Das Influenza A Virus (IAV) stellt weltweit eine ernstzunehmende Bedrohung für Gesundheit und Wirtschaft der Menschheit dar. Ein universeller und langanhaltender Impfstoff konnte noch nicht entwickelt werden und klinisch zugelassene Medikamente verlieren durch die rasante Entstehung von resistenten Stämmen zunehmend ihre Wirkung. Aus diesem Grund gewinnt die Erforschung neuer antiviraler Strategien zur Bekämpfung des Influenzavirus an Bedeutung zum Schutze unserer Gesellschaft. Eine vielversprechende Zielstruktur für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente stellt das virale Hämagglutinin (HA) dar. Das HA liegt in hoher Dichte auf Influenzaviren vor und ermöglicht die Bindung an Sialinsäuren (SA) auf Wirtszellen und die Verschmelzung mit deren Lipidmembran. HA-bindende Moleküle entfalten eine hemmende Wirkung bereits bei dem ersten Kontakt mit Zellen, sodass eine Infektion erst gar nicht stattfinden kann. Aufgrund einer hohen HA-Dichte auf der Virusoberfläche eignen sich besonders multivalente SA tragende Nanopartikel für die Hemmung einer viralen Infektion. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wurden in der vorliegenden Arbeit neue multivalente Binder gegenüber dem viralen Hämagglutinin (HA) entwickelt und studiert. Im Gegensatz zu bereits bekannten multivalenten Sialosiden, die in einer undefinierten räumlichen Orientierung auf Polymergerüsten präsentiert wurden, konnten in der vorliegenden Arbeit strukturelle Aspekte identifiziert werden, um Gerüstsysteme mit optimaler Rezeptorpräsentation gegenüber der Influenza A Virusoberfläche zu generieren. Neben SA-basierten Polymersystemen wurde auch ein gegen HA gerichtetes Peptid aus einem Antikörper identifiziert, welches sich auch für eine multivalente Interaktion mit IAV eignet. Diese Arbeit ermöglicht neue Einblicke in die Auswahl geeigneter Trägersysteme, eines optimalen Rezeptorabstandes und der Verwendung alternativer Rezeptoren mit dem Ziel einer Infektionshemmung von IAV. / Influenza A virus (IAV) still poses a serious threat to global health and economy of mankind. So far, a universal, long-lasting vaccine could not be developed, and clinically approved drugs are prone to lose activity due to the fast development of resistant strains. Because of this, research on new antiviral compounds and strategies to combat influenza viruses is of great importance for the protection of our society. A promising candidate for the development of novel antiviral drugs is the viral hemagglutinin (HA) protein. HA is present at high density on the viral envelope, which allows binding to sialic acid (SA) molecules on host cells and fusion with their membrane. Following, HA binding molecules have an inhibitory effect at the very first step of the infection cycle, leading to the inability of an infection. Based on a high HA density on the viral surface, SA carrying nanoparticles qualify for the inhibition of a viral infection. Based on this knowledge the study at hand demonstrates the development of new multivalent binders against viral HA and discusses them critically. In contrast to published multivalent sialosides, which are displayed in an undefined fashion on polymer scaffolds, the results of this thesis support the identification of structural requirements for the design of new scaffold systems with an optimal match to the viral surface. Beside sialoside based polymer systems, completely new peptide based systems, based on an HA binding antibody, were developed. Similar to polyglycerolsialosides, such multivalent peptide-decorated polymers were able to achieve nanomolar binding inhibition constants, too. In summary, this thesis enables new insights into the choice of a suitable carrier system, the optimal receptor spacing, and the use of alternative receptors with the ultimate goal of virus neutralization.

