Les systèmes d’expression végétaux sont utilisés couramment pour la production hétérologue de protéines recombinantes complexes. Des contraintes biochimiques dans le système de sécrétion cellulaire, comme l’abondance de protéases peu spécifiques ou des variations de pH d’un organite à l’autre, compromettent toutefois l’expression de plusieurs protéines d’intérêt. Des approches ont été développées pour améliorer l’environnement intracellulaire dans la plante hôte de manière à accroître la qualité et le rendement des protéines sécrétées. Dans ce projet, nous avons évalué l’impact de l’homéostasie du pH dans le système de sécrétion cellulaire des feuilles du Nicotiana benthamiana sur l’expression et la stabilité des protéines recombinantes. Nous démontrons le potentiel du canal ionique M2 du virus de l’Influenza comme nouvel outil pour augmenter le pH des compartiments acides du système de sécrétion cellulaire, une approche éventuellement utile pour la stabilisation des protéines sensibles aux milieux acides. En lien avec l’influence bien documentée du pH sur l’activité des protéases cellulaires, nous montrons ensuite qu’une modification du pH induite par l’expression du canal M2 influence les profils de dégradation de protéines de fusion sensibles à la protéolyse, des observations qui confirment l’impact du pH sur l’activité protéolytique des cellules végétales et qui suggèrent le potentiel du canal ionique M2 comme protéine accessoire pour augmenter la stabilité et le rendement des protéines recombinantes in planta. Finalement, nous abordons l’impact du canal ionique M2 sur l’expression des protéines endogènes à l’échelle de la cellule. Nous démontrons qu’une altération du pH dans le système de sécrétion en réponse à l’expression du canal ionique a des effets étendus sur le protéome foliaire, affectant la teneur de protéines retrouvées dans plusieurs compartiments cellulaires incluant les chloroplastes, le cytosol et la vacuole. Nous rapportons aussi l’établissement d’un ‘protéome hybride’ dans les plantes exprimant M2, composé de protéines caractéristiques aussi bien de plantes témoins non infectées que de plantes agroinfectées exprimant activement des protéines de défense. En résumé, nos données mettent en évidence le rôle de l’homéostasie du pH sur le protéome des cellules végétales et l’impact significatif du gradient de pH dans le système de sécrétion cellulaire sur la stabilité et le rendement des protéines recombinantes sensibles à l’acidité ou à la protéolyse. / Plant expression systems are commonly used for the heterologous production of complex recombinant proteins. However, biochemical conditions in the plant cell secretory pathway, such as the presence of poorly-specific proteases or pH variations from one organelle to another, impair the expression of several potentially useful proteins. Approaches have been developed to improve the cellular environment of the host plant in such a way as to increase the quality and yield of secreted recombinant proteins. In this project, we assessed the impact of pH homoeostasis in the leaf cell secretory pathway of wild tobacco Nicotiana benthamiana on the expression and stability of recombinant proteins. We demonstrate the potential of Influenza virus proton channel M2 as a new tool to increase pH in acidic compartments of the cell secretory pathway, eventually useful to stabilize acid-labile recombinant proteins. In line with the well-established influence of pH on cell protease activities, we then show that pH modification induced by the expression of the M2 channel influences the degradation profile of fusion proteins susceptible to proteolysis, thus confirming the impact of pH on protease activities in plant cells and highlighting the potential of M2 as an accessory protein to increase the stability and yield of recombinant proteins in planta. Finally, we describe the impact of the M2 proton channel on the expression of endogenous proteins at the cellular scale. We show that pH alteration in the secretion system upon M2 expression has cell-wide effects on the leaf proteome, affecting the content of proteins found in various cell compartments including the chloroplast, the cytosol and the vacuole. We report the establishment of a ‘hybrid proteome’ in leaf cells expressing the proton channel, composed of protein clusters characteristic of both control, non-infected plants and agroinfected plants actively expressing defense-related proteins. Overall, our data highlight the central role of pH homeostasis on the proteome of plant cells and the strong impact of pH gradient in the cell secretory pathway on the stability and yield of acidic pH-labile and protease-susceptible recombinant proteins.

