Com o objetivo de identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) 217 roedores (quatro camundongos -Mus musculus, 20 ratazanas - Rattus norvegicus e 193 ratos de telhado - Rattus rattus) foram capturados entre abril de 2005 e fevereiro de 2008, para realização do diagnóstico biológico e molecular. Das 20 ratazanas (Rattus norvegicus) capturadas apenas uma foi positiva para T. gondii pelo bioensaio, correspondendo a 5% de positividade entre as ratazanas e 0,46% entre todos os roedores capturados. O isolado obtido dessa ratazana foi caracterizado como genótipo recombinante I, III e u-1 por PCR-RFLP, similar ao isolado previamente descrito e obtido de duas ovelhas e um gato, todos do Estado de São Paulo. Quatro amostras de roedores negativos ao bioensaio resultaram como positivas ao T. gondii pela nested PCR B1. Entretanto, quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) não houve confirmação desse resultado em três delas. Em relação ao N. caninum, amostras de tecido cerebral e cardíaco de 121 roedores foram examinadas por nested PCR Nc5, tendo sido encontradas 12 amostras positivas, provenientes de 10 roedores. Quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) N. caninum não foi confirmado em nenhuma das amostras. Este estudo conclui que a ocorrência de T. gondii e N. caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) é baixa, sugerindo que estes animais não possuem papel importante na cadeia epidemiológica como reservatórios desses agentes para predadores como os cães e gatos urbanos. / In order to identify Toxoplasma gondii and Neospora caninum in urban rodents from the Great São Paulo (SP) 217 rodents (four Mus musculus, 20 Rattus norvegicus and 193 Rattus rattus) were captured between April 2005 and February 2008 to biological and molecular diagnosis. One out of the 20 Rattus norvegicus was considered positive by bioassay in mice, corresponding to a 5% positivity among Rattus norvegicus and a 0.46% positivity considering all captured rodents. The isolate from this rat was characterized as a recombinant I, III and u-1 genotype by RFLP-PCR. This characterization had been previously described from isolates obtained from two sheep and one cat also from São Paulo state. Four samples from rodents with negative results by bioassay were positive to T. gondii by nested PCR B1. However, when tested with nested PCR ITS1 and RFLP these results were not confirmed in three of these samples. Regarding N. caninum, brain and heart samples of 121 rodents were examined by nested PCR Nc5 and 12 samples from 10 rodents were positive. When tested with nested PCR ITS1 and RFLP all of these samples turned out to be negative. This study concludes that T. gondii and N. caninum have low occurrence in urban rodents in the Great São Paulo area, and they are not important as T. gondii and/or N. caninum reservoirs to predators like urban cats and dogs.

O objetivo deste estudo foi o isolamento de Toxoplasma gondii de ovinos e caprinos e posterior caracterização genotípica desses isolados. Amostras de soros ovinos (495) de 36 Municípios do Estado de São Paulo e de caprinos (143) de seis Municípios dos Estados da Bahia (10), Paraíba (12), Rio Grande do Norte (7) e São Paulo (114) foram testadas, através do Teste de Aglutinação Modificado (MAT&ge;25) à presença de anticorpos anti-T. gondii. Dos animais amostrados, 24,2% e 32,2% dos ovinos e caprinos respectivamente, apresentaram-se positivos com títulos que variaram de 25 a 3200 em ambas espécies. Dentre os ovinos houve associação (p<0,001) entre sexo, idade e sistema de produção com a presença de anticorpos