Mechanismen, die zur unterschiedlichen Pathogenität niedrig- und hochpathogener aviärer und humanpathogener Influenzaviren im Menschen beitragen, sind bisher nur ansatzweise verstanden. Auch sind Pathomechanismen, die der Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV-Infektion zu Grunde liegen, bisher weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell für die Untersuchung der Influenzavirus- und der MERS-CoV-Infektion etabliert. Dabei wurde die Replikationsfähigkeit und der Zelltropismus der Viren systematisch verglichen. Während hochpathogene aviäre, saisonale und pandemische Influenzaviren effizient in der humanen Lunge replizierten, konnten sich niedrigpathogene aviäre Viren und ein porcines Virus kaum vermehren. Alle Viren zeigten jedoch den gleichen Zelltropismus und infizierten im Alveolarepithel ausschließlich Typ II Zellen. Die unterschiedliche Pathogenität dieser Viren lässt sich daher nicht durch Unterschiede im Zelltropismus erklären. Gleichwohl konnte der humane und der aviäre Influenzavirusrezeptor sowohl auf Typ II als auch auf Typ I Zellen nachgewiesen werden. Niedrigpathogene aviäre Influenzaviren sind in der humanen Lunge durch die Freisetzung von zum größten Teil nicht infektiösen Viruspartikeln restringiert. MERS-CoV replizierte in humanem Lungengewebe mit ähnlicher Kinetik wie ein hochpathogenes H5N1 Virus. MERS-CoV Antigen war sowohl im Bronchialepithel, Alveolarepithel sowie im Endothel nachweisbar. Der funktionelle Rezeptors des MERS-CoV, die Dipeptidylpeptidase 4, wurde in allen infizierten Zelltypen sowie in Alveolarmakrophagen nachgewiesen. Die mikroskopische Analyse infizierter Gewebeproben weist zudem auf einen infektionsbedingten Alveolarschaden hin. Die Studie trägt wesentlich zum pathophysiologischen Verständnis pulmonaler Influenzavirus- und MERS-CoV-Infektionen bei. Das humane ex vivo Lungenkulturmodell stellt ein klinisch relevantes Modell zur Untersuchung respiratorischer Infektionen im Menschen dar. / Mechanisms contributing to the different pathogenicity of low and highly pathogenic avian and seasonal influenza viruses in humans are currently only partially understood. Furthermore, underlying pathological mechanisms of the Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV infection in humans are widely unknown. In this study a human ex vivo lung culture model was established, which allowed investigating influenza virus and MERS-CoV infection. Replication and cellular tropism of the different viruses were compared systematically. While highly pathogenic avian, seasonal and pandemic influenza viruses replicated efficiently, low pathogenic avian viruses and a porcine virus propagated poorly. However, all viruses showed the same cellular tropism and infected only type II cells within the alveolar epithelium. Therefore, the different pathogenicity of these viruses cannot be attributed to different cellular tropisms. Nevertheless, the human and the avian influenza virus receptor could be detected on type II and type I cells. Low pathogenic avian influenza viruses are restricted in the human lung by the release of mostly non-infectious progeny virus particles. The MERS-CoV replicated with similar kinetics to a highly pathogenic H5N1 virus in the human lung. MERS-CoV antigen was detected in the bronchial epithelium, alveolar epithelium and endothelium. The functional receptor of MERS-CoV, dipeptidylpeptidase 4, was found in all infected cell types and in alveolar macrophages. Microscopic analysis of infected tissue samples indicated an alveolar damage provoked by MERS-CoV infection. This study contributes substantially to the pathophysiological understanding of the pulmonary influenza virus and MERS-CoV infection. The human ex vivo lung culture model represents a clinically relevant model to investigate human respiratory infections.

Der Viruspartikelzusammenbau hängt von der Anreicherung viraler Untereinheiten in spezifischen Domänen der PM ab. Es wird vorgeschlagen, dass Membran-Rafts – geordnete, sphingomyelin- und cholesterinreiche Mikrodomänen in der PM – als lokale Rekrutierungsstellen dienen. Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Glykoprotein in der Hülle des Influenzavirus. Es dient der Bindung an die Wirtszelle und der Fusion mit dem Endosom. Es wird angenommen, dass HA bei der Abschnürung der Viruspartikel von der Zelle mitwirkt. Zwei Hauptbeobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich HA in Lipid-Mikrodomänen einlagert: HA wurde biochemisch in Detergens-resistenten Membranen nachgewiesen und die Virushülle ist mit raftbildenden Lipiden angereichert. Um die Rolle der HA-Transmembrandomäne für die Lipid-Raft-Inkorporation aufzuklären, wurde ein Konstrukt entwickelt, das den C-Terminus von HA mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP fusioniert, und die Transmembrandomäne, nicht aber die N-terminale Ektodomäne von HA enthält. In transfizierten Säugetierzellen wurde