Les virus influenza comptent parmi les agents pathogènes les plus importants à l'origine d'infections respiratoires graves. Les antiviraux jouent un rôle important dans les infections grippales sévères. Cependant, un usage monothérapeutique de l'oseltamivir (OS), un inhibiteur de la neuraminidase (INA), chez les personnes immunosupprimées (IS) favorise l'émergence fréquente de résistance à ce médicament, ce qui entraîne une mortalité importante chez les individus IS. En revanche, les inhibiteurs du complexe polymérase (baloxavir marboxil (BXM) et/favipiravir (FA)) n'ont pas été bien étudiés en tant que traitement chez les hôtes IS. Par conséquent, une nouvelle stratégie thérapeutique permettant d'éradiquer rapidement les virus influenza chez les patients IS est nécessaire. La combinaison d'antiviraux ciblant différentes étapes du cycle de vie viral peut augmenter l'efficacité antivirale et réduire la fréquence de la résistance aux médicaments par rapport à la monothérapie. Nous avons, dans un premier temps, adapté une souche contemporaine A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) chez des souris C57BL/6 après 15 passages. La caractérisation moléculaire du variant adapté a démontré que la combinaison des mutations dans les gènes PA (K615E) et HA (N122D, N144E, N246K et A304T) constituent des marqueurs important de virulence dans ce modèle. Dans un second temps, nous avons évalué l'efficacité de la combinaison d'OS avec des inhibiteurs de polymérase (BXM et/ou FA) contre le virus influenza A/H3N2 chez des souris pharmacologiquement IS. Nous avons trouvé que les approches de monothérapies avec l'OS ou le FA ont seulement retardé la mortalité, alors qu'un effet synergique sur la survie (80 % de survie) et une réduction des titres viraux pulmonaires ont été observés dans le groupe de la thérapie combinée (OS/FA) comparativement à l'OS. Le BXM simple ou en combinaison avec l'OS et/ou FA a engendré une protection complète (100 % de survie) et une réduction significative des titres viraux pulmonaires. Nous avons également observé que les traitements monothérapeutiques avec l'OS et le BXM ont induit les mutations E119V dans et I38T dans les gènes de la neuraminidase et de la polymérase acide (PA), respectivement, alors que les combinaisons n'ont pas induit de mutation de résistance. Mon projet de thèse démontre que le régime thérapeutique à doses multiples du BXM seul offrait des avantages supérieurs à ceux des monothérapies à base d'OS et de FA contre les virus A/H3N2. De plus, nous avons confirmé le potentiel de la thérapie combinée pour réduire le risque d'émergence de la résistance au sein des populations IS. Le BXM, approuvé en octobre 2018 par la FDA, est un antiviral ciblant la PA des virus influenza. La substitution I38T dans la PA est le marqueur moléculaire de résistance au baloxavir le plus répandu chez les virus de la grippe saisonnière. Le risque pour la santé publique posé par les variants présentant une sensibilité réduite au baloxavir dépend de leur capacité à se répliquer et à se transmettre dans la communauté par rapport aux virus sensibles. Nos objectifs étaient d'étudier : (1) L'impact de la mutation PA/I38T sur la capacité réplicative et la virulence des virus A/Québec/144147/09 (H1N1) et A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) in vitro et in vivo. (2) Le potentiel de transmission par contact direct des virus A/H3N2 de type sauvage (PA/I38) et mutant (PA/I38T) dans un modèle de cochon d'inde afin de prédire la transmissibilité dans la communauté. Nous avons trouvé que la substitution PA/I38T ne modifiait pas la capacité de réplication in vitro dans les cellules ST6GalI-MDCK et A549 dans les deux backgrounds génétiques. Chez les souris, les virus A/H1N1pdm09 et A/H3N2 recombinants portant la mutation PA/I38T ont induit des titres viraux pulmonaires et des pertes de poids comparables au virus sauvage. La substitution PA/I38T-H3N2 a également induit des titres comparables à ceux des virus sauvages dans les lavages naseaux des cochons d'inde et les deux virus se sont transmis de manière équivalente par contact direct. Nous avons trouvé une légère dominance du génotype sauvage (I38) par rapport au génotype mutant (38T) chez des cochons d'inde co-infectés par des mélanges de virus de type sauvage et mutant. Cependant, chez les souris, le génotype mutant a plutôt dominé le génotype sauvage. Collectivement, les virus influenza A contemporains portant la mutation PA/I38T peuvent conserver un niveau significatif de fitness viral, ce qui justifie la surveillance de leur dissémination. / Influenza viruses are among the most important pathogens causing severe respiratory diseases. Antiviral agents are recommended for treatment of severe influenza infections. Virus clearance is usually delayed among high-risk populations, including immunosuppressed (IS) patients. To inhibit virus replication in these individuals, the prolonged use of Oseltamivir (OS), a NA inhibitor (NAI), is required, which frequently leads to the emergence of drug-resistant viruses. In contrast, polymerase inhibitors (baloxavir marboxil (BXM) and favipiravir (FA)) have not been well studied as treatment in IS individuals. Therefore, a new therapeutic strategy to rapidly eradicate influenza viruses in IS patients is needed. Combination therapy with