L’acide hyaluronique (AH) est un polymère osidique aux propriétés mécaniques et biologiques d’intérêt pour le secteur de la santé et des cosmétiques. L’AH est produit à l’échelle industrielle par mise en oeuvre de souches de streptocoques groupe C et D. A l’issue de la production, une part de l’AH est libre dans le milieu de culture complexe, l’autre est associée à la capsule des cellules. La purification de l’AH est délicate en raison, d’une part, de la complexité des milieux de production et, d’autre part, des exigences de la pharmacopée européenne. L’objectif de cette thèse a été de proposer un enchaînement d’opérations et de conditions opératoires permettant une purification de l’AH à partir d’un milieu de production. Au départ, deux méthodes analytiques originales de quantification et d’évaluation de la taille de l’AH en milieux complexes ont été mises au point afin de pouvoir évaluer les critères de performance des procédés de séparation. Ensuite, quatre opérations permettant, premièrement l’extraction, deuxièmement l’élimination des cellules productrices d’AH, troisièmement la purification, et enfin, le séchage d’AH ont été établies. L’étude de l’extraction de la capsule d’AH assistée par SDS ou au TCA a permis d’établir que l’AH lié aux cellules ne représente que 7 % de l’AH produit. Il en a été déduit que cette étape n’est pas nécessaire. L’étude de la séparation des cellules du milieu de culture a montré que la microfiltration tangentielle n’est pas adaptée en raison, d’une part, d’une rétention trop élevée de l’AH (même avec des diamètres de pores supérieurs à 0,22 µm) et d’autre part, d’un colmatage trop rapide des membranes. Cette étape doit être réalisée par filtration frontale sur adjuvant de filtration (Célite). La purification de l’AH a été envisagée par diafiltration (DF) avec des membranes d’ultrafiltration. L’étude des conditions opératoires (PTM, débit d’alimentation, concentration en AH et seuil de coupure), par plan d’expériences, a permis de sélectionner des conditions qui maximisent le flux de perméat ainsi que la rétention d’AH. Ces conditions ont été appliquées en diafiltration au cours de laquelle les performances de séparation (rendement, pureté, productivité) ont été étudiées. Une méthodologie, basée sur les équations classiques de bilans de matière et de flux de perméat en DF, a alors été proposée. Cette démarche avait tout d’abord pour but de prédire lesdites performances en prenant en compte la composition complexe du milieu, de culture bactérienne mais aussi de faciliter l’agencement des étapes du procédé de purification. La diafiltration permet de satisfaire les exigences de pureté de la pharmacopée, mais pas les niveaux de certaines molécules (protéines et acides nucléiques). L’étude de l’adsorption de ces molécules sur charbon actif, en fonction de la température, de la force ionique, du pH et du type de charbon actif, a permis d’établir les conditions les plus favorables de l’élimination de ces molécules. Les équations classiques de modélisation des isothermes correspondant le mieux aux résultats expérimentaux ont été sélectionnées et utilisées avec les équations de performance en DF, afin d’associer au mieux ces deux étapes. Enfin, concernant le séchage de l’AH, deux méthodes, l’une par lyophilisation et l’autre par précipitation en solvant organique, ont été comparées. Ces dernières permettent d’obtenir moins de 20 % d’humidité et de conserver les propriétés des molécules d’AH / Hyaluronic acid (HA) is a biopolymer with mechanical and biological properties interesting the health and cosmetic areas. The industrial HA production is realized by implementation of streptococcus strains (group C or D). At the end of the production phase, a part of HA is free in a complex culture medium while the other remains associated to the cells in a capsule. The two main difficulties of the purification of HA lie, firstly, on the complexity of the production medium and, secondly, on the high requirements of the European Pharmacopoeia for such an application. The aim of this thesis was to provide an appropriate sequence of separation processes and a set of operating conditions for HA purification from a complex production medium which complies with the Pharmacopea. Initially, two original analytical methods for quantifying and evaluating the size of HA in complex environments have been developed in order to evaluate the performance criteria of the separation processes. Then, the HA extraction from the capsule, the elimination of cells, the purification and drying of HA were using classical separation processes and studied. The HA extraction by SDS or TCA showed that the HA bound to cells corresponds to 7 % of HA production. As a consequence, it was concluded that this step was not necessary. The cell separations from the culture medium by tangential microfiltration was unsuitable because of an excessive retention of HA (even at pore diameters higher than 0.22 µm) and