Nous avons étudié les relations entre les différentes voies du métabolisme énergétique lors de la mise en place des effets Crabtree et Warburg. L’effet du glucose sur le métabolisme énergétique de S. cerevisiae se traduit dans un premier temps par une inhibition cinétique du métabolisme oxydatif (effet Crabtree). Après l’ajout de glucose aux cellules, nous avons mis en évidence l’accumulation d’un intermédiaire de la glycolyse, le F1,6bP. Ceci induit une diminution drastique du rapport G6P/F1,6bP. Or, il a été montré que le G6P stimule et le F1,6bP inhibe l’activité de la chaine respiratoire mitochondriale « in-situ ». L’utilisation de mutants et la modulation de ce rapport nous a permis de montrer que l’induction de l’effet Crabtree chez la levure Saccharomyces cerevisiae est dû à une diminution du rapport G6P/F1,6bP. Parallèlement, le glucose induit un réarrangement génétique qui à terme conduit à un effet Warburg. Nous avons mis en évidence une diminution, au cours du temps du contenu mitochondrial par effet de dilution, suite à un arrêt de la biogenèse mitochondriale (répression de HAP4). Nous avons pu montrer que cette diminution quantitative des OXPHOS est sans effet sur la synthèse d’ATP cellulaire. Ceci est dû à une augmentation du flux de synthèse d’ATP glycolytique. L’utilisation de mutants HAP4", nous a permis de montrer qu’il n’y a pas de lien simple entre prolifération et répression des OXPHOS. Bien que le flux glycolytique diminue dans les conditions de maintien des OXPHOS, ceci est sans effet notoire sur la vitesse de prolifération. Ceci est un rare exemple d’une situation biologique ou l’on observe un découplage entre métabolisme énergétique et prolifération. / We used the yeast Crabtree (+) model to study the relationships between the energy metabolism pathways during the implementation of the Warburg effect. The effect of glucose on S. cerevisiae energetic metabolism results initially in a kinetic inhibition of the oxidative metabolism (Crabtree effect). Rapidly after the addition of glucose, we found an accumulation of F1, 6bP. This induces a drastic reduction in the ratio G6P / F1,6bP. Moreover, it has been shown that G6P stimulates and F1,6bP inhibits the activity of the respiratory chain "in-vitro". Mutants and the modulation of this ratio allowed us to show that the induction of the Crabtree effect is due to a decrease in the G6P / F1,6bP ratio. In parallel with the implementation of the Crabtree effect, glucose induces a genetic rearrangement that leads to a Warburg effect. We showed a decrease over time of mitochondrial enzymatic equipment by dilution effect, due to a halt of mitochondrial biogenesis (transcriptional repression of HAP4). We have been able to show that this decrease in respiratory capacity has no effect on the cellular capacity for ATP synthesis. This is due to the increase in glycolytic ATP synthesis flux. Furthermore, the use of mutants where there is no repression of mitochondrial metabolism upon glucose addition allowed us to show that there is no simple link between OXPHOS activity and cell proliferation. i.e. Mitochondrial metabolism repression/high glycolytic flux is not mandatory to allow a rapid cell proliferation. This is a rare example where energetic metabolism and cell proliferation are uncoupled.

Au cours de ma thèse, nous avons utilisé la truite arc-en-ciel, un poisson carnivore et modèle potentiellement pertinent du diabète, pour étudier des mécanismes de régulation du métabolisme intermédiaire hépatique par les nutriments (acides aminés (AA) et le glucose). Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux voies de signalisation de l’insuline et des acides aminés (Akt et mTORC1). Grâce à l’utilisation de rapamycine, un inhibiteur pharmacologique de mTORC1, nous avons montré que l'activation de mTORC1 stimule l'expression de gènes de la lipogenèse, de la glycolyse et du catabolisme des acides aminés, tandis que la voie de signalisation Akt inhibe celle des gènes impliqués dans la néoglucogenèse. Ces études ont été conduites dans le foie de truite ou en culture primaire d’hépatocytes de truite arc-en-ciel. En outre, nous avons démontré lors de stimulations à court terme in vivo et in vitro que l'expression hépatique des gènes de la lipogenèse est plus sensible à l'apport de protéines alimentaires ou d’AA qu’à l'apport de glucides ou de glucose. De plus, nous avons observé que des taux élevés d’AA conduisent, par le biais de l’activation de la voie de signalisation mTORC1, à une augmentation de l'expression des gènes lipogéniques mais surtout à une répression de l’inhibition de l’expression des gènes de la néoglucogenèse induite par l’insuline. Cet effet s’accompagne d’une augmentation de la phosphorylation de IRS-1 sur le résidu Ser302 qui pourrait être responsable de la baisse de phosphorylation d'Akt et par conséquent d’une inhibition de l’action de l'insuline. Enfin, en réalisant un test de tolérance au glucose chez des truites préalablement traitées avec de la rapamycine, nous avons conclu que la néoglucogenèse hépatique joue un rôle probablement majeur dans le contrôle de l'homéostasie glucidique chez la truite. Ainsi, une absence d’inhibition de la néoglucogenèse pourrait contribuer au maintien de l'hyperglycémie prolongée et au phénotype d’intolérance au glucose caractéristique des poissons carnivores. Cette thèse met en avant le rôle des protéines/AA dans la régulation du métabolisme intermédiaire de la truite et identifie certaines voies de signalisation cellulaire sollicités par les acides aminés pour réguler le métabolisme. Elle permet ainsi d’éclaircir certaines particularités nutritionnelles de la truite. / During my doctoral study, we used rainbow trout, a representative carnivorous fish and relevant diabetic model, to