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Bluthochdruck zählt zu einer der häufigsten Zivilisationskrankheiten und ist der Hauptfaktor für die Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen. Das Präventionspotenzial bei Hypertonie ist sehr hoch, da lebensstilassoziierte Faktoren wie Übergewicht, hoher Kochsalz- und Alkoholkonsum oder Stress die Entstehung eines erhöhten Blutdrucks wesentlich begünstigen. Daher wird eine antihypertensive Therapie meist mit nicht-medikamentösen Maßnahmen eingeleitet. Für die Regulation des Blutdrucks ist die nähere Betrachtung des Angiotensin-Converting Enzymes (ACE) wichtig, da es eines der Schlüsselenzyme des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems und des Kallikrein-Kinin-Systems darstellt. Die Möglichkeit, dass ACE-inhibierende Peptide aus Lebensmittelproteinen über die Nahrungsmittelaufnahme einen positiven physiologischen Effekt auf den Blutdruck ausüben, ist ein vielversprechender Ansatz zur Unterstützung einer nicht-medikamentösen Therapie bei Hypertonie. In der Literatur sind zahlreiche Peptide beschrieben, welche eine inhibitorische Wirkung auf das ACE in vitro besitzen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Klasse der tryptophanhaltigen Dipeptide, die in der Literatur als potente, natürliche ACE-Inhibitoren beschrieben sind. Die tryptophanhaltigen Peptide wurden hinsichtlich ihrer Gewinnung, ihrer Hemmwirkung auf das Zielenzym und bezüglich ihrer Bioverfügbarkeit in vitro und in vivo untersucht.

Während meiner Dissertation beschäftigte ich mich mit der Synthese von polyhalogenierten Pyrrolalkaloiden. Im Zentrum der Darstellung dieser Verbindungen stand die von mir in meiner Diplomarbeit erfolgreich zur Synthese von Pentabrompseudilin angewandte silber-katalysierte Cyclisierung von N-tosylsubstituierten Homopropargylaminen. So konnte das Pentachlorpseudilin in der zweiten Totalsynthese überhaupt sowie mehrere gemischt halogenierte synthetische Derivate aufgebaut werden. Diese Verbindungen konnten in einer Kooperation mit Herrn Prof. Gutzeit aus der Fachrichtung Biologie der TU Dresden und Herrn Prof. Manstein von der Medizinischen Hochschule Hannover, als hochwirksame Myosin ATPase-Inhibitoren identifiziert werden. Bei den verschieden halogenierten Verbindungen ließen sich deutliche Unterschiede in der inhibitorischen Aktivität feststellen. Ein zum Pentabrompseudilin benzologes Indolderivat, welches in einer kurzen Synthese aufgebaut werden konnte, war hingegen nicht aktiv. Im zweiten Teil der Promotion beschäftigte ich mich in einer Kooperation mit Dr. Kurzchalia vom Max-Planck-Institut für Molekulare Zellbiologie und Genetik (Dresden) mit der Synthese von hormonell aktiven Steroiden, speziell den Cholesten-26-säuren, welche Liganden für den hormonellen Rezeptor DAF-12 des Nematoden Caenorhabditis elegans repräsentieren. Die an C-25 R-konfigurierten Säuren waren in der Literatur mit einer deutlich geringeren Aktivität als die 25S-Säuren beschrieben. Die 25R-Steroide waren synthetisch leicht aus kommerziell erhältlichem Diosgenin zugänglich. So konnten alle drei 25R-Säuren in kurzen Synthesen dargestellt werden. In deren Verlauf wurden verschiedene Oxidations- und Schutzgruppenreaktionen eindrucksvoll angewendet. Für die Einführung der 25S-Konfiguration in der Seitenkette sollte eine EVANS-Aldolreaktion an geeignetem Startmaterial angewandt werden. In der Tat führte die Verwendung eines chiralen Oxazolidinons stereoselektiv zum gewünschten Enantiomer in sehr guten Ausbeuten, selbst bei