compounds targeting multiple steps in the viral life cycle may improve treatment outcomes and prevent the emergence of resistance. First, we generated a mouse-adapted A/H3N2 virus (A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) by 15 serial passages of mouse lungs. Molecular characterization of the adapted variant demonstrated that the combination of PA (K615E) and HA (N122D, N144E, N246K and A304T) mutations were critical markers of virulence in this model. In a second step, we evaluated the efficacy of OS and polymerase inhibitors (BXM and/or FA) combinations against influenza virus A/H3N2 infections in pharmacologically IS mice. We found that all untreated animals died. OS and FA monotherapies only delayed mortality, while we observed a synergistic improvement on survival (80 %) and lungs viral titers reduction in the OS/FA group compared to OS. BXM alone or in double/triple combination provided a complete protection and significantly reduced lungs viral titers. OS and BXM monotherapies induced the NA/E119V and PA/I38T substitutions, respectively, while we did not detect mutation with combinations. Our study confirms that the multiple dose regimen of BXM alone provided superior benefits compared to OS and FA monotherapies and suggests the potential for drug combinations to reduce the incidence of resistance. BXM, licensed in 2018 by the FDA, is an antiviral targeting the highly conserved cap-dependent endonuclease region of the PA gene. The PA/I38T substitution is the most common molecular marker of BXM resistance in seasonal influenza viruses. The public health risk posed by viruses with reduced susceptibility to BXM depends on their potential capacity to replicate and transmit in the community compared to susceptible viruses. We have two principal objectives: (1) To evaluate the impact of the PA/I38T substitution on the replicative capacity and virulence of A/Quebec/144147/09 (H1N1) and A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) viruses in vitro and in vivo. (2) To evaluate direct contact transmission of wild-type (PA/I38) and mutant (PA/I38T) A/H3N2 viruses in a guinea pig model to predict transmission in the community. We found that the PA/I38T substitution did not alter the in vitro replication capacity in ST6GalI-MDCK and A549 cells in both genetic backgrounds (A/H1N1pdm09 and A/H3N2). In mice, recombinant A/H1N1pdm09 and A/H3N2 viruses carrying the PA/I38T substitution induced viral titers and weight losses comparable to wild-type virus. The PA/I38T-H3N2 substitution also induced titers comparable to wild-type viruses in guinea pig nasal wash samples and both viruses were transmitted equivalently by direct contact. We found a slight dominance of the wild type (I38) over the mutant (38T) genotype in guinea pigs co-infected with mixtures of wild type and mutant viruses. However, in mice, the mutant genotype rather dominated the wild type virus. Collectively, contemporary influenza A viruses carrying the PA/I38T mutation may retain a significant level of viral fitness, warranting their monitoring in the community.

INTRODUCCIÓ L’abril de 2009 s’identifica un nou virus de la grip, l’A (H1N1) pdm09, en humans. El juny del mateix any, l’Organització Mundial de la Salut declara l’estat de pandèmia a nivell mundial. La malaltia pel nou virus va afectar centenars de nens al nostre medi durant la temporada 2009-2010. OBJECTIUS - Descriure l'espectre de malaltia per grip A (H1N1) pdm09 moderat i greu (aquells casos que requeriren ingrés en un hospital pediàtric de tercer nivell) en la població pediàtrica en el nostre medi. - Descriure la malaltia per grip A (H1N1) pdm09 en pacients pediàtrics en tractament per leucèmia limfàtica aguda, tant els ingressats com els que es va optar per tractar i seguir ambulatòriament. - Descriure els valors de càrrega viral de grip A (H1N1) pdm09 al moment del diagnòstic en relació amb variables epidemiològiques i clíniques en els pacients ingressats amb clínica respiratòria. PACIENTS I MÈTODES - Es dissenyen tres estudis amb recollida prospectiva de dades epidemiològiques, clíniques, analítiques i microbiològiques de nens amb malaltia confirmada amb detecció del material genètic del virus de la grip A (H1N1) pdm09 en aspirat nasofaringi. Els tres estudis es realitzen en un hospital pediàtric de tercer nivell (Hospital Sant Joan de Déu, Universitat de Barcelona) i els resultats es presenten en la memòria d’aquesta tesi. La recollida de dades es porta a terme durant la temporada pandèmica 2009-2010. S'efectuen els procediments estadístics pertinents per al tractament de dades. RESULTATS - El perfil del nen ingressat amb malaltia per grip A (H1N1) pdm09 és el d'un nen prèviament sa preescolar o bé el d'un nen d'edat escolar amb malaltia de base. La dificultat respiratòria i la hipoxèmia són el motiu principal d'ingrés, encara que també s'observen manifestacions extrapulmonars (neurològiques i cardíaques principalment). Les malalties cròniques pulmonars i neurològiques són els grups més importants de pacients que tenen malaltia de base i que requereixen ingrés. D'entre ells, els pacients amb malalties neurològiques suposen el principal grup de malalties cròniques d'entre els que requereixen ingrés a la Unitat de Cures Intensives Pediàtriques (UCIP). En els pacients que requereixen ingrés en UCIP