Orientadora : Profª Drª Valéria M. M. Sperandio Roxo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/02/2012 / Inclui referências : f. 31-34;44-51 / Área de concentração : Genética / Resumo: HLA-F é um gene pertencente ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) não clássico. Este gene codifica moléculas MHC de classe Ib com distribuição restrita e menos variações nucleotídicas que genes MHC de classe Ia. Dos 22 alelos registrados no banco de dados IMGT apenas quatro codificam proteínas que diferem em suas estruturas primárias. A fim de estimar o genótipo e as frequências alélicas, este estudo teve como foco as regiões previamente descritas do gene HLA-F que são codificadoras de proteínas. A genotipagem foi feita através de sequenciamento (SBT). A amostra foi composta por 199 doadores de medula óssea sem relações de parentesco entre si e que fazem parte do Registro Nacional de Doadores de Medula Óssea (REDOME), euro-brasileiros, provenientes da região Sul do Brasil. Cerca de 1673 pares de base foram analisados. O alelo mais frequente foi o HLA-F*01:01 (87.19%), seguido por HLA-F*01:03 (12.31%), HLA-F*01:02 (0.25%) e HLA-F*01:04 (0.25%). Significantes desequilíbrios de ligação foram verificados entre alelos do gene HLA-F e alelos de genes HLA de classe I e II. Este é o primeiro estudo sobre polimorfismos do gene HLA-F em uma amostra da população euro-brasileira contribuindo para a caracterização genética da região Sul do Brasil. Palavras-chave: Euro-brasileiros, HLA-F, desequilíbrio de ligação, polimorfismos, população. / Abstract: HLA-F is a non-classical major histocompatibility complex (MHC) gene. It codes class Ib MHC molecules with restricted distribution and less nucleotide variations than MHC class Ia genes. Of the 22 alleles registered on the IMGT database only four alleles encode for proteins that differ in their primary structure. To estimate genotype and allele frequencies, this study targeted on known protein coding regions of the HLA-F gene. Genotyping was performed by Sequence-Based Typing (SBT). The sample was composed by 199-unrelated bone marrow donors from the Brazilian Bone Marrow Donor Registry (REDOME), Euro-Brazilians, from Southern Brazil. About 1673 bp were analyzed. The most frequent allele was HLA-F*01:01 (87.19%), followed by HLA-F*01:03 (12.31%), HLA-F*01:02 (0.25%) and HLA-F*01:04 (0.25%). Significant linkage disequilibrium (LD) was verified between HLA-F and HLA classes I and II alleles. This is the first study regarding HLA-F polymorphisms in a Euro-Brazilian population contributing to the Southern Brazilian genetic characterization. Keywords: Euro-Brazilians, HLA-F, linkage disequilibrium, polymorphisms, population.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T20:52:13Z : No. of bitstreams: 1 avendanorueda_jc_me_arafo.pdf: 1556515 bytes, checksum: 41f930447d5e928990d3469d3288f326 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo deste estudo foi o de avaliar a biocompatibilidade e a infiltração no sentido coroa/ápice de um cimento obturador de canais radiculares à base de uretano dimetacrilato denominado Endo-Rez. Foram utilizados 56 canais radiculares de dentes de cães, os quais foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo I, Endo-Rez com restauração coronária (18 raízes); Grupo II, Sealapex com restauração coronária (10 raízes); Grupo III, Endo-Rez sem restauração coronária (18 raízes) e Grupo IV, canais radiculares obturados com Sealapex sem restauração coronária (10 raízes). Os canais radiculares foram instrumentados pela técnica clássica e obturados pela técnica de condensação lateral ativa (Grupo II e IV) e técnica de cone único (Grupo I e III). Decorridos 90 dias, os animais foram mortos e as peças submetidas ao processamento histológico. A avaliação histopatológica mostrou que os grupos I e III que foram obturados com Endo-Rez com e sem restauração coronária respectivamente, apresentaram semelhante infiltrado inflamatório periapical crônico de grau moderado/severo, severo aumento do espaço periodontal apical e ausência de selamento biológico apical. O grupo IV, obturado com Sealapex, aberto ao meio bucal por 90 dias, apresentou características histopatológicas similares aos grupos I e III. O Grupo II, cujos canais