Orientadora : Profª Drª Maria da Graça Bicalho / Coorientadora : Profª Drª Sueli Borrelli / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/08/2017 / Inclui referências : f.168-186 / Resumo: O rim é o órgão mais frequentemente transplantado no mundo. O transplante renal está associado a melhorias significativas na qualidade de vida e na longevidade de pacientes com falência irreversível desse órgão. Mesmo havendo histocompatibilidade HLA entre paciente e doador, terapia com imunossupressores é ainda necessária para minimizar os efeitos de anticorpos que teriam como alvo imune antígenos de histocompatibilidade secundários (MiHAs) presentes no órgão transplantado e que poderiam desencadear a rejeição e perda de enxerto. Pouco se conhece sobre o papel destes antígenos MiHAS, especialmente a molécula MICA, como indutor e alvo de resposta imune. Portanto, foi realizado uma revisão sobre o papel de MICA e anticorpos anti-MICA no transplante renal. A continuidade deste estudo se deu com a investigação de MICA e HLA-G, ambas moléculas com função imunomoduladora antagônica na resposta imune. MICA tem sido considerado como um MiHAs e potencial alvo de resposta imune mediada por anticorpos, enquanto HLA-G é descrito como um inibidor da resposta imune. Genótipos MICA, NKG2D e HLA-G de pacientes transplantados foram avaliados. Nosso estudo teve como principal objetivo desenvolver um Modelo de Pontuação de Risco (MPR) para avaliar pacientes que apresentam um risco maior ou menor de desenvolver a disfunção de aloenxerto renal. Outros objetivos foram: avaliar a relevância de genótipos e fenótipos de MICA (sMICA) e HLA-G (sHLA-G) para o prognóstico dos pacientes transplantados e comparar os níveis solúveis de sHLA-G e sMICA entre os grupos de pacientes transplantados (n=67), pacientes renais crônicos (n=32) e controles saudáveis (n=79). As amostras sanguíneas para análise de plasma foram coletadas no pré-transplante e até três meses após o transplante renal. Utilizou-se a técnica ELISA para avaliação dos níveis plasmáticos de sMICA e sHLA-G. As genotipagens de MICA, NKG2D e HLA-G foram realizadas por PCR-SSOP, RT-PCR e SBT, respetivamente. Esses resultados foram relacionados com 40 variáveis clínicas obtidas dos pacientes transplantados. Dos pacientes renais crônicos e controles saudáveis foram avaliados os genótipos e os níveis de sHLA-G e sMICA, os quais foram comparados com aqueles dos pacientes transplantados. Na construção do MPR estruturado a partir de todas as variáveis não invasivas (demográficas, clínicas, genéticas), aquelas que se mostraram mais fortemente associadas ao risco de disfunção do aloenxerto renal foram: presença de anticorpos HLA doador específico (DSAs), transplantes e transfusões sanguíneas precedentes ao transplante monitorado, abortos prévios, uso de ATG em terapia de indução, gênero masculino e idade dos doadores superior à 55 anos. Interessantemente, na criação do MPR os genótipos MICA e HLA-G não se mostraram como variáveis relevantes para o aprimoramento do modelo. No entanto, o papel antagônico anteriormente hipotetizado, entre MICA e HLA-G foi evidenciado quando genótipos portadores do alelo MICA A5.1 mostraram-se associados a fenótipos alto produtores de sMICA e baixa de sHLAG, enquanto aqueles genótipos portadores de HLA-G*01:04P mostraram- se associados com a alta produção de sHLA-G e baixa de sMICA. Estes achados demonstram a presença de potenciais genótipos-fenótipos MICA-HLA-G característicos a serem encontrados em pacientes com maior ou menor risco imunológico em desenvolver rejeição. Palavras chaves: MICA. HLA-G. NKG2D. transplante renal. / Abstract: The kidney is the most frequently transplanted organ in the world, and this treatment is associated to significant improvements in the quality of life and longevity of patients with end-stage renal disease. Even when there's HLA histocompatibility between patient and donor, a standard immunosuppressive therapy is still needed to reduce the antibody effects that target the MiHAs (minor histocompatibility antigens) present in the transplanted organ, which could be responsible for rejection. Very little is known on MiHAs' function, especially in regards to the MICA molecule. This is the reason why a review on MICA and anti-MICA antibodies in renal transplant was written. This review led to a further research to better understand MICA and HLA-G's roles, two molecules with an antagonist immunoregulatory function. From literature it emerged that MICA has been treated as a MiHA and as a possible target of an antibody-mediated immune response. Meanwhile, HLA-G has been described as an inhibitor of the immune response. In our research, MICA, NKG2D and HLA-G genotypes of kidney transplant patients were taken into account. The target of our study was to find a Risk Score Model (RSM) to evaluate patients exhibiting higher or lower risk for allograft dysfunction development. Other focus points of our study were: to investigate the role of MICA (sMICA) and HLA-G (SHLA-G) genotypes and phenotypes in the prognosis of kidney transplanted patients and compare the levels of soluble HLAG and soluble MICA between groups of transplanted patients (n=67), chronic renal patients (n=32) and control group (n=79). Plasma samples were collected in the time that went from before transplant up to 3 months after transplant. Soluble HLA-G and MICA levels were detected by ELISA, while MICA, NKG2D and HLA-G genotyping was performed by PCR-SSOP, RT-PCR and SBT, respectively. Chronic renal disease patients and controls were evaluated for sHLA-G and sMICA plasma levels, comparing them with those of transplanted patients. The Risk Score Model is composed of 40 non-invasive variables (demographic, clinical, treatment, genetic) obtained from transplanted patients. The ones which showed to be more strictly correlated to the risk of malfunctions of the transplanted organ were: total donor-specific antibodies (DSA), DSA positive against selected donors, previous transplant, previous blood transfusion and previous abortion, use of ATG in induction therapy, male gender and donors' age higher than 50 years. It's noteworthy that, during the creation of the RSM, MICA and HLA-G genotypes didn't appear to be especially relevant variables for the model. Nevertheless, the antagonistic role of MICA and HLA-G has resulted in the association of MICA-A5.1 genotypes with high production of soluble MICA and a low one of soluble HLA-G, while the HLA-G*01:04P genotype was connected with a high production of sHLA-G and a low one of sMICA. These results prove the presence of potentially characteristic MICA-HLA genotypes/phenotypes, which can be found in patients with higher/lower risk of rejection. Keywords: MICA. HLA-G. NKG2D. Kidney transplant.