a too fast membrane clogging. Good performances were observed with dead-end filtration using Celite. Then, the purification of HA by diafiltration (DF) with ultrafiltration membranes was considered. The operating conditions (PTM, feed rate, HA concentration and cutoff) allowing to maximize the permeate flow rate and the HA retention were selected from design of experiments methodology. The performances of purification by diafiltration (DF) in these conditions (yield, purity and productivity) were monitored. A method for predicting the performances according to the complex medium composition, based on the conventional mass balance equations and the DF permeate flow rate, was then proposed. This was done in order to facilitate the arrangement of the purification steps. In DF, the requirement of the pharmacopoeia in term of overall purity was obtained (> 95 %) but the proteins and nucleic acids levels were still above the threshold. This is why the adsorption of these molecules on activated carbon was studied as a function of temperature, ionic strength, pH and the type of activated carbon. The isotherm equations that better fitted the experimental data were selected and used combined to the equations of DF performances in order to find an appropriate chaining. Finally, the AH lyophilization and precipitation in organic solvent were compared. Both drying methods present less than 20 % moisture and preserve the properties of the molecule

Ce travail se proposait de développer, à l’échelle du laboratoire, un procédé de production microbienne d’acide hyaluronique (AH), biopolymère d’intérêt pour la cosmétique et la santé, chez une bactérie lactique naturellement productrice, Streptococcus zooepidemicus. Une étude bibliographique a permis d’identifier les points potentiellement critiques pour ce travail qui sont la composition du milieu de culture (identification de nutriments essentiels à la synthèse d’acide hyaluronique), les conditions opératoires et plus particulièrement d’oxygénation (transfert d’oxygène mais aussi maintien du potentiel d’oxydo-réduction), en relation avec les performances de production et le métabolisme des souches considérées. Une étape préliminaire a consisté en un développement et une amélioration de techniques analytiques pour disposer d’outils pertinents de suivi du métabolisme de Streptococcus zooepidemicus. La quantification de la biomasse hors acide hyaluronique ainsi que la détection de l’activité hyaluronidasique ont ainsi été développées tandis que d’autres méthodes chromatographiques et enzymatiques ont été simplement appliquées et validées aux substrats et métabolites considérés. La mise en œuvre de souches « environnementales » prélevées sur des sites infectieux chez le cheval, ainsi que de souches de collection, a permis dans un premier temps de formuler un milieu de culture et de définir des conditions de mise en œuvre exploitables à plus grande échelle pour la production d’AH. Des résultats très encourageants ont pu être obtenus avec des productions d’AH supérieures aux essais de la littérature, tout en mettant en avant des facteurs influents cruciaux tels que la concentration initiale en glucose ou encore l’oxygénation des cultures. L’influence de ces facteurs a été étudiée par la suite par le biais de cultures en bioréacteur de laboratoire en modes discontinu et discontinu-alimenté avec pour résultat l’obtention d’un mode de mise en œuvre et de conditions physico-chimiques de production améliorées. En parallèle, une étape importante de ce travail a consisté en une approche d’amélioration de souches « environnementales » par mutagénèse aléatoire, les performances de ces souches s’avérant initialement décevantes. Des mutants surproducteurs ont ainsi été générés, caractérisés au niveau de leurs performances métaboliques et conservés. En dernier lieu, un des mutants les plus performant a été mis en œuvre dans les conditions et le mode de culture sélectionnés précédemment. Tant le niveau de production d’AH, la productivité associée, que les tailles obtenues ont permis de valider ce travail de développement d’un procédé microbien de production d’AH, tout en identifiant de nouvelles voies d’amélioration / This work intended to develop a laboratory scaleproduction process ofhyaluronic acid (HA), a biopolymer of health and cosmetic interest, using a naturally AH producing lactic acid bacterium, Streptococcus zooepidemicus. A literature review allowed to identify the following critical points: firstly, the composition of the culture medium (identification of essential nutrients for microbial growth and synthesis of HA), secondly, the oxygenation level (oxygen transfer and associated redox modifications), and finally, in relation with, the production and metabolism abilities of the considered strains. A preliminary step was dedicated to the developmentorthe improvementof analytical techniques in order todispose of appropriate tools for the monitoring of Streptococcus