anti-T. gondii. Os caprinos apresentaram associação entre idade, sistema de produção, e raça com a soropositividade. Para o isolamento do agente o bioensaio em camundongos foi realizado utilizando-se pool de tecidos de ovinos (cérebro, coração e diafragma) e caprinos soropositivos (cérebro, coração e diafragma e masseter). Dos 82 bioensaios realizados com amostras de ovinos, 16 isolados (19,5%) foram obtidos. Houve associação entre o título de anticorpos anti-T. gondii e o isolamento do agente (p<0,001) com maior quantidade de isolados obtidos de animais com títulos mais altos. Para a caracterização genotípica das amostras utilizou-se a análise de polimorfismo de comportamento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR, que as identifica em genótipos I, II e III. Amostras do tipo I (87,5% dos ovinos e 100 % dos caprinos) e do tipo III (12,5% dos isolados de ovinos) foram obtidas e não houve o encontro de isolados tipo II ou mistas. Nos tecidos dos animais com títulos de anticorpos superiores a 400, e dos quais não se obteve o isolamento do agente pelo bioensaio (21 amostras de ovinos), foi realizada a nested-PCR das amostras primárias (homogeneizado de tecidos), não sendo obtida nenhuma amplificação. Amostras do tipo III não causaram óbitos nos camundongos e as tipo I causaram óbitos em 51,0% e 83,4% dos isolados de ovinos e caprinos, respectivamente. Houve associação entre a sobrevida dos camundongos infectados com o genótipo I de caprinos e ovinos (p<0,001). / The aim of this study was to analyze the SAG2 locus of Toxoplasma gondii isolated from sheep and goats in order to determine the frequency of occurrence of the three different lineages (types I, II and III). Serum samples of sheep (495) from 36 counties in São Paulo State and goat (143) from six counties in States of Bahia (10), Paraíba (12), Rio Grande do Norte (7) and São Paulo (114) were analyzed by the modified agglutination test (MAT&ge;25) for the detection of antibodies anti-T. gondii. Occurrence of antibodies anti-T. gondii was 24.2% and 32.2% in sheep and goats, respectively. The titers varied from 25 to 3200 in both species. Among sheeps, association of seropositivity (p<0,001) with sex, age, production system and presence of antibodies anti-T. gondii was observed. Association was also observed between the frequency of seropositive goats and age, production system and breed. For T. gondii isolation, pool of tissues of each seropositive sheep (brain, heart and diaphragm) and goat (brain, heart, diaphragm and masseter) were bioassayed in mice. From a total of 82 bioassay performed with sheep samples, 16 isolates (19.5%) were obtained. Association between antibodies anti-T. gondii titers and isolation was observed (p<0.001). Considering the goats, 12 isolates (42.6%) were obtained from 26 bioassays. For the genotypic characterization (genotype I, II and III), the restriction fragment length polymorphism (RFLP) was performed on fragments of the locus SAG2 amplified by PCR. Samples of type I (87.5% from sheep and 100% from goats) and type III (12.5% from sheep) was observed. Neither type II nor mixed samples were observed. In tissues samples from animals with antibodies titers above 400 in which T. gondii was not isolated (21 sheep sample), nested-PCR was performed and no amplification was observed. Mortality was not observed in the mice infected by the isolates type III. The isolates of type I from sheep and goats, respectively, killed 51.0% and 83.4% of the infected mouse. Association was also observed between mortality rate in infected mice and genotype I of sheep and goat (p<0.001).