der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen diesem Konstrukt und einem GPI-verankerten cyan fluoreszierenden Protein CFP (Raft-Marker) durch Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich HA-Konstrukte in Cholesterin-abhängigen Lipiddomänen anreichern, was durch eine erhöhte FRET-Effizienz nachgewiesen wurde. Zudem führen ein Cholesterinentzug aus der PM und die Deletion hochkonservierter Palmitylierungsstellen zu einer signifikanten Verringerung selbiger; sehr gering war diese zwischen dem HA-Konstrukt und einem Nicht-Raft-Marker. Darüberhinaus konnte durch ortsspezifische Mutagenese gezeigt werden, dass die verwendeten Konstrukte disulfidbrückenverbundene Oligomere bilden, welche Voraussetzung für den Transport der Konstrukte an die PM sind. Zeitaufgelöste Anisotropiemessungen ergaben für diese ein starkes Homo-FRET-Signal, welches die Oligomerisierungshypothese bestätigt. / Numerous enveloped viruses bud from the host cell plasma membrane (PM). Assembly of the new viral particles depends on the accumulation of the viral subunits at specific sites of the cell membrane. Lipid domains or rafts enriched of sphingomyelin and cholesterol were suggested as sites for local recruitment of viral components. Hemagglutinin (HA), a homotrimeric glycoprotein embedded in the envelope of influenza virus, mediates binding of the virus to the host cell and fusion between the viral envelope and the endosomal membrane. HA might play an important role in budding of the viral particles from the host cell. Two observations led to the suggestion that HA entraps in lipid microdomains. First, HA was rescued in DRM fractions, second the viral envelope was found to be enriched in lipids generally forming rafts. To elucidate the role of the HA transmembrane domain in lipid raft localization we expressed constructs harboring the transmembrane domain and the cytoplasmic tail but lacking the N-terminal ectodomain of HA in the PM of mammalian cells. We studied energy transfer (FRET) between these constructs and a GPI anchored CFP as a raft marker by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Our results suggest that HA constructs are indeed sorted into cholesterol-dependent lipid domains since cholesterol depletion of the PM caused a significant decrease of FRET efficiency. Likewise, deletion of the three highly conserved palmitoylation sites of HA is also accompanied by a reduction of FRET efficiency. Site directed mutagenesis demonstrated that TMD-HA constructs form disulfide linked oligomers and that oligomerization is fundamental for the transport to the PM. This result was corroborated by time resolved anisotropy measurements that revealed strong homoFRET between TMD-HA-YFP molecules, thus indicating protein clustering. Accordingly, trimerization of full length HA is fundamental for stability and the subsequent delivery of the protein to the cell surface.

Das Hüllglykoprotein Hämagglutinin (HA) von Influenzavirus ist verantwortlich sowohl für die Bindung als auch für die nachfolgende Fusion der viralen Hülle mit der endosomalen Membran. Eine Analyse der 3D Struktur der HA-Ektodomaine zeigt, dass die Stabilität des Proteins sowohl durch kovalente als auch durch nicht-kovalente Wechselwirkungen bedingt ist. Die Konformationsänderung von HA bei saurem pH-Wert weißt auf eine mögliche Rolle von Protonierungseffekten auf ionisierbare Aminosäuren hin. Untersuchungen zur Bedeutung geladener Aminosäuren und Salzbrücken für die Struktur des HA wurden auf der Grundlage von ‚site directed mutagenesis’ durchgeführt. Der Einfluss der Mutationen auf die Konformationsänderung und die Fusionsaktivität von HA wurden durch einen Proteinase K-Assay bzw. Fluoreszenzmikroskopie erfasst. Die Ergebnisse beider Methoden wurden miteinander korreliert. Abgesehen von der Mutante R109E zeigten Wildtyp-HA und alle anderen Mutanten eine vergleichbare Oberflächenexpression. Die beobachteten Unterschiede in der pH-Abhängigkeit der Konformationumwandlung zwischen Wildtyp-HA und HA-Mutanten zeigen, daß eine Zerstörung von Salzbrücken und ggf. eine Erhöhung der elektrostatischen Abstoßung an den betrachteten Kontakstellen sehr wahrscheinlich eine Herabsetzung der energetischen Barriere der Konformationsumwandlung verursacht. Dieser Ergebnisse erklären die molekularen Grundlagen des erhöhten pH-Schwellwertes der HA-Konformationsumwandlung von Amantadin-resistenten Influenzaviren. Im Gegensatz wurde für Mutanten, die die Stabilität von HA erhöhten, keine Konformationsumwandlung bei einem pH-Wert beobachtet, der typisch für die Konformationumwandlung von Wildtyp-HA war. Aminosäuren, die denen dieser stabiliserenden Mutationen entsprachen, wurden in einer natürlichen Influenzavirusvariante – A/JPN/305/57 – gefunden. Die Bedeutung von Ladungen für die Stabilität der HA-Ektodomaine wird dadurch unterstrichen, dass eine Konservierung einer positiven Ladung und insbesondere eines Argininrestes in der Position 109 (Nummerierung auf der Basis von HA X31) für alle Influenzaviren A und B gefunden wurde. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass sehr wahrscheinlich eine komplexe Salzbrücke an der Kontaktfläche zwischen HA1 und HA2 für alle Influenzaviren A evolutionär konserviert ist. / Hemagglutinin (HA), a major envelope glycoprotein is responsible for fusing viral and endosomal membranes during influenza virus entry. The analysis of 3D crystal structure of the HA ectodomain shows that the stability of protein is maintained by both non-covalent and covalent interactions. The conformational change of HA at low pH indicates a role for protonation effects of the ionisable amino acids. Structural investigations were done using “site directed mutagenesis” in order to conceive the importance of charged amino acids and more emphatically the involvement of salt bridges. The effect of mutations on the conformational change and fusion activity was probed by proteinase K assay and fluorescence microscopy respectively. It was observed that HA-wt and all the mutants except R109E showed comparable surface expression. The difference in pH threshold between the HA-wt and the mutants showed that breakage of salt bridge and further incorporation of repulsion at the considered interfaces would lower the energy barrier requirements for the conformational change. The results explain the molecular basis of the higher pH threshold for naturally occurring amantadine resistant mutants. On the other hand, mutants designed to stabilise the HA were resistant to conformational changes at those pH values which typically trigger the conformational change of HA-wt. Coincidentally these mutations were found to be existing in the natural variant of H2 Japan subtype (A/JPN/305/57). Interestingly, the study shows that a positive charge and, more specifically, an Arg residue at position 109 (numbering based on X-31 strain) is conserved in all of the influenza A and B viruses underlining the relevance of electrostatic interactions for the HA stability. Aptly a complex salt bridge at the interface of HA1 and HA2 is probably conserved evolutionarily in all the members of influenza A virus.

Le virus de l’influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de type H5N1 apparu en Chine en 1996 constitue une menace pour la santé humaine en raison de sa circulation endémique dans les volailles domestiques et de son potentiel zoonotique. La sévérité de l'infection liée à l'IAHP H5N1 est variable selon les espèces d'oiseaux: certains anatidés sont porteurs sains et asymptomatiques du virus tandis que dans les élevages de poulets, l'IAHP est fortement contagieux et caractérisé par des taux de mortalité supérieurs à 90%. Chez les humains, l'impact de l'IAHP H5N1 reste à ce jour modéré (630 cas humains dont 375 morts, World Health Organization Juin, 2013) en raison de la faible transmission du virus des volailles aux humains et d'humain à humain. Cependant, étant donné les taux de létalité élevés (>50%), un changement des modalités de transmission pourrait mener à un impact beaucoup plus élevé.<p>Depuis son émergence, l'IAHP H5N1 a eu un impact économique important dans de nombreux pays d’Asie du Sud-Est. La Thaïlande, pays qui fait partie des principaux exportateurs mondiaux de viande de volaille, a été sévèrement touchée par les multiples vagues épidémiques entre 2003 et 2005. Ces épisodes ont eu un impact sur les revenus des petits et moyens producteurs, mais également causé des pertes économiques importantes dans le secteur de la production intensive de volailles en raison de l'embargo imposé par les principaux marchés d'exportation. <p>L'objectif de ce travail est d’étudier quantitativement l'association entre la production intensive de la volaille et la distribution spatio-temporelle de l'IAHP H5N1 en Thaïlande. Deux approches ont été développées pour aborder cette étude: le développement d’une part de modèles statistiques visant à identifier les déterminants du risque d'IAHP H5N1, et d'autre part, de modèles mécanistiques visant à simuler des trajectoires épidémiques sur base de la connaissance des mécanismes de transmission de l'IAHP H5N1, de la structure du secteur de la production de volaille et des mesures d'intervention mises en place. <p>A l’aide de facteurs environnementaux et anthropogéniques, nous montrons que: (i) la distribution des canards domestiques en Asie peut être prédite en utilisant des modèles de régression non-linéaire, et (ii) la production de volailles peut être désagrégée entre production extensive et intensive sur base du nombre de volailles par éleveur. Enfin (iii), nous montrons en utilisant des arbres de régression boostés ("Boosted Regression Trees", BRT) que les principaux déterminants de la distribution du risque d'IAHP H5N1 sont les canards élevés en systèmes intensifs, le nombre de cycles de culture de riz et la proportion d'eau présente dans le paysage. Finalement, nous illustrons les potentialités des modèles mécanistiques pour évaluer l'efficacité des mesures d'intervention implémentées, tester des scénarios alternatifs d'intervention et identifier des stratégies optimales de prévention et d'intervention contre de futures épidémies<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse évalue le risque d’émergence d’un pathogène via l’avifaune sauvage dans une région indemne en combinant deux approches :(1) L’étude de pathogènes partageant des caractéristiques éco-épidémiologiques communes avec le pathogène émergeant ;et (2) L’utilisation de données écologiques disponibles dans la région indemne.