Avec plus de 170 millions de personnes infectées, l'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) représente une des premières infections virales dans le monde. La recherche et la mise au point de nouvelles molécules, capables de traiter de cette maladie sont donc d'une grande importance. Dans ce contexte et sur la base de résultats préliminaires obtenus avec des dinucléotides phosphoramidates GpC inhibant l'initiation de la réplication par la polymerase NS5B, nous avons conçu des inhibiteurs de seconde génération de type dimère de PNA (Peptide nucleic Acid). Nous présentons dans ce manuscrit la mise au point d'une méthode de synthèse originale de monomères et dimères de PNA, basée sur l'utilisation d'une réaction de Ugi à quatre composants (U-4CR). Cette méthode par U-4CR offre une grande variabilité de structures et séquences (G, A, C, T, U) en un nombre limité d'étapes, de plus la combinaison avec une activation micro-ondes permet d'augmenter l'efficacité et de réduire considérablement les temps de réaction. Cette stratégie a été appliquée en série dimère de PNA et en série chimère PNA-ARN. / With more than 170 millions people chronically infected, hepatitis C virus represents one of the major viral infections in the world. The research and development of novel antiviral is hence of great importance. In this context and on the basis of preliminary results obtained with dinucleotide phosphoramidates GpC inhibiting the initiation of replication of the NS5B polymerase, we designed a second generation of inhibitors type PNA dimers (Peptides Nucleic Acid). We describe in this manuscript the development of an original strategy to synthesize PNA monomers and dimers based on the use of the well-known Ugi four component reactions (U-4CR). This method allows a great structural variability in a limited number of steps. More, combining this efficient tool with microwaves irradiations allows an increase of the efficiency and a dramatic acceleration of the reaction time. This strategy was applied in PNA dimers series and PNA-RNA chimera series.

L’infection par le VHB est endémique en Thaïlande. Malgré l’introduction des programmes de vaccination contre le VHB, la transmission périnatale reste une cause majeure d’infection chronique. Les objectifs de ce travail étaient d’identifier les mutants du VHB pouvant être associés à des échecs de vaccination, de diagnostic et de thérapeutique. Le travail présenté ici est divisé en trois parties. Dans une première partie, nous avons analysé la prévalence de la transmission périnatale du VHB dans une cohorte issue d’un protocole thérapeutique de prévention de la transmission materno-fœtale du VIH. Nous avons cherché à caractériser les mutants d’échappement à la vaccination contre le VHB. Parmi 3349 femmes enceintes séropositives pour le VIH, l’antigène (Ag) HBs était positif dans 7% des cas. L’Ag HBs était détectable à l’âge de 2 et 18 mois chez 11 enfants nés de mères porteuses chroniques. Les variants du VHB présents au sein de 9 de ces paires mère-enfant ont pu être étudiés après séquençage et clonage. Trois types de transmission du VHB ont pu être décrites ; i) transmission de variants non mutés par les mères présentant une charge virale VHB élevée ii) transmission d’un virus mutant minoritaire isolé chez la mère, et iii) transmission de mutants déjà présents à plus de 20% chez la mère. La capacité in vitro de ces mutants à échapper à la réponse neutralisante anti-HBs sera étudiée en utilisant un modèle de pseudo-particules portant les mutations identifiées. / Thailand is an endemic area for chronic HBV infection. Despite implementation of HBV vaccination, perinatal HBV transmission remains a major cause of chronic infection. This study aimed at identifying HBV mutants that may be associated with vaccine failure, misdiagnosis of chronic HBV infection and antiviral treatment failure. The dissertation is divided in three parts. In the first part, we analyzed the prevalence of perinatal HBV transmission in a large HIV prevention cohort in Thailand and characterized the HBV vaccine escape mutants. Among 3,349 HIV-infected pregnant women, 7% were found HBsAg positive. Eleven children born to HBsAg-positive mother were found HBsAg-positive at 2–18 months of age. Complete series of samples were available for 9 mother-child pairs. Based on direct sequencing and cloning analysis, 3 patterns of transmission were observed : i) transmission of wild-type variants from mothers with high HBV DNA level, ii) transmission of maternal minor variant and iii) transmission of variants already present in maternal blood samples. The capacity of HBV variants to escape from anti-HBs neutralization in vitro will be further studied using HBV-pseudoviral particles harboring the characterized mutations.