radiculares foram obturados com o Sealapex com restauração coronária ocorreu infiltrado inflamatório moderado e espessamento do espaço periodontal apical predominantemente leve, na maioria dos espécimes, exibindo selamento apical biológico em apenas 1 caso, portanto 10% dos espécimes. / The aim of this study was to evaluate in vivo the biocompatibility and coronal leakage of a new urethane metacrylate resin-based sealer, EndoRez. Sixty root canals of dog's teeth were divided into four experimental groups. Group I and III, EndoRez with and without coronal obturation respectively, Group II and IV Sealapex with and without coronal obturation respectively. The teeth were instrumented with a classic technique with Groups II and IV filled by the lateral condensation active technique with gutta percha points, while groups I and III were filled by the single cone technique. After 90 days, the animals were killed and specimens prepared histopathologically. The histopathological evaluation showed in the Groups I and III filled with EndoRez and the Group IV filled with Sealapex, most specimens with severe and moderate chronic inflammatory infiltrate, severe thickness of periodontal ligament and the apical sealing absence, Whereas, in Group II filled with Sealapex, most specimens showed mild and moderate inflammatory infiltrate, less thickness of periodontal ligament, and 30% exhibit biological apical sealing.

Orientador: Erick da Cruz Castelli / Banca: Celso Teixeira Mendes-Júnior / Banca: Ramon Kaneno / Resumo: HLA-F é um gene de classe I não clássico do Complexo Principal de Histocompatibilidade humano. Este locus difere-se dos genes clássicos pelo baixo polimorfismo e diferente padrão de expressão. A exata função do gene HLA-F ainda permanece desconhecida. Acredita-se que o HLA-F possua uma função tolerogênica e imunomodulatória. Atualmente, há pouca informação acerca da variabilidade do gene HLA-F e os estudos disponíveis avaliaram apenas pequenos segmentos do gene e/ou buscaram por variantes já conhecidas. Neste estudo apresentamos uma estratégia para a avaliação completa da variabilidade do gene HLA-F, incluindo suas regiões regulatórias, usando sequenciamento de segunda geração (ou nova geração). Esta estratégia foi aplicada para descrever a variabilidade de uma amostra de 196 indivíduos oriundos do estado de São Paulo. Os resultados indicam que o gene HLA-F é muito conservado, considerando-se as diferentes moléculas codificadas, sendo que todas as sequências encontradas codificam apenas 4 moléculas HLA-F distintas. Uma dessas moléculas, associada ao grupo de alelos F*01:01, representa 82,45% das proteínas codificadas pelas sequências de HLA-F encontradas no Brasil. No entanto, a variabilidade nucleotídica e haplotípica encontrada no presente estudo mostrou-se muito superior a já descrita na literatura, embora a maioria das sequências detectadas apresenta mutações sinônimas ou intrônicas. A região 3' não traduzida do gene HLA-F mostrou-se pouco variável, com haplótipos bem definidos associados aos alelos de região codificadora. Esta baixa variabilidade proteica está provavelmente associada ao papel crítico do HLA-F na fisiologia do sistema imunitário / Abstract: HLA-F is a non-classical HLA class I gene and is distinguished from its classical counterparts by low allelic polymorphism and distinctive expression patterns. The exact function of HLA-F remains unknown. It is believed that HLA-F has tolerogenic and immune modulatory features. Currently, there is little information regarding the HLA-F allelic variation among humans and the available studies have evaluated only a fraction of the HLA-F gene segment and/or have searched for known alleles only. Here we present a strategy to evaluate the complete HLA-F variability including its regulatory segments (promoter and 3'UTR) by using massive parallel sequencing (or second generation sequencing) procedures. HLA-F variability was surveyed on 196 individuals from the Southeast of Brazil. The results indicate that the HLA-F gene is indeed conserved at the protein level, in which the three coding haplotypes detected encode for only four different HLA-F molecules, and one of these molecules represent 82.45% of all. However, HLA-F worldwide haplotype variability is much higher than our current knowledge. The 3'UTR presented few variable sites and well-defined haplotypes that are usually associates with the same coding alleles. This protein conservation is probably a consequence of the HLA-F's key role in the immune system physiology / Mestre