study the mechanisms underlying the regulation of hepatic intermediary metabolism by nutrients (amino acids (AAs) and glucose), and determine the potential involvement of insulin/Akt and mTORC1 signaling pathways in these regulations. Using acute administration of rapamycin, a pharmacological inhibitor of TOR, we first identified that mTORC1 activation promotes the expression of genes related to fatty acid biosynthesis, glycolysis and amino acid catabolism, while Akt negatively regulates gluconeogenic gene expression in rainbow trout liver and primary hepatocytes. Furthermore, we demonstrated hepatic fatty acid biosynthetic gene expression is more responsive to dietary protein intake/AAs than dietary carbohydrate intake/glucose during acute stimulations in vivo and in vitro. Moreover, we further showed that high levels of AAs up-regulate hepatic fatty acid biosynthetic gene expression through an mTORC1-dependent manner, while excessive AAs attenuate insulin-mediated repression of gluconeogenesis through elevating IRS-1 Ser302 phosphorylation, which in turn impairs Akt phosphorylation and dampens insulin action. Finally, using glucose tolerance test and acute inhibition of rapamycin, we concluded that hepatic gluconeogenesis probably plays a major role in controlling glucose homeostasis, which maybe account for the prolonged hyperglycemia and glucose intolerance phenotype of carnivorous fish. The present thesis brings forward our understandings about the roles of protein/AAs in the regulation of hepatic intermediary metabolism in trout and identifies relevant cellular signaling pathways mediating the action of amino acids on metabolism. It also clarifies some nutritional characteristics of the trout.

Une diète faible en sodium donnée à des rates lors de la dernière semaine de gestation induit une diminution de l’expansion volumique, du diamètre des artères utérines et du poids des placentas comparativement à des rates témoins. Ces perturbations suggèrent une diminution de la perfusion placentaire affectant l’apport foetal en nutriments. Les ratons naissent avec une restriction de croissance intra-utérine (RCIU). Chez le foetus, le substrat énergétique cardiaque principal est le glucose via la glycolyse. À la naissance, la source principale d’énergie est l’utilisation des acides gras par la β-oxydation. Nous émettons l’hypothèse que dans ce modèle de RCIU, le coeur foetal répond à la diminution d’apport nutritionnel due à une atteinte maternelle en adaptant son métabolisme énergétique cardiaque à la baisse. Les rates gestantes (témoins et recevant la diète faible en sodium) sont sacrifiées au jour 22 de gestation (sur 23). Les coeurs foetaux sont prélevés afin de caractériser les protéines dites « limitantes » in vitro des voies de la glycolyse et de la β-oxydation. Les expressions protéiques de GLUT1, GLUT4, HK1, HK2, CPT2, CPT1β, cytochrome c, PFK1, PKM1/2, mesurées par immunobuvardage de type Western, sont similaires entre les coeurs des foetus RCIU et témoins, mâles et femelles. L’expression protéique de CPT1α est diminuée dans les coeurs des femelles RCIU seulement. Il n’existe aucune différence significative entre les différents groupes quant à l’activité enzymatique de PKM1/2. Nos résultats dressent un profil métabolique général suggérant que le sexe du foetus peut avoir un effet sur la réponse cardiaque foetale à une atteinte du volume sanguin maternel causée par la diète restreinte en sodium. Ce profil métabolique semble démontrer une atteinte du catabolisme des lipides. Afin de bien caractériser cette réponse du mécanisme énergétique, l’activité enzymatique des autres enzymes principales de la glycolyse (HK1, HK2, PFK1), le flux intra-mitochondrial d’acyl CoA à travers les CPTs ainsi que la quantité totale d’acétyl CoA devront être quantifiés. / A low sodium diet was given to pregnant rats during the last week of gestation. This diet diminished the maternal expansion of blood volume, the uterine arteries diameter, and placental weight, when compared to their controls. Together, these results suggest a lower placenta perfusion and a decreased output of nutrients to the fetus. The offspring of these pregnant rats were born with an intra-uterine growth retardation (IUGR). The fetal heart utilizes glucose through glycolysis as the major cardiac energy substrate. At birth, the principal source of energy switches to the oxidation of fatty acids, through β-oxydation. We hypothesized that within our IUGR model, the fetal heart could respond to a diminished nutritional intake due to the maternal input when a decreased cardiac energy metabolism was present. The pregnant rats of both groups (controls and on the low sodium diet) were sacrificed on day 22 of a 23 day gestation. The fetal hearts were then analyzed looking for signs of the limiting proteins glycolysis and β-oxidation. The GLUT1, GLUT4, HK1, HK2, CPT2, CPT1β, cytochrome c, PFK1, PKM1/2 proteins obtained through a Western immunoblot method were similar between the hearts of the IUGR and their control fetuses, whether they were male or female. The protein expression of CPT1α was lower only in female IUGR fetal hearts. There was no significant difference between the groups with respect to the enzymatic activity of PKM1/2. Our results suggest that the metabolic profile changes with regards to the fetus gender and could affect the fetal cardiac metabolism, due to a lower maternal blood flow caused by a sodium controlled diet, by diminishing its lipid metabolism and sparing glucose metabolism. To characterize the energy metabolism, the enzymatic activity of the other principal limiting enzymes glycolysis (HK1, HK2, PFK1), the intra-mitochondrial flux of acyl CoA through the CPTs and the total quantity of acetyl CoA must also be analyzed.