A toxoplasmose, protozoose disseminada de baixa morbidade, apresenta número significativo de doença ocular, congênita ou do sistema nervoso central. O diagnóstico é sorológico por diferentes testes, mas limiares baixos e variação individual levam a frequentes problemas. Novos imunoensaios fluorescentes de fase sólida (FLISA) usam a quantificação direta de anticorpos. Aqui, desenvolvemos um FLISA multiplex (FLISAm) para a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM contra Toxoplasma gondii. Após padronização, a eficiência do FLISAm com conjugados comerciais foi feita inicialmente de forma isolada para cada imunoglobulina em 140 amostras de soro de universitários previamente analisadas pelo ELISA IgG/IgM. FLISA IgG mostrou boa concordância (Kappa=0,7088), com sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94,2%, enquanto FLISA IgM apresentou boa concordância (K=0,6026), menor sensibilidade de 55,5% e igual especificidade de 98,4%. Foram produzidos novos conjugados fluorescentes de maior especificidade e seu desempenho no FLISAm foi validado em 24 amostras e sua eficiência foi avaliada em 120 amostras conhecidas de soro de gestantes. FLISAm mostrou excelente concordância, tanto para a detecção de anticorpos IgG (K=0.8837, sensibilidade=100,0%, especificidade=87,5%), quanto para a detecção de anticorpos IgM (K=0,9187, sensibilidade=100%, especificidade=99,1%) com excelente reprodutibilidade. O teste desenvolvido é rápido, econômico, de fácil execução, alto rendimento e que pode ser utilizado como método de triagem de soroconversão em mulheres grávidas, útil em aplicações de grande número de amostras como o cuidado pré-natal. / Toxoplasmosis, a disseminated low morbidity protozoan disease, presented significant numbers of affected people, mainly ocular disease, fetal infections or encephalitis in immune deficient patients. Serology is the main diagnosis with commercial antibody assays, but individual variation or low thresholds cause many inconsistencies. New solid phase immunofluorescence assays (FLISA) allows direct antibody quantification in microplates. Here, we developed a multiplex FLISA (FLISAm) for simultaneous detection of IgG and IgM anti-Toxoplasma gondii antibodies. After standardization, the efficiency of this method was initially analyzed in isolated FLISA for each immunoglobulin with commercial conjugates in 140 serum samples of the students previously screened by IgG/IgM ELISA. IgG FLISA showed good concordance (Kappa=0.7088), 83,3% sensitivity and 94,2% specificity, while IgM FLISA also showed good concordance (Kappa=0,6026), lower 55,5% sensitivity and similar 98,4% specificity. New higher efficiency conjugated were prepared and tested in 120 serum samples of the pregnant woman in a same well conjunct IgG/IgM FLISAm. We also validate the FLISAm in 24 serum samples. Compared to isolated ELISA IgG/IgM, FLISAm demonstrated excellent concordance for IgG (Kappa=0.8837; sensitivity=100%; specificity=87,5%,) and IgM (Kappa=0,9187; sensitivity=100%; specificity=99,1%), with excellent reproducibility. The standardized FLISAm is quick, inexpensive, easily performed and high throughput and the assay can be used for screening serum conversion in pregnant women, useful in large numbers applications as antenatal care.

Introdução: A água tem sido considerada um importante veículo para a disseminação de surtos de toxoplasmose em vários países. Os oocistos de Toxoplasma gondii podem persistir no ambiente durante longos períodos, sendo altamente resistentes aos vários processos químicos de inativação, inclusive aos processos comuns de desinfecção utilizados pelos sistemas produtores de água. Pouco se tem registrado no país sobre a real extensão da contaminação dos recursos hídricos por Toxoplasma gondii, sendo que a sua detecção em amostras de águas é muito importante na implantação de ações preventivas. As metodologias existentes no momento para identificação e quantificação deste parasita nestes tipos de amostras não estão universalmente padronizadas e apresentam limitações. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo verificar a possível presença do protozoário em águas superficiais de abastecimento público no Estado de São Paulo mediante a implantação de uma metodologia específica para a quantificação de oocistos de Toxoplasma gondii por reação quantitativa de PCR em tempo real nessas amostras. Método: Um total de 39 amostras de águas superficiais provenientes de 10 mananciais do Estado de São Paulo foram analisadas durante o período de maio a dezembro de 2015. Volumes de 20L da amostra foram concentrados por meio de filtração em cápsulas Envirocheck® HV (Pall Gelman Laboratory), sendo a cápsula filtrante tratada com uma solução dispersante, eluída e o eluato concentrado por centrifugação. O sedimento obtido após a centrifugação da amostra foi submetido à extração de DNA, sendo utilizado o kit de extração PowerSoil DNA isolation® (MO BIO Laboratories). A sequência alvo selecionada para detecção e quantificação de oocistos de Toxoplasma gondii através da reação quantitativa de PCR em tempo real foi um fragmento de 62 pares de bases do gene B1, sendo utilizado o seguinte conjunto de iniciadores: 5 CTAGTATCGTGCGGCAATGTG 3 (531-551) e 5GGCAGCGTCTCTTCCTCTTTT 3 (571-592). A sonda utilizada foi: 5 (6-FAM) CCACCTCGCCTCTTGG-(NFQ-MGB) 3. Resultados: Do total das amostras analisadas, 7,7 por cento (3/39) foram positivas para oocistos de Toxoplasma gondii e dentre os 10 mananciais estudados, detectou-se a ocorrência do protozoário em 30 por cento (3/10) dos mesmos. Conclusão: Os dados obtidos no presente estudo demonstram que o protozoário Toxoplasma gondii está circulando em águas superficiais de abastecimento público no Estado de São Paulo. / Introduction: Water is an important vehicle for the spread of toxoplasmosis outbreaks in several countries. Toxoplasma gondii oocysts may remain for a long period in the environment and are highly resistant to chemical inactivation, including the routine classical disinfection procedures in water treatment facilities. Few reports have been published in Brazil about the real extent of the contamination of water resources by Toxoplasma gondii, which is of major importance to implement preventive actions. Methods for the identification and quantification of the parasite in water bodies are not standardized and have limitations. Objective: This study aimed to verify the presence of these protozoa in surface waters used as source for drinking water production in the State of São Paulo by implementing a specific methodology to quantify Toxoplasma gondii oocysts with quantitative real-time PCR. Method: Thirty nine samples of surface waters from 10 different sites in the State of São Paulo were analized from May to December 2015. Volumes of 20L of each sample were concentrated by filtration with capsule Envirocheck® HV (Pall Gelman Laboratory).The filter capsule was treated with a dispersant solution, eluted, and the eluate concentrated by centrifugation. DNA was extracted from the resulting pellet with PowerSoil DNA isolation® (MO BIO Laboratories) extraction kit. A fragment of 62 base pairs of the B1 gene was selected as target sequence for detection and quantitation the Toxoplasma gondii oocysts by the quantitative real-time PCR reaction, and the following primers: 5\' TAGTATCGTGCGGCAATGTG 3\' (531-551) and 5\'GGCAGCGTCTCTTCCTCTTTT 3\' (571-592) were used. The probe employed was 5 \'(6-FAM) CCACCTCGCCTCTTGG- (NFQ-MGB) 3\'. Results: Toxoplasma gondii oocysts were detected in 30 per cent (3/10) of the sites evaluated and 7.7 per cent (3/39) of all samples analyzed were positive. Conclusion: The results of the present study show that the protozoan Toxoplasma gondii is circulating in surface waters used as drinking water supply in the State of São Paulo.

Toxoplasma gondii vs radiação ionizante: Imunidade humoral e celular em baço e intestino de camundongos isogênicos imunizados com taquizoítos irradiados por Cobalto 60 Andrés Jimenez Galisteo Jr. Estudamos o desenvolvimento de uma vacina para toxoplasmose utilizando a radiação ionizante como ferramenta. Aqui avaliamos o desenvolvimento da imunidade sistêmica e intestinal e a resistência à infecção, em diferentes camundongos imunizados, por via oral e parenteral, com taquizoítos irradiados a 255 Gy e desafiados com cistos da cepa ME49. Camundongos C57Bl/6j, BALB/c e C57Bl/6j IFN--/- foram imunizados com 107 taquizoitos de T. gondii irradiados a 255Gy por diferentes vias. As