A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2912_1.pdf: 1186353 bytes, checksum: 92f2c91c8d664cec12729055eb4aaf14 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fatores genéticos, imunológicos e ambientais estão envolvidos na patogênese de diversas doenças. Dentre essas influências, o sistema de histocompatibilidade (HLA) se destaca pelo seu polimorfismo e capacidade de conferir susceptibilidade ou resistência a vários distúrbios imunomediados. De acordo com o grupo étnico-racial estudado, observam-se variações no perfil HLA relacionadas a idade de surgimento, o curso clínico e resposta ao tratamento de algumas doenças (2). Os genes do HLA são os mais polimórficos dos mamíferos (2,6). É possível que o polimorfismo exista para garantir a sobrevivência das espécies (5). A herança de um haplótipo materno e paterno em co-dominância faz com que cada pessoa possa expressar em suas células diferentes moléculas do HLA, o que lhe confere a vantagem de apresentar mais peptídeos antigênicos às células T, possibilitando assim uma maior cobertura da resposta imune (7). Quanto maior o polimorfismo do HLA numa população, maior será a probabilidade de um indivíduo herdar haplótipos diferentes e, portanto, ser heterozigoto para todos os loci (7). Para a compreensão dos mecanismos de associação das moléculas de histocompatibilidade com as doenças é imprescindível conhecer a nomenclatura dos diversos componentes do MHC, os métodos pelos quais os antígenos e os alelos de histocompatibilidade são identificados, e ainda a função das moléculas de HLA no sistema imune. Assim, torna-se mais fácil o entendimento dos mecanismos pelos quais as moléculas de histocompatibilidade participam da patogenia das doenças, conferindo susceptibilidade ou proteção contra o seu desenvolvimento (2). Os produtos dos genes HLA-DRB1*, DQB1* e DPB1* são as moléculas clássicas de histocompatibilidade de classe II, que estão envolvidas na rejeição contra enxertos e na apresentação de peptídeos aos receptores dos linfócitos T (8).legais foram pesquisadas as páginas de instituições nacionais e internacionais na Internet, perfazendo um total de 52 referências. O segundo artigo, original, configura-se em estudo sobre a necessidade de entender melhor a resposta imune do organismo frente a infecção pelo HBV em amostras de doadores de sangue da Fundação HEMOPE, realizado no período de dezembro de 2008 a dezembro de 2009, com desenho de estudo do tipo caso controle. Tem como objetivo principal descrever e comparar a frequência genotípica para os alelos HLA de classe II presentes nos lócus DRB1* em doadores de sangue com a infecção pelo HBV e imunes contra esta infecção no Estado de Pernambuco

Orientadores: Lilian Tereza Lavras Costallat, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T16:00:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bertolo_ManoelBarros_D.pdf: 5744580 bytes, checksum: f7167e9a18551a891129b8899097c781 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A associação de antígenos de histocompatibilidade com a artrite reumatóide (AR) vem sendo demonstrada em inúmeros estudos. A principal associação em população caucasóide é com o HLA-DR4, contudo, também vem sendo observada com HLA-DRl e outros antígenos. Resultados de vários trabalhos sugerem que, o HLA-DR4 está mais associado com a gravidade do que com suscetibilidade. Com a introdução das técnicas de biologia molecular foi possível determinar que, os subtipos do HLA-DR4, relacionados com AR, são os alelos HLA-DRBl *0401, *0404 e *0405, que estão mais associados à gravidade da doença do que com a suscetibilidade. Em alguns estudos verificou-se, também, que os subtipos do HLA-DRl associados com a doença são os alelos HLA DRBl *0101 e *0102. Os propósitos deste estudo foram os de analisar a freqüência dos antígenos HLA-DR, identificar os alelos específicos do HLA-DRB 1, determinar sua freqüência, correlacionar estes alelos com as manifestações clínicas e