Ctenomys flamarioni é um roedor subterrâneo endêmico do litoral do Estado do Rio Grande do Sul - Brasil. Devido à sua distribuição restrita ao ambiente costeiro, que está em constante mudança, e à fragmentação e destruição do habitat, devido à ação humana, essa espécie está nas listas de fauna ameaçadas de extinção. Estudos anteriores, com marcadores microssatélites e DNA mitocondrial, identificaram a baixa variabilidade genética na espécie, por outro lado, o estudo de loci que se esperam estar sob seleção seria uma ferramenta importante para identificar a relação dos indivíduos com o ambiente e os processos que moldaram a variabilidade genética da espécie ao longo da história. O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é composto por um grupo de genes estreitamente ligados que constituem o componente genético mais importante do sistema imunológico dos mamíferos. Dois principais mecanismos têm sido descritos como responsáveis pela manuntenção da diversidade do MHC e estão relacionados com o combate de parasitas e com mecanismos reprodutivos, que evitam o endocruzamento. Nesse estudo investigamos a variabilidade genética dos loci DRB e DQA do MHC e comparamos os índices de diversidades com os valores encontrados em estudos com outros ctenomídeos e com os encontrados para loci neutros da mesma espécie. A diversidade genética para o locus DRB de C. flamarioni foi menor do que a encontrada em estudos para o mesmo locus em outras espécies do gênero e também foi menor do que a encontrada em estudos para a mesma espécie, com marcadores neutros, inclusive para populações que passaram por reduções recentes (gargalos-de-garrafa). Os resultados indicam que a seleção balanceadora não foi suficiente para manter a diversidade genética nas populações estudadas e que as reduções populacionais, identificadas através dos loci neutros, devem ter sido bastante drásticas, por afetarem também a diversidade de um locus conhecidamente bastante variável (DRB de MHC). Não pudemos avaliar a diversidade do locus DQA devido a alta incidência de sequências muito divergentes encontradas, possivelmente pseudogenes. O estado de conservação de Ctenomys flamarioni é considerado crítico, por todos os fatores que afetam a espécie, como a instabilidade do ambiente em que ocorrem, a fragmentação e destruição do habitat pela ação humana e pela sua baixa diversidade genética, especialmente em um locus importante do sistema imunológico. A perda da diversidade no locus de MHC poderia estar relacionada à diminuição do número de indivíduos por população, que aumenta o risco de endogamia, que por sua vez pode levar à perda da aptidão reprodutiva, expressão de alelos recessivos deletérios e perda da flexibilidade adaptativa. Além disso, a perda da diversidade em um locus importante para a defesa do organismo contra parasitas aumenta a suscetibilidade dos indivíduos a doenças, e todos esses fatores elevam o risco de extinções locais, colocando em perigo o futuro da espécie. / Ctenomys flamarioni is a subterranean rodent, endemic to the coastline of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Due to its strict distribution to the coastal environment, which is constantly changing, and to habitat fragmentation and destruction caused by human actions, this species appears in lists of threatened fauna. Previous studies, using microsatellite markers and mitochondrial DNA, identified the low genetic variability in this species. On the other hand, the study of loci that are expected to be under balancing selection would be an important tool to identify the relation between individuals and their environment and processes which have molded the genetic variability of this species throughout history. The Major Histocompatibility Complex (MHC) is comprised by a closely connected group of genes that constitute the most important genetic component of the immune system of mammals. Two main mechanisms have been described as responsible for maintaining MHC diversity and are associated with parasite combat and reproductive mechanisms for inbreeding avoidance. In this study we investigated the genetic variability of the DRB and DQA loci of the MHC and compared these diversity indices with values found in studies about other ctenomyids and with values found for neutral loci in this species. The genetic diversity for the DRB locus in C. flamarioni was lower than what is found for the same locus in other species of the same genus and it was also lower than what was found in studies with this species using neutral markers, especially in populations which have gone through recent size reductions (bottlenecks). The results indicate that the balancing selection was not sufficient to maintain the genetic diversity in the studied populations and that population size reductions, identified through neutral loci, must have been very drastic, since they also affected the diversity of a loci which is known to be highly variable (DRB of the MHC). We could not evaluate the diversity for the DQA loci due to high incidence of very divergent sequences, possibly pseudogenes. The status of conservation of this species is considered critical due to all the factors that affect the species, such as the instability of the environment on which it occurs, habitat fragmentation and destruction caused by human actions, and its low genetic diversity, especially in an important locus of the immune system. The loss of diversity in the MHC locus could be associated to the decrease in number of individuals per population, which increases the risk of endogamy which, in turn, can lead to the loss of reproductive fitness, expression of deleterious recessive alleles and loss of adaptive flexibility. Moreover, the loss of diversity in a locus which is important in the defense of the organism against parasites increases the susceptibility of the individuals to diseases, and all these factors raise the risk of local extinctions, endangering the future of the species.

