Das Neuroblastom ist ein vom sympathischen Nervensystem ausgehender neuroektodermaler maligner Tumor des Kleinkindesalters. Bei über 50% der Neuroblastom-Ersterkrankungen liegt bereits das disseminierte Stadium 4 vor, das eine infauste Prognose hat. Eine wirksame Behandlung des Stadium 4 Neuroblastoms stellt deshalb nach wie vor eine der größten Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie dar: Die Gesamtüberlebensrate von 20-25% der Kinder, die an dieser bösartigen Krankheit leiden, konnte während der letzten zwei Jahrzehnte trotz neuer Chemotherapie-Protokolle nicht wesentlich verbessert werden. Aus diesem Grund gibt es zunehmend Bestrebungen sich um Therapiealternativen zu bemühen. In dieser Arbeit werden die derzeit möglichen immunologischen Strategien zur Behandlung des Neuroblastoms abgehandelt. / Neuroblastoma is a neuroectodermal malignancy of early childhood derived from sympathetic nervous tissue. At initial diagnosis over 50% of patients present with disseminated stage 4 disease which has a dismal prognosis. Effective treatment of patients with stage 4 neuroblastoma remains a major challenge in pediatric oncology. Despite novel therapeutic approaches including chemotherapy and autologous stem cell transplantation the overall survival rate of only 20-25% did not improve over the last two decades. Therefore, a lot of effort has been made to develop novel alternative therapies. This thesis summarizes possible immunotherapeutic strategies for the treatment of neuroblastoma.

Bei bhPIV3 handelt es sich um ein bovines Parainfluenzavirus Typ 3 (bPIV3), dessen Ober-flächenproteingene gegen jene des humanen Parainfluenzavirus Typ 3 (hPIV3) ausgetauscht wurden. Dieses ursprünglich als experimenteller Impfstoff gegen hPIV3 entwickelte Virus wurde darüber hinaus als Impfvektor zur Expression anderer viraler Antigene verwendet. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden die ersten bhPIV3-basierten Vektoren für nicht-virale Antigene hergestellt und in einem ersten Versuch evaluiert. Dazu wurden ein reverses Genetiksystem zur Herstellung rekombinanter bhPIV3 in einem neuen Labor aufgebaut und fünf neue rekombinante Viren erhalten, welche zusätzlich Antigene des Mycobacterium tuberculosis (M. tb.) exprimieren. Balb/c-Mäuse wurden intranasal mit den bhPIV3-Vektoren infiziert, so dass sowohl deren Replikation als auch der induzierte protektive Effekt gegenüber M. tb.-Neuinfektionen getestet werden konnte. In einem ersten Versuch zeigte sich, dass eine Immunisierung mit den rekombinanten Viren allein keine Schutzwirkung entfaltet. Als Boost-Impfung nach Gabe des Bacille Calmette Guérin (BCG) zeigten einige Vektoren jedoch einen signifikanten protektiven Effekt. In einem Folgeversuch konnten diese Beobachtungen jedoch bislang nicht bestätigt werden, so dass weitere Versuche durchzuführen sind, bevor eine endgültige Aussage bezüglich des hervorgerufenen Schutzeffektes getroffen werden kann. In einem weiteren Tierversuch wurde gezeigt, dass die Baumwollratte ein Tiermodell darstellt, in dem bhPIV3 erheblich schlechter repliziert als hPIV3. Trotz der eingeschränkten Replikation induzierte bhPIV3 neutralisierende Antikörpertiter gegen hPIV3, die mit durch hPIV3 induzierten Titern vergleichbar waren. Mit Hilfe eines neu generierten rekombinanten Virus, welches das grün fluoreszierende Protein EGFP exprimiert, konnte ein Weg aufgewiesen werden, die Bestimmung neutralisierender Antikörpertiter deutlich zu vereinfachen. / The initial objective of this project was to establish a reverse genetic system for generation of recombinant bovine/human parainfluenza virus type 3 (bhPIV3), a bovine PIV3 (bPIV3) in which the bhPIV3 glycoprotein genes are replaced by their counterparts of human PIV3 (hPIV3). In addition, methods needed to characterise virus infectivity, genetic integrity and relevant in vitro phenotypes were established. The reverse genetics system was used to add individual mycobacterium tuberculosis (M. tb.) open reading frames (ORFs) as supernumerary gene units to the