laboratoriais e caracterizar aqueles que podem predizer o padrão evolutivo da AR em pacientes caucasóides. Foram avaliados 65 pacientes caucasóides, com AR, diagnosticados pelos critérios. da "American College of Rheumatism" (ACR). Todos foram avaliados clinicamente quanto ao envolvimento articular e extra-articular. O quadro funcional foi analisado usando-se a classificação funcional de Steinbrocker (CFS). Fator reumatóide (FR) e exame radiográfico foram realizados em todos os pacientes. Na determinação dos antígenos de classe I e TI utilizou-se a reação da microlinfocitotoxicidade. O DNA genômico dos pacientes positivos para HLA-DRl e DR4 foi amplificado pela reação da cadeia da polimerase (PCR), e a identificação dos alelos efetuada através da hibridização de sondas de oligonucleotídeos com seqüências específicas (SSO). Nesta casuística, o HLA mais freqüente foi o HLA-DRl (26,2%), quando comparado com o grupo controle (11,5%) (p<0,05). HLA-DR4 ocorreu em 24,6% dos pacientes e em 18% dos controles (p>0,05). Os pacientes com HLA-DRl não mostraram associação com nenhuma das variáveis clínicas e laboratoriais estudadas. Aqueles com DR4 positivo, quando comparados com DR4 negativo, apresentaram maiores títulos de FR, erosão óssea e um pior grau na CFS (p<0,05). Os alelos HLA-DRBI *0401 e *0404 apresentaram associação com um quadro funcional mais incapacitante, FR em altos títulos e erosão óssea, não se evidenciando predomínio significativo de um sobre o outro, com exceção do Fator Reumatóide, que estava em maiores títulos nos pacientes com o alelo *0404. Os alelos HLA-DRBI *0101 e *0102, embora mais freqüentes, não apresentaram associação com as variáveis clínicas e laboratoriais. Os pacientes com HLA-DRBI *0401, *0404 e *0101, que possuem seqüências semelhantes de aminoácidos na região 70-74 (QKRRA - QRRAA), mostraram maior freqüência de erosões. A partir dos dados obtidos, concluímos que os alelos HLA-DRBI *0101 e *0102 estavam relacionados com a suscetibilidade na AR, enquanto que os alelos HLA-DRB 1 *0401 e *0404 estavam associados com doença mais agressiva / Abstract: Several reports have shown that rheumatoid arthritis (RA) is associated with HLA-DR4, however association of RA and HLA-DRI has been found also in caucasian population. Subsets of HLA-DR4 were recognized using molecular biology technics. It has been mentioned that DR4 aneles (HLA-DRB 1 *0401, *0404, *0405) are more associated with severity than susceptibility to the disease. Our goals were to determine the HLA-DR frequency, to identify the specifics alleles of HLA-DRBI, to correlate these aneles with the clinical and laboratorial manifestations and to determine the aneles that can identify patients with more aggressive disease in caucasian with rheumatoid arthritis. Sixty five caucasian patients with RA (ACR's criteria) were analyzed with clinical, serological, radiographic data and functional status according to the Steinbrocker scale. To determine Class I and 11 antigens the microlinfocitotoxicity reaction was employed. Genomic DNA from HLA-DRI and DR4 positive patients was amplified by the polymerase chain reaction (PCR). Dot blotting and hybridization with sequence specific oligonucleotide (SSO) probes were performed. The phenotypic frequency of HLA-DRI in RA patients (26,2%) was significantly greater than controls (11,5%) (p<O,05). HLA-DR4 occurred in 24,6% of the patients and in the 18% of controls (p>0,05). The HLA-DRI positive patients did,'not show ditTerences when compared to HLA-DRI negative. Positive DR4 patients had significantly higher tittles of rheumatoid factor, bone erosions and worst functional status (p<0,05). The alleles HLA-DRB 1 *0401 e *0404 were associated with worst functional status, bone erosions and rheumatoid factor. HLA-DRBI *0101 and *0102 were the most frequent aneles, however not associated with clinical and laboratory characteristics. Those with HLA-DRBI *0101, *0401 e *0404 aneles, who presented de shared epitope (QKRAA - QRRAA) at position 70-74, showed erosion more frequently. We can conclude that the HLA-DRBI *0101 and *0102 aneles are associated with susceptibility to RA while *0401 and *0404 with more aggressive disease / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Medicina