Les migrants d’Afrique subsaharienne paient un lourd tribut au VIH/sida et à l’hépatite B en France, puisqu’ils représentaient en 2013 31% des découvertes de séropositivité au VIH et 40% des patients pris en charge pour une hépatite B chronique. Cette thèse a pour objectif de comprendre l’impact de la maladie dans des vies déjà marquées par la migration, dans une dans une perspective holistique, c’est-à-dire qui prend en compte les différents éléments structurants de la trajectoire, qu’ils soient résidentiels (dont la migration), familiaux, professionnels, administratifs etc. L’enquête Parcours a permis de collecter de façon quantitative les histoires de vie de 2468 migrants subsahariens en Ile-de-France, 926 vivant avec le VIH, 779 vivant avec une hépatite B (non infectés par le VIH) et 763 n’ayant aucune de ces infections. Les parcours de vie de ces personnes ont été recueillis au moyen d’un questionnaire biographique qui renseigne les éléments structurants de la trajectoire de vie (professionnels, familiaux, conjugaux, résidentiels, etc…). Pour analyser ces trajectoires, les méthodes classiques d’analyse de survie ont été mobilisées, ainsi que les méthodes d’analyse de séquence du type Optimal Matching. Les trajectoires d’installation des migrants en France, qu’ils soient ou non atteints par le VIH ou l’hépatite B, ont été marquées par une grande insécurité dans les premières années, insécurité en termes de logement, de titres de séjour et d’emploi qui a duré six ans en médiane. Bien souvent, l’annonce de la maladie a précisément eu lieu à ce moment de l’arrivée en France. La migration elle-même a eu un impact majeur sur les trajectoires de vie des personnes sur le plan familial et professionnel. L’annonce d’une hépatite B chronique n’a elle pas d’effet sur les trajectoire de vie, tandis que le VIH entraîne une détérioration importante du bien-être, sans pour autant influer sur les trajectoires de couple ou d’emploi. Enfin, les personnes ayant obtenu un titre de séjour pour soins sont discriminées dans leur accès à la carte de résident ou la nationalité française. / Migrants from Sub-Saharan Africa are very much affected by HIV/AIDS and hepatitis B in France; in 2013 they represented 31% of seropositivity discoveries for HIV and 40% of the patients taken in charge for a chronic hepatitis B. This thesis aims to understand the impact of illness in lives that are already affected by migration, in a holistic approach, which takes into account the different structuring elements of the trajectory, which may be residential (including migration), family-related, professional, administrative, etc. The Parcours survey is a quantitative biographical survey that collected 2468 life trajectories of Sub-Saharan migrants in Paris greater are, 926 living with HIV, 779 living with a chronic Hepatitis B (and not infected by HIV) and 763 who had neither of these two infections. These persons’ life courses have been collected with a biographical questionnaire which gathers information about different structuring elements of the life trajectory (professional, family-related, marital, residential, etc…). To analyse these life courses, classic survival methods were used, along with sequence analyses such as Optimal Matching. A common feature of all Sub-Saharan migrants’ integration pathways is the insecurity they experienced during their first years in France in terms of housing, legal documents and employment, which for most of them lasted more than six years and which was independent from the fact of being infected by HIV or chronic Hepatitis B. The diagnosis of illness often occured precisely at this moment of arrival in France. Migration itself had a major impact on life courses at the family and occupational level. The diagnosis for chronic Hepatitis B has no impact on life trajectories, whereas HIV diagnosis entailed an important degradation of well-being but did not impact on conjugal or employment trajectories. Finally, persons holding a permit of stay for health reasons are discriminated in their access to resident card or French nationality.