Ctenomys flamarioni é um roedor subterrâneo endêmico do litoral do Estado do Rio Grande do Sul - Brasil. Devido à sua distribuição restrita ao ambiente costeiro, que está em constante mudança, e à fragmentação e destruição do habitat, devido à ação humana, essa espécie está nas listas de fauna ameaçadas de extinção. Estudos anteriores, com marcadores microssatélites e DNA mitocondrial, identificaram a baixa variabilidade genética na espécie, por outro lado, o estudo de loci que se esperam estar sob seleção seria uma ferramenta importante para identificar a relação dos indivíduos com o ambiente e os processos que moldaram a variabilidade genética da espécie ao longo da história. O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é composto por um grupo de genes estreitamente ligados que constituem o componente genético mais importante do sistema imunológico dos mamíferos. Dois principais mecanismos têm sido descritos como responsáveis pela manuntenção da diversidade do MHC e estão relacionados com o combate de parasitas e com mecanismos reprodutivos, que evitam o endocruzamento. Nesse estudo investigamos a variabilidade genética dos loci DRB e DQA do MHC e comparamos os índices de diversidades com os valores encontrados em estudos com outros ctenomídeos e com os encontrados para loci neutros da mesma espécie. A diversidade genética para o locus DRB de C. flamarioni foi menor do que a encontrada em estudos para o mesmo locus em outras espécies do gênero e também foi menor do que a encontrada em estudos para a mesma espécie, com marcadores neutros, inclusive para populações que passaram por reduções recentes (gargalos-de-garrafa). Os resultados indicam que a seleção balanceadora não foi suficiente para manter a diversidade genética nas populações estudadas e que as reduções populacionais, identificadas através dos loci neutros, devem ter sido bastante drásticas, por afetarem também a diversidade de um locus conhecidamente bastante variável (DRB de MHC). Não pudemos avaliar a diversidade do locus DQA devido a alta incidência de sequências muito divergentes encontradas, possivelmente pseudogenes. O estado de conservação de Ctenomys flamarioni é considerado crítico, por todos os fatores que afetam a espécie, como a instabilidade do ambiente em que ocorrem, a fragmentação e destruição do habitat pela ação humana e pela sua baixa diversidade genética, especialmente em um locus importante do sistema imunológico. A perda da diversidade no locus de MHC poderia estar relacionada à diminuição do número de indivíduos por população, que aumenta o risco de endogamia, que por sua vez pode levar à perda da aptidão reprodutiva, expressão de alelos recessivos deletérios e perda da flexibilidade adaptativa. Além disso, a perda da diversidade em um locus importante para a defesa do organismo contra parasitas aumenta a suscetibilidade dos indivíduos a doenças, e todos esses fatores elevam o risco de extinções locais, colocando em perigo o futuro da espécie. / Ctenomys flamarioni is a subterranean rodent, endemic to the coastline of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Due to its strict distribution to the coastal environment, which is constantly changing, and to habitat fragmentation and destruction caused by human actions, this species appears in lists of threatened fauna. Previous studies, using microsatellite markers and mitochondrial DNA, identified the low genetic variability in this species. On the other hand, the study of loci that are expected to be under balancing selection would be an important tool to identify the relation between individuals and their environment and processes which have molded the genetic variability of this species throughout history. The Major Histocompatibility Complex (MHC) is comprised by a closely connected group of genes that constitute the most important genetic component of the immune system of mammals. Two main mechanisms have been described as responsible for maintaining MHC diversity and are associated with parasite combat and reproductive mechanisms for inbreeding avoidance. In this study we investigated the genetic variability of the DRB and DQA loci of the MHC and compared these diversity indices with values found in studies about other ctenomyids and with values found for neutral loci in this species. The genetic diversity for the DRB locus in C. flamarioni was lower than what is found for the same locus in other species of the same genus and it was also lower than what was found in studies with this species using neutral markers, especially in populations which have gone through recent size reductions (bottlenecks). The results indicate that the balancing selection was not sufficient to maintain the genetic diversity in the studied populations and that population size reductions, identified through neutral loci, must have been very drastic, since they also affected the diversity of a loci which is known to be highly variable (DRB of the MHC). We could not evaluate the diversity for the DQA loci due to high incidence of very divergent sequences, possibly pseudogenes. The status of conservation of this species is considered critical due to all the factors that affect the species, such as the instability of the environment on which it occurs, habitat fragmentation and destruction caused by human actions, and its low genetic diversity, especially in an important locus of the immune system. The loss of diversity in the MHC locus could be associated to the decrease in number of individuals per population, which increases the risk of endogamy which, in turn, can lead to the loss of reproductive fitness, expression of deleterious recessive alleles and loss of adaptive flexibility. Moreover, the loss of diversity in a locus which is important in the defense of the organism against parasites increases the susceptibility of the individuals to diseases, and all these factors raise the risk of local extinctions, endangering the future of the species.