bhPIV3 genome and to rescue bhPIV3 vectors that expressed M. tb. antigens. In addition, a similar vector expressing the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was constructed. Following the in vitro characterization of the derived viral vectors, the M. tb. vectors were evaluated for their efficacy to protect against M. tb. aerosole challenge in the Balb/c mouse model for tuberculosis. Although, in a single experiment, vaccination with bhPIV3 vectors alone did not confer any protection against M. tb. challenge, a boost with selected bhPIV3 vectors after Bacille Calmette Guérin (BCG) priming was successful in conferring protective efficacy against M. tb. challenge. A repeat of this challenge study could not confirm the initial observation, and further experiments are needed to determine whether the observed protection can be reliably reproduced. Evaluation of the bhPIV3 vectors in the cotton rat model showed that this small animal model is suitable to evaluate the attenuation phenotype of bhPIV3 compared to human parainfluenza virus type 3 (hPIV3). Although replication of bhPIV3 was highly restricted compared to hPIV3, hPIV3 neutralizing antibody titers induced by bhPIV3 infection were similar to those induced by hPIV3 infection. Studies with bhPIV3 expressing EGFP led to a new fluorescence based assay to determine hPIV3 neutralizing antibody titers. This assay could save time and resources in hPIV3 serology.

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Immunotherapy for Alzheimer\''s disease has emerged as a promising approach for clearing pathological tau protein conformers. To explore this kind of treatment we tested an active immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments in P301L tangle model mice that develop neuronal tau aggregates as observed in frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease. We found that an immunization reduces neurodegeneration in α-motor neurons in the spinal cord and slows progression of the tangle-related behavioral phenotype. Performance on behavioral assays correlated with tau pathology at the corresponding spinal cord level. Interestingly, a slowed progression of these tauopathy related characteristics were only seen in mice that received a specific immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments, not in animals that received a non-specific activation of the immune system. An immunization witch pseudo-phosphorylated tau fragments may be a valuable therapeutic option in targeting one of the major hallmarks of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung und Charakterisierung der ersten Antikörper gegen Triacetontriperoxid (TATP), einem hoch empfindlichen und unkonventionellen (nicht-kommerziellen) Initialsprengstoff. Entscheidend dafür war die Synthese eines TATP-imitierenden Haptens, welches die typische nonagonale Struktur des TATP mit seinen drei Peroxid- und sechs Methylgruppen nahezu perfekt nachbildet, aber den Vorzug einer zusätzlichen Carboxygruppe zur kovalenten Kopplung an Proteine aufweist. Dadurch konnte das TATP-Hapten an Rinderserumalbumin (BSA) gebunden werden, um ein immunogenes Konjugat zu erzeugen, welches die erfolgreiche Immunisierung zweier Säugetierarten, Maus und Kaninchen, ermöglichte. Der Verlauf der In vivo-Immunisierungen wurde durch die Analyse der Tierseren in regelmäßigen Abständen mittels enzymgekoppeltem Immunoassay (ELISA) verfolgt. Die polyklonalen Antikörper beider Spezies waren ungewöhnlich selektiv gegenüber TATP. Jedoch unterschied sich die Affinität der Antikörper der zwei Spezies um das 5000-fache, wobei die Kaninchenseren den Mausseren überlegen waren. Entsprechend war auch die mit Kaninchenserum erreichbare TATP-Nachweisgrenze von 0.01 µg/L deutlich besser im Vergleich zu 50 µg/L, die mit Mausserum erzielt wurden. Der Messbereich des TATP-ELISA mit Kaninchenserum deckte zudem mehr als vier Zehnerpotenzen ab, wie mittels Präzisionsprofil bestimmt wurde. Die erhaltenen TATP-Antikörper aus Kaninchen stehen damit Anwendungen in Nachweissystemen