L’hépatite B est une maladie du foie qui pose un problème majeur de santé publique. Il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir complètement de l’infection, et de nouvelles thérapies ont besoin d’être développées. Étant donné son rôle clé dans le cycle de vie du virus de l’hépatite B (VHB), la protéine core qui forme la capside virale est aujourd’hui l’une des cibles avec le plus grand potentiel thérapeutique. Nos recherches sont focalisées sur la caractérisation des capsides du VHB dans différents états conformationnels en utilisant des techniques de biochimie et de RMN du solide, afin de révéler leur conformation précise sous différentes conditions, incluant l’interaction des capsides avec des antiviraux, et la relation entre la conformation de la capside et la maturation du virus. Un système d’expression bactérienne ainsi qu’un système acellulaire de synthèse de protéine à base de germes de blé ont été établis au laboratoire pour produire les capsides, et des protocoles pour désassembler puis réassembler les capsides en présence de différents types d’ARN ont été implémentés. Des échantillons de capsides formées dans E. coli et réassemblées in vitro ont été analysés par RMN. Les différentes formes de capsides observées incluent les protéines tronquées Cp140 et Cp149, la protéine entière Cp183, phosphorylée P-Cp183, et enfin des mutants. Dans un premier temps, nous avons préparé des échantillons pour l’attribution séquentielle de la protéine core par RMN du solide. L’utilisation de la détection carbone en RMN requiert plusieurs dizaines de milligrammes d’échantillon, qui ont pu être produits en utilisant l’expressions bactérienne en milieu minimum contenant des isotopes marqués. Les attributions séquentielles ont été réalisées sur la protéine tronquée Cp149, qui donne des spectres très similaires à Cp183. Cet échantillon a également été utilisé pour identifier les différences conformationnelles entre les 4 monomères de la capside, qui sont provoquées par la symétrie icosaédrale T=4. Ensuite, l’objet principal de cette thèse a été l’investigation et la comparaison d’une large variété de capsides, dans leur forme autoassemblée dans les bactéries E. coli, ainsi que dans leur forme réassemblée. Pour le réassemblage de la protéine entière, qui requiert la présence d’acides nucléiques, nous avons testé différents types d’ARN y compris l’ARN viral prégénomique. Nous avons étudié différentes symétries (T=3 et T=4), ainsi que les états d’oxydation de la capside, et comparé les différences de conformation grâce aux perturbations de déplacements chimiques observées dans les spectres RMN. Nous avons pu identifier les acides aminés impliqués dans les changements conformationnels majeurs entre les différentes préparations. La RMN du solide en détection proton à 100 kHz a récemment émergé comme un outils important pour l’analyse de protéines produites en quantités moindres. Nous avons appliqué cette stratégie à l’analyse des capsides de Cp149 afin d’obtenir l’attribution des protons amides. La détection proton par RMN du solide peut être combinée avec succès à la synthèse des protéines en système acellulaire, qui donne de faibles rendements par rapport aux cultures en bactéries. Cette approche est particulièrement intéressante pour analyser la modulation de l’assemblage des capsides induite par la présence de drogues. Bien que nous ayons commencé à étudier l’impact de modulateurs d’assemblage par RMN en détection carbone sur des capsides formées dans E. coli et réassemblées (données préliminaires non montrées dans ce manuscrit), la détection proton ouvre la voie vers l’analyse de l’impact de ces modulateurs sur l’assemblage des protéines core directement à la sortie du ribosome / Hepatitis B is a widely spread liver disease which causes a heavy burden for human health, with 257 millions of people affected by chronic infection and about 780,000 deaths per year. Yet, infected patients can not be completely cured by current treatments using notably nucleos(t)ide analogues and interferons. In order to achieve the goal of the World Health Assembly (WHA), who wishes to eliminate hepatitis B by 2030, new therapies need to be developed. Given its critical role for the Hepatitis B virus (HBV) life cycle, the core protein (Cp) is today one of the antiviral targets with the highest potential. Our research focuses on