The current understanding of lactate metabolism in fish is based almost entirely on interpretation of concentration measurements that cannot be used to infer changes in flux. Moreover, the transporters regulating these fluxes have never been characterized in rainbow trout. My goals were: (1) to quantify lactate fluxes in rainbow trout under normoxic resting conditions, during acute hypoxia, and exercise by continuous infusion of [U-14C] lactate; (2) to determine lactate uptake capacity of trout tissues by infusing exogenous lactate in fish rest and during graded exercise, and (3) to clone monocarboxylate transporters (MCTs) and determine the effects of exhausting exercise on their expression. Such information could prove important to understand the mechanisms underlying the classic “lactate retention” seen in trout white muscle after intense exercise. In normoxic resting fish, the rates of appearance (Ra) and disappearance (Rd) of lactate were always matched (~18 to 13 µmol kg-1 min-1), thereby maintaining a low baseline blood lactate concentration (~0.8 mM). In hypoxic fish, Ra lactate increased from baseline to 36.5 µmol kg-1 min-1, and was accompanied by an unexpected 52% increase in Rd reaching 30.3 µmol kg-1 min-1, accounting for a rise in blood lactate to 8.9 mM. In exercising fish, lactate flux was stimulated > 2.4 body lengths per second (BL s-1). As the fish reached critical swimming speed (Ucrit), Ra lactate was more stimulated (+67% to 40.4 μmol kg-1 min-1) than Rd (+41% to 34.7 μmol kg-1 min-1), causing an increase in blood lactate to 5.1mM. Fish infused with exogenous lactate stimulated Rd lactate by 300% (14 to 56 μmol kg-1 min-1) during graded exercise, whereas the Rd in resting fish increased by only 90% (21 to 40 µmol kg-1 min-1). Four MCT isoforms were partially cloned and characterized in rainbow trout: MCT1b was the most abundant in heart, and red muscle, but poorly expressed in gill and brain where MCT1a and MCT2 were prevalent. MCT4 was more expressed in the heart. Transcript levels of MCT2 (+260%; brain), MCT1a (+90%; heart) and MCT1b (+50%; heart) were stimulated by exhausting exercise. This study shows that: (i) the increase in Rd lactate plays a strategic role in reducing the lactate load imposed on the circulation. Without this response, blood lactate accumulation would double; (ii) a high capacity for lactate disposal in rainbow trout tissues is elicited by the increased blood-to-tissue lactate gradient when extra lactate is administered; and (iii) rainbow trout may be unable to release large lactate loads rapidly from white muscle after exhausting exercise (lactate retention) because they poorly express MCT4 in white muscle and fail to upregulate its expression during exercise.