zooepidemicus metabolism. The quantification of the biomass without considering capsular HA fraction as well as detection of hyaluronidase activity have been developed while other chromatographic and enzymatic methods have been more basically applied to and validated with the substrates and metabolites considered. The laboratory scale cultures of collection (ATCC) as well as “environmental” strains were initially used to formulate a workable cultivation broth and to define suitable culture conditionsfor a use at a larger scale to produce HA. Very positive results were obtained with higher production of HA in comparison with literature assays, while critical influencing factors such as the initial glucose concentration or the oxygenation levelin cultures were highlighted. The influence of these factors was thoroughly studied with bioreactor cultures in both batch and fed-batch modes leading to improved cultivation conditions and culture mode. In parallel, another important step consisted in the highly performance improvement of initially low HA producing "environmental" strains via random mutagenesis. Very promising overproducing mutants have therefore been generated, characterized in their kinetic and metabolic capabilities and long-term stored. At last, one of the best and most reliable mutant has been cultivated with the best previously selected medium composition and operating conditions. Both the HA production level, productivity and size observed validated the findings of this process development work, while helping to identify new improvement domains and strategies

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Lors d’infections vaginales, divers pathogènes se développent au détriment de la flore locale. L’utilisation de lactobacilles en traitement prophylactique et/ou curatif pourrait pallier ce problème. Le but de ce travail de thèse a été de développer des microparticules mucoadhésives à base de pectine et d’acide hyaluronique (HA) pour la libération intravaginale de probiotiques. Quatre souches probiotiques ont été associées à des prébiotiques afin d’obtenir un effet symbiotique. Les microparticules ont été formulées par émulsification-gélification ionique. Dans un premier temps, l’étude de l’influence de différents paramètres de procédé et de formulation a permis de définir les conditions opératoires pour l’obtention de microparticules d'environ 140 µm de diamètre encapsulant des probiotiques viables. Puis, les propriétés mucoadhésives des microparticules ont été évaluées in-vitro et ex-vivo par des mesures rhéologiques en mode dynamique et par des tests d’indentation. La présence d’HA entraine une augmentation importante du pouvoir bioadhésif des particules. Enfin, ces microparticules ont été incorporées dans des comprimés par un procédé de granulation humide. L’encapsulation des bactéries permet leur protection lors du procédé de compression. De plus, contrairement aux formes classiques d'administration des probiotiques, les microparticules permettent d'obtenir un profil de libération prolongée des bactéries sur environ 10h contre 1h dans le cas d’un comprimé comportant des probiotiques non encapsulés. Un début de prolifération bactérienne s’opère entre 16 et 24 heures. Le comprimé ainsi développé est tout-à-fait adapté à une application vaginale / More than 300 millions of women around the world have urinary or vaginal infections, including yeast vaginitis and bacterial vaginosis. Vaginal use of probiotics offers a potential alternative approach to health restoration and maintenance of the vaginal microflora. Moreover, prebiotics may be combined with probiotics to obtain a symbiotic effect. The aim of this work was to develop pro- and pre-biotics-loaded bioadhesive microparticles by using pectin and hyaluronic acid (HA). Four probiotic strains classically used in vaginal applications and one prebiotic have been selected. Microparticles were produced by emulsification/gelation method using calcium as cross-linking agent. The study of process and formulation parameters allowed obtaining microparticles with a mean diameter of 140 µm which encapsulated between 1010 to 1011 cfu/g of microparticles. Their mucoadhesive properties have been proved both by rheological and indentation measurements in in-vitro and ex-vivo conditions. Moreover, results have shown that HA addition in pectin solutions enhanced the bioadhesive properties of the gel-based microparticles. Afterwards, microparticles have been incorporated inside tablet by wet granulation. Microencapsulation of probiotics allowed protecting them during the compression process. The kinetic release of probiotics studies in in-vitro conditions exhibited a sustained release profile for 10 hours against 1h for unencapsulated probiotics. A beginning of probiotic strain proliferation was observed between 16 to 24 hours. The developed tablet is well-suited to vaginal application