the characterization of HBV capsids in different conformational states using biochemistry and solid-state NMR, aiming at revealing their precise conformation under different conditions, including the interaction of capsids with antivirals, and the correlation between capsid conformation and viral maturation. For sample preparation, both a bacterial expression system and a wheat germ cell-free protein synthesis system have been established in the laboratory to produce HBV capsids, and protocols to disassemble and reassemble capsids with different nucleic acids have been implemented. Both capsids preformed in E. coli and capsids reassembled in vitro were addressed to NMR studies. Different capsids forms include the truncated versions Cp140 and Cp149, the full length protein Cp183, the phosphorylated P-Cp183 and mutant forms. First, we have prepared samples for the sequential assignment of the protein using solid-state NMR. The use of carbon-13 detection asks for several tens of milligrams of sample, which were produced using labeled isotopes and bacterial expression in minimal media. Sequential assignments were performed using the truncated capsid Cp149, which showed highly similar spectra to Cp183. This sample was also used to identify conformational differences between the four different monomers in the capsid, which are due to the T=4 icosahedral symmetry. Then, the main body of the thesis is the investigation and comparison of a variety of different capsid forms, including Cp183, P-Cp183, Cp149, Cp140, another truncated form resulting in mainly T=3 icosahedral assemblies, and Cp140 C61A and Cp183 F97L mutants. We investigated all samples in both the E. coli-produced and reassembled forms, which needs for the full-length protein the presence of nucleic acids, of which we tested several, including the viral pregenomic RNA. We investigated different symmetries, as well as oxidation states of the capsid, and compared the differences via chemical shift perturbations observed in NMR spectra. We reported in a site-specific manner the major conformational changes observed between the different preparations. Proton-detected solid-state NMR at 100 kHz has recently emerged as a tool for analyzing proteins with the need of less sample amount. We have applied this strategy to the analysis of the Cp149 capsids, in order to obtain sequential assignments of the amide proton resonances. For this, deuteration of the protein in bacteria was used as well, needing adaptation of sample preparation protocols. Proton detection can be successfully combined with cell-free protein synthesis, which gives low yields compared to bacterial expression. This approach is of potential interest to analyze capsid assembly modulation induced by the presence of drugs. While we have started in the framework of this thesis to analyze the capsid in presence of different capsid assembly modulators by carbon-13 detected NMR on E. coli and reassembled capsids (preliminary results not reported here), proton detection opens the way to an analysis of the impact of capsid modulation directly on the exit of the core proteins from the ribosome, on assembly. We showed that cell-free expression combined with proton-detection solid-state NMR can be used to analyze capsid chemical shifts, and thus in future work the conformational modulations

Introduction : L’exposition au virus de l’hépatite C entraîne une infection virale du foie. La plupart des patients infectés sont asymptomatiques (85%). La phase aigüe de l’infection peut passer inaperçue mais le fardeau à long terme de l’infection est lourd, conduisant annuellement dans 1%-4% des cas à un cancer du foie ou nécessitante une greffe hépatique. Au Canada, on diagnostique 11600 cas d’infections par le VHC par année. Avant l'ère des antiviraux à action directe (AAD) et avec les traitements d’interféron, le taux de guérison était à 50%. En outre, il y a eu beaucoup d’effets sur la santé mentale. C’est pour cela que s’ils n’avaient pas de support à la maison on leur refusait le traitement. Les médicaments AAD ont révolutionné le traitement de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). Leur taux de guérison de l’ordre de 95%, et moins d’effets secondaires en a fait le traitement de choix dans l’infection par le VHC. Afin de mieux gérer les patients infectés et d’identifier les obstacles à l’élimination