preparações de taquizoítos irradiados, por via oral e parenteral, induziram produção de imunoglobulinas IgG e IgA no soro de camundongos, sendo predominante a subclasse de IgG2b, determinadas por ELISA. A produção de IgM foi mínima. Os animais imunizados pela via parenteral, apresentaram uma maturação mais rápida da avidez de anticorpos IgG que os animais imunizados por via oral. Houve excreção de IgG, IgA e IgM nas fezes dos animais imunizados, mais intensa nos animais imunizados por via oral. No estudo da imunidade celular induzida por antígeno e detectada for real-time PCR, houve uma grande produção de IFN- por células esplênicas, menor por células das placas de Peyer intestinais, onde houve maior produção de IL-2. Houve proteção em todos os nossos esquemas avaliados, maior nos animais BALB/c. Os animais deficientes de IFN-, não foram afetados pelo processo de imunização e apresentaram produção de IgG e IgA sérico e excreção de S-IgA e S-IgM nas fezes, com menor numero de cistos cerebrais em animais imunizados por via parenteral. Todos nossos dados apontam para a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina oral para toxoplasmose, utilizando taquizoítos irradiados, com aplicação prática na imunização de felinos domésticos e selvagens. / We are developing a vaccine for toxoplasmosis, using ionizing radiation as a tool. Here we analyzed the production of sytemic and intestinal immunity, with protection studies, in several strains of inbred mice, by oral or parenteral route, using 255 Gy irradiated tachyzoites of T. gondii RH strain, with challenge with cysts of ME- 49 strain. C57Bl/6j, BALB/c and C57Bl/6j IFN--/- mice were immunized with 107 irradiated tachyzoites, be parenteral or oral route. Those preparations, both by parenteral or oral routes, induced the production of specific IgG, mainly of the IgG2b subclass, and IgA immunoglobulins in serum, , as determined by ELISA. IgM production was negligible. Parenteral immunized mice showed higher IgG avidity maturation, as compared to oral immunized mice. Fecal excretion of IgG, IgA and IgM was detected in stools of immunized animals, more intense in oral immunized mice. In cellular immunity studies, induced by antigen, with detection of cytokine production by quantitative real-time PCR, there are a great production of IFN- by spleen cells, with lower levels in Peyer patches cells, where there are a greater IL-2 production. Challenge studies in immunized mice demonstrated protection to infection in all used schedules, greater in BALB/c mice. C57Bl/6j IFN--/- mice, when immunized, showed no signs of disease and produced similar or greater levels of antibodies than wild type mice. They also excreted S-IgA and S-IgM in stools, but with low numbers of brain cysts in parenteral immunized mice, despite similar mortality. Our data points to a fair possibility of use of those irradiated parasites as an oral vaccine, devised to use for veterinary or wild felines vaccination, reducing the production of oocysts by those hosts and interrupting the chain transmission of human toxoplasmosis.

Apesar de o protozoário Toxoplasma gondii ser considerado a única espécie válida para o gênero, são reconhecidas três linhagens clonais, denominadas Tipo I, Tipo II e Tipo III, predominantes em países da Europa ocidental e Estados Unidos. Com a pesquisa de amostras deste parasito provenientes de outras regiões do mundo, como no caso do Brasil, várias outras configurações genotípicas diferentes das dos arquétipos mencionados acima vêm sendo encontradas. Neste trabalho, quarenta galinhas/galos (Gallus domesticus) de criação livre de oito propriedades rurais de áreas limítrofes ao Pantanal da Nhecolândia no estado do Mato Grosso do Sul foram eutanasiadas e amostras de sangue, cérebro e coração foram coletadas. O sorodiagnóstico foi realizado através do Teste de Aglutinação Modificado (MAT) e, com um pool de órgãos dos animais positivos, foi realizado bioensaio em camundongos. Foram obtidos, após o bioensaio, 11 isolados de T. gondii. O DNA foi extraído dos tecidos dos camundongos infectados e a tipificação dos isolados foi realizada utilizando 12 marcadores PCR-RFLP, genericamente denominados SAG1, 5´3´SAG2, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3. Vinte