Orientador: Maria Helena Stangler Kraemer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T07:41:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_MargarethBatistella_M.pdf: 6313551 bytes, checksum: 8178ffea4cd174c603fb4375c28bad24 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Diversos estudos tem relatado a associação entre as especificidades HLA-DR, DQ e doenças. Entretanto poucos tem correlacionado as associações dos antígenos HLA de classe II com estudos em família. Relatamos juntamente com as tipagens HLA de classe II as reações em cultura mista de linfócitos (CML) em 60 pacientes portadores de leucemia linfóide aguda (LLA), leucemia mielóide aguda (LMA) e anemia aplástica (AA) incluindo 202 indivíduos das famílias. As tipagens HLA de classe II foram realizadas pelo método de microlinfocitotoxicidade (TERASAKI et alli 1964). Os anti-soros utilizados, DR1 a DR18 e DQ1 a DQ8 eram provenientes de Pel-Freez, C-Six, Université Catholique de Louvain - Bruxelles - Belgique. Os testes de cultura mista de linfócitos foram realizados pelo micrométodo descrito por HARTZMAN et alli. (1971). As células utilizadas, respondedoras e estimuladoras, eram provenientes dos pacientes, dos irmãos, do pai e da mãe. O teste t, a análise da variância, e o X2 para a comparação das freqüências, foram utilizados para análise estatística. Comparando as tipagens sorológicas com os valores em cultura mista de linfócitos na LLA e AA, os dois métodos estavam significativamente associados entre os pacientes e indivíduos das famílias incompatíveis e indefinidos, enquanto que, na LMA não ocorreu associação. Entre os pacientes e indivíduos das famílias incompatíveis, ocorreu associação entre a tipagem sorológica e a cultura mista de linfócitos na LLA e LMA, e na AA não ocorreu associação. Para a resposta relativa nas três doenças, entre os pacientes e indivíduos das famílias, indefinidos, não ocorreu associação entre a tipagem sorológica e CML. Estes resultados sugerem que a cultura mista de linfócitos é capaz de discriminar especificidades entre os indivíduos incompatíveis e indefinidos na LMA, LLA e AA e que na anemia aplástica a cultura mista é indispensável para a identificação das especificidades HLA em todos os grupos testados / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Maria Helena Stangler Kraemer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:28:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Biral_AnaCristinaWestphalCheraria_M.pdf: 8667247 bytes, checksum: c127a462b302f100f7038554539e5f28 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Introdução- A psoríase é uma doença de pele crônica, inflamatória com genes envolvidos na predisposição à doença, localizados na região altamente polimórfica do complexo principal de histocompatibilidade, no cromossomo 6p21.3. O objetivo desse estudo foi identificar, avaliar a distribuição e determinar as associações genéticas dos genes HLA de classe I e os microssatélites do Fator de Necrose Tumoral (TNF) em pacientes brasileiros com psoríase. Pacientes e Métodos- As tipagens HLA-A, -B, -C foram realizadas em 92 pacientes com psoríase e 160 indivíduos sadios como grupo-controle através do DNA genômico, utilizando-se o método PCR/SSP. Desses 92 pacientes, com psoríase, foram tipados 70 pacientes e 71 indivíduos sadios para os microssatélites do TNF, classificados de acordo com o número de alelos (TNFa, b, c, d, e) e amplificados através do DNA genômico pela reação em cadeia da polimerase, visualizadosem gel desnaturante de poliacrilamida, em condições específicaspara cada loco. Resultados- Dos 92 pacientes, 43,3% foram HLA-Cw*06 positivo (p<0,0001 e OR=5.3). Os alelos HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-Cw*12 e os haplótipos HLA-B*13 Cw*06, HLAB* 57 Cw*06 e HLA-B*39 Cw*12 mostraram-se aumentados nos pacientes com psoríase, com significânciaestatística (P<0,05), quando comparados ao grupo-controle de indivíduos sadios. Os microssatélites TNFa4, TNFb1, TNFe1 e o haplótipo TNFa2 b1 c2 d4 e1 mostraram-se com fTeqüência diminuída e com significância estatística (P<0,05) nos pacientes com psoríase quando comparados ao grupo-controle de indivíduos sadios. O alelo HLA-B*13 e os haplótipos HLA-B*13 Cw*06, TNFa11 b4 c1 d3 e3, mostraram-se com freqüências aumentadas e significância estatística (P<0,05) nos pacientes com psoríase tipo TI quando comparados ao grupo-controle de indivíduos sadios. Também foi encontrado na comparação de pacientes psoríase tipo I com o grupo-controle de indivíduos sadios, um haplótipo estendido nessa região cromossômica, HLA-B*57 HLA-Cw*06 TNFa2 b5 c2 d4 c3, com signifiQânciaestatística (P<0,05). Conclusões- Esse estudo mostrou uma associação positiva entre os alelos HLA-B*13, HLA-B*57, Cw*06, Cw*12 e os haplótipos HLA-B*13 Cw*06, HLA-B*57 Cw*06, HLAB* 39 Cw*12, TNFa11 b4 c1 d3 e3 e o haplótipo estendido HLA-B*57 Cw*06 TNFa2 b5 c2 d4 e3, dete~~~o susceptibilidade para o desenvolvimento