de l’infection, nous avons créé et analysé la cascade de soins de l’hépatite C dans un centre extrahospitalier. Méthodes: Nous avons analysé la cascade de soins en hépatite C pour une cohorte de patients suivis dans une clinique spécialisée en VIH/VHC avec au besoin suivi en toxicomanie et traitement à bas seuil (pas de refus de traitement a patients toxicomane). Tous les patients avec test d’anticorps anti-VHC positif de la clinique ont été inclus. Les patients coinfectés avec VIH ont été inclus. Les données démographiques, de laboratoire, de suivi médical et thérapeutiques ont été collectées à l’aide du dossier médical électronique. Les patients avec >=2 visites ont été considérés « pris en charge », la guérison a été mesurée par la réponse virologique soutenue (RVS) trois mois post-traitement. Nous avons calculé l’incidence cumulative de chaque étape de la cascade. Résultats: Entre 2010 et 2018, 1135 patients avec test anti-VHC+ ont consulté à la clinique médicale urbaine du Quartier Latin (cmuQL). 75% étaient des hommes, leur âge médian était de 54 ans, 39% étaient des personnes qui utilisent des drogues par injection, 76% ont été traités pour l’hépatite C. 1100 patients (97%) ont été pris en charge, 966 (85%) ont eu un test d’ARN, 825 (73%) ont reçu un traitement, 772 (68%) ont atteint la fin du traitement, et 703 (62%) ont eu une RVS. Au total, 46 patients (4%) sont décédés dont 21 sont décédés avant d’être traités. 69 patients (6%) ont eu une guérison spontanée et 90 patients ont été réinfectés au moins une fois. Conclusions: Le traitement des patients infectés par le VHC dans une clinique multidisciplinaire avec prise en charge concomitante de la toxicomanie était un succès. Les défis majeurs de la cascade de soins en hépatite C étaient l’initiation du traitement et l’adhérence au suivi après la fin du traitement. / Exposure to the hepatitis C virus leads to viral infection of the liver. Most infected patients are asymptomatic (85%). The acute phase of infection may go unnoticed, but the long-term burden of infection is heavy, leading to 1%-4% per year to liver cancer or requiring liver transplantation. In Canada, 11,600 cases of HCV infection are diagnosed each year. Before the DAA era and at the time of treatment with interferon, the cure rate was around 50%. Also, there were a lot of effects on mental health. Therefore, if the patient didn’t have sufficient family support, they were being refused for treatment. DAAs have revolutionized the treatment of hepatitis C (HCV) infection. Their 95% cure rate and fewer side effects have made them the treatment of choice in HCV infection. To better manage infected patients and identify barriers to infection clearance, we designed and analyzed the hepatitis C care cascade in an out-of-hospital setting. Methods: We analyzed the cascade of hepatitis C care for a cohort of patients followed in a clinic specializing in HIV/HCV with follow-up in substance abuse and low-threshold treatment (treatment offered even if the patient had drug dependence). All patients with positive anti-HCV antibody tests from the clinic were included. HIV positive patients were also entered in the research. Demographic, laboratory, medical follow-up, and therapeutic data were collected using the electronic medical record. Patients with >=2 visits were considered “in care”, and cure was measured by sustained virologic response (SVR) three months post-treatment. We calculated the cumulative impact of each step of the cascade. Results: Between 2010 and 2018, 1135 patients with an anti-HCV+ test consulted at the urban medical clinic in the Latin Quarter. 75% were men, their median age was 54 years, 39% were in the category of people who inject drugs (PWID), and 76% had already been treated. 1100 patients (97%) were taken care of, 966 (85%) had an RNA test, 825 (73%) received treatment and 772 (68%) reached the end of treatment and 703 (62 %) had an SVR. A total of 46 patients (4%) died, of which 21 died before being treated. 69 patients (6%) recovered spontaneously, and 90 patients (8%) were reinfected at least once. Conclusions: Treatment of HCV-infected patients in a multidisciplinary clinic with concurrent addiction management was successful. The major challenges of the hepatitis C cascade of care were treatment initiation and adherence to follow-up after the end of treatment.