La recherche de variations d’activités enzymatiques associées à des phénotypes chez la tomate (Solanum Lycopersicum) a permis d’apporter de nouveaux éléments pour l’étude desrelations existantes entre le métabolisme central et la qualité du fruit. Ce projet qui engageaitune nouvelle thématique au sein de l’unité Biologie et Pathologie de Fruit (UMR 1332, INRABORDEAUX) a permis dans un premier temps de développer une plateforme d’enzymologieà haut débit. Cette structure permet d’une part de réaliser plus de 10 000 déterminationsd’activités enzymatiques par jour avec une très grande reproductibilité et d’autre part dedéterminer les constantes de Michaelis (Km) apparentes pour jusqu’à une dizaine d’enzymespar jour.Dans un deuxième temps ce projet s’est attaché à étudier les relations existantes entre lesenzymes de la voie de la glycolyse chez le cultivar de tomate MicroTom. Nous y avonsrelevé l’existence de corrélations fortes entre les activités de ces enzymes. Nous avonségalement mis à jour l’existence de corrélations pour les enzymes mesurées à partir de deuxétages foliaires distincts ce qui suggère que les réseaux enzymatiques sont conservés ausein d’une plante.Dans un troisième temps, le criblage d’une collection de mutants de tomate MicroTom a étéentrepris. Ce criblage de plus de 150 familles (soit environ 1800 plantes) sur la base desactivités enzymatique de onze enzymes du métabolisme central à deux concentrations desubstrats différentes (saturante et non saturante) a abouti à l’identification de deux familles.Ces deux familles porteraient chacune une mutation affectant les caractéristiques cinétiquesde la Triose-Phosphate Isomérase. Ces mutations étaient toujours en cours d’étude à la finde ce projet. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension desrelations entre les enzymes du métabolisme central. Ils permettent aussi d’apporter desméthodes d’identification rapide de mutants enzymatiques au sein d’une large population. / Research on enzymatic variations associate with phenotypes in tomato (SolanumLycopersicun) provided new and original input regarding links between central metabolismand fruit quality. This project took part in a new topic of the Fruit Biology and Pathology Unit(UMR 1332, INRA BORDEAUX). First, during this project, a new high-throughputenzymology platform was created. This unique lab offers possibility to determine both morethan 10 000 enzyme activities per day with a very good reliability and apparent Michealisconstant (Km) for up to ten enzymes per day.Second, this project investigated existent relationship between glycolytic enzymes inMicroTom tomato cultivar. We highlighted strong correlations between enzymes in leaves.We also uncovered correlations between enzymes activities measured in two distinct foliarlevels. These elements suggest inheritability of the enzymes network within the plant.Third, the screen of an Ethylmethyl Sulfonate (EMS) MicroTom mutant’s collection wasinitiated. 150 families (around 1800 plants) were screened for eleven enzymes with twodifferent substrate concentrations. At the end of the process, two families were identified;both could have mutation(s) that affect(s) the kinetic characteristic of Triose-Phosphateisomerase. These mutations were style investigated at the end of this project. These originalresults provide new perspectives for knowledge of relationship between central metabolism’senzymes. Finally, This project proposes new and rapid enzymatic mutant identification withina large population as an EMS mutant’s collection.

The current understanding of lactate metabolism in fish is based almost entirely on interpretation of concentration measurements that cannot be used to infer changes in flux. Moreover, the transporters regulating these fluxes have never been characterized in rainbow trout. My goals were: (1) to quantify lactate fluxes in rainbow trout under normoxic resting conditions, during acute hypoxia, and exercise by continuous infusion of [U-14C] lactate; (2) to determine lactate uptake capacity of trout tissues by infusing exogenous lactate in fish rest and during graded exercise, and (3) to clone monocarboxylate transporters (MCTs) and determine the effects of exhausting exercise on their expression. Such information could prove important to understand the mechanisms underlying the classic “lactate retention” seen in trout white muscle after intense exercise. In normoxic resting fish, the rates of appearance (Ra) and disappearance (Rd) of lactate were always matched (~18 to 13 µmol kg-1 min-1), thereby maintaining a low baseline blood lactate concentration (~0.8 mM). In hypoxic fish, Ra lactate increased from baseline to 36.5 µmol kg-1 min-1, and was accompanied by an unexpected 52% increase in Rd reaching 30.3 µmol kg-1 min-1, accounting for a rise in blood lactate to 8.9 mM. In exercising fish, lactate flux was stimulated > 2.4 body lengths per second (BL s-1). As the fish reached critical swimming speed (Ucrit), Ra lactate was more stimulated (+67% to 40.4 μmol kg-1 min-1) than Rd (+41% to 34.7 μmol kg-1 min-1), causing an increase in blood lactate to 5.1mM. Fish infused with exogenous lactate stimulated Rd lactate by 300% (14 to 56 μmol kg-1 min-1) during graded exercise, whereas the Rd in resting fish increased by only 90% (21 to 40 µmol kg-1 min-1). Four MCT isoforms were partially cloned and characterized in rainbow trout: MCT1b was the most abundant in heart, and red muscle, but poorly expressed in gill and brain where MCT1a and MCT2 were prevalent. MCT4 was more expressed in the heart. Transcript levels of MCT2 (+260%; brain), MCT1a (+90%; heart) and MCT1b (+50%; heart) were stimulated by exhausting exercise. This study shows that: (i) the increase in Rd lactate plays a strategic role in reducing the lactate load imposed on the circulation. Without this response, blood lactate accumulation would double; (ii) a high capacity for lactate disposal in rainbow trout tissues is elicited by the increased blood-to-tissue lactate gradient when extra lactate is administered; and (iii) rainbow trout may be unable to release large lactate loads rapidly from white muscle after exhausting exercise (lactate retention) because they poorly express MCT4 in white muscle and fail to upregulate its expression during exercise.

No description available.