<p>\ / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dependent on the excretion pattern, wastewater monitoring of viruses can be a valuable approach to characterizing their circulation in the human population. Using polyethylene glycol precipitation and reverse transcription-quantitative PCR, the occurrence of RNA of SARS-CoV-2 and influenza viruses A/B in the raw wastewater of two treatment plants in Germany between January and May 2022 was investigated. Due to the relatively high incidence in both exposal areas (plant 1 and plant 2), SARS-CoV-2-specific RNA was determined in all 273 composite samples analyzed (concentration of E gene: 1.3 × 10⁴ to 3.2 × 10⁶ gc/L). Despite a nation-wide low number of confirmed infections, influenza virus A was demonstrated in 5.2% (concentration: 9.8 × 10² to 8.4 × 10⁴ gc/L; plant 1) and in 41.6% (3.6 × 10³ to 3.0 × 10⁵ gc/L; plant 2) of samples. Influenza virus B was detected in 36.0% (7.2 × 10² to 8.5 × 10⁶ gc/L; plant 1) and 57.7% (9.6 × 10³ to 2.1 × 10⁷ gc/L; plant 2) of wastewater samples. The results of the study demonstrate the frequent detection of two primary respiratory viruses in wastewater and offer the possibility to track the epidemiology of influenza by wastewater-based monitoring.

Die Assemblierung von Influenzaviren erfolgt an Rafts der apikalen Wirtszellplasmamembran mit denen das Hämagglutinin (HA) über Acylierungen im C-Terminus und hydrophobe Aminosäuren seiner Transmembrandomäne (TMD) interagiert. M2 besitzt eine cytoplasmatische amphiphile Helix (AH), die ebenso potenzielle Raft-Motive aufweist: Eine Acylierung und Cholesterol-Bindemotive. In dieser Arbeit wurde per Konfokalmikroskopie an polarisierten Zellen, die fluoreszenzmarkierte M2-Varianten exprimierten, gezeigt, dass diese M2-Motive nicht für den apikalen Transport, der vermutlich durch Raft-ähnliche Vesikel erfolgt, benötigt werden. Messungen des Förster-Resonanzenergietransfers über Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM-FRET) in der Plasmamembran lebender Zellen, die fluoreszenzmarkiertes HA und M2 koexprimierten, ergaben, dass diese Motive auch nicht für die Interaktion mit den durch HA, in Abhängigkeit von dessen Raft-Motiven, stabilisierten Raft-Domänen notwendig sind. Mittels reverser Genetik konnten infektiöse WSN-Viren mit fehlender Acylierung am Ende der HA-TMD, nicht jedoch Viren ohne die zwei cytoplasmatischen Acylierungen hergestellt werden. Weiterhin ergaben Wachstumsanalysen, dass die Acylierung von HA und M2 für den gleichen Schritt des viralen Replikationszyklus von Bedeutung sind. Für die M2-AH wurde postuliert, dass sie die Membrankrümmung detektiert und durch Insertion in die Wirtszellmembran die Virusabschnürung bewirkt. Infektiöse Viren ohne M2 oder ohne die AH konnten ebenso wie Viren mit M2 mit einer Helix mit reduzierter Amphiphilität in dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Allerdings führte die Substitution der AH durch typische krümmungsdetektierende oder modulierende Helices zu Viren, deren Wachstum um zwei bis vier Titerstufen im Vergleich zum Wildtyp reduziert war. Die Helix-Amphiphilität scheint wichtig zu sein, aber auch die Sequenz oder bestimmte Aminosäuren sind offenbar für eine effiziente Virusreplikation notwendig. / The assembly of influenza virus particles occurs at the apical plasma membrane of the host cell at membrane rafts which the hemagglutinin (HA) interacts with via acylations in its C-terminal region and via hydrophobic amino acids in the transmembrane domain (TMD). M2 possesses a cytoplasmic amphiphilic helix (AH) that also contains potential raft motifs: an acylation and cholesterol-binding motifs. In this work, confocal microscopy of polarised cells, which were expressing fluorescently labelled M2-variants, demonstrated that these motifs of M2 are not required for apical transport, which is assumed to be mediated by raft-like vesicles. Furthermore, FLIM-FRET (Förster resonance energy transfer measured via fluorescence lifetime imaging microscopy) analyses, performed in the plasma membrane of living cells coexpressing fluorescently labelled HA and M2, revealed that these M2-motifs are not required for association with the large coalesced raft phase organised by HA. In contrast, deleting HA’s raft-targeting features clearly reduced clustering