La maladie alcoolique du foie (MAF) et l’hépatite C chronique (HCC) sont les causes les plus fréquentes de cirrhose, carcinome hépatocellulaire (CHC) et transplantation hépatique dans les pays industrialisés. La fibrose hépatique est le stigmate lésionnel de la progression de la maladie vers la cirrhose comme dans toutes les hépatopathies chroniques. Certains facteurs de risque cliniques environnementaux ont été identifiés. Toutefois, ils n’expliquent pas l’extrême variabilité individuelle de la progression de la fibrose. L’influence ethnique à développer une maladie plus sévère ainsi que les études de concordance des jumeaux mono- et di-zygotiques sur la prévalence de la cirrhose alcoolique ont suggéré l’existence de facteurs génétiques associés. Les nombreuses études de gènes candidats réalisées n’ont identifié que très peu de variants associés de manière reproductible. Pour l’HCC par exemple, le score de risque de cirrhose ou « CRS » a montré sa capacité à prédire une fibrose avancée dans diverses cohortes caucasiennes. Récemment, une étude d’association pangénomique (GWAS) dans la stéatohépatopathie non-alcoolique (NAFLD) a mis en évidence un singleton (single nucleotide polymorphism [SNP]) particulier (rs738409 C>G) dans le gène PNPLA3. Ce dernier s’est révélé être, dans diverses études, le SNP ayant l’impact le plus robuste et le plus reproductible dans cette maladie. Par ailleurs, ce même variant a également été significativement associé à la cirrhose alcoolique chez les hispaniques.<p><p>Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont permis de montrer que :<p><p>1) Le CRS avait la capacité de prédire la progression de la fibrose chez des patients caucasiens ayant une HCC dans 2 cohortes européennes indépendantes.<p><p>2) Par ailleurs, dans la MAF, nous avons répliqué chez des patients caucasiens l’association entre le SNP rs738409 dans le gène PNPLA3 et la cirrhose. Nous avons également montré pour la première fois, que l’expression de PNPLA3 était significativement diminuée chez les patients avec une fibrose plus avancée. De plus, nous avons observé dans 2 cohortes européennes que rs738409 était également associé à la prévalence du CHC.<p><p>3) Enfin, nous avons également mis en évidence l’impact de ce même SNP sur la stéatose hépatique et la fibrose dans l’HCC sans toutefois qu’il influence la réponse à la thérapie antivirale dans 3 cohortes caucasiennes indépendantes.<p><p>Ainsi de manière remarquable, un même SNP (rs738409) apparait associé à des lésions hépatiques sévères dans les trois pathologies hépatiques chroniques les plus fréquentes (la MAF, l’HCC et la NAFLD). Ceci suggère des voies pathogéniques communes de la fibrogénèse hépatique. Par ailleurs, ces travaux soulignent indirectement que les GWAS ont la capacité d’ouvrir de nouvelles voies physiopathologiques et d’identifier de nouveaux variants, gènes ou région génétiques capables de constituer de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques dans l’HCC et la MAF. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie chronique caractérisée par une destruction progressive du parenchyme hépatique par le système immunitaire. La majorité des patients atteints d’HAI sont des femmes (75% à 90% des cas). L’amélioration des traitements au cours des dernières années a permis à un grand nombre de ces femmes de devenir enceintes. Pendant la grossesse, une rémission spontanée de la maladie a pu être observée chez les femmes atteintes d’HAI. Cette rémission est temporaire et elle est généralement suivie d’une rechute suite à l’accouchement (post-partum). Les causes exactes de cette rémission associée à la grossesse et de la rechute post-partum ne sont pas connues à ce jour. Nous avons donc tenté de reproduire ces phénomènes dans un modèle murin d’HAI développé dans notre laboratoire, afin de déterminer les mécanismes possiblement impliqués. Notre modèle d’HAI consiste en une xéno-immunisation de souris C57BL/6 avec les auto-antigènes impliqués dans l’HAI de type 2 chez l’humain. Nous avons ainsi accouplées des souris préalablement xéno-immunisées, puis nous les avons sacrifiées au début de la 3e semaine de gestation ou 2 à 3 semaines post-partum, afin d’évaluer les dommages hépatiques et afin d’étudier la réponse immunitaire. Comme chez les femmes atteintes d’HAI, les souris présentent une rémission de la maladie pendant la grossesse. Nous en sommes venus à cette conclusion par l’observation d’une diminution de l’inflammation hépatique, des niveaux de transaminases sériques et des titres d’auto-anticorps circulants. À l’inverse des humains, les souris xéno-immunisées ne présentent pas de rechute post-partum. Une analyse des cellules régulatrices (cellules T régulatrices et cellules B productrices d'IL-10) suggère une implication des Tregs hépatiques dans la rémission, car ceux-ci sont augmentés pendant la gestation. Ces Tregs hépatiques sont majoritairement d’origine thymique et ne semblent pas particulièrement attirés au foie en réponse à l’inflammation. La polarisation TH2 est un phénomène connu pendant la grossesse, par contre elle ne semble pas influencer la réponse auto-immune dans nos souris. Une meilleure compréhension des mécanismes d’immunosuppression observés lors de la grossesse pourrait mener au développement d’une thérapie mieux ciblée. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a disease of unknown aetiology, characterized by a progressive destruction of the hepatic parenchyma by the immune system. Women are predominantly affected by AIH, with a prevalence of 75% in type 1 AIH and 90% in type 2. Improvement of treatments to control liver inflammation has contributed to increase the number of pregnant patients. During pregnancy, a spontaneous, but temporary, remission of the disease has been observed in women with AIH, often followed by post-partum relapse. Currently, this phenomenon is not fully understood. Thus, we aim to study the mechanisms responsible for the pregnancy-related remission and post-partum relapses in a murine model of AIH developed in our laboratory. Xenoimmunization of C57BL/6 mice with the antigens recognized by autoreactive cells of type 2 AIH patients results in a loss of tolerance, with clinical and biochemical features of AIH similar to those observed in patients. For this study, xenoimmunized mice were mated and sacrificed at the beginning of the 3rd week of gestation or 2-3 weeks post-partum, and liver disease was evaluated at that time as well as the immune response. As it occurs in women with AIH, pregnancy induces a remission of the disease in our murin model. Pregnant mice show a decrease of liver inflammation, ALT levels and circulating autoantibodies. The mice did not show any sign of relapse during the post-partum period. Our analysis of cellular populations with regulatory properties (regulatory T cells and IL-10 secreting B cells) revealed an increase of hepatic Tregs during pregnancy, which suggests an implication of those cells in the remission. Those Tregs infiltrating the liver are mainly originated from the thymus and do not seem to be recruited to the liver in response to inflammation. Although a switch towards a TH2 response is known to occur during pregnancy, this phenomenon does not seem to be implicated in the remission of AIH in our murine model. A better understanding of the natural immunosuppression occurring during pregnancy could bring important knowledge to design new and improved therapy for AIH.