trobem un major temps d'evolució de la malaltia abans d'iniciar el tractament amb oseltamivir i aquest retard en l'inici del tractament antiviral es relaciona amb una major risc d'ingrés en UCIP en el model multivariant. - Els nens amb leucèmia limfàtica aguda en fases de tractament més intensiu presenten una malaltia per grip més greu (broncopneumònia). Els nens en tractament de manteniment no presenten cap complicació amb tractament amb oseltamivir. - Els valors de càrrega viral al diagnòstic es correlacionen negativament amb el temps de durada de la clínica en el moment de fer la recollida de la mostra. Tenir una càrrega viral alta havent passat 5 o més dies des de l'inici de la clínica es relaciona amb un major risc de malaltia greu per grip A (H1N1) pdm09 (necessitat de tractament amb ventilació mecànica invasiva o no invasiva). / “INFLUENZA A(H1N1)PDM09: MODERATE AND SEVERE DISEASE IN THE PEDIATRIC PATIENT. VIRAL LOAD AT DIAGNOSIS AS A BIOMARKER OF SEVERITY.” TEXT: INTRODUCTION A new influenza virus was identified in April 2009 in humans. The influenza A (H1N1) pdm09 disease affected hundreds of children in our country during the pandemic season (2009-2010). OBJECTIVES - To describe the moderate and severe influenza A (H1N1) pdm09 disease (cases requiring for admission in a tertiary pediatric hospital) in children of our setting. - To describe the influenza A (H1N1) pdm09 disease in pediatric patients with acute lymphatic leukemia. - To describe the influenza A (H1N1) pdm09 viral load values at diagnosis in hospitalized children with respiratory symptoms and their relations with epidemiological and clinical variables. PATIENTS AND METHODS - Three different studies were designed and their results are presented. The studies were performed in a tertiary pediatric hospital (Hospital Sant Joan de Déu, University of Barcelona). Data collection was carried out during the pandemic season (2009-2010) in children with confirmed infection with a real-time RT-PCR. RESULTS - A previously healthy infant or a school-aged patient with underlying disease was the profile of the hospitalized child with influenza A (H1N1) pdm09 infection. Respiratory distress and hypoxemia were the main reasons for admission, although extrapulmonary manifestations were also observed (mainly neurological and cardiac). Children with chronic pulmonary diseases or with neurological disorders were the most important groups of patients with an underlying disease of those who required hospitalization. Patients with neurological chronic diseases more often required admission to the Pediatric Intensive Care Unit (PICU). Delays in starting treatment with oseltamivir were associated with an increased risk of admission to PICU in a multivariate model. - Children with acute lymphatic leukemia in intensive treatment phases developed a more severe influenza disease. Children in maintenance treatment phase had not complications. All of them were treated with oseltamivir. - The values of viral load at diagnosis were correlated negatively with the duration of the symptoms at the moment of sampling. To have a high viral load after 5 or more days of the onset of clinical symptoms was associated with an increased risk of severe illness (requiring for mechanical ventilation) due to influenza A (H1N1) pdm09 infection.

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In den vergangenen Jahren wurde ein Anstieg der Anzahl infektiöser Gastroenteritiden beobachtet, welche durch Viren hervorgerufen wurden. In vielen Fällen ließen sich Infektionen auf den Verzehr kontaminierter Lebensmittel zurückführen. In diesem Zusammenhang wurde der Begriff der sogenannten „food borne viruses“ geprägt. Welche Bedeutung Rohwurstprodukten bei der Übertragung humanpathogener Viren zukommt, kann derzeit nur anhand weniger objektiver wissenschaftlicher Fakten eingeschätzt werden. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit Studien zu Tenazität und Inaktivierung von Viren in Rohwurstprodukten. Dabei wurde ECHO-Virus stellvertretend für die Spezies humaner Enteroviren untersucht. Enteroviren zeichnen sich durch eine hohe Tenazität aus. Als ein wichtiger Vertreter kann Polio-Virus angeführt werden, welches bekanntlich durch Lebensmittel übertragbar ist. Im Zuge der aktuellen Problematik mit aviären Influenzaviren wurden stellvertretend zwei niedrigpathogene Isolate aviärer Influenzaviren für die Versuchsreihen gewählt. Die gewonnenen Ergebnisse sollten dazu beitragen, die Rolle des Lebensmittels Rohwurst bei der Übertragung lebensmittelassoziierter Virusinfektionen besser abschätzen zu können (hinsichtlich einer Risikobewertung) und Aussagen hinsichtlich möglicher Maßnahmen zur Risikominimierung zu ermöglichen. vorgenommen werden.

