Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2631.pdf: 1610800 bytes, checksum: 9f443d37247fb5fee135a70ec93a8142 (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / Immobilization and stabilization of enzymes increases their potential for use in industrial scale. D-hydantoinases (dihidropirimidina amidrohidrolase EC 3.5.2.2) catalyze the hydrolysis of D-hydantoins, generating the corresponding Ncarbamoil- D-amino acid and are used in the production of D-amino acids, including Dphenylglycine and D-p-hydroxyphenylglycine.This work reports studies for immobilization and stabilization of D-hydantoinase from Vigna angularis (E.C. 3.5.2.2.). Different strategies of multipoint covalent attachment in organic supports as chitosan and agarose were used. Different protocols of immobilization were employed, being the adittion of ions during the reduction step with the NaBH4 important to protect enzyme catalytic site. The active and stabilized derivatives were used to catalyze the hydrolysis of D-phenylhydantoin. The temperature and pH enzyme profiles showed maximum enzyme activity at 60ºC and pH 10,0. The subunits of the enzyme present molecular mass aroundt 50kDa. The enzyme immobilized in glyoxyl-agarose in the presence of Zn2+ ions during the reduction step, with immobilization time of 24h, was the best derivative, being 89-fold more stable than the soluble enzyme. The analysis of amino acids showed that a 50% of lysines residue present in the enzymes was covalently linked in glyoxyl-agarose. The enzyme immobilized in epoxy-chitosan-alginate was 20-fold more stable than the soluble enzyme. All the tested immobilization protocols led to 100% of immobilization yield. Soluble enzyme and the best glyoxyl and chitosan enzyme derivatives were used to catalyze the hydrolysis of D- phenylhydantoin , and led to the production of 99% of NCarbamoil- D-Phenylglycine after 3, 9 and 15h of reaction respectively. / A imobilização e estabilização de enzimas aumentam muito o potencial de uso industrial desses catalisadores. D-hidantoinases (dihidropirimidina amidrohidrolase EC 3.5.2.2) são enzimas que catalisam a hidrólise de hidantoínas, com abertura do anel, para o correspondente N-carbamoil-D-aminoácido e são usadas na produção de Daminoácidos, incluindo D-fenilglicina e D-p-hidroxifenilglicina. Este trabalho relata os estudos desenvolvidos para a imobilização e estabilização de D-hidantoinase de Vigna angularis (3.5.2.2.). Foram abordadas diferentes estratégias de imobilização multipontual em suportes orgânicos como quitosana e agarose. Diferentes protocolos de imobilização foram empregados, sendo adição de íons durante a redução com NaBH4 importante para proteção do centro catalítico da enzima. Os derivados ativos e estabilizados foram empregados na reação de hidrólise da fenilhidantoína. O estudo de temperatura e pH de máxima atividade da enzima foi 60°C e pH 10,0. As subunidades da enzima apresentam peso molecular, com valor próximo a 50kDa. A enzima imobilizada em glioxil-agarose na presença dos íons Zn2+ durante a etapa de redução, com tempo de imobilização de 24 h foi o derivado mais estável sendo 89 vezes mais estável que a enzima solúvel. A análise de aminoácidos mostrou que aproximadamente 50% dos resíduos de lisina presentes na enzima foram covalentemente ligados no derivado de glioxil-agarose. A enzima imobilizada em quitosana-alginato-epoxilado foi 20 vezes mais estável que a enzima solúvel. Todos os procedimentos de imobilização testados levaram a 100% de rendimento de imobilização. Enzima solúvel e os melhores derivados obtidos por imobilização em glioxil e quitosana foram usados na catálise da hidrólise de fenilhidantoína, produzindo 99% de N-Carbamoil-D-fenilglicina nos tempos de 3, 9 e 15 h, respectivamente.

Submitted by Caroline Periotto (carol@ufscar.br) on 2016-09-21T12:53:09Z No. of bitstreams: 1 TeseVV.pdf: 2152205 bytes, checksum: cbcb3bfba1aaf9c801ac47859a7bd77a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-23T18:25:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseVV.pdf: 2152205 bytes, checksum: cbcb3bfba1aaf9c801ac47859a7bd77a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-23T18:25:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseVV.pdf: 2152205 bytes, checksum: cbcb3bfba1aaf9c801ac47859a7bd77a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-23T18:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVV.pdf: 2152205 bytes, checksum: cbcb3bfba1aaf9c801ac47859a7bd77a (MD5) Previous issue date: 2016-05-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The use of lipases in large scale processes is limited due to their high cost. The reuse of the catalyst can contribute to make the enzymatic process more attractive. Hydrophobic supports are the mostly used for lipase immobilization, due to the mechanism of interfacial activation in the presence of hydrophobic interface. However, enzyme physically adsorbed to the support does not allow high operational stability. Therefore, in this work was evaluated the immobilization of commercial lipases from Candida antarctica type B (CALB), Thermomyces lanuginosus (LTL) e Pseudomonas fluorescens (LPF) on hybrid supports, that enable the hydrophobic adsorption, followed by covalent linkage between the adsorbed enzyme and the activated support. Silica was activated with trietoxy(octyl)silane (OCTES), (3-aminopropyl)trietoxysilane (APTES) e 3-glycidyloxypropyl)trimetoxysilane (GPTMS), aiming to produce supports with different functionality, as following: silica containing octyl groups (octyl-silica, OS), octyl and aldehyde groups (octyl-silica-glyoxyl and octyl-silicaaldehyde, OSGlx and OSGlu, respectively), and silica containing octyl and epoxy groups (octyl-silica-epoxy, OSEpx). From adsorption assays using the hydrophobic dye Rose of Bengal it was found that the modification of the silica with OCTES significantly increased the hydrophobicity of all the supports. Silica modified with OCTES groups showed to be 4 times more hydrophobic than non-modified silica. The support OSGlu yielded more active CALB biocatalyst, while OS yielded more active biocatalysts prepared with PFL and TLL. All the biocatalysts showed high stability in tert-butanol, specially CALB immobilized on OSGlu (OSGlu-CALB), maintaining 95% of its initial activity after 168 h at 60 ºC. CALB-OSGlu was successfully used in the synthesis of fructose oleate at 55ºC, yielding up to 70% conversion after 9 cycles of 6 hours, while the commercial biocatalyst Novozyme 435 retained around 53%. TLL and PFL were used in the synthesis of fructose oleate at 35ºC in presence of different amounts of water. All biocatalysts showed excellent performance in the ester synthesis when small amount of water (1%, v/v) was added to the organic phase, except for the lipases immobilized on silica modified with octyl and epoxy groups (OSEpx). Small amount of water increased around 5-times the ester productivity compared to reaction without water. Conversions around 70% were achieved at low temperature (35ºC) and short time of reaction (30 min). These results represent an advance in this field from of industrial point of view, where productivity is a relevant parameter for large-scale processes. Finally, porcine pancreatic lipase (PPL) immobilized on OS was used in the synthesis of xylose oleate and xylose caprilate, because it is the most inexpensive lipase commercially available. The results showed to be promising, because conversions around of 70% were achieved after 2 h of reaction at 60 oC. Generally, this work showed that the chemical modification of the silica surface with different active groups allowed the preparation of biocatalysts with different microenvironment, which exhibits an important role in the activity and stability of the immobilized enzymes. Besides, the biocatalysts prepared in this work showed excellent performance and operational stability in syntheses of sugar esters, showing to have potential for industrial application. / O uso de lipases em larga escala é limitado devido ao seu alto custo. O reuso do biocatalisador contribuiria para tornar o processo custo-efetivo. Suportes hidrofóbicos são os mais utilizados na imobilização de lipases, devido ao mecanismo de ativação interfacial na presença de interfaces hidrofóbicas. Entretanto, o fato da enzima ligar-se fisicamente ao suporte não garante maior estabilidade operacional. Portanto, nesse trabalho foi avaliada a imobilização de lipases comerciais de Candida antarctica tipo B (CALB), Thermomyces lanuginosus (LTL) e Pseudomonas fluorescens (LPF) em suportes híbridos, os quais possibilitam adsorção hidrofóbica, seguida de ligação covalente enzima-suporte. Sílica foi funcionalizada com trietoxi(octil)silano (OCTES), (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) e 3-glicidiloxipropil)trimetoxisilano (GPTMS), para produzir suportes com diferentes funcionalidades: sílica contendo grupos octil (octil-silica, OS), sílica contendo grupos octil e aldeídos (octil-sílica-glioxil e octil-sílica-glutaraldeído, OSGlx e OSGlu, respectivamente) e sílica contendo grupos octil e epóxi (octil-sílica-epóxi, OSEpx). A modificação da sílica com OCTES aumentou significativamente a hidrofobicidade de todos os suportes, observado a partir de ensaios de adsorção do corante hidrofóbico Rosa de Bengala. Sílica modificada com grupos OCTES apresentou hidrofobicidade cerca de quatro vezes superior à apresentada pela sílica não modificada. O suporte OSGlu rendeu biocatalisadores mais ativos para CALB, enquanto OS rendeu biocatalisadores mais ativos para LPF and LTL. Todos os biocatalisadores apresentaram boa estabilidade em terc-butanol, especialmente CALB imobilizada em OSGlu (CALB-OSGlu), retendo em torno de 95 % de sua atividade inicial após 168 h a 60 ºC. CALB-OSGlu foi usada com sucesso na síntese de oleato de frutose a 55ºC, mantendo mais de 70% de conversão após nove ciclos de 6 horas, enquanto para o biocatalisador comercial Novozyme 435 a conversão foi de aproximadamente 53%. LTL e LPF foram aplicados na síntese de oleato de frutose a 35ºC na presença de diferentes percentuais de água. Todos os biocatalisadores mostram excelente desempenho na síntese do éster adicionando-se uma pequena quantidade de água (1%, v/v) na fase orgânica, exceto para as enzimas imobilizadas em OSEpx. A presença de água contribuiu para aumentar em até cinco vezes a produtividade do éster em comparação à reação na ausência de água. Uma conversão de aproximadamente 70% foi alcançada à baixa temperatura (35ºC) e curto período de tempo (30 min). Esses resultados representam um avanço nesta área do ponto de vista industrial, onde a produtividade é um parâmetro relevante para processos em larga escala. Por fim, a lipase do pâncreas de porco (LPP) imobilizada em OS foi empregada na síntese de oleato de xilose e caprilato de xilose, devido ao seu menor custo dentre as lipases disponíveis comercialmente. Os resultados foram expressivos, obtendo-se uma conversão de aproximadamente 70% após 2 h de reação à 60ºC. De modo geral, esse trabalho mostrou que a modificação química da superfície da sílica com diferentes grupos ativos permitiu a preparação de biocatalisadores com diferentes microambientes, exercendo papel importante na atividade e estabilidade das lipases imobilizadas. Além disso, os biocatalisadores preparados neste trabalho apresentaram excelente desempenho e estabilidade operacional em reações de síntese de ésteres de açúcares, mostrando ter potencial para aplicação industrial.