Orientador: Sofia Rocha Lieber / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T00:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_SimoneCorteBatistadeSouza_M.pdf: 12986126 bytes, checksum: 56f6e541e8fd3c63c90b4163763aa88d (MD5) Previous issue date: 1998 / Abstract: Pregnancy can be considered as a very successful all graft, but the underlying mechanism is not yet completely understood. HLA all tigens compatibility is very important in c1inic transplant due to their all ore cognition by immune system. Nevertheless, genetic differences between maternal and paternal HLA antigens seem to be an important factor for implantation and development of the concept. Such differences lead to immune active responses but, at same time, they help the development of tolerant responses, important to embryo acceptance. So, couples sharing HLA antigens are more subjected to Recurrent Spontaneous Abortion (RSA). As the fetus can be considered a half-all genetic graft, the patient's previous immunization with husband's lymphocytes could be helpful, since it could induce, in patient sera, the arising of both citotoxic antibodies and mixed Lymphocyte culture (MLC) blocking factors, both against husband's . antigens. Those factors have been seen as important for the normal pregnancies and reflect the immune tolerant status of the pregnant women. Hence, the aims of this study was: (1) to examine the HLA compatibility degree in 111 RSA couples and in 161 fertile couples; (2) to define the incidenceofcitotoxic antibodies against husband's lymphocytes (cross match assay) and MLC blocking factors in 291 RSA patients serum; (3) to verify the changes in previous cited factors ill 178 RSA patients submitted to immune therapy. The therapy consisted of 2 to 6 intradermal inoculations, every four weeks, containing 80 X 106 husband or husband plus unrelated donor mononuc1ear cells; (4) to evaluate the relevance of cytotoxic antibodies and MLC blocking factors in 101 cases of pregnancy outcome. We have found that, in our own population, the number of shared HLA antigens was greater in RSA couples than in normal fertile couples. Additional1y, cytotoxic antibodies and MCL blocking factors were found in low frequency (around 12%) in RSA patients. The immune therapy induced the development aft antibodies against husband's lymphocytes in 84,5% of the cases, as well as MCL blocking factors in 71,5% aft the cases, most of them being not specific to husband's lymphocyte responses. Citotoxic antibodies also reacted against to the cross reacting HLA antigens group bin addition to the husband HLA c1ass I antigens, in 52 % of the patients. The miscarriage incidence fell down to 25,7% with the immunization. But the use of cross match and MLC inhibition assays were found to be a limited value in predicting the pregnancy outcome. We did not find significant differences between term and abortion groups concerning these two factors. Since most of the 17 patients of fertile control group studied were in a 12-week-period of pregnancy, it was difficult to evaluate the direct effects of the blocking factors in sera. It is possible that those factors could be absorbed in the fetus-placenta compartment. Where they could contribute to down regulating HLA molecules and with the help of cytokine profile TH2 could induce the immune tolerance to fetal antigens. So, there is a need for an additional in vitro functional test that gives a qualitative assessment of immunotolerant status before pregnancy establishment. This would enable the clinidian to predict the need of additional immunizations for any particular patient. The results suggest an important aid of immunotherapy in the RSA treatment. However, the assays used in this study resulted in a poor predictive test of miscarriage. Nevertheless the cross match and MCL inhibition tests could be used as a first step for monitoring patients who had undergone immune therapy. The couple HLA typing could help define the inclusion or not of unrelated donor in immunizatioti protocols / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Este trabalho teve como objetivo principal descrever a diversidade genética e identificar a estrutura populacional de populações de tamanduá-mirim distribuídas ao longo dos