e sete galinhas (67,5%) foram sorologicamente positivas para T. gondii e 13 (32,5%) foram negativas. Das amostras soropositivas, 7 (25,9%) foram positivas na diluição 1:5, 3 (11,1%) em 1:10, 2 (7,4%) em 1:20, 3 (11,1%) em 1:320, 1 (3,7%) em 1:640, 3 (11,1%) em 1:1280, 2 (7,4%) em 1:2560, 4 (14,8%) em 1:5120 e 2 (7,4%) em 1:10240. Quanto à genotipagem, cinco genótipos foram revelados nos 11 isolados de galinhas de cinco propriedades do município de Aquidauana e uma propriedade do município de Rio Verde do Mato Grosso, incluindo um genótipo misto encontrado em um isolado (TgCkBr198) que demonstrou um complexo cujos padrões são uma combinação de 2 alelos observados em oito loci. Dois genótipos foram descritos pela primeira vez, considerando os 140 isolados de galinhas de diferentes regiões brasileiras avaliadas em estudos anteriores. Os resultados corroboram com estudos anteriores sobre os isolados de T. gondii no Brasil, confirmando sua diversidade e atipicidade. / Despite the protozoan Toxoplasma gondii is considered the only valid species for the genus, three clonal lineages are recognized, known as the Type I, Type II and Type III, which predominate in Western European countries and the USA. The search for samples of this parasite from other regions of the world, as in the case of Brazil, has revealed different genotypes other than the archetypes above mentioned. In this study, forty free range chickens (Gallus domesticus) of eight farms from areas belonging to the Pantanal Nhecolândia in the state of Mato Grosso do Sul were euthanized and samples of blood, brain and heart were collected. The serodiagnosis was performed using the technique of modified agglutination test (MAT) and a pool of organs of seropositive animals was used to perform the bioassay in mice. It was obtained 11 isolates of T. gondii. DNA was extracted from tissues of infected mice and characterization of isolates was performed using 12 PCR-RFLP markers, known generically SAG1, 5\'3\'SAG2, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, C29-2, L358, PK1, Apico and CS3. Twenty-seven chickens (67.5%) were serologically positive for T. gondii and 13 (32.5%) were negative. Among the seropositive samples, 7 (25.9%) were positive at 1:5 dilution, 3 (11.1%) in 1:10, 2 (7.4%) in 1:20, 3 (11.1%) at 1:320, 1 (3.7%) at 1:640, 3 (11.1%) in 1:1280, 2 (7.4%) in 1:2560, 4 (14.8%) on 1:5120 and 2 (7.4%) at 1:10240. With regard to genotyping, five genotypes were found within 11 isolates from chickens from five properties in the municipality of Aquidauana and one property of the municipality of Rio Verde of Mato Grosso, including a mixed genotype found in one isolate (TgCkBr198) that showed a complex pattern which is a combination of 2 alleles observed at eight loci. Two genotypes have been described for the first time, considering the 140 isolates from chickens in different Brazilian regions evaluated in previous studies. The results corroborate with previous studies on the isolates of T. gondii in Brazil, confirming their diversity and atypicality.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

Em nosso estudo pretendemos estudar a via oral para o desenvolvimento de vacina para toxoplasmose utilizando parasitas irradiados por Cobalto-60, como uma alternativa para a prevenção desta importane parasitose. Para tanto, avaliamos o desenvolvimento da imunidade sistêmica e intestinal e a resistência à infecção, em camundongos imunizados por esta via com taquizoítos irradiados a 255Gy, e desafiados com cistos da cepa ME-49. Camundongos isogênicos C57Bl/6j foram imunizados com 107 taquizoitos de T. gondii irradiados a 255Gy em diferentes esquemas e utilizando adjuvantes leite (anti-péptico) e hidróxido de alumínio (anti-ácido). As preparações de taquizoítos irradiados por via oral induziram produção de imunoglobulinas IgG e IgA no soro de camundongos, sendo predominante a subclasse de IgG2a, similar a infecção crônica, determinadas por ELISA. Seu uso com adjuvantes anti-pépticos ou anti-ácidos induziu produção de IgA fecal e menos significativamente de IgG fecal. Existem indícios de indução de tolerância em nível intestinal, com queda da produção de anticorpos e da proliferação celular antígeno dirigida, especialmente quando o