Les nanoparticules à base d’acide hyaluronique (AH) sont utilisées pour de nombreuses applications pharmaceutiques. Elles peuvent cibler les tumeurs par interaction avec le CD44,qui est un récepteur biologique surexprimé à la surface de certaines cellules cancéreuses. Dans ce projet nous explorons l’application potentielle de ces nanoparticules dans les domaines cosmétiques, car l’AH est aussi un ingrédient important pour l’hydratation et le renouvellement de la peau. Les copolymères à bloc à base de polypeptides et de polysaccharides ont été synthétisés par une combinaison de polymérisation par ouverture de cycle et de couplage par chimie « click ». Les nanoparticules ont été obtenues par l’auto assemblage de ces copolymères en utilisant un procédé de nano precipitation, dont la taille et la morphologie sont contrôlées par les paramètres expérimentaux. L’interaction entre les nanoparticules d’AH et le CD44 a été quantifiée par la résonance de plasmon de surface(RPS). En comparant avec l’AH libre en solution, les nanoparticules d’AH ont montré une interaction plus efficace avec le CD44, mettant ainsi en évidence un effet de multivalence des nanoparticules. Finalement, la dégradation enzymatique de ces nanoparticules d’AH a été évaluée avec deux types de hyaluronidases, HYAL1 et SPAM-1. La digestion des nanoparticules de l’AH a été significativement ralentie par rapport à l’AH libre. De manière très surprenante, ces nanoparticules de AH ont pu inhiber l’activité de l’enzyme HYAL1 et protéger l’AH libre dans la solution. Enfin, des ligands du récepteur TLR2 de type lipopeptide ont été synthétisés et leurs performances via TLR2 ont été évaluées par RPS. / Nanoparticles based on hyaluronic acid (HA) are widely used in pharmaceutics. They can target the tumor by the interaction with CD44, a biological receptor overexpressed in some cancer cells. In this project, we investigate the potential applications of these nanoparticles in cosmetics, since HA is also an important ingredient for the skin hydration and renewing. Block copolymers based on polypeptides and polysaccharides were synthesized using a combination of ring opening polymerization and “click chemistry”. The nanoparticles were formed by the self-assembly of these block copolymers using a nanoprecipitation process, and their size and morphology were controlled by the experimental conditions. The interaction between nanoparticles and CD44 were measured by surface plasmon resonance(SPR). Compared to free hyaluronic acid chains in solution, the HA-based nanoparticles could interact more efficiently with CD44, thus demonstrating a multivalent effect. The enzymatic degradation of these HA nanoparticles was then evaluated with twohyaluronidases: HYAL1 and SPAM-1. The digestion of the HA nanoparticles was significantly slower than that of free hyaluronic acid. Surprisingly, these HA nanoparticles could even inhibit the activity of the enzyme HYAL1 and protect free HA chains in the solution. Finally, lipopeptide-based ligands of the biological receptor TLR2 were also synthesized and their performances were evaluated by SPR.

Introduction : L’allongement de l’espérance de vie, qui a pour corollaire le vieillissement de la population, laisse présager d’un recours croissant au renfort prothétique en chirurgie des troubles de la statique pelvienne et pariétale. Actuellement, en uro-gynécologie, l’utilisation des prothèses de synthèse est communément admise pour l’abord abdominal (cœlioscopique ou laparotomique) alors même que la voie vaginale est sujette à d’innombrables controverses. La rétraction prothétique représente un réel problème iatrogène, source de douleurs, d’érosion et de récidive, quelle que soit la voie d’abord utilisée. Il s’agit d’une complication sérieuse et, à l’heure actuelle, la moins documentée. L’étiopathogénie de cette rétraction reposerait sur les phénomènes adhérentiels de l’hôte, en réponse au matériau implanté (« contraction passive »). Objectifs : - Rechercher une solution à la rétraction prothétique. Le postulat de départ de cette thèse pose le fait que l’adjonction d’un gel ou d’un film d’acide hyaluronique, connus pour leur efficacité dans la diminution des adhérences post-opératoires, préviendrait la rétraction d’un implant en polypropylène chez la rate.