biomas brasileiros através do uso de ferramentas de genética de populações e do acesso a regiões neutras e adaptativas do genoma da espécie. A amostragem de indivíduos de tamanduá-mirim é complicada pela difícil detecção do animal em trabalhos de campo, pela sua complicada captura e manipulação. Assim, fez-se necessário o uso de espécimes de museu e de amostras não-invasivas. A fim de validar o uso das mesmas para a genotipagem confiável de oito locos de microssatélites desenvolvidos para a espécie foi utilizado um método de padronização da qualidade das amostras (Índice de Qualidade, QI) e estimativa dos erros de genotipagem. Foi observada uma qualidade superior das amostras não invasivas (N=19) em relação às peles de museu (N=138). Foi possível também eliminar amostras com desempenho ruim (QI<0.7 e sucesso de amplificação maior que 75%), e garantir a confiabilidade dos resultados de microssatélites das amostras que permaneceram no estudo para análises posteriores. Devido à grande área de distribuição da espécie de forma contínua, se tornou complicado traçar populações pré-definidas. Assim, a abordagem da genética da paisagem foi a ferramenta mais apropriada para o estudo da estrutura de populações em T. tetradactyla (N=176). Comparativamente, duas abordagens foram usadas: agrupamento de indivíduos pelo critério de proximidade geográfica, designado aqui como a priori (20 populações), e análises baseadas no indivíduo, sem informação prévia de agrupamento populacional, referida no capítulo como a posteriori (quatro transectos testados). Foram encontrados níveis de diversidade moderados (média de 11.38 alelos por lóco) e poucas evidências de estruturação entre populações das localidades amostradas (K=2 na maioria dos testes). Os indivíduos que mostraram maior diferenciação foram originados da Floresta Amazônica. Esta região também demonstrou maior diversidade genética (riqueza alélica e heterozigosidade esperada) que as outras. Por outro lado, populações distribuídas ao longo da Mata Atlântica e regiões adjacentes demonstraram um padrão de isolamento por distância. Populações do Brasil central (Cerrado e Pantanal) não demonstraram diferenciação em relação às demais. Finalmente, foi estudada a variação genética adaptativa da espécie através da diversidade do gene DRB do complexo MHC. Esta família gênica codifica proteínas envolvidas no reconhecimento de antígeno e ativação da resposta imune adaptativa, e são regulados por seleção natural, especialmente por pressão seletiva dirigida por patógenos. É esperado que a diversidade de patógenos seja distinta nos biomas brasileiros, sendo os ambientes florestais mais biodiversos neste quesito do que ambientes da Diagonal Seca, o que representa pressões seletivas diferentes. Assim, foi investigada a diversidade do gene DRB éxon 2 em indivíduos (N=65) dos diferentes biomas brasileiros através de sequenciamento de nova geração (454 GS Junior), e os resultados de distribuição dos alelos foram comparados com os microssatélites. Foi encontrada uma alta diversidade (60 alelos no nível de aminoácido e 70 alelos no nível de nucleotídeos) e assinaturas claras de seleção positiva no gene (dN/dS=2.94). Maior riqueza alélica e proporção de alelos privados foram encontradas em biomas florestados, especialmente na Floresta Amazônica. Além disso, os marcadores neutros (microssatélites), demonstraram padrões similares ao DRB, revelando a força de eventos demográficos e deriva genética que também moldaram os padrões de diversidade deste gene do MHC / This work aimed to describe the genetic diversity and population structure of populations of the lesser anteater distributed along Brazilian biomes through population genetic tools, accessing neutral and adaptive genomic regions of the species. Sampling lesser anteater individuals is complicated due to infrequent detection of the animal in field works, its complicated capture and manipulation. Thus, it was necessary to use museum specimens and noninvasive samples. To validate these samples for the reliable genotyping of eight microsatellite loci developed for the species, a standardization method of the quality of samples (Quality Index, QI) and genotyping errors was used. A superior quality of noninvasive samples (N=19) compared