Die zunehmende Ausbreitung des Usutu-Virus in Europa als Ursache für fatale Ausbruchsgeschehen innerhalb der Avifauna, insbesondere unter Sperlingsvögeln (Passeriformes) und Eulenartigen (Strigiformes), stellt in Zusammenhang mit einem neuroinvasiven sowie zoonotischen Potential ein Risiko für die Veterinär- sowie Humanmedizin dar. Trotz dieser Relevanz stehen derzeit keine zugelassenen Therapeutika gegen eine Usutu-Virus-Infektion zur Verfügung. Auf Basis indikationsfremder Substanzen mit pharmakologischer Zulassung im Sinne des drug repositioning sowie auf Grundlage der Gegenregulation viral-induzierter Modulationen des Zellmetabolismus wurde die Identifikation antiviraler Therapieoptionen gegen das Usutu-Virus in vitro angestrebt.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Usutu-Virus 2.1.1 Ursprung, Klassifikation und Epidemiologie 2.1.1 Transmissionszyklus und Wirtstropismus 2.1.2 Aufbau des Virions und des Genoms 2.1.3 Veterinärmedizinische Relevanz und pathologische Ausprägung 2.1.4 Humanmedizinische Bedeutung als Zoonose-Erreger 2.1.5 Vergleichende Aspekte zum West-Nil-Virus 2.2 Antivirale Präventions- und Therapieoptionen 2.2.1 Möglichkeiten und Grenzen der Immunprophylaxe 2.2.2 Pharmaka mit potentiell antiviraler Wirkung gegen Flaviviren 2.2.3 Identifizierte Substanzen gegen das Usutu-Virus 2.3 Zelluläre Systeme als antivirale Zielobjekte 2.3.1 Das Interferon-System und seine antivirale Schutzfunktion 2.3.2 Viral-induzierte Modulation des Wirtszellmetabolismus 3 Zielstellungen der Dissertation 4 Material 4.1 Zelllinien 4.2 Viruslinien 4.3 Zellkulturmedien 4.4 Pharmakologische und andere Substanzen 4.5 Chemikalien 4.6 Lösungen und Puffer 4.7 Antikörper 4.8 Reagenzien und Kit-Systeme 4.9 Enzyme und Nukleotide 4.10 Primer 4.11 Verbrauchsmaterialen 4.12 Geräte 4.13 Datenbanken und Software 5 Methodik 5.1 Zellkultivierungstechnik und PBMC-Isolation 5.2 Isolation von Usutu-Virus-Linien aus Gewebeproben in Zellkultur 5.2.1 Aufbereitung aviären Organmaterials 5.2.2 Typisierung von in Deutschland zirkulierenden Usutu-Virus-Linien (2019, 2020) 5.2.3 Virusanzucht in verschiedenen Zellkulturen zur Virusstock-Generierung 5.3 Quantifizierung des extrazellulären Virustiters 5.4 Immunfluoreszenzanalyse 5.5 Präparation pharmakologischer und anderer Substanzen 5.6 Infektionsansätze mit dem Usutu-Virus und WNV 5.7 Durchflusszytometrische Analyse 5.8 Zytotoxizitätsstudien 5.9 Extrazelluläre Fluxanalyse mittels Agilent Seahorse XF-Technologie 5.10 Statistische Analyse 6 Ergebnisse 6.1 Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 6.2 Replikationsdynamik des Usutu-Virus in verschiedenen Zelllinien 6.3 Pharmakologisches Screening zur antiviralen Wirksamkeit gegen das Usutu-Virus 6.4 Identifikation und Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften von Ivermectin 6.5 Wirkung von Ivermectin gegen Linie 2 des West-Nil-Virus in einer aviären Zelllinie 6.6 Metabolischer Phänotyp Usutu-Virus-infizierter Zelllinien 6.7 Antivirale Inhibition der Glykolyse durch 2-Deoxy-D-Glukose 6.8 Einfluss von exogenem Interferon auf den Wirtszellmetabolismus unter Infektion 6.9 Auswirkung der Interferon-Rezeptor-Defizienz auf den Metabolismus unter Infektion 7 Diskussion 7.1 Typisierung und Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 7.2 Charakterisierung der zelltypspezifischen Permissivität und Replikationskinetik 7.3 Identifikation antiviral wirksamer Substanzen gegen das Usutu-Virus 7.4 Usutu-Virus-induzierte Modulation des Metabolismus als antiviraler Ansatz 8 Ausblick 9 Zusammenfassung 10 Summary 11 Literaturverzeichnis 12 Anhang 12.1 Zusatzmaterial 12.2 Publikation 1 12.3 Publikation 2 12.4 Publikation 3 12.5 Weitere Veröffentlichungen 13 Danksagung / The emerge of Usutu virus (USUV) in Europe as a causative agent of fatal outbreaks in avifauna, notably in Passeriformes and Strigiformes, as well as its neuroinvasive and zoonotic potential emphasize a considerable risk in veterinary and human medicine. Despite its relevance, recently, no approved drugs against USUV infections are available. The identification of antiviral therapeutic options against USUV in vitro was addressed based on the analysis of approved drugs of other medical indications in terms of drug repositioning and the counteraction of viral-induced alterations of the cellular metabolism.