- Établir un état des lieux, au lendemain des recommandations alarmistes américaines, mais plus nuancées et rassurantes de la part de nos sociétés savantes et experts européens vis-à-vis du recours au renfort prothétique en chirurgie vaginale.Matériels et méthodes : au décours d’une revue de la littérature, un modèle expérimental a été élaboré. Soixante rates ont été randomisées en 3 groupes. Un défect herniaire standard a été induit par laparotomie médiane au niveau de la paroi abdominale antérieure puis réparé par l’utilisation d’une prothèse en polypropylène de faible grammage macroporeux seule (groupe 1), avec application d’un film (groupe 2) ou avec enduction prothétique d’un gel (groupe 3) d’acide hyaluronique. Huit semaines après la procédure, une nouvelle laparotomie a été réalisée permettant l’évaluation d’un score adhérentiel et des surfaces prothétiques. Une étude histologique microscopique de l’interface hôte-tissu a également été effectuée.Résultats : Le groupe 1 (groupe contrôle), présentait un taux de rétraction prothétique de 29%. Les groupes 2 (p=0.0238) et 3 (p=0.0072) présentaient des taux de rétraction significativement plus bas, respectivement de 19.12% (groupe film) et 17% (groupe gel). La différence entre les 3 groupes était statistiquement significative (p=0.0153). Les adhérences post-opératoires étaient significativement moins importantes dans les groupes utilisant l’acide hyaluronique. Le groupe 1 présentait significativement un score adhérentiel plus élevé (30.40) que les groupes 2 (11.67, p=0.0028) et 3 (11.19, p=0.0013). La colonisation conjonctivale était moins intense dans le groupe gel, comparativement aux groupes film et témoin (p=0.0181).Conclusion et perspectives cliniques : Notre travail expérimental a démontré que la surface prothétique était sauvegardée de façon statistiquement significative lors du recours à un gel ou un film d’acide hyaluronique La rétraction prothétique, compliquant la chirurgie avec implant synthétique en polypropylène, pourrait être prévenue par l’adjonction de ce complément. Ceci préviendrait la formation d’adhérences post-opératoires et de fibrose, propices à la contraction du tissu hôte péri-prothétique et conduisant à la rétraction du matériau de renfort. Cette donnée devrait être intégrée dans une stratégie de sauvegarde prothétique préservant la qualité ainsi que la durée de la réparation chirurgicale tout en limitant la douleur post-opératoire. / IntroductionThe prolongation of life expectancy, which has for corollary the aging of the population, leads to predict of a growing appeal to the use of prosthetic reinforcement in surgery for pelvic statics’ disorders and parietal hernias. Currently, in uro-gynecology, the use of synthetic meshes is commonly admitted for the abdominal approach (by laparoscopy or laparotomy) while the vaginal route is subject to innumerable controversies. Prosthetic retraction (shrinkage) represents a real iatrogenic problem, causing pain, erosion and recurrence, whatever the approach used. This is a serious complication and, at the moment, the least documented. The etiopathogenesis of this retraction is based on host adhesion phenomena, in response to the implanted material ("passive contraction").Objectives-To research for a solution to prosthetic retraction. The basic premise of this thesis puts the fact that the addition of a gel or a film of hyaluronic acid, known for their effectiveness in reducing post-operative adhesions, would prevent the retraction of a polypropylene implant in a rat model.-To establish an update, the day after the American alarmist recommendations, but more nuanced and reassuring on behalf of our learned societies and European experts with regard to prosthetic reinforcement ‘use in vaginal surgery.Material and methods :Following a review of the literature, an experimental model was developed. Sixty rats were randomized into 3 groups. A standard hernial defect was induced by medial laparotomy in the anterior abdominal wall and then repaired using a macroporous low weight polypropylene mesh alone (group 1), with application of a film (group 2) or coating of a gel (group 3) of hyaluronic acid. Eight weeks after the procedure, a new laparotomy was realized to evaluate an adhesion score and prosthetic surfaces. A microscopic histological study of the host-tissue interface was also performed.Results :Group 1 (control group) had a mesh retraction rate of 29%. Groups 2 (p = 0.0238) and 3 (p = 0.0072) had significantly lower retraction rates, respectively 19.12% (film group) and 17% (gel group). The difference between the 3 groups was statistically significant (p = 0.0153). Post-operative adhesions were significantly less important in groups using hyaluronic acid. Group 1 had a significantly higher adherence score (30.40) than groups 2 (11.67, p = 0.0028) and 3 (11.19, p = 0.0013). Conjunctival colonization was less intense in the gel group, compared to the control and film groups (p = 0.0181).Conclusion and clinical perspectives :Our experimental study has shown that the prosthetic surface is protected in a statistically significant way when using a gel or film of hyaluronic acid. Mesh shrinkage, complicating surgery with synthetic polypropylene implant, could be prevented by the addition of this complement. This would prevent the formation of postoperative adhesions and fibrosis, which are conducive to contraction of the periprosthetic host tissue and leading to retraction of the reinforcing material. This data should be incorporated into a prosthetic safeguard strategy that preserves the quality as well as the duration of surgical repair while limiting post-operative pain.