Ce travail examine les mécanismes de l’immunité innée impliqués dans l’hépatite aiguë virale du modèle murin d’infection par le virus de l’hépatite virale murine de type 3 (MHV-3). Afin de déterminer le rôle du TLR2 dans l’aggravation de l’hépatite, des infections avec le virus MHV-3 ont été réalisées in vivo chez des souris C57BL/6 et des souris déficientes pour le gène tlr2 et in vitro dans des macrophages et des hépatocytes infectés avec le virus MHV-3 et le virus moins virulent MHV-A59. Les niveaux de transcription et de traduction des senseurs microbiens, des interférons (IFN) de type I, des cytokines et/ou des chimiokines ont été évalués par qRT-PCR et ELISA. Les cellules ont été traitées avec des petits ARNs interférants (siRNAs) pour le TLR2 et le CEACAM1a ou mises en présence d’inhibiteurs des voies d’endocytose. Les résultats révèlent le rôle stimulateur du TLR2 pour la réplication virale, la production de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α et des chimiokines CXCL1, CXCL10 et CCL2. Un nouveau mécanisme d’échappement aux senseurs viraux dépendant du TLR2 a également été mis en évidence dans les macrophages et les hépatocytes lors de l’infection de ces cellules avec le virus MHV-3, et non pas avec le virus moins virulent MHV-A59. Ces différents travaux révèlent un nouveau rôle du TLR2 lors d’infections virales dans l'aggravation de la réponse inflammatoire tout en protégeant le virus des autres senseurs de la réponse immune innée. / This work investigates the innate immunity mechanisms involved in the Murine Hepatitis Virus type 3 (MHV-3) acute hepatitis disease model. In the goal of determining the role of the TLR2 receptor in aggravating the hepatitis disease, in vivo infections with the MHV-3 virus were performed on C57BL/6 mice or tlr2-/- gene knockout mice as well as in vitro infections of murine macrophages and hepatocytes with the MHV-3 and less virulent MHV-A59 serotypes. The levels of transcription and translation of different microbial sensors, type I interferons (IFN), cytokines and/or chemokines were measured by qRT-PCR and ELISA tests. Cells were treated with small interfering ARN (siRNA) for the TLR2 and/or CEACAM1a genes or treated with the different endocytosis inhibitors before infection. Our results reveal the stimulatory role of the TLR2 receptor on viral replication, production levels of the IL-6 and TNF-α cytokines and chemokines CXCL1, CXCL10 and CCL2. This study also reveals a new immune evasion mechanism via TLR2 in macrophages infected with MHV-3, but not with the lesser virulent MHV-A59 serotype. These different experiments have revealed a new role for the TLR2 receptor in viral infections wherein inflammatory responses are aggravated whilst shielding viral detection by other pathogens sensors of the innate immunity.

L’hépatite autoimmune (HAI) est une maladie grave affectant le foie et présentant un haut taux de mortalité lorsque non traitée. Les traitements disponibles sont efficaces, mais de graves effets secondaires leur sont associés. Ces effets secondaires sont généralement le résultat d'une forte immunosuppression et d’autres sont spécifiques à chaque médicament. Aucune immunothérapie spécifique n’est présentement disponible pour le traitement de l’HAI. Récemment, un modèle murin d’HAI a été développé dans notre laboratoire par xénoimmunisation des souris C57BL/6 avec les antigènes humains de l'HAI de type 2. Ce modèle présente la plupart des caractéristiques biochimiques et cliniques retrouvées chez les patients atteints d'HAI de type 2. Dans cette étude, nous avons évaluée l’efficacité de deux types de traitement pour l’HAI de type 2 à l’aide de notre modèle murin. Dans un premier temps, l’anticorps anti-CD3ε a été étudié en prophylaxie et en traitement. Nous avons montré qu’une posologie de 5µg d’anti-CD3 i.v. par jour pendant 5 jours consécutifs induit une rémission chez les souris avec HAI de type 2 établie (traitement). Cette rémission est caractérisée par une normalisation des niveaux d’alanine aminotransférase et une diminution significative de l’inflammation hépatique. Cette rémission semble être associée à une déplétion partielle et transitoire des lymphocytes T CD3+ dans la périphérie et une augmentation des lymphocytes T régulateurs CD4+, CD25+ et Foxp3+ dans le foie. La même posologie lorsqu’elle est appliquée en prophylaxie n’a pas réussi à prévenir l’apparition de l’HAI de type 2. La deuxième voie de traitement consiste en l’administration par voie intranasale d’un forte dose de formiminotransférase cyclodésaminase murin (mFTCD), un autoantigène reconnu dans l’HAI de type 2. Une administration en prophylaxie par voie intranasale de 100µg de mFTCD par jour durant 3 jours consécutifs arrive à prévenir l’HAI de type 2 en diminuant l’inflammation hépatique au bout de deux semaines post-traitement. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a severe liver disease with high mortality rates if left untreated. Current treatments, while effective, are associated with deleterious side-effects. These side effects are specific to each drug and the result of broad immunosuppression. Recently, a murine model of type 2 AIH has been created in our laboratory in wild-type naïve mice. In this model, DNA immunization with type 2 AIH human autoantigens breaks immune tolerance and induces an autoimmune response against the liver. Lately, new therapeutic strategies based on depletion of specific immune cell populations have been proposed for the treatment of several diseases, including autoimmune diseases. Currently, no immunotherapies using biological agents are available for the treatment of autoimmune liver diseases. Therefore, the goal of this project is to study the efficacy of new immunotherapeutic agents for the treatment of type 2 AIH in an experimental model. We evaluated the effectiveness of two approaches for treating type 2 AIH. First, we tested the anti-CD3ε antibody in prophylaxis and in treatment of type 2 AIH. We showed that a dosage of 5µg i.v. of anti-CD3ε antibody per day for 5 consecutive days induced remission in mice with established type 2 AIH. This remission was defined as a normalization of serum alanine aminostransferase levels and a significant decrease of liver inflammation in treated mice. This remission seems to be associated with a transitory depletion of CD3+ T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells and increased CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes in the liver. But when this dosage was applied in prophylaxis, it could not prevent the induction of type 2 AIH. The second approach was to induce tolerance by nasal administration of murin formiminotransferase cyclodeaminase (mFTCD), an autoantigen of type 2 AIH. We showed that nasal administration of 100µg of mFTCD for 3 consecutive days prevented development of type 2 AIH in prophylaxis by reducing liver inflammation.