leite foi utilizado como adjuvante, em ensaios de produção in vitro de anticorpos ou proliferação estimulada por antígenos de T.gondii, por esplenócitos e linfócitos intestinais. As preparações orais induziram proteção quantitativa ao desafio dos animais imunizados por cepa cistogênica, que foi semelhante a imunização parenteral, quando o hidróxido de alumínio foi usado como adjuvante. Todos estes dados mostram a possibilidade de desenvolvimento de uma vacina oral para toxoplasmose utilizando taquizoítos irradiados, com aplicação prática num futuro próximo para uso em campo, utilizando iscas atrativas para imunizar felinos domésticos e selvagens. / We study the oral route for the development of a vaccine for toxoplasmosis, using parasites irradiated with 60 Cobalt, as an alternative for vaccine development to this worldwide parasitic infection. We evaluated the development of immunity at serum or mucosal levels, and their efficiency in protect the mice against challenge with oral cysts of the ME-49 strain. C57Bl/6j isogenic mice were immunized by oral route with 107 255 Gy irradiated tachyzoites from RH strain, at several protocols using milk as anti-peptic adjuvant and alum hydroxide as antacid. The preparations of irradiated tachyzoites induced production of serum IgG and IgA in immunized mice, as determined by ELISA, with IgG2a as the dominant subclass, similar to chronic infection. Their use with adjuvant allowed the excretion of significant amounts of IgA in stools also IgG, despite a lesser extent. There are suggestion of tolerance induction at mucosal level, with lower antigen induced proliferation and lower in vitro antibody production by spleen and gut lymphocytes, with the latter doses, specially when milk was used as adjuvant. All oral preparations induced some quantitative protection against challenge, which was similar to the parenteral route only isolated alum hydroxide was used as adjuvant. All these data support the possibility of the development of an oral vaccine against toxoplasmosis, using irradiated tachyzoites, which would be possible tool in near future for use in field baits, for immunizing either domestic or wild felids.

O Toxoplasma gondii apresenta uma estrutura populacional clonal. A análise genotípica do locus SAG2 foi realizada para determinar a ocorrência de diferentes linhagens de T. gondii (tipos I, II e III) em gatos domésticos. Amostras de soro de 237 gatos de 15 municípios no estado de São Paulo foram testadas para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii através do teste de aglutinação modificado (MAT). Anticorpos (MAT &ge; 25) foram encontrados em 84 (35,4%) dos 237 gatos. Com os tecidos (cérebro, coração, língua e musculatura esquelética) de 71 gatos positivos foram realizados bioensaios em camundongos (cinco camundongos por grupo) sendo obtidos 47 isolados. A análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR revelou que 34 isolados (72,4%) eram do tipo I, 12 (25,5%) eram do tipo III e um (2,1%) apresentava infecção mista (tipo I e tipo III). Não houve isolado do tipo II. A maioria dos isolados do tipo I (23/34) causou o óbito de todos os camundongos infectados e a maioria dos isolados do tipo III (7/12) não levou ao óbito nenhum camundongo infectado. Foram encontrados cistos no cérebro dos camundongos infectados em todos os 47 isolados. A determinação genotípica também foi feita diretamente das amostras primárias dos gatos (homogeneizados de tecidos) usando a nested-PCR-RFLP. A caracterização do locus SAG2 foi bem sucedida em 80,4% (37/46) das amostras testadas. Os genótipos obtidos das amostras primárias foram idênticos aos dos isolados correspondentes. O genótipo misto foi confirmado pelo seqüenciamento direto de DNA dos produtos da PCR obtidos do isolado e da amostra primária do gato. Amostras dos cinco camundongos infectados com este isolado foram seqüenciadas. Três camundongos se infectaram com o genótipo tipo III, um com o genótipo tipo I e o outro com o genótipo misto, demonstrando que infecções mistas podem originar diferentes padrões de infecção em um hospedeiro. / Toxoplasma gondii has a clonal population structure. Genotypic analysis of the SAG2 locus was performed to determine the occurrence of the different lineages of T. gondii (types I, II and III) in domestic cats. Antibodies to T. gondii were determined in serum samples of 237 cats from 15 counties in São Paulo state, Brazil, by the modified agglutination test (MAT). Antibodies (MAT &ge; 25) were found in 84 (35.4%) of 237 cats. Tissues (brain, heart, tongue and skeletal muscle) of 71 of the positive cats were bioassayed in mice (five mice per group). Forty-seven isolates were obtained. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) in PCR-amplified SAG2 products revealed that 34 isolates (72.4%) were type I, 12 (25.5%) were type III and one (2.1%) was mixed with type I and type III. There was no type II isolate. Most of the type I isolates (23/34) killed all infected mice and most of the type III isolates (7/12) killed no infected mice. Tissue cysts were found in mice infected with all 47 isolates. The genotype determination was also made directly from primary samples from cats (tissue homogenates) using nested-PCR-RFLP analysis. Characterization of the SAG2 locus was successful in 80.4% (37/46) of the samples tested. Genotypes obtained from primary samples were the same as those from the corresponding isolates. The mixed genotype was confirmed by direct DNA sequencing of PCR products from the isolate and from the cat primary sample and samples from the five mice infected with this isolate were sequenced. Three had type III genotype, one had type I, and one had type I + type III, demonstrating that mixed infections can originate different patterns of infection in a host.

Foram colhidas, de março a junho de 2004, amostras de sangue de 108 carneiros e 920 matrizes de 32 propriedades comerciais de ovinos do Distrito Federal, totalizando 1028 amostras. Os soros foram submetidos à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando-se as diluições 1:64 e 1:50 como ponto de corte para, respectivamente, T. gondii e N. caninum. A prevalência observada para T. gondii foi de 38,22% (26,81% < IC 0,95 < 49,62%). Os títulos variaram de 64 a 65536, e o título com maior freqüência foi 2048 (21,15%). Para N. caninum, a prevalência foi de 8,81% (7,08% < IC 0,95 < 10,53%), com títulos variando de 50 a 51200, sendo o título mais freqüente 50 (21,11%). Ovinos reagentes a ambos os parasitas corresponderam a 4,67%. A análise dos possíveis fatores de risco não foi possível, pois todas as propriedades possuíam ao menos um animal positivo para T. gondii e a maioria (87,50%) das propriedades foram positivas para N. caninum. A prevalência para T. gondii foi significativamente maior entre os machos que entre as fêmeas. Utilizando-se reação em cadeia pela polimerase e enzimas de restrição para o locus SAG2, em uma amostra de cérebro dentre 11 colhidas em um abatedouro da região foi identificado T. gondii tipo I. Os resultados demonstram que as infecções pelos dois parasitas estão presentes e disseminadas no rebanho ovino do Distrito Federal. / From March to June 2004, serum samples from 108 rams and 920 ewes were collected from 32 herds within Distrito Federal, Brazil. The samples were tested by Immunofluorescent Antibody Test, using sera diluted 1:64 and 1: 50 as cut-off values for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively. The observed prevalence for T. gondii infection was 38.22% (26.81%<IC 0,95<49.62%). The titers encountered ranged from 64 to 65536, with the most prevalent titer being 2048 (21.15%). The observed prevalence for N. caninum infection was 8.81% (7.08%<IC 0,95<10,53%). The titers ranged from 50 to 51200, being 50 the most frequent titer value (21.11%). The reactant sera to both pathogens corresponded to 4.67% of the samples. The risk factors for T. gondii and N. caninum infections were not determined because of the absence of negative herds for T. gondii infection and the high proportion of herds positive for N. caninum infection (87.50%). The prevalence for T. gondii infection was significantly higher among males than in females. By using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of locus SAG2 on 11 brain samples collected in a regional slaughterhouse, only one sample was positive and proved to be archetype I. The results show that infection by both parasites is widespread in the ovine population from Distrito Federal.