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Usutu-Virus 2.1.1 Ursprung, Klassifikation und Epidemiologie 2.1.1 Transmissionszyklus und Wirtstropismus 2.1.2 Aufbau des Virions und des Genoms 2.1.3 Veterinärmedizinische Relevanz und pathologische Ausprägung 2.1.4 Humanmedizinische Bedeutung als Zoonose-Erreger 2.1.5 Vergleichende Aspekte zum West-Nil-Virus 2.2 Antivirale Präventions- und Therapieoptionen 2.2.1 Möglichkeiten und Grenzen der Immunprophylaxe 2.2.2 Pharmaka mit potentiell antiviraler Wirkung gegen Flaviviren 2.2.3 Identifizierte Substanzen gegen das Usutu-Virus 2.3 Zelluläre Systeme als antivirale Zielobjekte 2.3.1 Das Interferon-System und seine antivirale Schutzfunktion 2.3.2 Viral-induzierte Modulation des Wirtszellmetabolismus 3 Zielstellungen der Dissertation 4 Material 4.1 Zelllinien 4.2 Viruslinien 4.3 Zellkulturmedien 4.4 Pharmakologische und andere Substanzen 4.5 Chemikalien 4.6 Lösungen und Puffer 4.7 Antikörper 4.8 Reagenzien und Kit-Systeme 4.9 Enzyme und Nukleotide 4.10 Primer 4.11 Verbrauchsmaterialen 4.12 Geräte 4.13 Datenbanken und Software 5 Methodik 5.1 Zellkultivierungstechnik und PBMC-Isolation 5.2 Isolation von Usutu-Virus-Linien aus Gewebeproben in Zellkultur 5.2.1 Aufbereitung aviären Organmaterials 5.2.2 Typisierung von in Deutschland zirkulierenden Usutu-Virus-Linien (2019, 2020) 5.2.3 Virusanzucht in verschiedenen Zellkulturen zur Virusstock-Generierung 5.3 Quantifizierung des extrazellulären Virustiters 5.4 Immunfluoreszenzanalyse 5.5 Präparation pharmakologischer und anderer Substanzen 5.6 Infektionsansätze mit dem Usutu-Virus und WNV 5.7 Durchflusszytometrische Analyse 5.8 Zytotoxizitätsstudien 5.9 Extrazelluläre Fluxanalyse mittels Agilent Seahorse XF-Technologie 5.10 Statistische Analyse 6 Ergebnisse 6.1 Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 6.2 Replikationsdynamik des Usutu-Virus in verschiedenen Zelllinien 6.3 Pharmakologisches Screening zur antiviralen Wirksamkeit gegen das Usutu-Virus 6.4 Identifikation und Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften von Ivermectin 6.5 Wirkung von Ivermectin gegen Linie 2 des West-Nil-Virus in einer aviären Zelllinie 6.6 Metabolischer Phänotyp Usutu-Virus-infizierter Zelllinien 6.7 Antivirale Inhibition der Glykolyse durch 2-Deoxy-D-Glukose 6.8 Einfluss von exogenem Interferon auf den Wirtszellmetabolismus unter Infektion 6.9 Auswirkung der Interferon-Rezeptor-Defizienz auf den Metabolismus unter Infektion 7 Diskussion 7.1 Typisierung und Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 7.2 Charakterisierung der zelltypspezifischen Permissivität und Replikationskinetik 7.3 Identifikation antiviral wirksamer Substanzen gegen das Usutu-Virus 7.4 Usutu-Virus-induzierte Modulation des Metabolismus als antiviraler Ansatz 8 Ausblick 9 Zusammenfassung 10 Summary 11 Literaturverzeichnis 12 Anhang 12.1 Zusatzmaterial 12.2 Publikation 1 12.3 Publikation 2 12.4 Publikation 3 12.5 Weitere Veröffentlichungen 13 Danksagung

Problématique : Durant la période fœtale, le métabolisme global du fœtus fonctionne en hypoxie, ce qui limite la phosphorylation oxydative dans la mitochondrie, et par conséquent la production d’adénosine triphosphate (ATP). Ces conditions sont nécessaires pour le développement intra-utérin. Lors de la naissance, l’augmentation des concentrations d’oxygène et un stress oxydatif permettent une transition métabolique. Une charge oxydative supplémentaire en période néonatale pourrait perturber cette transition métabolique et causer des complications. La nutrition parentérale (NP) administrée aux nouveau-nés prématurés apporte un triple fardeau oxydatif : une exposition à des peroxydes oxydants autogénérés par l’interaction des composants de la NP, une carence en vitamine C (instable en solution), et une déficience en glutathion, vu la charge oxydative élevée. Cette charge oxydative excessive affecte l’homéostasie redox au foie et aux poumons, ainsi que le métabolisme énergétique hépatique, et ce, par des effets immédiats et à long-terme. La méthylation de l’ADN est un possible mécanisme qui explique les effets à long terme. Le but de ce travail était de caractériser l’impact à court- et long-terme de la NP néonatale sur l’homéostasie redox, la méthylation de l’ADN, et le métabolisme des glucides et lipides, en isolant chacun des facteurs nutritionnels. Méthodes : Des cochons d’Inde ont été divisés dans les groupes suivants 1) NP : nutrition intraveineuse complète ; 2) NP+ glutathion disulfure (GSSG) (6 ou 12µM- substrat pour la synthèse intra-cellulaire de glutathion); 3) Diète complète : nutrition orale complète 4) Diète déficiente en Vitamine C; 5) Diète déficiente en Cystéine; 6) Diète double déficiente; ou. À 1 semaine de vie, la moitié des animaux était sacrifié et l’autre moitié a commencé à manger une diète complète jusqu’à l’âge adulte. Résultats et discussion : Les animaux ayant reçu une NP néonatale ont un métabolisme énergétique permettant la synthèse de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) par l’augmentation de l’activité de la glucokinase (captation de glucose), et diminution de celles de la phosphofructokinase-1 (PFK-1) (glycolyse) et acétyl-CoA-carboxylase-1 (ACC)(lipogenèse). À l’âge adulte, les animaux ont une diminution des niveaux de GSSG, indiquant un débalancement de l’homéostasie redox vers le côté réducteur programmé par la NP néonatale. L’activité augmentée de l’ACC suggère une tendance à accumuler les lipides au foie à la suite d’une