RésuméLes lésions du cerveau sont un problème médical majeur, celui-ci possédant des ressources limitées pour la guérison. Les patients souffrent souvent des déficiences graves et durables, dégradant leur qualité de vie et imposant des couts importants. Des thérapies qui visent l'implantation des cellules souches neurales supportées par un biomatériau qui imite la matrice extracellulaire du cerveau sont en développement. L’ECM du cerveau a une teneur élevée en acide hyaluronique (HA). Ce glycosaminoglycane possède la biocompatibilité et l'activité biologique requises par les applications avec des cellules souches neurales.Nous avons développé des hydrogels à base de HA, possédant des propriétés mécaniques et des densités en peptide d’adhésion cellulaire (GRGDS) contrôlées, pour l'étude in vitro de la différenciation de cellules souches neurales en neurones. L'analyse de neurites en 3-D par microscopie biphotonique a montré une excroissance accrue et une densité élevée des neurites dans les hydrogels les plus élastiques (G '= 400 Pa), combinées avec l'existence d'un optimum dans l'extension des neurites en fonction de la densité des ligands dans le cas des hydrogels contenant des GRGDS. La croissance des neurites relève vraisemblablement d’une combinaison d’interactions adhésives cellule-HA, cellule-GRGDS, et cellule-molécules extracellulaires secrétées.Par la suite la dégradabilité enzymatique des hydrogels de HA a été étudiée. Les hydrogels de HA se dégradent sous l'effet de l'enzyme hyaluronidase suivant un modèle mono-exponentiel, ce qui correspond à une population homogène de chaînes de HA clivables. Les hydrogels avec des modules d'élasticité plus élevés, montrent des vitesses de dégradation enzymatique plus faibles. Le remplacement de l'agent de réticulation PEG-bis(thiol) pour un polymère HA-(SH)3 clivable par voie enzymatique conduit à une réduction du temps nécessaire à la dégradation complète des hydrogels.Dans un troisième temps, nous avons développé des gels de héparosane sans activité biologique qui pourraient révéler une meilleure compréhension du rôle joué par le HA dans la différentiation des NSCs et dans l’extension des neurites. Nous avons montré que le CD44 joue un rôle mesurable dans le processus d'adhésion des cellules MEF. Il existe d'autres procédés par lesquels ces cellules peuvent adhérer sur les hydrogels d’héparosane, cependant la force de ces interactions est plus faible. / AbstractDamage caused to the central nervous system (CNS) is a major medical concern. As the CNS has limited ability to regenerate its damaged cells, patients can suffer from serious and long-term disabilities and impairments, which put strains on public healthcare systems. Therapies that aim to implant neural stem cells together scaffolds that mimic the extracellular matrix of the brain are being developed. Hyaluronic acid is an important component of the brain ECM. This glycosaminoglycan possesses the required biocompatibility and bioactivity for use in neural stem cells applications.We have developed HA-based hydrogels with controlled mechanical properties and cell adhesion peptide (GRGDS) densities for the in vitro study of neural precursor cells’ differentiation into neurons. The analysis of neurite outgrowth in 3-D by two-photon microscopy showed an increased outgrowth and density of neurites in the softest hydrogels (G’ = 400 Pa), combined with the existence of an optimum in neurite outgrowth as a function of ligand density in the case of hydrogels containing GRGDS. Neurite outgrowth in these hydrogels most likely involves a combination of adhesive interactions between cell-HA, cell-GRGDS moieties, and cell-secreted extracellular molecules.The enzymatic degradability of HA hydrogels was then investigated. The HA hydrogels degrade under the effect of the Hyaluronidase enzyme following a mono-exponential model, corresponding to a homogenous population of cleavable HA polymer chains. Hydrogels with higher elastic moduli have progressively lower enzymatic degradation rates. The substitution of the PEG-bis(thiol) crosslinker by an enzymatically cleavable HA-(SH)3 polymer led to a reduction in the time required for the complete degradation of the hydrogels.Finally we developed heparosan hydrogels that are devoid of biological functions and thus provide better insight into the role of HA in NSCs differentiation and neurite outgrowth. We showed that CD44 plays a measurable role in the adhesion process of MEF cells. There are alternative processes through which cells can attach to the heparosan hydrogels however the strength of these adhesions is weaker. Heparosan is a viable biomaterial for hydrogel synthesis that does not interact with the CD44 receptor, resulting in lower cellular adhesions.