da psoríase. Também foram encontrados os microssatélites TNFa4, TNFbI, TNFel e o haplótipo TNFa2 bl c2 d4 el com associação negativa, sugerindo um fator de proteção na psoriase. Esses resultados apontam para o fato de que a detecção dos polimorfismos do HLA classe I e microssatélites no loco TNF poderiam ser marcadores de susceptibilidade e proteção genética na doença em pacientes brasileiros / Abstract: Introduction - Psoriasis is a genetic chronic inflammatory skin disorder with genes involved in disease predisposition located within the highly polymorphic Major Histocompatibility Complex (MHC) region on the chromosome 6p21.3. The goal of the present study was to identify, evaluate distribution and determine genetic associations of HLA class I genes and Tumor Necrosis Factor (TNF) microsatellites with psoriasis in Brazilian patients. Patients and Methods - HLA-A,-B, -C typingwas carriedout in 92 psoriasispatientsand 160 healthy individuaIs through genomic DNA using the PCR-SSP method. Typing ofTNF microsatellites was carried out in 70 of the 92 psoriasis patients and in 71 healthy controls. TNF microsatellites were classified according to the number of alleles (TNFa, b, c, d, e) amplified through genomic DNA by polymerase chain reaction and visualized in denaturing polyacrylamine gel, in specific conditions for each locus. Results - Of the 92 patients, 43.3% were HLA-Cw*06 positive (p<0.0001 and OR=5.3). HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-Cw*12 alleles and HLA-B*13 Cw*06, HLA-B*57 Cw*06 and HLA-B*39 Cw*12 haplotypes were found to be increased in patients with psoriasis, with a statistical significance (p<0.05) when compared to healthy individuaIs. TNFa4, TNFbl, TNFel microsatellites and the TNFa2 bl c2 d4 el haplotype showed a decreased frequency and a statistical significance (p<0.05) in psoriasis patients when compared to healthy individuals. HLA-B*13 allele and HLA-B*13 Cw*06, TNFall b4 c1 d3 e3 haplotypes showed increased frequencies and a statistical significance (p<0.05) in patients with type II psoriasis when compared to healthy individuaIs. We further found an extended haplotype in that chromosomic region, HLA-B*57 HLA-Cw*06 TNFa2 b5 c2 d4 c3, with a statistical significance (p<0.05). Conclusions - This study shows a positive association between the HLA-B*13, HLA-B*57, Cw*06, Cw*12 alleles and the B*13 Cw*06, B*57 Cw*06, B*39 Cw*12, TNFall b4 cl d3 e3 haplotypes and the extended haplotype HLA-B*57 Cw*06 TNFa2 b5 c2 d4 e3, which determines susceptibility to the development ofpsoriasis. We further found TNFa4, TNFbl, TNFel microsatellites and the TNFa2 bl c2 d4 el haplotype with negative association, which suggests a protection factor against psoriasis. Results point to the fact that detection of HLA class I polymorphisms and microsatellites in the TNF locus may be markers of either genetic susceptibility, or protection against the disease in Brazilian patients / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientador: Nedenia Bonvino Stafuzza / Banca: Danísio Prado Munari / Banca: Luciane Madureira de Almeida / Resumo: O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é uma região do genoma com um denso agrupamento de genes que apresentam alto grau de polimorfismo. Os genes do MHC estão divididos em regiões que apresentam similaridades funcionais, contendo genes da classe I, II e III, sendo que em bovídeos a classe II é subdividida em dois agrupamentos denominados IIa e IIb. Genes da classe II do MHC têm chamado muito a atenção, se tratando de animais de produção, diante da necessidade de melhorar métodos de controle de doenças, por meio do desenvolvimento de novas vacinas e seleção de animais resistentes. Desta forma, o presente trabalho visou à realização de um estudo da diversidade alélica do gene DRB3 em três raças de búfalo de rio criadas no Brasil (Mediterrâneo, Jafarabadi e Murrah) utilizando a técnica de PCR-RFLP. As amostras de DNA foram extraídas de bulbo folicular de 24 animais da raça Mediterrâneo, 23 animais da raça Jafarabadi e 18 animais da raça Murrah. As reações de PCR foram realizadas com volume total de 30 μl e o produto de PCR obtido foi digerido com três enzimas de restrição: RsaI, HaeIII e PstI. Os pares de iniciadores de PCR produziram produto de PCR de aproximadamente 300 bp de tamanho. A digestão com a enzima de restrição RsaI apresentou oito alelos, com tamanhos aproximados: O (300 bp), RsaI-A (230+70 bp), RsaI-B (180+120 bp), RsaI-C (130+90+70 bp), RsaI-D (140+90+70 bp), RsaI-E (120+70+60 bp), RsaI-F (120+110+70 bp) e RsaI-G (110+70+60+55 bp), sendo cinco alelos (O, RsaI-A, RsaI-B, RsaI-C, RsaI-E) na raça Mediterrâneo, quatro alelos (O, RsaI-A, RsaI-F e RsaI-G) na raça Jafarabadi e três alelos (O, RsaI-A e RsaI-D) na raça Murrah. Em todos os produtos de PCR, das três raças, o genótipo homozigoto para o alelo O foi o mais frequente (300bp/300bp). Com a enzima de restrição HaeIII foram observados quatro