to study skins (N=138) was observed. It was also possible to eliminate samples with a bad performance (QI<0.7 and amplification success higher than 75%), and thus guarantee the reliability of microsatellites results for samples kept in further analysis. Due to the great and continuous distribution area of the species, it becomes difficult to delineate predefined populations. Thereby, landscape genetics approach was a better suited tool for studying the population structure of T. tetradactyla individuals (N=176). Comparatively, two approaches were used: grouping of individuals by a geographical proximity criterion, designated here as a priori (20 populations), and analysis based on individuals, without previous information of population grouping, referred here as a posteriori (four transects tested). Moderate levels of diversity were found (average of 11.38 alleles per locus), and few evidences for structuring between populations of the sampled localities (K=2 in most tests). The individuals showing the major differentiation were originated from the Amazon Forest. This region also demonstrated higher genetic diversity (allelic richness and expected heterozygosity) than others. By the other hand, populations distributed in Atlantic Forest and adjacent regions demonstrated a pattern of isolation by distance. Populations from central Brazil (Cerrado and Pantanal) did not show distinction from the others. Finally, the adaptive genetic variation of the species was studied through DRB gene diversity, from MHC. This gene family codes for proteins involved in the antigen recognition and activation of the adaptive immune response, and are regulated by natural selection, especially by selective pressure driven by pathogens. It is expected that the pathogen diversity is distinct in Brazilian biomes, being florested biomes more diverse than dry central Brazil environments, which represents different selective pressures. Therefore, the diversity of DRB exon 2 gene in individuals (N=65) from different Brazilian biomes was investigated through Next Generation Sequencing (454 GS Junior), and the results of allele distributions were compared with microsatellites. A high diversity was found (60 alleles in amino acid level and 70 in nucleotide level) and clear signatures of positive selection in DRB (dN/dS=2.94). Greater allelic richness and private allele number were found in forested biomes, especially in the Amazon Florest. Besides, neutral markers (microsatellites) demonstrated similar patterns to DRB, revealing the strength of demographic events and genetic drift in shaping the diversity patterns in MHC

INTRODUÇÃO: As moléculas HLA são os principais alvos da rejeição nos transplantes de órgãos sólidos. A influência dos anticorpos anti-HLA pré-formados e da compatibilidade HLA no transplante de fígado ainda não está bem definida. A maioria dos transplantes é realizada sem a pesquisa de anticorpos anti-HLA pré-formados e sem pareamento HLA. OBJETIVOS: Avaliar as associações dos anticorpos anti-HLA pré-formados e da compatibilidade HLA à rejeição celular aguda (RCA) em até 90 dias após o transplante. MÉTODOS: Coorte prospectiva de transplantes de fígado ABO compatíveis/idênticos realizados entre janeiro de 2012 e dezembro de 2013. Enxertos que sobreviveram além de 4 dias foram incluídos. A pesquisa de anticorpos anti-HLA classes I e II foram realizadas por meio de ensaios de fase sólida (LABScreen® Mixed e LABScreen® Single Antigen). MFI (Mean Fluorescence Intensity) >= 1.000 foi onsiderado omo positi o para anticorpos anti-HLA. Tipificação HLA-A, B e DR, de receptores e doadores foi feita por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction). Conforme o número de alelos HLA incompatíveis, os transplantes foram classificados em compatíveis (0-3 incompatibilidades) e incompatíveis (4-6 incompatibilidades). Apenas episódios de RCA comprovados por biópsia, associados a alterações das provas hepáticas, foram considerados. O critério Banff foi utilizado para diagnóstico e os episódios foram estratificados em leves, moderados e graves. Modelos de regressão de Cox foram realizados e as razões de risco (RR) associadas foram determinadas. Sobrevidas livres de RCA foram obtidas por meio do estimador de