diète riche en glucides. L’ajout de glutathion à la NP ne prévient pas ces perturbations, car les déficiences en glutathion et vitamine C jouent un rôle sur la modulation des niveaux protéiques de l’ACC. Les diètes néonatales déficientes en vitamine C et cystéine augmentent l’activité de la PFK-1. Cette augmentation se maintient jusqu’à l’âge adulte chez les mâles, mais pas chez les femelles. Les niveaux protéiques de la glucokinase et ACC sont diminués à 1 semaine, et ceux de l’ACC sont élevés à 3 mois dans les groupes ayant reçu une des diètes déficientes. Ces effets sont similaires à ceux trouvés dans les animaux nourris avec la NP, suggérant que la déficience de la NP en ces nutriments et non les peroxydes cause ces effets. Dans tous les groupes, un stress oxydatif a été démontré à 1 semaine de vie, soit par l’augmentation des niveaux de GSSG, ou la diminution du GSH. Cet effet est vrai pour le foie et le poumon. Une réponse de Nrf2 est observée aussi au foie, ce qui caractérise un niveau bas de stress oxydatif. La baisse de GSH pulmonaire chez les animaux déficients est secondaire à l’inhibition oxydative de la voie de transméthylation au foie. Une diminution des niveaux d’ARNm de glutathion réductase et glutarédoxine sont observées, ce qui favorise encore le stress oxydatif pulmonaire. À long terme, les effets sont les opposés, soit débalancement de l’homéostasie redox vers le côté réducteur au foie et poumon. La méthylation de l’ADN était diminuée au foie des animaux nouveau-nés recevant les diètes déficientes, mais aucun changement n’a été observé aux poumons. Cette diminution est en accord avec les hauts niveaux d’ARNm des gènes de la protéine régulatrice de la glucokinase, et AMPK. À long-terme, l’effet inverse est observé pour la méthylation de l’ADN Conclusion : La NP modifie le flot d’énergie au foie à 1 semaine visant favoriser le métabolisme redox en détriment du métabolisme énergétique. Cet effet semble créer une déficience énergétique fonctionnelle, qui se développe en une lipogenèse accrue en âge adulte. Cela peut représenter un exemple de la plasticité développementale. Bien qu’un stress oxydatif en âge néonatal ne soit pas létal, il affecte le métabolisme énergétique et redox à long-terme, probablement par la méthylation de l’ADN. Les résultats de ce travail démontrent que ces animaux adultes ont une capacité accrue d’entreposer de l’énergie, soit par une lipogenèse plus élevée, soit par une accumulation d’énergie redox (glutathion). Aucune maladie métabolique n’était observée chez les animaux, mais il est attendu à ce que ces animaux développent ces maladies plus facilement suite à l’exposition à des insultes (habitudes de vie malsaines, tabagisme, etc.). / Problematic: During the fetal period, the general metabolism works under hypoxia, limiting oxidative phosphorylation in mitochondria and adenine triphosphate (ATP) synthesis. These conditions are necessary for intrauterine development. After birth, the increasing oxygen concentrations and the associated oxidative stress induce a metabolic transition. An excessive oxidative load during the neonatal period could perturb this transition. Parenteral nutrition (PN) administered to premature newborns comes with a triple oxidative burden: contaminating peroxides generated in solution, vitamin C deficiency (unstable in solution), and glutathione deficiency (caused by the high oxidative load). This oxidative load affects redox homoeostasis in the liver and lungs, as well as energy metabolism in the liver. These effects are not only immediate, but they are also delayed. DNA methylation is a candidate mechanism explaining the long-term effects. The objective of this work was to characterize the short- and long-term impacts of neonatal PN over redox homoeostasis, DNA methylation and carbohydrate and lipid metabolism by isolating each of these factors. Methods: Six groups of three-day-old guinea pigs received for 4 days either: 1) Total PN; 2) PN+glutathione disulfide (GSSG) (6 or 12µM-anti-peroxide);3) Vitamin C deficient; 4) Cysteine deficient; 5) Double deficient; or 6) Complete diets. At 1 week of life, half of the animals were sacrificed, and the other half started eating nutritionally complete diets until adulthood. Results and discussion: NP animals had energy metabolism shifted favouring nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) synthesis, as evidenced by the increase in glucokinase activity (glucose trapping in hepatocytes) and decrease in phosphfuctokinase-1 (PFK-1) (glycolysis) and acetyl-CoA-carboxyalase-1 (ACC) (lipogenesis) activities. Adding GSSG to parenteral nutrition prevents these changes. During adulthood, ACC activity is increased, suggesting a tendency to accumulate lipids after a diet rich in carbohydrates. Adding GSSG to PN does not prevent these changes as they seem to be caused by the nutritional deficiencies in vitamin C and