L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie chronique caractérisée par une destruction progressive du parenchyme hépatique par le système immunitaire. La majorité des patients atteints d’HAI sont des femmes (75% à 90% des cas). L’amélioration des traitements au cours des dernières années a permis à un grand nombre de ces femmes de devenir enceintes. Pendant la grossesse, une rémission spontanée de la maladie a pu être observée chez les femmes atteintes d’HAI. Cette rémission est temporaire et elle est généralement suivie d’une rechute suite à l’accouchement (post-partum). Les causes exactes de cette rémission associée à la grossesse et de la rechute post-partum ne sont pas connues à ce jour. Nous avons donc tenté de reproduire ces phénomènes dans un modèle murin d’HAI développé dans notre laboratoire, afin de déterminer les mécanismes possiblement impliqués. Notre modèle d’HAI consiste en une xéno-immunisation de souris C57BL/6 avec les auto-antigènes impliqués dans l’HAI de type 2 chez l’humain. Nous avons ainsi accouplées des souris préalablement xéno-immunisées, puis nous les avons sacrifiées au début de la 3e semaine de gestation ou 2 à 3 semaines post-partum, afin d’évaluer les dommages hépatiques et afin d’étudier la réponse immunitaire. Comme chez les femmes atteintes d’HAI, les souris présentent une rémission de la maladie pendant la grossesse. Nous en sommes venus à cette conclusion par l’observation d’une diminution de l’inflammation hépatique, des niveaux de transaminases sériques et des titres d’auto-anticorps circulants. À l’inverse des humains, les souris xéno-immunisées ne présentent pas de rechute post-partum. Une analyse des cellules régulatrices (cellules T régulatrices et cellules B productrices d'IL-10) suggère une implication des Tregs hépatiques dans la rémission, car ceux-ci sont augmentés pendant la gestation. Ces Tregs hépatiques sont majoritairement d’origine thymique et ne semblent pas particulièrement attirés au foie en réponse à l’inflammation. La polarisation TH2 est un phénomène connu pendant la grossesse, par contre elle ne semble pas influencer la réponse auto-immune dans nos souris. Une meilleure compréhension des mécanismes d’immunosuppression observés lors de la grossesse pourrait mener au développement d’une thérapie mieux ciblée. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a disease of unknown aetiology, characterized by a progressive destruction of the hepatic parenchyma by the immune system. Women are predominantly affected by AIH, with a prevalence of 75% in type 1 AIH and 90% in type 2. Improvement of treatments to control liver inflammation has contributed to increase the number of pregnant patients. During pregnancy, a spontaneous, but temporary, remission of the disease has been observed in women with AIH, often followed by post-partum relapse. Currently, this phenomenon is not fully understood. Thus, we aim to study the mechanisms responsible for the pregnancy-related remission and post-partum relapses in a murine model of AIH developed in our laboratory. Xenoimmunization of C57BL/6 mice with the antigens recognized by autoreactive cells of type 2 AIH patients results in a loss of tolerance, with clinical and biochemical features of AIH similar to those observed in patients. For this study, xenoimmunized mice were mated and sacrificed at the beginning of the 3rd week of gestation or 2-3 weeks post-partum, and liver disease was evaluated at that time as well as the immune response. As it occurs in women with AIH, pregnancy induces a remission of the disease in our murin model. Pregnant mice show a decrease of liver inflammation, ALT levels and circulating autoantibodies. The mice did not show any sign of relapse during the post-partum period. Our analysis of cellular populations with regulatory properties (regulatory T cells and IL-10 secreting B cells) revealed an increase of hepatic Tregs during pregnancy, which suggests an implication of those cells in the remission. Those Tregs infiltrating the liver are mainly originated from the thymus and do not seem to be recruited to the liver in response to inflammation. Although a switch towards a TH2 response is known to occur during pregnancy, this phenomenon does not seem to be implicated in the remission of AIH in our murine model. A better understanding of the natural immunosuppression occurring during pregnancy could bring important knowledge to design new and improved therapy for AIH.