Au laboratoire, une méthode originale d'encapsulation par transacylation entre l'alginate de propylène-glycol (PGA) et une protéine a été mise au point. Cette méthode est basée sur la création de liaisons amides entre les fonctions amines libres de la protéine et les groupes esters du PGA dans une phase aqueuse émulsionnée (E/H) après alcalinisation. Les microparticules obtenues, stables, biocompatibles et biodégradables, sont potentiellement intéressantes pour la délivrance de substances actives en thérapeutique ou en cosmétique.Le premier objectif de ce travail est d'étudier l'influence des propriétés physicochimiques des deux biopolymères (protéine et PGA) et de leurs solutions, ainsi que l'effet des paramètres de préparation sur la réaction de transacylation et sur les propriétés des microparticules obtenues. Pour cela, la sérumalbumine humaine (HSA) a servi de protéine modèle et les microparticules ont été préparées dans différentes conditions physicochimiques puis caractérisées. Différents liens ont été établis entre les propriétés physicochimiques des solutions initiales des deux polymères et les propriétés fonctionnelles des microparticules obtenues.Le deuxième objectif est de remplacer le PGA, seul polysaccharide utilisable jusqu'à présent pour la microencapsulation par transacylation, par d'autres polysaccharides naturels, dans la préparation de microparticules. Etant donné ses propriétés intrinsèques limitantes, le remplacement du PGA par d'autres esters polysaccharidiques parait avantageux dans le domaine d'application des microparticules.Dans ce travail, le PGA a été remplacé par une série d'esters semi-synthétiques d'alginate puis par d'autres polysaccharides estérifiés naturels (pectines) ou semi-synthétiques (esters polypectiques et esters de l'acide hyaluronique). Les conditions optimales pour l'utilisation de chaque ester ont été alors déterminées. / In our laboratory, an original method of microencapsulation was developed, based on the use of a transacylation reaction, creating covalent bonds between proteins and propylene glycol alginate (PGA). The covalent bonds are created after alkalization of the aqueous phase of a W/O emulsion, without using bifunctional crosslinking reagent.The resulting microparticles, which are stable, biocompatible and biodegradable, have potential applications for the delivery of active compounds for therapeutics or cosmetics.The first aim of this work is to study the influence of the physicochemical properties of the two polymers (protein and PGA) and of their solutions, as well as the effect of the preparation parameters on the transacylation reaction and on microparticle characteristics. For this purpose, human serum albumin (HSA) was picked as a model protein and microparticles were prepared using several physicochemical conditions then characterized. Several relationships were established between the physicochemical properties of the initial solutions of the two polymers and the functional properties of the resulting microparticles.The second purpose is to replace the PGA, only polysaccharide used for microencapsulation by transacylation so far, by other natural polysaccharides in the preparation of microparticles. Given its limiting intrinsic properties, the replacement of PGA by other polysaccharidic esters seems advantageous in the field of microparticle applications.In this work, the PGA was successfully replaced by a series of semisynthetic alginate esters, and then by other polysaccharidic esters, either natural esters (pectin) or semisynthetic esters (polypectate esters and hyaluronate esters). The optimal conditions for the use of each ester were then determined.

La métastase et la chimiorésistance sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints d’un cancer. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant ces deux processus devient donc un domaine de recherche important pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ma thèse, je me concentre sur la compréhension du rôle du facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes 4E (eIF4E) dans l’invasion du cancer, et je décris un nouveau mécanisme de résistance que nous avons découvert en étudiant le développement de la résistance à un inhibiteur connu d’eIF4E, la ribavirine. eIF4E est un puissant oncogène qui est connu pour être élevé dans une multitude de cancers comprenant entre autres les sous-types M4 / M5 de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Il fonctionne dans la traduction et l'exportation nucléocytoplasmique d'ARNm en se liant à la coiffe m7G des ARNm possédant des codes USER spécifiques dans leur région UTR 5' et/ou 3'. En reconnaissant ces codes USER, le complexe dans lequel se trouve eIF4E régule de manière coordonnée l'expression de gènes essentiels à la croissance, à la prolifération et à la survie, et ainsi, eIF4E a été placée en tant que nœud central d'un régulon d'ARN régissant la prolifération. En analysant les voies dans lesquelles l’export est régulé de façon coordonnée par eIF4E et les effets physiologiques qui en découlent, j'ai trouvé un enrichissement de la voie biosynthétique de l'acide hyaluronique (HA) et de son principal récepteur CD44 qui sont des médiateurs clés connus des métastases cancéreuses. J’ai également démontré que l'élévation d’eIF4E modifie la surface des cellules cancéreuses en les recouvrant de protrusions riches en HA de type microvillus et enrichies d'armes de destruction métastatique. Heureusement, en dégradant le manteau HA ou en utilisant des inhibiteurs de CD44 en combinaison avec la ribavirine, nous pouvons alors nous défendre. Compte tenu de l'avantage prolifératif que confère la surexpression d’eIF4E, il est devenu un talon d'Achille attrayant pour le traitement de cancers ayant un niveau élevé d'eIF4E. En effet, lors d'un essai