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4556.pdf: 4130912 bytes, checksum: ce52d6d080c273997017ee16e040fc29 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Agência Nacional de Petróleo / Lipases (triacyl-glycerol-hydrolases) are enzymes that catalyze hydrolysis, esterification and transesterification reactions. Lipase can be obtained from animals, microbial and vegetable sources. Nowadays, commercial lipases are majority produced from microbial sources. The use of these enzymes in industrial scale is still limited because of its high cost of production, favoring then, the search for new sources of lipases. This work aimed the utilization of oilseeds as lipase sources, aiming its use in the synthesis of fatty esters and in the hydrolysis of vegetable oils. To achieve this goal, the protein content of seeds of sunflower, castor bean and soybean was solubilized in buffered medium. The oilseeds were crushed in the presence of sodium phosphate buffer pH 7.0 (50 mM), followed by 11 hconstant stirring at room temperature. Under these conditions, the average productivities were ca. 237, 100 and 81 U/g of dried seeds. The solids were withdrawal from the crude extract by filtration, followed by centrifugation. The clarified crude extract was purified by ultrafiltration in 100 kDa cut-off polypropylene membrane. This procedure allows an activity recovery of 40, 35 and 11% for soybean, sunflower and castor bean, respectively. The purified lipases from soybean, sunflower and castor bean seeds were immobilized on hydrophobic support (silica-octyl) by interfacial adsorption, yielding biocatalysts with recovered activities of 683%, 413% and 1494%, respectively. SDS-PAGE electrophoresis and activity assays during the immobilization of the purified lipases on silica-octil suggested the presence of two lipase isoforms with molecular weights around of 20 and 30 kDa. Soluble soybean lipase exhibited optimum pH and temperature for hydrolysis of olive oil around 8.0 and 47 °C, respectively, while for immobilized soybean lipase (derivative) were 6.0 and 57°C, respectively. The halflife of the immobilized lipase at 50oC and pH 7 was around 8 h. The synthesis of butyl butyrate at 40oC catalyzed by immobilized lipase yield a conversion of approximately 15% after 9 h of reaction. The productivity of lipases from soybean seeds can be increased by germination of the seeds for 12 h, followed by extraction at 25oC for 12 h with salt solution (sodium phosphate buffer pH 7.0) at 100 mM concentration, supplemented with 1% (m/v) Tris-HCl. / Lipases (glicerol éster hidrolases, EC 3.1.1.3) catalisam reações de hidrólise, esterificação e transesterificação. As lipases podem ser obtidas de fontes animais, microbianas e vegetais, sendo que as de origem microbiana representam a grande maioria das lipases produzidas atualmente. No entanto, o uso dessas enzimas em escala industrial ainda é restrito devido ao alto custo de produção, favorecendo, assim, a busca por novas fontes de lipase. Este trabalho teve por objetivo a utilização de sementes de oleaginosas como fontes de lipases, visando sua aplicação na síntese de ésteres de ácidos graxos e hidrólise de óleos vegetais. Inicialmente sementes de soja, girassol e mamona foram trituradas em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7, seguida por agitação de 11 horas em temperatura ambiente. Sob essas condições, as produtividades médias foram de aproximadamente 237, 100 e 81 U/g de sementes secas. Os sólidos foram removidos do extrato enzimático bruto por filtração e o extrato enzimático foi clarificado por centrifugação. O extrato clarificado foi purificado por ultrafiltração em membrana de polipropileno com diâmetro de corte de 100 kDa. Esse procedimento permitiu a recuperação de 40, 35 e 11% da atividade inicialmente presente nos extratos enzimáticos brutos obtidos a partir de sementes de soja, girassol e mamona, respectivamente. Lipases de sementes de soja, girassol e mamona foram imobilizadas por adsorção hidrofóbica em sílica ativada com grupos octil (sílica-octil), obtendo-se biocatalisadores com atividades recuperadas de 683%, 413% e 1494%, respectivamente. Eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático da soja e ensaios de atividade durante a imobilização em sílica-octil sugeriram a presença de duas isoformas de lipases, com massas moleculares de aproximadamente 20 e 30 kDa. O pH e a temperatura de máximas atividades hidrolíticas do extrato enzimático da soja foram de 8,0 e 47ºC, respectivamente, enquanto para a enzima imobilizada foram de 6,0 e 57ºC, respectivamente. O tempo de meia-vida da enzima imobilizada a 50ºC e pH 7 foi de 8 h. Na síntese de butirato de butila, realizada a 40ºC, obteve-se uma conversão de aproximadamente 15% em 9 h de reação. A produtividade de lipases de sementes de soja pode ser aumentada por germinação das sementes por 12 h, seguida da extração a 25ºC por 12 h com solução salina (tampão fosfato de sódio, pH 7,0) com uma concentração de 100 mM e adição de Tris-HCl 1% (m/v).