with M2. While the removal of the two cytoplasmic acylations prevented the rescue of infectious virus by reverse genetics, a mutant virus without acylation in the HA-TMD could be rescued. Moreover, growth analyses revealed that the acylations of HA and M2 are important for the same step in the viral replication cycle. It has been postulated that the M2-AH detects membrane curvature and accomplishes membrane scission by inserting into the host cell membrane. Viruses without M2, without the M2-AH or with M2 containing a helix with reduced amphiphilicity could not be produced in this work. However, substituting the AH by typical curvature-sensing or -generating helices led to viruses with two to four orders of magnitude reduced growth as compared to wildtype virus. The amphiphilicity of the helix seems to be important, but also the sequence or specific amino acids appear to be necessary for an efficient virus replication.

Im Unterschied zu anderen RNA Viren vervielfältigen Influenzaviren ihr Genom im Zellkern infizierter Zellen. Für die erfolgreiche Vermehrung müssen neu gebildete Genomsegmente (virale Ribonukleoproteine, vRNPs) wieder aus dem Zellkern exportiert werden. Dafür nutzt Influenza einen Exportkomplex, der sich aus dem viralen Matrixprotein 1 (M1) und Nukleusexportprotein (NEP) zusammensetzt und vRNPs unter Verwendung des zellulären Exportproteins CRM1 aus dem Zellkern transportiert. Zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit dem Exportkomplex sind noch unbeantwortet: Wie viele Exportkomplexe werden pro vRNP gebunden? Wie interagieren die Proteine innerhalb des Komplexes mit vRNPs? Wie wird die zeitliche und räumliche Präsenz der beteiligten Proteine im Verlauf der Infektion reguliert? Um zu einem besseren Verständnis beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie und molecular brightness-Analysen genutzt, um die Oligomerisierung der beteiligten Exportkomplexproteine zu quantifizieren. Werden Fluoreszenzproteine für solche Untersuchungen verwendet, treten häufig nicht-fluoreszente Zustände auf, die die Bestimmung des Oligomerzustandes beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit ein einfaches Korrekturmodel vorgestellt, das die Population an nicht-fluoreszenten Zuständen berücksichtigt, und somit die genaue Bestimmung des Oligomerzustandes erlaubt. Dadurch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass NEP Homodimere im Zytoplasma ausbildet, wohingegen eine um das 2,5-fach geringere Homodimerpopulation im Zellkern vorhanden war. Durch die Integration von Informationen über den Lokalisationsphänotyp und den Oligomerzustand von NEP sowie mehrerer Mutanten, konnte ein Modell abgeleitet werden, dass den Regulationsmechanismus beschreibt: Durch vorrübergehendes Maskieren und Demaskieren der beiden Nukleusexportsignale wird der Transport von NEP reguliert. Die Dimerisierung im Zytoplasma und Monomerisierung im Zellkern unterstützen diesen Mechanismus. / Influenza viruses are the causative agent of severe epidemics and pandemics, causing up to 650,000 deaths annually. Unlike other RNA viruses, Influenza viruses replicate their genome within the nucleus of cells. Hence, progeny genome segments - viral ribonucleoproteins (vRNPs) - need to be exported from the nucleus to complete the replication cycle. To fulfil this task, Influenza relies on a viral nuclear export complex built from M1 and NEP, that mediates export by hijacking the cellular CRM1-dependent export machinery. In this context a number of questions remain unanswered, such as how many export complexes bind to a single vRNP, what is the exact interaction pattern of vRNPs with export complex proteins, and how translocation of nuclear export relevant proteins such as NEP are regulated and optimally timed during the course of infection? In the present study, the potential of NEP to form homo-dimers in situ was shown for the first time by applying fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) and molecular brightness analysis, that allows determination of protein oligomerization in living cells. However, when using fluorescent proteins in FFS studies non-fluorescent states are observed, which strongly affect molecular brightness analysis. Therefore, in this study a simple correction model was described, taking into account quantified non-fluorescent state fractions, to finally allow accurate and unbiased determination of oligomerization. This way it was shown, that NEP forms homo-dimers within the cytoplasm of cells, whereas a 2.5-fold lower homo-dimer population was observed in the nucleus. Combining the subcellular localization dependent oligomeric state of NEP and several NEP mutants with their localization phenotypes, a regulation mechanism was proposed in which the translocation of NEP is regulated by transient masking and unmasking of its two NESs, which is supported by dimerization in the cytoplasm and monomerization in the nucleus of cells, respectively.