Es wird angenommen, dass das Influenzavirus-Glykoprotein Hämagglutinin (HA) für seine Funktion sowohl bei der Virusfreisetzung als auch bei der Fusion von viraler und zellulärer Membran mit Cholesterin- und Sphingolipidreichen Domänen, sogenannten Membran-Rafts, assoziiert sein muss. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Membran-Raft-Affinität von HA in lebenden Zellen mittels FLIM-FRET gemessen werden. Dabei wurde mit Hilfe der Fluroreszenz-Lebenszeit-Messung (FLIM) der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von fluoreszenzmarkiertem HA auf einen etablierten Raft-Marker bestimmt. Diese Messungen zeigten, dass beide Proteine in gemeinsamen Klustern in der Plasmamembran vorkommen. Durch Cholesterinentzug und durch den Einsatz von Cytochalasin D, welches die Mikrofilamente zerstört, konnte diese Klusterbildung reduziert werden. Demnach tragen sowohl die Membran-Rafts als auch das Aktinnetzwerk zu dieser Klusterbildung bei. Mittels FLIM-FRET konnte zusätzlich bestätigt werden, dass die Signale für die Detergenslöslichkeit von HA in Triton-Extraktionsexperimenten, die Palmitylierung und die stark hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der Transmembrandomäne (TMD), auch im lebenden System eine wichtige Rolle spielen. Zusätzlich konnten biochemische Experimente zeigen, dass die hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der HA-TMD den intrazellulären Transport, nach der Trimerbildung, entscheidend verzögern. Diese Verzögerung ist vermutlich auf einer erschwerten Integration dieser Proteine in die Membran-Rafts begründet. Die virale Fusion mit der Wirtszellmembran wird durch eine pH5-Behandlung vermittelte Konformationsänderung von HA ausgelöst. FLIM-FRET-Messungen zeigten für die pH5-Konformation von HA eine verglichen mit der pH7-Konformation verringerte Klusterbildung mit dem Raft-Marker. Somit ist offensichtlich, dass die Membranfusion-vermittelnde HA-Konformation eine verringerte Raft-Affinität besitzt. Diese verringerte Raft-Affinität könnte eine wichtige Rolle bei der Störung der Lipide an der Fusionsstelle spielen und somit die Bildung und/oder Vergrößerung der Fusionspore erleichtern. / It has been supposed that the hemagglutinin (HA) of influenza virus is recruited to cholesterol- and sphingolipid-enriched domains, also named membrane-rafts, to accomplish its function in virus budding and membrane fusion. This study aimed at verifying the affinity of HA for membrane-rafts in living cells using fluorescence-lifetime imaging microscopy to measure Förster’s resonance energy transfer (FLIM-FRET). FLIM-FRET revealed strong clustering between a fluorescence-tagged HA-protein and a well-established raft-marker in CHO cells. Clustering was significantly reduced when rafts were disintegrated by cholesterol depletion and when microfilaments were disrupted with cytochalasin D. Thus, membrane-rafts as well as the actin meshwork contribute synergistically to clustering. Clustering was also reduced by the removal of the known signals for the association of HA with detergent-resistant-membranes, the palmitoylation and the first amino acids in the transmembrane region (TMR). Since these mutations are obviously important for the raft-association of HA their function during the transport through the ER and the Golgi-complex was studied. These investigations showed that the exchange of the first three amino acids of the HA-TMR led to a decelerated transport after trimer-formation of the protein, probably due to retarded integration of these proteins into membrane-raft domains. Mediating viral fusion with the host cell membrane requires an irreversible conformational change of HA. FLIM-FRET studies of this low pH conformation unveiled that the clustering with the raft-marker is decisively reduced compared to the pre-fusion conformation of the protein. It might be assumed that the fusion-mediating conformation of HA reduces the proteins affinity for membrane-rafts. Therefore it is likely that this reduced affinity for rafts after the conformational change is relevant to cause perturbation of lipids at the fusion site and thereby facilitating the formation and/or enlargement of the fusion pore.

Einleitung: Aviäre Influenzaviren (AIV) gehören zu den Influenza A-Viren (IAV) und sind sehr wandelbar. Die Bandbreite der Erkrankungsverläufe reicht, abhängig von Faktoren wie Virussubtyp und -stamm oder der Wirtstierart, von einer asymptomatischen Erregerausscheidung, z. B. bei Wasservögeln, über ausgeprägte respiratorische Erkrankungen bei vielen Säugern einschließlich des Menschen bis hin zu systemischen Infektionen mit Nekrosen und Entzündungen in vielen Organen und hoher Letalität, häufig bei Hühnern und Puten und in Verbindung mit hochpathogenen AIV (HPAIV). Weltweit und auch in Deutschland dauert aktuell ein AIV-Ausbruch an, sodass eine Gefährdung für die Tiergesundheit und aufgrund des zoonotischen Potenzials auch für den Menschen besteht. Im Gegensatz zu galliformen Spezies steht bei anderen Vogelarten und insbesondere Säugern die Virulenz nicht in besonders enger Verbindung mit dem Vorhandensein einer polybasischen Spaltstelle des Hämagglutinins (HA), wobei die pathogenetische Grundlage dieser Virulenzunterschiede bisher wenig erforscht ist. Die vorliegende Arbeit ist Teil einer größeren tierexperimentellen Versuchsreihe zur näheren Charakterisierung von virulenzdeterminierenden Regionen des AIV-Genoms, insbesondere von Variationen in der Spaltstelle des HA und des Nichtstrukturproteins 1 (NS1), hinsichtlich ihres Einflusses auf Pathogenität, Virulenz und Gewebetropismus. Ziele der Untersuchungen: Die übergreifende Hypothese der Studien war, dass neben der Variation der Spaltstelle des HA weitere, im Genom der IAV kodierte Virulenzdeterminanten existieren, deren Auswirkungen tierartspezifisch unterschiedlich ausgeprägt sind. Ziel der ersten Studie war die Etablierung eines semiquantitativen