clinique de phase II parmi des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë M4 / M5 réfractaire et récidivante, la ribavirine a conduit au ciblage d'eIF4E et a donné lieu à des réponses cliniques significatives, incluant des réponses complètes ou partielles. Cependant, tel qu’attendu lors d’un traitement monothérapique, les patients ayant répondu finissent par développer une résistance au médicament. Mon analyse a révélé que cette résistance est due à un mécanisme nouveau caractérisé par l'élévation du facteur de transcription Sonic Hedgehog GLI1 qui conduit à la glucuronidation du médicament et donc à la perte de l'interaction entre la drogue et sa cible. Heureusement, ce mécanisme peut être inversé en utilisant des inhibiteurs de la voie Hedgehog. En conclusion, ces découvertes fournissent de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cellules cancéreuses agressives et résistantes. / Metastasis and chemoresistance are the leading cause of mortality among cancer patients. The discovery of molecular mechanisms governing these two processes is becoming an important area of research for the design of novel therapeutic strategies. In my thesis, I focus on understanding the role of the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) in cancer invasion and describe a novel mechanism of resistance that we discovered while studying the development of resistance to a known eIF4E inhibitor, ribavirin. eIF4E is a potent oncogene that is known to be elevated in a multitude of cancers including M4/M5 subtypes of acute myeloid leukemia (AML). It functions in mRNA translation and nucleocytoplasmic export by binding to the m7G cap of mRNAs possessing specific USER codes in their 5’ and/or 3’ UTRs. By recognizing these USER codes, eIF4E complex coordinately regulates the expression of genes essential for growth, proliferation and survival and as such has been placed as a central node of an RNA regulon governing proliferation. When analyzing which pathways have their export coordinately regulated by eIF4E and what physiological effects arise from it, I found an enrichment in the hyaluronic acid (HA) biosynthetic pathway as well as its major receptor CD44 which are known key mediators of cancer metastasis. I demonstrate that eIF4E elevation changes the surface of cancer cells sugar-coating them with HA-rich microvillus-like protrusions that are enriched with weapons of metastatic destruction. Luckily, through degrading the HA-coat or using inhibitors of CD44 in combination with ribavirin we can strike back. Given the proliferative advantage that eIF4E overexpression conveys, this rendered it as an attractive Achilles heel for the treatment of cancers where eIF4E levels are high. Indeed, in a phase II clinical trial in refractory and relapsed poor prognosis M4/M5 AML patients, ribavirin led to eIF4E targeting and resulted in significant clinical responses including complete and partial remissions. However, as it is expected for monotherapy treatment, all responding patients eventually developed resistance to the drug. My analysis revealed that resistance is due to a novel mechanism characterized by elevation of the Sonic Hedgehog transcription factor GLI1 which leads to drug glucuronidation and the subsequent loss of drug-to-target interaction. Fortunately, this mechanism can be reversed using Hedgehog pathway inhibitors. Taken together, these findings provide novel therapeutic venues for the treatment of aggressive and resistant cancer cells.

Les traitements des pathologies de l’oreille interne par voie locale se développent en alternative aux traitements par voie générale peu efficaces et responsables de nombreux effets secondaires. Dans ce travail, nous avons développé une formulation originale constituée de liposomes dispersés au sein d’un gel d’acide hyaluronique pour la libération prolongée d’un corticoïde dans l’oreille interne après administration locale dans l’oreille moyenne. D'abord, une étude physicochimique approfondie a permis d'identifier les paramètres clés de formulation qui ont un impact sur les propriétés du gel de liposomes en termes de caractéristiques rhéologiques, de seringabilité, de stabilité, de microstructure et enfin de diffusion des liposomes dans le gel. Ensuite, le gel de liposomes contenant la dexamethsone phosphate a été évalué in vivo chez le cobaye. L'administration locale du gel de liposomes a abouti à une libération prolongée du corticoïde dans l'oreille interne, sans aucun effet négatif sur la fonction auditive. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique de la formulation pour le traitement de la surdité secondaire à un traumatisme sonore et pour la préservation de l’audition durant l’implantation cochléaire a montré des résultats préliminaires très prometteurs. / Local, rather than systemic drug delivery is being developed to treat inner ear diseases. In this work, we developed an original drug delivery system based on liposomes dispersed within a hyaluronic acid gel for the sustained delivery of a corticoid to the inner ear after local administration in the middle ear. First, a thorough physicochemical study allowed to identify the key formulation parameters that impact the liposomal gel properties in terms of rheological behavior, syringeability, stability, microstructure and diffusion of liposomes within the gel. Then, the liposomal gel containing dexamethsone phosphate was evaluated in vivo in guinea pig. The local administration of the liposomal gel in the middle ear resulted in a sustained release of the corticoid in the inner ear without any negative effect on the hearing function. Promising preliminary data were obtained regarding the therapeutic efficacy of the formulation for hearing recovery after acoustic trauma and for hearing preservation during cochlear implantation.