alelos, com tamanhos aproximados ... / Abstract: The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a genome region with have a dense clusters of genes that showing a high degree of polymorphism. The genes of the MHC are divided in regions that show similar functions, and contain genes of the classe I, II and III. The class II, in bovides is subdivided in two clusters called IIa and IIb. Much attention has been given to class II genes, especially to the livestock, because the production animal has a need of more efficient methods to control diseases through the development of vaccines and selection of resistant animals. Therefore, the present work aimed study the allelic diversity of the DRB3 gene in three breeds of river buffaloes raised in Brazil (Mediterranean, Jafarabadi and Murrah) by PCR-RFLP. DNA samples were extracted from follicle bulb of 24 Mediterranean, 23 Jafarabadi and 18 Murrah buffaloes breeds. The PCR reactions have 30 μl of volume and the PCR product was digested with three restriction enzymes: RsaI, HaeIII and PstI. The primers pairs produced a PCR product with 300 bp size proximally. Digestion with the restriction enzyme RsaI presented eight alleles, with proximally sizes: O (300 bp), RsaI-A (230+70 bp), RsaI-B (180+120 bp), RsaI-C (130+90+70 bp), RsaI-D (140+90+70 bp), RsaI-E (120+70+60 bp), RsaI-F (120+110+70 bp) and RsaI-G (110+70+60+55 bp), and were five alleles (O, RsaI-A, RsaI-B, RsaI-C and RsaI-E) in the Mediterranean breed, four alleles (O, RsaI-A, RsaI-F and RsaI-G) in the Jafarabadi breed and three alleles (O, RsaIA and RsaI-D) in the Murrah breed. In all of the PCR products, of the three breeds, the homozygote genotype for the allele O was the most frequent (300bp/300bp). Digestion with the HaeIII restriction enzyme produced four alleles, with proximally sizes: HaeIII-A (220+80 bp), HaeIII-B (170+80+50 bp), HaeIII-C (210+80 bp) and HaeIII-D (170+130 bp), where the Mediterranean breed presented the four alleles ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-30Bitstream added on 2014-08-13T18:01:11Z : No. of bitstreams: 1 000736106.pdf: 1310930 bytes, checksum: 28ecc16bb9798a305ffacdd9b95396fe (MD5) / O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é uma região do genoma com um denso agrupamento de genes que apresentam alto grau de polimorfismo. Os genes do MHC estão divididos em regiões que apresentam similaridades funcionais, contendo genes da classe I, II e III, sendo que em bovídeos a classe II é subdividida em dois agrupamentos denominados IIa e IIb. Genes da classe II do MHC têm chamado muito a atenção, se tratando de animais de produção, diante da necessidade de melhorar métodos de controle de doenças, por meio do desenvolvimento de novas vacinas e seleção de animais resistentes. Desta forma, o presente trabalho visou à realização de um estudo da diversidade alélica do gene DRB3 em três raças de búfalo de rio criadas no Brasil (Mediterrâneo, Jafarabadi e Murrah) utilizando a técnica de PCR-RFLP. As amostras de DNA foram extraídas de bulbo folicular de 24 animais da raça Mediterrâneo, 23 animais da raça Jafarabadi e 18 animais da raça Murrah. As reações de PCR foram realizadas com volume total de 30 μl e o produto de PCR obtido foi digerido com três enzimas de restrição: RsaI, HaeIII e PstI. Os pares de iniciadores de PCR produziram produto de PCR de aproximadamente 300 bp de tamanho. A digestão com a enzima de restrição RsaI apresentou oito alelos, com tamanhos aproximados: O (300 bp), RsaI-A (230+70 bp), RsaI-B (180+120 bp), RsaI-C (130+90+70 bp), RsaI-D (140+90+70 bp), RsaI-E (120+70+60 bp), RsaI-F (120+110+70 bp) e RsaI-G (110+70+60+55 bp), sendo cinco alelos (O, RsaI-A, RsaI-B, RsaI-C, RsaI-E) na raça Mediterrâneo, quatro alelos (O, RsaI-A, RsaI-F e RsaI-G) na raça Jafarabadi e três alelos (O, RsaI-A e RsaI-D) na raça Murrah. Em todos os produtos de PCR, das três raças, o genótipo homozigoto para o alelo O foi o mais frequente (300bp/300bp). Com a enzima de restrição HaeIII foram observados quatro alelos, com tamanhos aproximados ... / The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a genome region with have a dense clusters of genes that showing a high degree of polymorphism. The genes of the MHC are divided in regions that show similar functions, and contain genes of the classe I, II and III. The class II, in bovides is subdivided in two clusters called IIa and IIb. Much attention has been given to class II genes, especially to the livestock, because the production animal has a need of more efficient methods to control diseases through the development of vaccines and selection of resistant animals. Therefore, the present work aimed study the allelic diversity of the DRB3 gene in three breeds of river buffaloes raised in Brazil (Mediterranean, Jafarabadi and Murrah) by PCR-RFLP. DNA samples were extracted from follicle bulb of 24 Mediterranean, 23 Jafarabadi and 18 Murrah buffaloes breeds. The PCR