Scoringsystems für die wichtigsten histopathologischen Veränderungen sowie die Verteilung des Virusantigens in verschiedenen Organen. Ziel der zweiten Studie war die Automatisierung der Messung des Virusantigens, um die Untersuchung einer höheren Probenzahl zu ermöglichen sowie einen schnellen Überblick über die jeweiligen Zielorgane zu erhalten. Ein weiteres Ziel aller vier vorgestellten Studien war die Anwendung der Methoden zur Untersuchung des Einflusses genetischer Variationen, insbesondere der Spaltstelle des HA sowie des NS1, auf den Gewebetropismus und den Grad der Läsionen in experimentellen Infektionen bei Hühnern, Puten und Enten. Tiere, Material und Methoden: In allen Studien wurden Gewebeproben verwendet, die aus verschiedenen, am Friedrich-Loeffler-Institut (Greifswald-Insel Riems) durchgeführten Infektionsexperimenten stammen. Gruppen von Hühnern, Puten und Enten wurden zur Untersuchung unterschiedlicher Fragestellungen mit einer Vielzahl an teilweise genetisch modifizierten AIV oculonasal oder intravenös infiziert: Insbesondere wurden H4-Viren mit Reassortment mit H5N1-Viren, H5N1-, H5N8- und H7N7-Wildtypviren, H9N2-Viren mit modifizierter HA-Spaltstelle sowie H7N1-Viren mit variabler Länge der C-terminalen Effektordomäne des NS1 näher betrachtet. Von einem Teil der infizierten Tiere wurde jeweils ein breites Organspektrum histopathologisch und immunhistochemisch untersucht. Zur Etablierung der semiquantitativen und quantitativen Untersuchungsmethoden sowie zur Analyse der Ergebnisse wurden die verfügbaren Gruppen aufgrund ihrer oft geringen Größe (2 bis 10 histopathologisch und immunhistochemisch untersuchte Tiere pro Gruppe) unter Berücksichtigung der jeweiligen Fragestellung teils zusammenfassend analysiert, wobei zum Teil auch Daten aus vorangegangenen Experimenten reevaluiert und miteinbezogen wurden. Ergebnisse der semiquantitativen Analysen aus verschiedenen Experimenten wurden mittels Kruskal-Wallis- und Mann-Whitney-U-Tests und die quantitativen Daten mittels Mann-Whitney-U- und Friedman-Tests miteinander verglichen sowie Spearman- und Pearson-Korrelationsanalysen durchgeführt. Ergebnisse: Es wurde ein semiquantitatives Scoringsystem zur Erfassung nekrotisierender Läsionen sowie der Virusverteilung in Parenchym- und Endothelzellen etabliert. Bei Anwendung dieses Systems zeigten sich teils signifikante, oft durch genetische Variationen in Virulenzfaktoren bedingte Unterschiede. So waren mit H7N7 HPAIV assoziierte, nekrotisierende Läsionen bei Puten größtenteils stärker ausgeprägt als bei Hühnern. Bei Hühnern zeigte sich zusätzlich ein Endotheltropismus. Dagegen fanden sich bei mit demselben Virus infizierten Enten keine nekrotisierenden Läsionen und kein Virusantigen. H9N2-Viren mit Variationen in der Spaltstelle des HA unterschieden sich insbesondere in der Schwere der klinischen Erkrankung bei Puten sowie im Verhalten in zellkulturbasierten Analysen. Bei einer Infektion von Puten mit H7N1-Viren, die eine variable Länge des NS1 aufwiesen, fand sich für die untersuchten Varianten eine systemische Streuung des Virusantigens mit Nekrosen bzw. nekrotisierender Entzündung und einer Depletion der lymphatischen Organe in ähnlicher Ausprägung. Auch bei weiteren Untersuchungen, z. B. bezüglich des Schweregrads der klinischen Erkrankung sowie der Virusreplikation, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Zudem wurde eine automatisierte Organauswahl sowie eine anschließende schwellenwertbasierte Messung des Virusantigens für sechs verschiedene Organe entwickelt. Auch hier fanden sich teils signifikante Unterschiede hinsichtlich des Gewebetropismus im Zusammenhang mit dem Infektionsweg. Die Ergebnisse der semiquantitativen und der quantitativen Untersuchungsmethoden zeigten eine signifikante positive Korrelation sowohl untereinander als auch jeweils mit Daten aus einer quantitativen reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Schlussfolgerungen: Die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden wurden validiert und zeigten eine Korrelation mit bisher verwendeten Untersuchungsmethoden sowie eine breite Anwendbarkeit, wenngleich eine Erprobung und Etablierung an einer größeren Probenzahl und Gruppengröße der Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein sollte. In den vorgestellten Studien konnte gezeigt werden, dass die polybasische Spaltstelle des HA die wichtigste Determinante für die Virulenz und den Endotheltropismus von H7N7 HPAIV bei Hühnern darstellt, jedoch nicht alle vorhandenen Virulenzunterschiede bei Puten und Enten erklären kann. Zudem weist die untersuchte genetische Variation der Spaltstelle des HA von H9N2 einen quantitativen Effekt auf die Virulenz in Puten auf. Die C-terminale Effektordomäne des NS1 scheint bei Puten hingegen keine wesentliche Rolle für die Virulenz und den Gewebetropismus zu spielen. Auch andere Faktoren wie der Infektionsweg können einen Einfluss auf die Virusverteilung nehmen. Wenngleich in diagnostischen Einzelfällen aufgrund der inhärenten Variabilität der Immunhistochemie eine qualitative Untersuchung das Mittel der Wahl bleibt, weisen die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden aufgrund ihrer studienübergreifenden Anwendbarkeit sowie ihrer biometrischen Auswertbarkeit entscheidende Vorteile für den Einsatz im experimentellen Bereich auf.