Les travaux de recherche effectués dans le cadre de cette thèse ont été guidés par le manque d’information et une compréhension limitée des mécanismes épidémiologiques à l’origine de l’émergence et de la diffusion de la grippe aviaire hautement pathogène, souche H5N1 en Chine du Sud, aussi reconnue comme l’épicentre potentiel de l’émergence des virus influenza aviaires à caractères pandémiques. <p>Dans ce cadre, des données spatio-temporelles relatives aux foyers de la maladie ainsi que des données de surveillance virologiques (isolement du virus effectué dans le cadre du système de surveillance nationale) ont été collectées sur une période de quatre ans et analysées afin d’éxplorer les facteurs de risque relatifs à l’émergence et persistence de la maladie dans certaine zones de production du sud de la Chine. Les analyses ainsi effectuées ont permis d’identifier, à travers l’utilisation de méthodes statistiques robustes ayant fait leur preuve dans le domaine de la santé ou de l’écologie (la régression logistique classique et les arbres de regression logistique), des facteurs de risque liés à certains types de production de volailles (canards élevés en plein air, zones riches en eau et par extension associées à la riziculture) ou des facteurs associés à l’activité humaine. A travers une représentation cartographique des facteurs ainsi identifiés, des cartes de risque ont été produites permettant ainsi de visualiser d’une part les zones à haut risque de persistence de l’infection virale et d’autre part les zones vulnérables à l’apparition de foyers de la maladie, donnant aux autorités nationales la possibilité de mieux cibler leurs politiques de surveillance et de contrôle. <p>Dans un second temps, notre étude s’est portée sur les marchés à volailles traditionnels du sud de la Chine qui représentent un risque permanent de persistence, d’évolution et de diffusion des virus influenza aviaires, ainsi qu’un risque important en matière de santé publique. La dynamique de ces marchés et les liens qui les unissent ont été étudiés à travers des outils d’analyse empruntés à la sociologie tels que l’Analyse des Réseaux Sociaux (Social Network Analysis). Grace à cette approche, l’importance de l’hygiène de ces marchés et notamment du nettoyage et de la désinfection des cages dans la persistence du virus a été mise en évidence. Enfin, des enquêtes effectuées auprès des vendeurs de volailles ont permis d’identifier l’origine et la destination des animaux vendus et de reconstruire des réseaux plus ou moins intriqués de liens commerciaux qui unissent ces marchés entre eux dans trois provinces du sud de la Chine. L’analyse de ces réseaux et de leurs configurations ont permis d’identifier des marchés à plus haut risque de persistence de l’infection du fait de leur position centrale au sein de ces réseaux. De même qu’il est indispensable de cibler la surveillance et le contrôle de la maladie dans des zones écologiquement favorables à la persistence des virus influenza aviaires, cette étude révèle l’importance de certaines pratiques hygiéniques et commerciales dans la persistence de la maladie et la nécessité de cibler la surveillance et le contrôle au niveau de certains de ces marchés situés au centre d’un réseau dense et connecté, pour pouvoir in fine mieux contrôler la maladie au niveau national.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished