas de Homo sapiens e Bos taurus e a expressão de genes envolvidos na degradação de queratina, metabolismo e controle do ciclo celular. O perfil de expressão dos genes sub3 e sub5 que codificam para queratinases, mad2 e mad2B que codificam proteínas envolvidas no controle da mitose, e os genes idh1 (subunidade regulatória da isocitrato desidrogenase - NAD+), idh2 (subunidade catalítica da isocitrato desidrogenase - NAD+), idhp (isocitrato desidrogenase - NADP+), icl (isocitrato liase) e meicl (metilisocitrato liase), que codificam proteínas envolvidas em vias metabólicas, foi analisado após o cultivo de T. rubrum em meios contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina. A atividade queratinolítica foi avaliada após o cultivo de T. rubrum nesses meios e também em unha humana. Além disto, o efeito do antifúngico terbinafina na atividade queratinolítica e na expressão dos genes sub3 e sub5 foi analisado em meios contendo unha humana ou queratina. Após o cultivo de T. rubrum a atividade das enzimas IDH e IDHP componentes do ciclo de Krebs, ICL do ciclo do glioxilato e MeICL do ciclo do metilcitrato também foram avaliadas. Essas análises revelaram que a variação da fonte nutricional, do pH do meio de cultivo, e a presença/ausência do fator de transcrição PacC, proporcionam às diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1) uma modulação diferenciada do acúmulo de transcritos dos genes, bem como da atividade queratinolítica e atividade das enzimas IDH, IDHP, ICL e MeICL. Outro fenômeno verificado foi que o antifúngico terbinafina afeta o acúmulo de transcritos dos genes sub3 e sub5, e a atividade queratinolítica de acordo com a fonte nutricional e a linhagem de T. rubrum. Além disso, em condições de estresse por pH alcalino a enzima IDHP é preferencialmente requisitada para manutenção do ciclo de Krebs, sendo que a linhagem mutante pacC-1 requisita em maior proporção as vias anapleróticas do que a linhagem selvagem H6. É importante enfatizar que a enzima ICL de T. rubrum possui atividade enzimática regulada por fosforilação, sendo sua atividade reduzida por esta modificação pós traducional. A identificação deste mecanismo de regulação da ICL por fosforilação e as análises dos transcritos de icl sugerem que em T. rubrum a regulação do fluxo de carbono no ciclo do glioxilato ocorra tanto em nível transcricional como pós-traducional. Os resultados obtidos possibilitaram ainda propor o primeiro modelo para T. rubrum que relaciona vias metabólicas, amparado por dados experimentais obtidos após o cultivo deste dermatófito em queratina. / Dermatophytes are fungi characterized by the ability to invade keratinized tissues using keratin as a major source of nutrients. When they invade host tissues they cause a type of ringworm called dermatophytosis. Among the dermatophytes, the species Trichophyton rubrum is the most common cause of tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris, and tinea corporis, being considered an anthropophilic and cosmopolitan fungus. However, the knowledge of the interaction of this pathogen with the host is scarce. Due to the clinical importance of T. rubrum, this study analyzed the amino acid composition of keratin proteins derived from Homo sapiens and Bos taurus, and the expression of genes involved in keratin degradation, metabolism, and cell cycle control. The expression profile of the sub3 and sub5 genes, encoding keratinases, mad2 and mad2B, encoding proteins involved in the control of mitosis, and the genes idh1 (regulatory subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idh2 (catalytic subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idhp (NADP+ - isocitrate dehydrogenase), icl (isocitrate lyase), and meicl (metilisocitrate lyase), which encode proteins involved in metabolic pathways, was analyzed after cultivation of T. rubrum in media containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin. The keratinolytic activity was evaluated after cultivation of T. rubrum in these media and also in human nail. Furthermore, the effect of the antifungal agent terbinafine in keratinase activity and sub3 and sub5 gene expression was analyzed in media containing human nail or keratin. After culturing T. rubrum the enzyme activity of IDH and IDHP, components of the Krebs cycle, ICL of the glyoxylate cycle, and MeICL of the metilcitrato cycle were also evaluated. These analyses revealed that the variation in the nutritional source, the pH of the medium, and the presence/absence of the transcription factor PacC, provide to the different T. rubrum strains used in this study (CBS, H6 and pacC-1) differential modulation of transcripts accumulation of the genes, as well as keratinolytic activity and enzymatic activities of IDH, IDHP, ICL and MeICL. Another phenomenon observed was that the antifungal terbinafine affects the accumulation of transcripts of the genes sub3, sub5, and the keratinolytic activity according to nutritional source and T. rubrum strain. In addition, in stress conditions by alkaline pH the IDHP enzyme is preferably required for maintenance of the Krebs cycle, and the mutant pacC-1 requests the anaplerotic pathways in greater proportion than the wild type strain H6. It is important to emphasize that T. rubrum ICL enzyme has its enzymatic activity regulated by phosphorylation, being reduced by this post translational modification. The identification of this regulation mechanism by phosphorylation of ICL and icl transcripts analysis suggest that in T. rubrum the carbon flux regulation in the glyoxylate cycle occurs at both transcriptional and post-translational levels. The results also made possible the proposition of the first model for T. rubrum correlating metabolic pathways, supported by experimental data obtained after cultivation of this dermatophyte in keratin.