reactions have 30 μl of volume and the PCR product was digested with three restriction enzymes: RsaI, HaeIII and PstI. The primers pairs produced a PCR product with 300 bp size proximally. Digestion with the restriction enzyme RsaI presented eight alleles, with proximally sizes: O (300 bp), RsaI-A (230+70 bp), RsaI-B (180+120 bp), RsaI-C (130+90+70 bp), RsaI-D (140+90+70 bp), RsaI-E (120+70+60 bp), RsaI-F (120+110+70 bp) and RsaI-G (110+70+60+55 bp), and were five alleles (O, RsaI-A, RsaI-B, RsaI-C and RsaI-E) in the Mediterranean breed, four alleles (O, RsaI-A, RsaI-F and RsaI-G) in the Jafarabadi breed and three alleles (O, RsaIA and RsaI-D) in the Murrah breed. In all of the PCR products, of the three breeds, the homozygote genotype for the allele O was the most frequent (300bp/300bp). Digestion with the HaeIII restriction enzyme produced four alleles, with proximally sizes: HaeIII-A (220+80 bp), HaeIII-B (170+80+50 bp), HaeIII-C (210+80 bp) and HaeIII-D (170+130 bp), where the Mediterranean breed presented the four alleles ...

A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:02:12Z : No. of bitstreams: 1 so_mvr_dr_arafo.pdf: 744217 bytes, checksum: 8bf048177cd6e909a65866fcf5ea6681 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo deste trabalho foi avaliar a liberação de íons cálcio e pH, de três pastas à base de hidróxido de cálcio, a saber: UltraCal- XS, Calcicur e pasta aquosa, além de avaliar a resposta tecidual das mesmas em tecido conjuntivo subcutâneo, do dorso de ratos Wistar, nos períodos de 7 e 30 dias. A análise do cálcio contido nas pastas testadas foi realizada utilizando a espectrofotometria por absorção atômica. As leituras de pH foram efetuadas com o emprego de um peagâmetro. As mensurações do pH e liberação de cálcio foram realizadas nos períodos experimentais de 1 hora, 1, 2, 3, 7, 15, 30, 45 e 60 dias. Para a resposta de biocompatibilidade foram empregados 18 ratos Wistar, nos quais foram inseridos, no tecido subcutâneo do dorso, 04 tubos de polietieleno, contendo em cada tubo uma das 3 pastas, nos períodos de 7 e 30 dias. Os resultados indicaram diferenças significativas entre o pH e liberação de cálcio das pastas estudadas, quando foram levados em consideração os valores no período inicial, valores mínimo, máximo e quando da comparação dos valores final e inicial (delta). O pH e liberação de cálcio foram maiores para a pasta controle e Calcicur, respectivamente, quando comparadas a UltraCal (ANOVA-1via). No experimento de biocompatibilidade não foi possível observar diferenças estatísticas significantes entre os 3 materiais testados nos períodos de 7 e de 30 dias, entretanto, levando em consideração os eventos celulares, foi possível identificar que, para as 3 pastas de hidróxido de cálcio, ocorreu uma redução nos escores de avaliação de 7 para 30 dias (ANOVA-2 vias). As pastas UltraCal, Calcicur e controle mantiveram-se com pH acima de 12 em todos tempos testados. A dissociação em íons cálcio e hidroxila, das pastas controle e Calcicur, aconteceu de forma mais rápida, até 45 dias, em função do veículo aquoso. As 3 pastas... . / The aim of this study was to evaluate the release of calcium íons and pH of three calcium hydroxide pastes: UltraCal XS, Calcicur and aqueous paste besides evaluating the tissue's response in subcutaneous conjunctive tissue extracted from the dorsal part of Wistar rats in the period of 7 and 30 days. The analysis of the calcium present in the pastes was performed using a spectrophotometer by atomic absorption. A pHmeter was employed to read the measured pH. The pH and calcium release measurements were performed in the experimental times of 1 hour and 1, 2, 3, 7, 15, 30, 45 and 60 days. For the biocompatibility response 18 Wistar rats were used, on which were inserted into the dorsal subcutaneous tissue poliethylene tubes containing each one the three pastes, in the periods of 7 and 30 days. The results showed significant differences between the pH and calcium release of the pastes considering the values from starting time, minimum and maximum values, and when comparing the final and starting values (delta). The results showed higher pH and calcium release to the control paste and Calcicur respectively when compared to UltraCal (ANOVA- one way). On the biocompatibility experiment, statistically significant differences were not observed among the three tested materials in the periods of 7 and 30 days. Nevertheless, considering the cellular events, it was possible to identify that for all three calcium hydroxide pastes there was an evaluation score reduction from 7 to 30 days (ANOVA-two ways). Ultracal, Calcicur and the control paste maintained the pH above 12 during all times. The calcium and hydroxil ions from the control paste and Calcicur presented a faster ionic dissociation, up to 45 days due to the aqueous vehicle. The biocompatibility of the three pastes was observed in the evaluated observation times.