Kaplan Meier e comparadas entre os grupos pelo teste log-rank. RESULTADOS: Cento e vinte e nove transplantes foram analisados. Incidência global de RCA em 90 dias foi de 14,7%. A pesquisa de anticorpos anti-HLA pré-formados foi considerada positiva em 35,6% dos transplantes. Em relação à compatibilidade HLA, 91,5% dos transplantes foram classificados como incompatíveis. A sensibilização para anticorpos anti-HLA foi associada a um risco aumentado de RCA (RR=4,3; IC 95%=1,3 - 13,5; p=0,012). De acordo com a classe do anticorpo, observamos que a classe II foi associada a um risco aumentado de RCA (RR=56,4; IC 95%= 4,5 - 709,6; p=0,002). Para anticorpos classe I, foi observada associação marginalmente significante (RR=2,77; IC 95%=0,8 - 8,8; p= 0,08). Uma melhor compatibilidade HLA não foi associada a um risco reduzido de RCA (RR= 0,9; IC 95%=0,2-4; p=0,89). CONCLUSÕES: O presente estudo mostrou que a sensibilização para anticorpos anti-HLA pré-formados om I >= 1.000 está asso iada a um risco aumentado de rejeição celular aguda precoce no transplante de fígado. Anticorpos classe II foram também associados a um risco aumentado de RCA e anticorpos classe I foram tendência. A melhor compatibilidade HLA não foi associada a um risco reduzido de RCA neste estudo. A presença de sensibilização para anticorpos anti-HLA pré-formados poderia servir como marcador de imunorreatividade aumentada contra os enxertos. Isso permitiria ajustes individualizados de imunossupressão / INTRODUCTION: Human leucocyte antigens (HLA) molecules are the main targets of rejection in solid organ transplantation. Significance of anti-HLA preformed antibodies and HLA compatibility remains unclear in liver transplantation. Majority of liver transplants are performed without assessment of preformed anti-HLA antibodies and HLA-matching. OBJECTIVES: Evaluate associations of preformed anti-HLA antibodies and HLA compatibility with acute cellular rejection (ACR) in the first 90 days after transplantation. METHODS: Prospective cohort of ABO-identical/compatible liver transplants between January 2012 and December 2013. Grafts that survived more than 4 days were included. Anti-HLA class I and II antibodies were determined by solid phase assays (LABScreen® Mixed and LABScreen® ingle Antigen). A mean fluores en e intensity ( I) >= 1.000 was considered as positive for anti-HLA antibodies. Recipients and donors HLA typing for HLA-A, B and DR were performed using polymerase chain reaction (PCR) assays. According to HLA mismatches (MM), transplants were divided in compatible (0-3 MM) and incompatible (4-6 MM). Only biopsy proven ACR episodes, associated with abnormal liver tests, were considered. Banff criteria was used for diagnosis of ACR and episodes were graded as mild, moderate and severe. Cox proportional hazards models were performed and associated hazard ratios (HR) were determined. Free ACR rates were estimated with Kaplan-Meier analysis and were compared between groups with the log-tank test. RESULTS: One hundred twenty nine transplants were analyzed. Overall incidence of ACR was 14.7% in 90 days. Assessment of anti-HLA pre-formed antibodies was considered positive in 35.6% of transplants. Regarding HLA compatibility, 91.5% were considered incompatible. Anti-HLA antibodies sensitization was associated with an increased risk of ACR (HR= 4.3; CI 95%=1,3 - 13,5; p=0.012). According to class of antibody, we could observe that class II was associated with an increased risk of ACR (HR=56.4; CI 95%= 4.5 - 709.6; p=0.002). Class I antibodies were considered tendency to increased risk of ACR (HR=2.7; CI 95%= 0.8 - 8.8; p=0,08). A better HLA compatibility was not associated with a lower risk of ACR (HR=0.9; CI 95%=0.2-3.8 p=0.89). CONCLUSIONS: The present study indicates that preformed anti-HLA antibodies with I >= 1.000 are associated with an increased risk of early ACR rejection in liver transplantation. Class II antibodies were also associated with an increased risk of ACR. Class I antibodies were considered tendency. HLA matching had no influence on early acute cellular rejection on this study. Anti-HLA antibodies sensitization could serve as a marker of increased immunoreactivity to the graft. It would serve for tailored immunosuppression