für die sehr empfindliche Detektion von TATP zur Verfügung, die u. a. in sicherheitsrelevanten Bereichen zum Einsatz kommen könnten. Als erste Anwendung wurde ein TATP-ELISA realisiert, der im Rahmen dieser Arbeit ausführlich optimiert wurde. Außerdem wurden erste Schritte zur Entwicklung eines TATP-Schnelltests (LFA) unternommen. Weitere Biosensoren auf Grundlage der neu entwickelten TATP-Antikörper sind denkbar. / The present work decribes the production and characterization of the first antibodies against triacetone triperoxide (TATP), a highly sensitive and improvised (non-commercial) primary explosive. Crucial to this work was the synthesis of a TATP-related hapten that mimics almost perfectly the typical nonagonal structure of TATP with its three peroxide and six methyl groups. Advantageously, it has an additional carboxylic acid group, which provides a conjugation site for covalent attachment to proteins. Thus, the TATP hapten could be linked to bovine serum albumin (BSA) to produce an immunogenic conjugate, allowing the successful immunization of two different mammalian species, mouse and rabbit. The in vivo immunization progress was followed by periodically analyzing the animals’ sera using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The polyclonal antibodies of both species were remarkably selective to TATP. The affinity of these TATP-antibodies was, however, different between the two species, with the rabbit sera showing an affinity about 5000-fold superior than the murine one. Consequently, the TATP detection limit of 0.01 µg/L was considerably better using the sera from rabbit in contrast to 50 µg/L when mouse serum was used. The working range of the TATP-ELISA with rabbit sera covers more than four decades, calculated from a precision profile. The obtained TATP antibodies from rabbit are now available for applications in highly sensitive detection systems for TATP, which could be employed, among others, in security-relevant areas. The first application was the realization of a TATP-ELISA, which was extensively optimized within the course of this work. Furthermore, the first steps towards the development of a lateral flow assay (LFA) targeting TATP were taken, making conceivable further biosensor platforms based on the newly developed TATP antibodies.

Das Humane Immundefizienzvirus (HIV) ist der Erreger von AIDS und als Zoonose von den Schimpansen (HIV-1) bzw. den Rauchmangaben (HIV-2) auf die menschliche Population übergesprungen. Diese Primatenspezies sind die natürlichen Wirte für die simianen verwand-ten Viren SIVcpz bzw. SIVsm. Die nicht-natürlichen Virus-Wirt-Beziehungen der Immundefizienzviren resultieren in einem pathogenen Verlauf, wie HIV im Menschen und SIVmac in Rhesusmakaken. Die natürlichen Wirte Rauchmangaben, Schimpansen, Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM) und viele mehr entwickeln hingegen kein simianes AIDS. Dies erfolgt trotz lebenslanger Infektion mit SIV und einer zur HIV-Infektion im Menschen äquivalenten Viruslast. Die natürlichen Wirte weisen darüber hinaus keine Immunantwort gegen das virale Kernprotein Gag (gruppen-spezifisches Antigen) auf, was ein früh und zahlreich gebildetes Protein während der Virusreplikation ist. Die fehlende humorale Immunantwort könnte die natürlichen Wirte vor Aktivierung des Immunsystems und dadurch auch vor sAIDS bewahren. Frühere Versuche in AGM mit injiziertem SIVagmGag-Protein zeigten zwar, dass die Induktion einer humoralen Immunantwort gegen SIVagmGag möglich ist, diese aber schon nach kurzer Zeit wieder absinkt. Des Weiteren bildete sich durch Infektion mit SIVagm in den Tieren keine anamnestische Immunantwort heraus, die für die Erkennung von gleichen Epitopen maßgeblich ist. Es scheint ein Unterschied in der Erkennung von exogenem injiziertem SIVagmGag-Protein zu endogenem, durch das Virus selbst gebildetem, Protein in den AGM zu bestehen. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Immunisierung mit SIVagmGag-DNA unter Umgehung des Unterschieds in der Proteinprozessierung eine anamnestische Immunantwort in den AGM induziert. Um diese Hypothese zu testen und die Gag-Immunreaktion in Abwesenheit anderer viraler Gene bezüglich der Pathogenität zu evaluieren, wurden codonoptimierte SIVagmGag- und SIVmacGag-DNA Immunisierungsvektoren generiert. Die Proteinexpression wurde in vitro und die Immunogenität in Balb/c und C57Bl/6 Mäusen getestet. Jeweils eine Gruppe von vier AGM erhielt bioballistisch SIVagmGag-DNA bzw. SIVmacGag-DNA. Als Kontrollen dienten mit codonoptimierter DNA immunisierte Rhesusmakaken sowie mit Leervektor immunisierte Primaten beider Spezies. Als Kostimulanz wurde zusätzlich jeweils speziesspezifische gmcsf DNA verwendet. Im Gegensatz zu den Rhesusmakaken konnte in den AGM durch DNA-Immunisierung keine zelluläre und nur eine schwache, transiente humorale anamnestische Immunantwort nach Infektion induziert werden, obwohl beide Gag-Proteine endogen produziert wurden. Daher kann die fehlende anamnestische Immunantwort der AGM nach Immunisierung mit Gag-Protein vermutlich nicht auf Unterschiede in der Proteinprozessierung und -erkennung (endogen versus exogen) zurückgeführt werden. Die Ergebnisse dieser Studie deuten an, dass während der Infektion dieses natürlichen Wirtes eine aktive Unterdrückung der anti-Gag-Antikörperantwort stattfindet, möglicherweise induziert durch eine Anergie in Gag-spezifischen T-Helferzellen. / The causative agents of AIDS, the human immunodeficiency viruses (HIV-1 and HIV-2), were transmitted zoonotically to the human population from the natural hosts of the related simian immunodeficiency viruses SIVcpz (chimpanzees) and SIVsm (sooty mangabeys), respectively. In contrast to the outcome of infections in non-natural hosts (e.g. HIV in humans, SIVmac in rhesus macaques), the natural hosts of SIV do not develop simian AIDS-like symptoms despite life-long infection with virus loads matching those seen in HIV-infected humans. Many such natural host primates infected with SIV, such as SIVagm-infected African green monkeys (AGMs), fail to mount an antibody response to the intact viral core protein Gag (group-specific antigen), a protein produced extensively during infection. It has been postulated that this lack of an immune response to Gag could protect the natural hosts from immunopathological effects and therefore from simian AIDS. Previous studies in AGMs indicated that Gag protein produced endogenously during infection is ''seen'' by the immune system differently than that introduced exogenously by protein immunisation, possibly through differences in processing or through specific tolerance at the T-cell level. To address these possibilities, primate studies were performed in which the responses in the natural and non-natural hosts to endogenously produced Gag protein in the absence of other viral genes were compared and the influence of such endogenous priming on the immune response to infection was evaluated. This was achieved by bioballistic immunisation of AGMs and rhesus macaques with codon-optimised DNA coding for SIVagm or SIVmac Gag protein delivered together with DNA coding for the species-specific GM-CSF cytokine. Prior to the primate studies, the DNA constructs were evaluated in BALB/c and C57Bl/6 mice for immunogenicity and protein expression. In contrast to the rhesus macaques, SIVagmGag DNA immunisation of African green mon-keys generally failed to prime for an anamnestic cellular immune response and primed for only a weak, transient anamnestic humoral response to the protein upon infection, despite the proteins resulting from both immunisation and infection being produced endogenously. Differences in protein processing and recognition (endogenous versus exogenous) do not therefore appear to account for the lack of priming for an anamnestic immune response seen using a protein immunogen. Rather, the results seem to indicate that an active suppression of the anti-Gag immune response may occur during infection of this natural host of SIV, possibly by the induction of anergy in Gag-specific Th cells.

Die vorsätzliche Freisetzung von Variola Virus (VARV) und schwere Erkrankungen des Menschen durch zoonotische Affen- (MPXV) und Kuh- (CPXV) pocken Viren stellen nach wie vor eine Bedrohung für die Bevölkerung dar. Klassische Pockenimpfstoffe bergen die Gefahr einer schweren Erkrankung. Deshalb ist die Entwicklung neuer Impfstoffe und Therapeutika von entscheidender Bedeutung. Deren Wirksamkeit und Sicherheit muss zunächst in verschiedenen Tiermodellen bewiesen werden. Existierende Makakken-Primatenmodelle leiden unter sehr artifiziellen Bedingungen der letalen Krankheitsinduktion durch VARV oder MPXV. Aus diesem Grund wurde das Calpox Virus/Krallenaffen-modell etabliert, welches auf einem CPXV aus natürlich infizierten Neuweltaffen (Marmosets) basiert. Das neue Modell hat drei wesentliche Vorteile: Die Arbeit mit Calpox Virus kann unter Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden und ist folglich einfacher in der Handhabung. 2. Die intranasale (i.n.) Infektion von Marmosets (Krallenaffen; Callithrix jacchus) spiegelt den natürlichen Infektionsweg von VARV wieder. Infizierte Affen entwickelten Pocken ähnliche Symptome und verstarben innerhalb von 2-3 Tagen nach Auftreten erster Symptome. Hohe Viruslasten wurden im Blut, Speichel und allen untersuchten Organen nachgewiesen. 3. Die i.n. Titration des Calpox Virus ergab eine 50 % Affen-Infektions-Dosis (MID50) von 8.3x102 pfu. Diese ist um den Faktor 10000 niedriger als in anderen Pocken-Primatenmodellen. Neun bis zehn Wochen nach einer Immunisierung mit dem Lister-Elstree Impfstoff waren alle Krallenaffen gegen eine letale Dosis des Calpox Virus (10 MID50) geschützt. Damit konnte der Nutzen des Calpox Virus/Krallenaffen-modells für die Erforschung neuer Impfstoffe gezeigt werden. Das Calpox Virus/Krallenaffen-modell überwindet wesentliche Nachteile bestehender Primatenmodelle und ist somit ein geeignetes Model für die Evaluierung von neuen Impfstoffen, Impfstrategien und antiviralen Therapien. / The intentional re-introduction of Variola virus (VARV), the agents of smallpox, into the human population remains of concern today. Moreover, zoonotic infections with Cowpox (CPXV) and Monkeypox virus (MPXV) cause severe diseases in humans. Smallpox vaccines presently available can have severe adverse effects that are no longer acceptable. The efficacy and safety of new vaccines and antivirals have to be demonstrated by different animal models. The existing primate models, using VARV and MPXV, need very high viral doses that have to be applied intravenously to induce a lethal infection in macaque monkeys. To overcome these drawbacks, the main objective of this study was to develop a primate model in which a smallpox-like disease could be induced by a CPXV virus designated calpox virus which was isolated from a lethal orthopox virus (OPV) outbreak in New World monkeys (marmosets). The new non-human primate model has three major advantages: 1. Working with calpox virus is less challenging and can be done under bio-safety-level two. 2. Mimicking the natural route of VARV infection, intranasally infected marmosets (Callithrix jacchus) reproducibly developed clinical symptoms of an OPV infection and died within two to three days after onset of the first symptoms. High viral loads of calpox virus were detected in blood, saliva and all analyzed organs. 3. Intranasal titration of the virus resulted in a 50 % monkey infectious dose (MID50) of 8.3x102 pfu, a lethal infectious dose 10,000 lower than those used in any other primate model. Moreover, we showed the aptitude of the primate model for the testing of new vaccines since nine to ten weeks after immunization with Vaccinia virus Lister-Elstree marmosets were completely protected against intranasal challenge with 10 MID50 of calpox virus. As the calpox virus/marmoset model overcomes major limitations of current primate models it is suitable to evaluate new vaccines, new vaccination strategies and antiviral therapies.

Chitinasen sind wichtigen Moleküle im Lebenszyklus parasitischer Fadenwürmer und bedeutende Medikamenten- und Impfstoffziele. Hier wurden drei Chitinasesequenzen (I, II und III) durch Charakterisierung von 9 Klonen aus einer Genbank von Acanthocheilonema viteae gefunden. Die Anzahl der drei sehr homologen Chitinasegene wurde durch Southern-Blot bestätigt. Die größten Unterschiede sind in den Exons zu finden, die die Serin-Threonin-reiche Domäne der Chitinasen codieren. Diese Domäne ist in Sequenz III ca. 10fach länger als in Sequenz I. Sequenz I und III haben Eigenschaften eines transkribierten Genes: ein Startcodon, ein offener Leserahmen, ein Stopcodon und ein Polyadenylierungssignal. Sequenz II fehlt das erste Exon mit dem Startcodon. Bei Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek adulter A. viteae Würmer bzw. L3 Stadien, sowie durch Reverser Transkriptase-PCR (RT-PCR) wurden in den Mikrofilarien, L3 und L4 Transkripte für Gen I gefunden, jedoch nicht für Gen III. Das N-terminale Fragment der A. viteae-Chitinase wurde in ein Expressionsplasmid ligiert und in E. coli exprimiert. Ungefähr 80 % der exprimierten Chitinase lagen in Einschluss-Körpern vor. Dieser unlösliche Anteil konnte unter denaturierenden, der lösliche Anteil unter nativen Bedingungen aufgereinigt werden. Die aus den Einschluss-Körpern aufgereinigte Chitinase zeigte im Vergleich zur löslichen Chitinase eine 13fach verminderte Aktivität. Vom aktiven Zentrum der Chitinase wurden Peptide synthetisiert und parallel mit Chitinase aus den Einschluss-Körpern für Vakzinierungsexperimente im A. viteae / Meriones unguiculatus-Filarien-Modell genutzt. Die Reduzierung der Wurmlast um 29 % nach einer Immunisierung mit rekombinantem Protein zeigte eine tendenziell schützende Kapazität des Proteins. In zwei unabhängigen Experimenten konnte nach Immunisierung mit zwei synthetischen Peptiden (P1 und P2) eine bedeutende Reduktion der Wurmlast beobachtet werden. In der P1-Gruppe gab es eine gleichmäßige Reduktion der Mf-Last, die nur im zweiten Experiment signifikant war (39 %, p > 0,05 und 45 %, p < 0,05). In der P2-Gruppe konnte in einem von zwei Experimenten eine signifikante Reduktion der Mf-Last erzielt werden (75 %, p < 0,05). Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß Filarien-Chitinasen potenzielle Ziele für Impfstoffe sind. / Chitinases are enzymes that break down chitin to its monomers. They are important molecules in the life cycle of parasitic nematodes representing important drug and vaccine targets. Here, three chitinase sequences (I, II and III) were obtained by characterising nine clones from a genomic library of Acanthocheilonema viteae. Southern blots confirmed the existence of three chitinase genes in A. viteae. The organisation of all three genomic sequences is similar, with the greatest difference occurring in exons encoding the serine-threonine rich domain of chitinases: this domain is about ten times larger in sequence III compared to I, but is absent in sequence II. Sequence I and III had features of regularly transcribed genes: start ATG, open reading frame, stop codon and polyadenylation signal. Sequence II lacked the first exon with start ATG. Screening of cDNA libraries from adult female A. viteae worms and L3 (third-stage larvae), as well as reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ! showed transcripts in uterine microfilariae, L3 and L4 (fourth-stage larvae) for gene I only. The N-terminal fragment of A. viteae chitinase was cloned into an expression vector and expressed in Escherichia coli. About 80% of the expressed chitinase were found in inclusion bodies and were purified under denaturing conditions. The soluble fraction was about 20% and could be purified under native conditions. Chitinase purified from inclusion bodies was 13-fold less active compared to soluble chitinase. Synthetic peptides (P1 and P2) were designed from the active site of A. viteae chitinase, and used in parallel with chitinase from inclusion bodies in vaccination experiments using the A. viteae / Meriones unguiculatus filariasis model. Vaccination with recombinant protein led to a 29 % significant reduction in adult worm burden in a single experiment. Vaccination with P1 and P2 led to an overall non significant reduction in adult worm burden in two independent experiments. In the P1 group, there was a consistent reduction (39%, p>0.05 and 45%, p

Der Einzeller Eimeria tenella zählt zu den hochpathogenen Parasiten des Haushuhns und ist Verursacher der Blinddarm-Kokzidiose, eine Erkrankung, die zu hohen ökonomischen Belastungen in der Geflügelindustrie führt. Zur Zeit existiert noch kein Impfstoff, der auf Basis von einzelnen Antigenen wirksam ist. Insbesondere die Identifizierung und Charakterisierung von sekretorischen Proteinen, welche an der Parasit-Wirtszell-Interaktion beteiligt sind, könnte einen Beitrag zur Entwicklung einer Immunprophylaxe darstellen. Ziel dieser Arbeit war es, sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren und ausgewählte cDNA-Sequenzen in DNA-Immunisierungsstudien zu überprüfen. Um ein DNA-Immunisierungsprotokoll für Hühner zu erarbeiten, wurden die cDNAs von drei schon bekannten E. tenella-Antigenen alleine oder in Fusion zur cDNA des stabilisierenden enhanced green fluorescence protein (EGFP) in zwei unterschiedliche DNA-Immunisierungsvektoren (pCDNA3, pVR1012) kloniert. Die Überprüfung der Serokonversion zeigte, dass nach DNA-Immunisierung von Hühnern mit beiden Vektoren bzw. mit und ohne EGFP-Fusion vergleichbare Immunantworten induziert wurden. D.h. mit dem etablierten DNA-Immunisierungsprotokoll konnte eine Expression heterologer (Eimerien) Gene im Huhn erzielt werden. Um neue sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren wurden bioinformatische und experimentelle Methoden eingesetzt. Über die bioinformatischen Analysen wurden aus E. tenella-expressed sequence tag (EST)-Datenbanken 54 putativ sekretierte E. tenella-Sequenzen extrahiert für die aufgrund ihrer beschriebenen Funktion und Lokalisierung eine Beteiligung an der Wirts-Parasit-Interaktion abgeleitet wurde. Mittels funktioneller Komplementierung in Hefen konnten aus einer E. tenella-Sporozoiten-cDNA-Bank 25 sekretorische Sequenzen identifiziert werden. Die cDNA-Sequenzen von 13 neu identifizierten sekretorischen Proteinen wurden in DNA-Immunisierungsstudien überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Methoden geeignet sind, um sekretorische Proteine von E. tenella zu identifizieren. Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit, sollten jedoch weitere verbesserte Immunisierungsprotokolle erarbeitet werden, um die immunprotektive Wirkung der isolierten Kandidaten-Antigene von E. tenella in Hühnern zu überprüfen. Wie die vorliegende Arbeit bestätigt, eignet sich die Methode der DNA-Immunisierung vermutlich als Grundlage solcher Verfahren, wobei zukünftig die Induktion der essentiellen intestinalen Immunantwort im Vordergrund stehen sollte. / The protozoan parasite Eimeria tenella is highly pathogenic in chickens and causes caecal coccidosis that contribute to high economic losses in poultry farming. At the moment no vaccine based on a single antigen is available. The identification and characterization of proteins that are involved in host parasite interaction could particularly contribute to the development of immunoprophylactic control strategies. In order to establish a DNA immunisation protocol, cDNA of three already known E. tenella antigens were subcloned alone or in fusion to the stabilising fusion partner enhanced green flurescence protein (EGFP) into two different DNA immunisation vectors (pCDNA3, pVR1012). Following DNA immunisation of chickens using both vectors with or without EGFP fusion, respectively, the induction of comparable immune responses were shown by serum conversion. This implies it was possible to achieve heterologous (Eimeria) gene expression in chickens with the established immunisation protocol. In order to identify new E. tenella secretory proteins bioinformatic and experimental approaches were used. Following bioinformatic analysis 54 putatively secretory E. tenella sequences were identified for which roles in host parasite interaction were surmised, due to their localisation and function. The identification of secreted proteins from a E. tenella sporozoite cDNA library using a functional complementation assay in yeast resulted in 25 unique sequences. The cDNA of 13 newly identified secretory proteins were tested in DNA immunisation studies. The results showed that both methods are capable of identifying secretory proteins of E. tenella. Owing to the results presented here, new immunisation protocols should be established to test the immune protective capacity of candidate antigens of E. tenella in chickens. The present study confirmed the method of DNA immunisation as a basic tool for such new protocols. In future, however, DNA immunisation protocols should focus on the induction of essential intestinal immune responses.

Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen sind essentielle Komponenten der protektiven Immunität. Die Mechanismen ihrer Induktion, ihres Überlebens und der Gedächtnis-B-Zellreaktivierung sind allerding bisher nur unvollständig verstanden. Um unser Wissen diesbezüglich zu erweitern, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen Charakteristika von Primär- und Sekundärimmunantworten nach Immunisierung mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) untersucht und zum anderen das Vorkommen sowie der Phänotyp humaner Gedächtnis-B-Zellen in verschiedenen lymphatischen Geweben analysiert. Die primäre parenterale KLH Immunisierung führte auf serologischer und zellulärer Ebene zu einer Reihe unerwarteter Ergebnisse, welche u. a. das Auftreten von IgA Antikörpern und die gleichzeitige Präsenz von hoch- und wenig mutierten primären Plasmablasten beinhalteten. Die Untersuchung der Gedächtnis-B-Zellverteilung in verschiedenen lymphatischen Geweben ergab den größten Gedächtnis-B-Zellpool in der Milz. Blut-, Tonsillen-, Knochenmarks- und Milz-Gedächtnis-B-Zellen wiesen nur wenige phänotypische Unterschiede auf. Einer davon war die CD69 Expression auf tonsillären ruhenden Gedächtnis-B-Zellen, was darauf hindeutet, dass tonsilläre Gedächtnis-B-Zellen tatsächlich sessil sein könnten. Die hier erhaltenen Ergebnisse stellen neue Erkenntnisse über bisher unbeschriebene Mechanismen bei parenteralen Immunantworten wie zum Beispiel die Induktion von IgA Antikörpern sowie die potentielle Rekrutierung kreuzreaktiver Gedächtnis-B-Zellen dar. Es bleibt zu klären, wie die Reaktivierung solcher Gedächtnis-B-Zellen reguliert ist. Derartiges Wissen wäre insbesondere für Therapien von Erkrankungen des Immunsystems, wie Autoimmunität, von Bedeutung. Das potentiell patrouillierende Verhalten der Gedächtnis-B-Zellen ist ein markanter Unterschied zu den nischenabhängigen sessilen Plasmazellen und deutet weitestgehend darauf hin, dass Gedächtnis-B-Zellen nicht auf derartige Nischen angewiesen sind. / Memory B cells (mBC) and antibodies are major mediators of protective immune responses yet the mechanisms of their induction, maintenance and mBC reactivation are poorly understood. Therefore, to enhance knowledge in this regard this study comprehensively characterized a human primary and secondary B cell immune response to Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Secondly, mBC maintenance was investigated by a systematic analysis of mBC presence, frequency and phenotype within different lymphoid organs. Parenteral primary KLH immunization yielded unexpected results on the serological and B cellular level, including KLH-specific IgA antibody induction, the simultaneous presence of low and highly mutated circulating KLH-specific primary plasmablasts and only little clonal overlap between the primary, memory and secondary KLH-specific B cell repertoires. With respect to the organ distribution of human mBC, the spleen was identified as a major mBC reservoir. Splenic, tonsillar, bone marrow and blood mBC pools exhibited a largely comparable phenotype. Yet, we found tonsillar mBC to express CD69. Due to their resting state tonsillar mBC could therefore constitute a tissue resident cell population. The observations described allow insights into hitherto unknown potential mechanisms behind primary immune responses, i.e. prominent IgA induction by parenteral challenge and inclusion of cross-reactive mBC. The so far unclear regulatory players involved deserve future investigation, as such knowledge may be crucial for therapeutic interventions in immune system disorders. Furthermore, strikingly different to the resident plasma cells in the bone marrow, mBC appear to distribute between lymphoid organs and continuously recirculate in peripheral blood indicative of their potential permanent screening activities, suggesting that human mBC do not require one dedicated niche for their principle survival.