La grippe est une infection respiratoire responsable de complications respiratoires ou neurologiques nécessitant une prise en charge rapide et adaptée. L’émergence des technologies de séquençage à haut débit (NGS) permet l’étude des communautés microbiennes résidentes ainsi qu’une étude approfondie du génome des pathogènes impliqués. Cette thèse a pour objectif de caractériser le microbiome respiratoire et la diversité génomique virale des patients infectés par les virus grippaux, en corrélant les données clinicobiologiques recueillies. Après recueil des prélèvements respiratoires d’enfants hospitalisés entre 2010 et 2014, le séquençage de leur microbiome respiratoire a mis en évidence une augmentation de la diversité microbienne ainsi qu’une signature microbienne différentielle entre formes cliniques. Une répartition différentielle de taxons (OTU) permet la prédiction de complications chez les enfants infectés. L’étude d’échantillons respiratoires de patients adultes permettra de compléter la signature prédictive. Après validation des processus analytiques et bioinformatiques par reconstitution artificielles de quasi espèces et recueil de 125 prélèvements cliniques respiratoires, le séquençage du génome entier par NGS des virus grippaux permet de différencier les diversités initiales en fonction de la nature du virus infectant et de la complication. En comparaison du prélèvement initial précoce les échantillons prélevés successivement mettent en évidence une diversification différentielle entre les différents segments des virus grippaux infectant les patients, que ce soit chez les patients immunocompétents ou chez un patient immunodéprimé à l’excrétion prolongé / Influenza is a respiratory infection responsible for respiratory or neurological complications and require rapid and adapted management. The emergence of next-generation sequencing (NGS) allows the study of resident microbial communities as well as an in-depth study of the genome of the pathogens. This thesis aimed to characterize the respiratory microbiome and the viral genomic diversity of influenza virus infected patients, correlating these data to the collected clinical data. After sampling of respiratory specimens from hospitalized children between 2010 and 2014, the sequencing of their respiratory microbiome revealed an increase in microbial diversity and a differential microbial signature between clinical forms. A differential taxon distribution (OTU) allows the prediction of complications in infected children. The study of adult respiratory samples will complete the predictive signature.After validation of the analytical and bioinformatic processes by artificial reconstitution of quasi-species and collection of 125 respiratory clinical specimens, the sequencing of the whole genome by NGS of the influenza viruses allow to differentiate the initial diversities according to the nature of the infecting virus and the complication. Compared to early samples, specimen sampled successively show a differential diversification between the different segments of influenza viruses, whether in immunocompetent patients or in an immunocompromised patient with prolonged excretion

La grippe porcine est une infection enzootique touchant 50% du cheptel français. Elle passe parfois inaperçue, mais peut également induire une forte morbidité au sein des lots d’animaux touchés, entraînant une baisse des performances zootechniques et des pertes économiques importantes. La sévérité de l’infection à virus influenza A chez le porc peut dépendre de divers facteurs, comme les virus eux-mêmes, les pratiques d’élevage, le statut immunitaire des animaux, les infections concomitantes par d’autres pathogènes respiratoires, etc. De la même manière, diverses formes épidémiologiques de la grippe existent en élevage. Ainsi, des infections peuvent se répéter à un âge déterminé, sur toutes les bandes successives d’un élevage, notamment chez des jeunes présentant une immunité passive. Afin de mieux comprendre cette diversité clinique et épidémiologique de la grippe porcine, et aider à l’élaboration de stratégies d’intervention adéquates pour le contrôle de la maladie, nous avons cherché à apporter de nouvelles connaissances quant à certains facteurs pouvant favoriser l’exacerbation du syndrome grippal et/ou son caractère récurrent, et plus généralement aux mécanismes sous-jacents à la pathogenèse des virus influenza A chez le porc, en relation avec les réponses de l’hôte infecté. Nous avons d’abord comparé, suite à inoculations expérimentales de porcs exempts d’organismes pathogènes spécifiés, la pathogénicité des deux virus influenza porcins les plus fréquemment rencontrés chez le porc en France, l’un du lignage européen « avian-like swine H1N1 » (H1avN1), l’autre du lignage européen « human-like reassortant swine H1N2 » (H1huN2), seuls ou en association avec Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), autre pathogène respiratoire répandu en élevage. Nous avons montré que l’infection H1huN2 induit une pathologie plus marquée que l’infection H1avN1, et que la pré-infection des porcs par Mhp induit une exacerbation de l’infection H1avN1, mais pas H1huN2. Nous avons utilisé le modèle de co-infection Mhp/H1avN1 pour évaluer deux approches alternatives qui permettraient de diminuer l’impact des infections grippales et de leurs complications : l’apport de composés aux propriétés antioxydantes via l’alimentation ; et la restriction alimentaire de courte durée. Dans ces deux cas nous avons montré des effets bénéfiques sur les paramètres zootechniques pendant les jours suivant l’infection grippale. Ce travail a également apporté de nouvelles connaissances quant aux modifications des marqueurs plasmatiques de stress oxydant, ainsi que sur les modifications métaboliques faisant suite à la co-infection Mhp/H1avN1. La sévérité des manifestations cliniques de la grippe étant liée à la qualité de la réponse immunitaire mise en place chez l’hôte infecté, nous avons entrepris d‘étudier les réponses immunitaires du porc touché par la grippe et d’évaluer l’impact de facteurs tels que la présence de Mhp ou d’anticorps d’origine maternelle sur ces réponses. Nous avons ainsi montré que l’infection virale induit une inflammation et une réponse interféron. La pré-infection par Mhp exercerait un effet additif sur cette