Este trabalho teve por objetivo a preparação e caracterização de membranas de polissulfona (PSU) e a imobilização da enzima lipase nestes filmes, para a produção de membranas enantiosseletivas, visando utilização futura em separação de misturas quirais. Membranas de PSU foram preparadas pelo processo de inversão de fase, utilizando clorofórmio como solvente e água como agente coagulante para a inversão. Foram preparadas membranas com diferentes espessuras e os seguintes parâmetros para a inversão de fase foram definidos: concentração das soluções, tempo de evaporação do solvente, secagem e tratamento térmico. As membranas foram caracterizadas, visando a utilização em processo de eletrodiálise (ED) e imobilização da enzima lipase PS. Para a imobilização foi utilizado o glutaraldeído como agente bifuncional para ligação da enzima ao polímero. Na imobilização foram determinados os parâmetros cinéticos velocidade máxima (Vmáx) e constante de Michaelis-Menten (Km), a quantidade de enzima imobilizada nas membranas pelo método de Bradford e a atividade da enzima livre e imobilizada através da hidrólise do acetato de p-nitrofenila (PNPA). As membranas de PSU preparadas por inversão são hidrofóbicas, e apresentaram características de permesseletividade e capacidade de troca iônica inferiores às apresentadas pelas membranas comerciais Selemion®; CMT e CMV e resistência elétrica superior à destas membranas. O diâmetro dos poros nas membranas é menor que 100 nm. . A quantidade máxima de enzima imobilizada foi de 2,35 mg .g-1 de polímero em 18 horas de imobilização com um rendimento de 61,2%. A atividade da enzima decai após a imobilização, de 14780 U.g-1 (enzima livre) para 1184 U.g-1 (enzima imobilizada). / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-13T17:21:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jadison Fabricio de Souza.pdf: 3168334 bytes, checksum: ec62af877268ce2e7d357db5c8c5e372 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-13T17:21:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jadison Fabricio de Souza.pdf: 3168334 bytes, checksum: ec62af877268ce2e7d357db5c8c5e372 (MD5) / Preparation and characterization of polysulfone (PSU) membranes and the immobilization of lipase enzyme in these membranes to produce enantioselective membranes, in order to separate chiral compounds, is the subject of the present work. PSU membranes were prepared by phase inversion, using chloroform as solvent and water as nonsolvent. Membranes with different thickness were prepared and phase inversion parameters such as (solution concentrations, solvent evaporation time, drying and thermal treatment) were investigated. Membranes were characterized, in order to use them in electrodialysis process (ED) and in the lipase PS enzyme immobilization. For immobilization, bifunctional agent glutaraldehyde was used to link the enzyme to the polymer. On immobilization, the kinetic constants (Km e Vmax), the amount of immobilized enzyme with Bradford method and the activity of free and immobilized enzyme with p-nitrophenyl acetate (PNPA) hydrolysis, were determined. PSU membranes prepared by phase inversion are hydrophobic and, when compared with Selemion®; CMT and CMV commercial membranes, present lower permeselectivity, lower ion exchange capability and higher resistance. Membranes pore diameter is lower than 100 nm. The maximum amount of immobilized enzyme in the membranes reached 2.35 mg per gram of polymer after 18 hours of immobilization with a 61,2% yield . Enzyme activity decays after immobilization , from 14780 U.g-1 (free enzyme) to 1184 U.g-1 (immobilized enzyme).

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PabloCS.pdf: 513122 bytes, checksum: 78dbc24a28ad9d22efb06ffdb7409a3f (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / A ?-D-N-acetilglucosaminidase extracted and partially isolated from crustacean Artemia franciscana by ammonium sulfate precipitation and filtration gel chromatography Bio Gel A 1.5m. the enzyme was immobilized on ferromagnetic Dacron yielding a insoluble active derivative with 5.0 units/mg protein and 10.35% of the soluble enzyme activity. ?-D-N-acetilglucosaminidase-ferromagnetic Dacron was easily removed from the reaction mixture by a magnetic field, it was reused for ten times without loss in its activity. The ferromagnetic Dacron was better activated at pH 5.0. The particles visualized at scanning electron microscope (SEM) had presented different sizes, varying between 721nm and 100?m. Infra red confirmed immobilization on support, as showed by primary amino peaks at 1640 and 1560 cm-1 . The immobilize enzyme presented Km of 2.32 ? 0.48 mM and optimum temperature of 50?C. Bought presented the same thermal stable of the soluble enzyme and larger enzymatic activity at pH 5.5. ?-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagn?tico showed sensible for some ?ons as the silver (AgNO3), with loss of activity. The ?-D-N acetilglucosaminidase activity for mercury chloride (HgCl2), whom is one of the most toxic substance joined in nature, it was presented activity already diminished at 0,01mM and lost total activity at 4mM, indicating sensitivity for this type of metal. ?-D-N-acetilglucosaminidase-ferromagnetic Dacron showed degradative capacity on heparan sulfate, the enzyme still demonstrated degradative capacity on heparan sulphate, suggesting a possible application to produce fractions of this glycosaminoglycan / A ?-D-N-acetilglucosaminidase, extra?da e parcialmente isolada do crust?ceo Artemia franciscana atrav?s de precipita??o com sulfato de am?nio e cromatografia em gel filtra??o Bio Gel A 1.5m foi imobilizada em Dacron ferromagn?tico rendendo um derivado insol?vel ativo contendo 5,0 unid/mg de prote?na e retendo 10,35% da atividade da enzima sol?vel. A ?-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagn?tico foi facilmente removida do meio reacional com o aux?lio de um campo magn?tico e p?de ser reutilizada por dez vezes seguidas sem perda de atividade. O Dacron ferromagn?tico foi melhor ativado a pH 5,0 As part?culas visualizadas no microsc?pio eletr?nico de varredura (MEV) apresentaram diferentes tamanhos, variando entre 721nm e 100?m. O infra vermelho confirmou a imobiliza??o ao suporte, quando exibiu os picos de aminas prim?rias a 1640 e 1560 cm-1 . A enzima imobilizada apresentou Km aparente de 2,32 ? 0,48 mM e atividade ?tima a temperatura de 50?C. Ambos apresentaram praticamente a mesma estabilidade t?rmica da enzima sol?vel e maior atividade enzim?tica no pH 5,5. A ?-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagn?tico apresentou-se sens?vel a alguns ?ons como a prata (AgNO3), demonstrando perda de atividade. A atividade ?-D-N-acetilglucosaminidasica para cloreto de merc?rio (HgCl2), que ? uma das subst?ncias mais t?xicas encontradas na natureza, apresentou-se diminu?da j? a 0,01mM e perdeu a atividade total a 4mM, indicando sensibilidade a esse tipo de metal. A enzima ainda demonstrou capacidade degradativa sobre o heparan sulfato, sugerindo uma poss?vel aplica??o para produzir fragmentos desse glicosaminoglicano

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Banca: Aneli de Melo Barbosa / Resumo: O uso de células microbianas imobilizadas para aumentar a produção de metabólitos fúngicos em processos fermentativos tem mostrado altos rendimentos. Nesse trabalho foi avaliado pela primeira vez, a imobilização de células do Botryosphaeria rhodina, um fungo ligninolitico produtor constitutivo de lacases. Três suportes foram avaliados: Fibra Acrílica Fina (FAF); Espuma de Poliuretano Expandido (EPE); Espuma de Poliuretano Fibroso (EPF). O EPF foi o melhor suporte por ter mostrado uma imobilização mais homogenia das células. Um planejamento fatorial foi desenvolvido para otimizar a produção de lacases por células livres, na presença de álcool veratrílico (AV). A análise da superfície de resposta mostrou que 18mM como a melhor concentração de AV para a produção de lacases, usando-se 3 mL de homogeinato de células como inóculo (DOλ400nm 0.4-0.6) para 25 mL de meio de cultura em frascos de 125mL, a 180 rmp, durante 126 horas a 28ºC. O perfil de crescimento do fungo, associado a produção de lacase foram comparados na presença e na ausência de AV, usando-se células livres e células imobilizadas do B. rhodina. A imobilização aumentou aproximadamente 3 vezes a produção de lacases e manteve estável o nível de produção durante 6 reciclos. A imobilização de células do B. rhodina mostrou-se útil uma vez que economizou 72horas para atingir a maior produção de lacase, quando comparada com células livres e também aumentou a tolerância do fungo a concentrações mais altas de AV (500mM) / Abstract: The use of microbial immobilized cells to increase the production of fungal metabolites in fermentation processes has showed higher yields. This work evaluated by the first time, the immobilization of Botryosphaeria rhodina cells, a ligninolytic fungus that produces laccase. Three carriers were evaluated: acrylic fine fiber (FAF), expanded polyurethane foam (EPE), and fiber polyurethane foam (EPF). The EPF was the best carrier because showed a homogeneous immobilization cells. A factorial design was developed in order to optimize the laccase production by free cells in the presence of the laccase inducer veratryl alcohol (VA). The analysis by response surface answer showed 18 mM as the best VA concentration to produce laccase using 3 mL of a cell homogenate (ODλ400nm 0.4-0.6) as inoculum, to 25 mL of culture medium in shaked flasks (125 mL) at 180 rpm, during 126 hours at 28 °C. A growth profile for laccase and fungal biomass production were compared with and without VA using free and immobilized cells of B. rhodina. The cell immobilization increased approximately 3 folds the laccase production and maintained it stable during 6 consecutive recycles. The cell immobilization of B. rhodina showed to be useful once saved 72 hours to achieve the higher laccase production when compared to the one with free cells, and also increased the fungal cell tolerance at higher VA concentrations (500 mM) / Mestre

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Immobilized enzymes provide many advantages when compared to the usage of their free forms. Among these ones, remarkable advantages are the possibility of the biocatalyst reusability, easy separation at the end of the process, its usage in continuous way and the enhancement of its stability. This work was performed aiming the immobilization of the α-galactosidase enzyme from Aspergillus niger in ion exchange resin and the evaluation of its catalytic activity. Firstly, tests were performed in five different resins: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. According to the results, Duolite A-568 was chosen as the best support. Therefore, studies were done aiming the optimization of the immobilization process in this resin. Glutaraldehyde 1% (v/v) was used before the enzyme adsorption process and it enhanced the operational stability of the immobilized enzyme. Preliminary tests did not showed difference for the immobilization process at the temperatures of 25 and 40°C. A full factorial design and a central composite design were performed to study the best immobilization conditions varying the pH, the α-galactosidase concentration and the immobilization time. The results led to use the following immobilization conditions: pH 4.5; 15 g/L of α-galactosidase and 3 hours of immobilization. The temperature of maximum activity occurred at 60°C for both free and immobilized enzyme. The activation energy calculated by linear adjustment of Arrhenius equation was 5.66 kcal/mol for soluble α-galactosidase and 4.48 kcal/mol for immobilized α-galactosidase. The optimum pH range obtained for free enzyme was 4.0-5.0 and for immobilized enzyme it was 3.0-6.0. The immobilization process improved the α-galactosidase activity in alkaline pHs. Analysis of pH stability showed that both forms of enzyme were resistant for the pH ranges studied (3.5 to 7.5 for free and 3.0 to 8.0 for immobilized). However, the thermal stability of the biocatalyst immobilized in the support decreased. The kinetic studies without inhibition showed closed values of maximum speed (Vmax) for both enzyme forms (194.5 U for free and 187.7 U for immobilized). Although, the Michaelis-Menten constant (Km) of immobilized enzyme was higher than the free one (18.8 and 12.5 g/L, respectively). The hydrolysis reaction of raffinose was inhibited by the addition of the reaction products, sucrose and galactose, and the results of inhibition by galactose pointed for the competitive inhibition type. Then, storage tests of immobilized α-galactosidase showed that the enzyme maintained its activity even after 145 days when kept at the temperature of 4°C. / O uso de enzimas imobilizadas proporciona muitas vantagens em relação ao seu uso na forma livre. Dentre estas vantagens se destacam a possibilidade de reutilização do biocatalisador, a sua fácil separação ao final do processo, a utilização em modo contínuo e o aumento de sua estabilidade. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de imobilizar a enzima α-galactosidase de Aspergillus niger em resina de troca iônica e avaliar a sua atividade catalítica. Inicialmente, foram feitos testes preliminares de imobilização em 5 tipos de resinas: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. Pelos resultados obtidos, Duolite A-568 foi selecionada como melhor suporte e, portanto, estudos foram feitos para a otimização do processo de imobilização nesta resina. Glutaraldeído na concentração de 1% (v/v) foi utilizado anteriormente ao processo de adsorção da enzima e melhorou a estabilidade operacional da α-galactosidase imobilizada. Testes preliminares não indicaram diferença do processo de imobilização para temperaturas de 25 e 40°C. Realizou-se um planejamento fatorial completo e um planejamento composto central para estudar as melhores condições de imobilização variando-se o pH, concentração de α-galactosidase e tempo de imobilização. Os resultados obtidos levaram a utilizar as seguintes condições de imobilização: pH 4,5, concentração de α-galactosidase de 15 g/L e tempo de imobilização de 3 horas. A temperatura de máxima atividade enzimática foi 60°C tanto para a enzima livre quanto imobilizada. O valor da energia de ativação encontrado pelo ajuste linear da equação de Arrhenius foi de 5,66 kcal/mol para α-galactosidase solúvel e 4,48 kcal/mol para α-galactosidase imobilizada. A faixa de pH ótimo obtido para a enzima livre foi 4,0-6,0 e para a enzima imobilizada foi 3,0-6,0. O processo de imobilização melhorou a atividade da α-galactosidase para pHs mais alcalinos. A análise de resistência ao pH mostrou que ambas as formas da enzima foram resistentes para as faixas estudadas (3,5 a 7,5 para livre e 3,0 a 8,0 para imobilizada). No entanto, a resistência térmica do biocatalisador retido no suporte foi menor. O estudo cinético sem inibição apresentou valores de velocidade máxima (Vmáx) próximos para as duas formas da α-galactosidase (194,5 U para livre e 187,7 U para imobilizada), porém o Km da forma imobilizada foi maior que o da livre (18,8 g/L e 12, 5 g/L de rafinose, respectivamente). A reação de hidrólise da rafinose foi inibida pela adição dos produtos da reação, sacarose e galactose, sendo que os resultados de inibição por galactose apontam para o tipo de inibição competitiva Por fim, testes de estocagem da α-galactosidase imobilizada mostraram que a enzima manteve sua atividade mesmo após 145 dias mantida a temperatura de 4°C. / Mestre em Engenharia Química

Neste trabalho, apresentamos a eletrossíntese de um novo polímero condutor derivado do polipirrol (PPI) funcionalizado com um grupo carboxílico, o polipirrol-2-ácido carboxílico (PPI-2-COOH), e o seu uso como transdutor amperométrico em biossensores pelo uso da polifenol oxidase (PFO). São apresentadas todas as etapas de síntese e de caracterização dos filmes poliméricos em microeletrodos e o preparo e a resposta dos biossensores montados para a detecção de um composto fenólico. Nossos estudos sobre eletrossíntese, respostas eletroquímicas dos filmes, juntamente com resultados de microgravimetria e modelagem molecular de dímeros e trímeros derivados de PI-2-COOH, permitiram com que pudéssemos sugerir pela primeira vez um mecanismo de eletropolimerização deste monômero em meio não aquoso. Na caracterização dos filmes por espectroscopia in situ no UV-visível e infravermelho próximo foram observadas duas bandas idênticas às transições pi-pi* características dos filmes de PPI no seu estado neutro e de maior dopagem, confirmando a possibilidade de haver duas conformações na cadeia do PPI-2-COOH. Com a modelagem molecular de um oligômero formado a partir da oxidação do PI-2-COOH, verificamos que para cada 4 anéis heterocíclicos acoplados entre si na posição 4-5, um par de anéis se encontrava em um plano diferente do segundo par de anéis, mantendo este padrão em toda a extensão da cadeia polimérica. A resposta redox dos filmes nos permitiu observar a preferência do polímero pela entrada de cátions em sua estrutura. Nos espectros de FTIR também comprovamos a presença do grupo carboxílico na estrutura do polímero, o que permitiu uma imobilização enzimática por ligação covalente. A confecção de microeletrodos destinados para a análise por injeção em fluxo (FIA) nos possibilitou uma economia de reagentes, praticidade e boa reprodutibilidade das medidas. Os biossensores amperométricos obtidos pela imobilização covalente da PFO sobre filmes de PPI-2-COOH apresentaram um pH ótimo de funcionamento em 9,4 e um potencial ótimo de trabalho em +70 mV vs Ag/QRE. Finalizamos nosso trabalho obtendo as respostas amperométricas dos biossensores para a detecção de um composto fenólico, pirocatecol, com uma linearidade entre as concentrações de 5x10-4 até 2,5x10-2 mol/L. / In this work, we present the electrochemical synthesis of a new conducting polymer derived of polypyrrole (PPI) functionalized by carboxylic group, the polypyrrole-2-carboxylic acid, and its application as amperometric transducer in biosensor by use of polyphenol oxidase (PFO). All the steps of syntheses and characterization of the polymer film in microelectrodes and response of the biosensor build for detection of phenolic compost. Our study about electrosyntheses, electrochemical response of the films (PPI-2-COOH) together with microgravimetry result and the molecular modeling of dimer and trimer derived from PI-2-COOH allowed one to suggest, for the first time, the mechanism of electropolymerization of this monomer in non-aqueous medium. When the technique of in-situ ultraviolet-visible spectroscopy (UV-VIS in-situ) was observed two bands, identical to the transition pi-pi* which are characteristics of the PPI films on their neutral state and of bigger doping, confirming the possibility that there may be two conformations in the PPI-2-COOH chain. With the molecular modeling of an oligomer formed by PI-2-COOH oxidation, we verified that for each four heterocyclic ring coupled together in the position 4-5, there´s a pair of rings, maintaining this pattern in all the extension of the polymeric chain. The redox response through the electrochemical measurement we could observe in FTIR the polymer preference for the cations adsorption. On the FTIR measurements, we could also observe the presence of the carboxylic group in the polymers structure, which is needed for the enzymatic immobilization by covalent binding. The fabrication of the microelectrode destined to flow injection analysis (FIA), made possible not only to save a lot of reagents, but also demonstrated praticity in the experimental set up and good reproducibility of results. Hence, the obtaining of amperometric biosensor by covalent binding of PFO on the PPI-2-COOH film, presented good pH in 9.4 and great work potential in +70 mV vs Ag/AgCl. We finish the work with the amperometric response of the biosensor in the detection of pyrocatechol, forming a straight line between the concentrations of 5x10-4 to 2.5x10-2 mol/L.

Esta dissertação apresenta um estudo de diferentes metodologias de imobilização (fisissorção, quimissorção com carboxibenzaldeído e quimissorção com glutaraldeído) da lipase de Burkholderia cepacia em nanopartículas magnéticas e sua aplicação na resolução cinética de alcoóis secundários racêmicos. O método de imobilização por fisissorção resultou na imobilização de 0,21 mg de proteína em 20 mg de nanopartículas magnéticas. Para a mesma quantidade de nanopartículas magnéticas, o método de quimissorção com carboxibenzaldeído imobilizou 0,26 mg de proteína contra 0,28 mg de proteína pelo método de quimissorção com glutaraldeído, a melhor relação encontrada neste trabalho. A atividade enzimática foi avaliada na resolução cinética de alcoóis secundários racêmicos [(RS)-2-bromo-1-(fenil)etanol, (RS)-2-bromo-1-(4-nitrofenil)etanol, (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol e (RS)-1-(fenil)-1,2-etanodiol] via reação de transesterificação enantiosseletiva. O efeito de diferentes parâmetros reacionais para a resolução cinética foi estudado, como agente acilante, quantidade de substrato, solvente, quantidade de nanopartículas magnéticas (suporte), velocidade de agitação, tempo e temperatura reacionais. Os melhores parâmetros encontrados foram acetato de vinila como agente acilante, tolueno como solvente e sob agitação de 800 rpm. Observou-se que após 30 dias de estocagem da lipase imobilizada por fisissorção sua atividade foi mantida. Além disso, estudou-se a reciclagem da enzima imobilizada, durante a resolução cinética. A melhor temperatura e tempo reacional foram determinados para cada método de imobilização. A quimissorção com glutaraldeído foi o melhor método de imobilização para a reciclagem da enzima, pois durante 8 ciclos de resolução cinética a conversão (50 %) e a enantiosseletividade (>99 %) foram mantidas. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o processo de imobilização permite um aumento da estabilidade da enzima quando comparada com a enzima livre, permitindo sua reutilização por vários ciclos reacionais. / This dissertation describes studies about different immobilization methodologies (physisorption, chemisorption with carboxibenzaldehyde and chemisorption with glutaraldehyde) of the Burkholderia cepacia lipase on magnetic nanoparticles and its application in the enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcohols. The physisorption method immobilized 0.21 mg of protein per 20 mg of magnetic nanoparticles. Using the same amount of magnetic nanoparticles, the chemisorption method with carboxibenzaldehyde immobilized 0.26 mg of protein against 0.28 mg for the chemisorption with glutaraldehyde, the best result found in this work. The enzymatic activity was determined in the enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcohols [(RS)-2-bromo-1-(phenyl)ethanol, (RS)-2-bromo-1- (4-nitrophenyl)ethanol, (RS)-1-(4-nitrophenyl)ethanol and (RS</I<)-1-(phenyl)- 1,2-ethanodiol] via enantioselective transesterification reaction. The effect of several reaction parameters for the kinetic resolution was studied, such as acetyl donor, substrate concentration, solvent, amount of magnetic nanoparticles (support), agitation speed, reaction time and temperature. The best results were obtained using vinyl acetate as acetyl donor, toluene as solvent, and 800 rpm as agitation speed. Regarding the physisorption method, after 30 days as storing time the enzymatic activity remained the same. Besides, the reusability of immobilized lipase was evaluated. The best temperature and reaction time in the kinetic resolution were determined for each immobilization method. The chemisorption with glutaraldehyde was the best immobilization method for the enzyme reusability, because even after 8 cycles of the kinetic reaction, the conversion (50 %) and enantioselectivity (>99 %) remained the same. Based on these results, it is possible to conclude that the immobilization process increased the enzyme stability when compared to the free enzyme, allowing its reusability for many reaction cycles.

Probióticos são suplementos alimentares de microrganismos vivos com efeitos benéficos no hospedeiro animal pela melhora do balanço intestinal. Dentre os microrganismos considerados probióticos, somente aqueles microrganismos classificados como bactérias ácido lácticas (LAB) são considerados importantes em relação à alimentação. Cultivos de altas densidades de células são cada vez mais importantes do ponto de vista industrial para a obtenção de LABs, pois produtos adicionados com esses suplementos apresentam alto valor agregado. Este trabalho tem por objetivo a produção de Lactobacillus plantarum em cultivo submerso em biorreator, avaliação da sua resistência na forma livre e imobilizada frente às condições de armazenamento sob refrigeração e trânsito gastrointestinal e elaboração de produto fermentado com adição de probióticos. Inicialmente foram realizados experimentos para selecionar Lactobacillus que apresentassem alta produtividade de biomassa. Em seguida foram realizados experimentos para avaliar a utilização de soro de queijo como ingrediente base da formulação do meio de cultivo e sua suplementação com diferentes fontes de nitrogênio. Com o microrganismo selecionado, L. plantarum, realizou-se a seleção de variáveis através do delineamento experimental Plackett Burman (P-B). A otimização das condições de cultivo foi realizada utilizando um delineamento composto central rotacional (DCCR). Paralelamente, foram testadas a sobrevivência de L. plantarum em armazenamento sob refrigeração e à exposição a meios que simulem a passagem pelo aparelho digestivo. Estas avaliações foram realizadas comparativamente entre os microrganismos na forma livre e na forma microencapsulada utilizando como polímeros alginato de sódio e pectina e recobrimentos com alginato de sódio e quitosana. Os resultados mostraram que a temperatura, pH, taxa de aeração, concentração de lactose e peptona foram os parâmetros que mais influenciaram a produção de biomassa. O DCCR para temperatura e taxa de aeração mostraram que o máximo de produção de biomassa predita foi de 14,30 g L-1 de L. plantarum, nas condições otimizadas. No ponto central do DCCR, atingiu-se a produção de biomassa de L. plantarum de 10,2 g L-1, como taxa de conversão de 0,10 g de células g-1 de lactose e 1,08 g de ácido láctico g-1 lactose (m/m) com as seguintes condições de cultivos: 140 g L-1 de lactose; 15 g L-1 peptona; 5 g L-1 extrato de levedura; pH 5,2; velocidade de agitação de 200 rpm; 34 ºC e 3,5 vvm. O meio intestinal simulado não interferiu na viabilidade dos microrganismos em relação ao meio controle. Já o meio gástrico simulado diminui drasticamente a viabilidade dos microrganismos nas condições testadas não havendo diferença significativa entre os diferentes materiais imobilizantes utilizados e o controle sem imobilização. No armazenamento sob refrigeração houve aumento da viabilidade em relação às células não imobilizadas, sendo que os tratamentos em que houve menor perda de viabilidade foram imobilização em 4 % de pectina, 3 % de alginato de sódio recoberto com quitosana e mistura de 2 % de alginato de sódio e 2 % de pectina. Quando testada a viabilidade em iogurte de L. plantarum imobilizados em 3 % de alginato recoberto com quitosana houve perda de viabilidade de 0,55 ciclo logarítmico durante 38 dias de armazenamento. A cepa de L. plantarum estudada se mostra como um microrganismos potencial para utilização como probiótico em alimentos, uma vez que demonstrou alta produtividade de células e boa viabilidade frente às condições de estresse utilizadas. / Probiotics are live microorganisms feed supplement, which beneficially affects the host animal by improving its intestinal microbial balance. Among the microorganisms considered probiotics, only those strains classified as latic acid bacteria - LAB are considered of importance regarding to the nutritional effects. High cell density cultivations of LABs are important from the industrial viewpoint, because products added with this supplement are of high value. The aims of this work were to investigate the biomass production of Lactobacillus plantarum in submerged bioreactor cultures, evaluate the resistance of free and immobilized L. plantarum when submitted to refrigerated storage, the viability in simulated gastrointestinal juices and in yoghurt. Initially, experiments were performed to select Lactobacillus that showed high productivity of biomass. Further experiments were performed to evaluate the use of cheese whey as a basic ingredient in the formulation of the medium and its supplementation with different nitrogen sources. The selected microorganism, L. plantarum, was used for the selection of variables of the Plackett Burman (PB) design. The optimization of culture conditions was performed using a central composite rotational (CCD) design. In parallel, it was tested the survival of L. plantarum in refrigerated storage and exposure to media that simulated the passage through the digestive tract. These evaluations were performed comparatively between microorganisms in the free and microencapsulated form using as polymers sodium alginate and pectin, coated with sodium alginate or chitosan. Results have shown that temperature, pH, aeration rate, lactose, and peptone were the most influential over biomass formation. The CCD for temperature and aeration rate showed that the model predicted maximal biomass production of 14.30 g L-1 (dw) of L. plantarum under the optimized conditions. At central point of CCD, it was obtained a biomass production of 10.2 g L-1 (dw), with conversion rates of 0.10 g of cell g-1 lactose and 1.08 g lactic acid g-1 lactose (w/w), with the following conditions: 140 g L-1 of lactose; 15 g L-1 peptone; 5 g L-1 of yeast extract; pH 5.2; stirred agitation of 200 rpm; 34 ºC and 3.5 vvm. The simulated intestinal medium did not affect the viability of microorganisms in relation to the control medium. However, the simulated gastric medium drastically reduces the viability of microorganisms in the conditions tested with no significant difference between the different materials used and the control without immobilization. In refrigerated storage there was an increase in the viability compared to free microorganisms, and the treatments with lower loss of viability were those of 4% pectin, 3% sodium alginate coated with chitosan and a mixture of 2% alginate sodium and 2% pectin. When tested the viability in yogurt of L. plantarum immobilized in 3% alginate coated with chitosan, the viability loss was 0.55 log cycle during 38 days of storage. The strain of L. plantarum studied was shown as a potential organism for use as probiotics in food, since it has shown high yield and good cell viability in the face of stress conditions used.