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:07Z : No. of bitstreams: 1 000832261.pdf: 4195140 bytes, checksum: 6e2b831f192d8949fd6dfe375c6ff96a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As atividades biológicas e farmacológicas dos biflavonoides são diversas incluindo suas propriedades imunossupressivas, anticancerígenas, antioxidantes, antiangiogênicas, antibacterianas, antivirais e antifúngicas. No presente estudo, avaliou-se a potencial capacidade do biflavonoide morelloflavona, isolada de Garcinia xanthochymus, em modular a expressão de HLA-G (Human Leukocyte Antigen- G), bem como seu potencial efeito quimiopreventivo. Inicialmente, foi avaliado o índice de morte celular causado pela morelloflavona por meio do ensaio de Anexina V - Iodeto de proídio em PBMC (Células mononucleares do sangue periférico), o qual apresentou índices de morte celular significantes. Através da citometria de fluxo observou-se um aumento da expressão de HLA-G vinculado à membrana celular em linhagens de melanoma (FON) (p < 0,001). Pôde-se observar a indução de HLA-G solúvel em linhagens de melanoma transfectada (M8-HLA-G1) (p < 0,001), sem alteração para os demais tipos celulares estudados, pelo ensaio imunoenzimático- ELISA. A expressão de RNAm de HLA-G também foi induzida pela morelloflavona, observada pela RT- PCR, em células de melanoma M8 que não expressam HLA-G constitutivamente. Ainda, foi avaliada a atividade quimiopreventiva da morelloflavona. Observou-se a duplicação da atividade da enzima quinona redutase na linhagem de hepatocarcinoma celular (Hepa1c1c7) por meio do ensaio quinona redutase. Pelo ensaio do cometa foi possível verificar a capacidade genotóxica e antigenotóxica. Em relação à antigenotoxicidade, a morelloflavona causou dano de DNA no pré-tratamento. No pós-tratamento foi observado que a morelloflavona pode ter a capacidade de reverter danos de DNA causados pelo peróxido de hidrogênio. Sendo assim, os dados demonstrados revelam que a morelloflavona induz a expressão de HLA-G e possui efeito quimiopreventivo. / The biological and pharmacological activities of biflavonoids are diverse, including their immunosuppressive, anticancer, antioxidant, antiangiogenic, antibacterial, antiviral and antifungal properties. In the present study we assessed the potential ability of morelloflavone, a biflavonoid isolated from Garcinia xanthochymus in modulating the expression of HLA-G (Human Leukocyte Antigen-G), as well as their potential chemopreventive effect. First, we measured the rate of cell death by morelloflavone using Annexin V - Propidium iodide assay in PBMC (peripheral blood mononuclear cells), which showed significant levels of cell death. By flow cytometry was observed the increased expression of HLA-G membrane bound in melanoma cells line (FON) (p < 0.001). Also, was observed the induction of HLA-G soluble in transfected melanoma cells line (M8-HLA-G1) (p < 0.001), with no change to other cell types studied by Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA. The expression of HLA-G mRNA was also induced by morelloflavone, observed by RT-PCR, in melanoma cells (M8) that do not express HLA-G constitutively. Still, we evaluated the chemopreventive activity of morelloflavone. We observed a doubling of quinone reductase enzyme activity in hepatocellular carcinoma cells line (Hepa1c1c7) by quinone reductase assay. By comet assay we were able to verify the genotoxic and antigenotoxic capacity. Regarding antigenotoxicity, morelloflavone caused DNA damage pre treatment. In the posttreatment was observed that morelloflavone may be capable of reversing DNA damage caused by hydrogen peroxide. Thus, the data show that morelloflavone induces the expression of HLA-G and has chemopreventive effect. / FAPESP: 09/52716-4 / CNPq: 140022/2010-4 / CAPES: 0103-110