inflammation et pourrait favoriser la persistance du virus dans le poumon. Nous avons également montré que la présence d’immunité passive protège cliniquement le porcelet mais n’empêche pas l’excrétion du virus, retarde la réponse lymphocytaire T et inhibe la réponse humorale post-infectieuse. Malgré la réponse immunitaire humorale défaillante, les animaux étaient totalement protégés d’une seconde infection homologue lorsque les anticorps maternels avaient disparus. Ces travaux ont permis d’apporter de nouvelles connaissances sur les facteurs influençant l’infection grippale en élevage porcin ainsi que sur les mécanismes sous-jacents, ce qui est une prérequis pour l’amélioration des mesures de lutte et de maitrise de la maladie. Ils permettent, d’envisager d’améliorer la santé des animaux en agissant sur leur régime alimentaire. / Swine influenza is an enzootic infection affecting 50% of the French livestock. The infection can be unnoticed but can also induce high morbidity among batches of affected animals, resulting in lower production performance and significant economic losses. The severity of influenza A virus in pig is influenced by many factors such as the virus strain, husbandry practices, the immune status of animals, concomitant infections with other respiratory pathogens, etc. In the same way, various epidemiological forms of influenza exist in farms. Thus, infections can be repeated in all successive batches within a farm, especially among young animals with passive immunity. In order to better understand the clinical and epidemiological diversity of the swine flu, and help develop appropriate strategies to control the disease, we tried to bring new knowledge about factors that promote the exacerbation of the flu syndrome and/or its recurrence, and more generally to give new information about the mechanisms underlying the pathogenesis of influenza viruses in pigs, in relation to the response of the infected host. Firstly, we compared, through experimental infections of specific pathogen free pigs, the pathogenicity of the two swine influenza viruses mostly detected in pigs in France, i.e. one from the European “avian-like swine H1N1” lineage (H1avN1) and the other one from the European “human-like reassortant swine H1N2” lineage (H1huN2), each one alone or in co-infection with Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), another respiratory pathogen widespread in French farms. We showed that the H1huN2 infection induced a more marked pathology than the H1avN1 infection, and that Mhp pre-infection induced the exacerbation of the H1avN1, but not the H1huN2, infection. Then, we used the Mhp/H1avN1 co-infection model to evaluate alternative approaches that could reduce the impact of influenza infections and their complications: firstly, a supply of compounds with antioxidant properties in food; and secondly, a feed restriction of short duration. In both cases, we showed beneficial effects on zootechnical parameters the days following influenza infection. This work has also brought new knowledge on modulation of oxidative stress markers in plasma, as well as metabolic changes following the co-infection with Mhp and H1avN1 in pigs. The severity of flu clinical manifestations being related, among other, to the quality of the immune responses developed by the infected host, we studied these responses in pigs experimentally infected by H1avN1 and assessed the impact of factors such as the presence of Mhp or maternal derived antibodies on these responses. We showed that the viral infection induced inflammation and interferon response. The Mhp pre-infection exerted an additive effect on inflammation of lung tissue and may promote the virus persistence in the lung. Finally, we have shown that the presence of maternally-derived immunity protected the piglets clinically but did not prevent viral shedding, delayed the T cell response and strongly inhibited the post-infectious humoral response. However, despite the failed humoral immune response, animals were completely protected from a second infection occurring when maternal antibodies had disappeared. Therefore, this work have brought new knowledge on factors influencing influenza infection in pig as well as the underlying mechanisms, which is a prerequisite for improving disease control. They allow, between-other, to consider improving the health and welfare of animals by acting on their diet.

Les huit ARN viraux (ARNv) génomiques des influenzavirus de type A sont sélectivement empaquetés dans les virions, vraisemblablement sous la forme d’un complexe supramoléculaire maintenu par des appariements ARN/ARN entre signaux d’empaquetage. Afin d’améliorer la compréhension des règles qui gouvernent ce mécanisme, nous avons déterminé le réseau d’interactions formé entre les ARNv de la souche modèle de laboratoire A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Nous avons ensuite défini, au nucléotide près et par deux approches in vitro, les séquences des ARNv impliquées dans la formation de certaines interactions. Le rôle fonctionnel de deux d’entre elles a été testé en contexte infectieux. Nous avons également poursuivi l’étude d’une interaction identifiée au laboratoire entre deux ARNv de la souche A/Moscou/10/99 (H3N2) circulante. Enfin, nous avons collaboré avec le Dr L. Brown (Australie) sur l’étude du rôle d’une interaction entre deux ARNv de la souche A/Udorn/307/72 (H3N2). / The genome of influenza A viruses comprises eight viral RNAs (vRNAs) likely to be selectively packaged into progeny virions as organized supramolecular complexes where vRNAs are held together by base pairing within the packaging signals. To better understand the rules governing this mechanism, we investigated the vRNA/vRNA interaction network of the A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) strain. We then identified, at the nucleotide level, using two in vitro approaches, the vRNA sequences involved in several of the interactions. Two of them were functionally tested in an infectious context. We also studied an interaction previously identified in the laboratory between two vRNAs belonging to the circulating A/Moscow/10/99 (H3N2) strain. Finally, we collaborated with Dr L. Brown (Australia) in order to assess the role of an interaction between two vRNAs of the A/Udorn/307/72 (H3N2) strain.