cysteine. Neonatal diets deficient in vitamin C and cysteine increase PFK-1 activity. This increase is maintained until adulthood in males but not in females. Protein levels of glucokinase and ACC are decreased at 1 week of life and ACC levels are increased at adulthood in deficient groups. These effects are like the ones observed in PN animals. In all groups, oxidative stress is demonstrated in 1-week-old animals, either by an increase in GSSG levels, or a decrease in GSH. This is true for the liver and lungs. An Nrf2 response is also observed in the liver, suggesting a low level of oxidative stress. The decrease in lung GSH is secondary to the oxidative inhibition of the transmethylation pathway in the liver. Decreased levels of glutathione reductase and glutaredoxin mRNA levels are observed in lungs, favouring pulmonary oxidative stress. At adulthood, an imbalance in redox homeostasis towards a reducing state is observed in lungs and liver. DNA methylation was decreased in the liver of deficient animals at 1-week, but no changes were observed in lungs. This decrease is in accordance with the decrease in mRNA levels of glucokinase regulatory protein and AMPK. At adulthood, the opposite effect was observed for DNA methylation. Conclusion: Parenteral nutrition alters the energy flow in the liver of 1-week-old animals, favouring redox metabolism over energy metabolism. This effect seems to create a phenotype of functional energy deficiency which translates into an increased lipogenesis at adult age. This may be an example of developmental plasticity. Although neonatal oxidative stress is not lethal, it affects energy and redox metabolism at adulthood, probably through DNA methylation. The presented results demonstrate these animals have an increased capacity of storing energy, either through increased lipogenesis, or by an increase in redox energy accumulation (glutathione). No metabolic disease was observed. Although it would be expected that these animals would develop these diseases more easily after exposure to insults, such as unhealthy lifestyle habits, smoking, and others.

Dans les pays industrialisés, les rétinopathies ischémiques proliférantes telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré sont les principales causes de cécité chez les individus en âge de travailler et la population pédiatrique. Ces pathologies sont caractérisées par une dégénérescence microvasculaire initiale suivie d’une hyper-vascularisaton compensatoire disproportionnée et pathologique. Les sirtuines constituent une importante famille de protéines impliquées dans le métabolisme et la réponse au stress. Plus particulièrement, sirtuine 3 (SIRT3) est une déacétylase mitochondriale primordiale qui agit au cœur du métabolisme énergétique et de l’activation de nombreuses voies métaboliques oxydatives. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’une déficience en SIRT3 diminue la sévérité des lésions vasculaires dans le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). En plus de stimuler l’angiogénèse, l’absence de SIRT3 est aussi associée à une augmentation de la glycolyse, possiblement en activant la famille de gènes 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). Nous suggérons que le manque de SIRT3 est impliqué dans l’effet Warburg et procure ainsi un avantage prolifératif et protecteur dans l’OIR. La présente étude propose SIRT3 comme nouvelle cible thérapeutique potentielle dans la rétinopathie du prématuré, une maladie dont les complications désastreuses persistent tout au long de la vie. / Proliferative ischemic retinopathies such as proliferative diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity (ROP) are the leading causes of blindness in working age and pediatric populations in industrialized countries. These pathologies are characterized by an initial microvascular degeneration followed by a disproportionate compensatory but pathological hyper-vascularization mounted by the hypoxic and energy deficient retina in an attempt to reinstate metabolic equilibrium. Sirtuins are an important family of protein involved in metabolism and stress response. Sirtuin 3 (SIRT3) in particular is a major mitochondrial deacetylase central to energy metabolism and the regulation of many oxidative pathways. For the first time, our results show that a lack of SIRT3 decreases the severity of vascular lesions in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Deficiency in SIRT3 not only stimulates angiogenesis, but also increases glycolysis, possibly through indirect activation of the gene family 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). We suggest that a lack of SIRT3 is involved in the Warburg effect and therefore confers a proliferative advantage that is protective in OIR. The present study puts forward SIRT3 as a new potential therapeutic target for ROP, a disease leading to life-long vision complications.