großen Ansätzen. Zur weiteren Transformation musste die durch die Aldolreaktion eingeführte Hydroxygruppe an C-24 entfernt werden. Dies gelang in exzellenter Ausbeute mit Hilfe einer radikalischen Deoxygenierung nach BARTON und MCCOMBIE. So konnte in acht Stufen ein zentrales Syntheseintermediat gewonnen werden, dass in alle drei Naturstoffe überführt werden konnte. Damit waren ausreichende Mengen für biologische Untersuchungen hergestellt worden. Mit der gesättigten (25S)-Dafachronic Acid konnte ein neuer Ligand für DAF-12 synthetisiert werden. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass die Existenz einer Doppelbindung in den Cholesten-26-säuren für die biologische Aktivität unerheblich ist. Für weitere biologische Tests konnten neue Normethylderivate des Cholesterols gewonnen werden. Diese zeigten zum Teil ungewöhnliche biologische Aktivität. Außerdem wurden Versuche zu an verschiedenen Positionen bromierten Cholesterolderivaten unternommen. Im letzten Teil meiner Dissertation konnten neue hoch hydroxylierte Steroide dargestellt werden, die in einer Kooperation mit Prof. Franzblau vom Institute for Tuberculosis Research (Chicago, USA) auf ihre Aktivität gegen Mycobacterium tuberculosis getestet werden sollten. Dabei konnte eine ungewöhnliche 1,2-anti-Hydroborierung beoachtet werden, deren Mechanismus noch genauer untersucht werden muss.

NF1 ist eine autosomal dominante Erbkrankheit, die durch inaktivierende Mutationen im Neurofibromin-Gen verursacht wird. NF1 manifestiert sich durch eine erhöhte Tumor-Inzidenz des neuralen Gewebes in der Haut (Neurofibroma). Neben diesen häufigeren klinischen Manifestationen haben rund 50% der NF1-Patienten Skelett-Anomalien. Häufiger sind Röhrenknochen betroffen, die klinischen Symptome reichen von Tibia-Krümmung über Spontanfrakturen bis hin zu Nonunions. Diese Studie analysiert den Heilungsverlauf von Femurfrakturen in Nf1Prx1- Mäusen. Der Frakturkallus von Mäusen wurde an den Tagen 7, 10, 14 und 21 durch µCT, Histologie und molekulare Analysen evaluiert. µCT und histologische Analysen haben eine beeinträchtigte Knochenheilung in Nf1Prx1-Mäusen gezeigt. Eine erhöhte periostale Knochenbildung in den frühen Stadien der Heilung war zu beobachten, sowie eine reduzierte, aber anhaltende Knorpelbildung und Bindegewebs-Akkumulation innerhalb der Fraktur. Wir konnten zeigen, dass der normalen Heilungsprozess durch dieses Bindegewebe behindert wird, welches durch alpha smooth muscle actin-positive Myofibroblasten gebildet wird, die ihrerseits aus einer bisher noch nicht identifizierten Muskelfaszie abgeleitet sind. Dieser Zusammenhang wird durch eine Microarray-Analyse der Kallus-Gewebe bestätigt, die ergab, dass durch den Knock-Out Gene reguliert wurden, die in Physiologie, Proliferation und Differenzierung von Muskelzellen involviert sind. Darüber hinaus waren extrazelluläre-Matrix-Gene in den Mutanten hoch regeuliert. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass eine Ähnlichkeit des Heilungsverlauf zwischen dem Nf1Prx1-Mausmodell und NF1-Patienten besteht. Folglich kann an diesem Mausmodell untersucht werden, durch welche Mechanismen die Mutationen im NF1 zu Knochenheilungsstörungen führen. Außerdem konnte in einer Pilotstudie der Effekt des Neurofibromin-Mangels auf die Knochenheilung durch Behandlung mit MEK-Inhibitoren in vitro und in vivo weitestgehend behoben werden / Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant genetic disease resulting from inactivating mutations in the gene encoding the protein neurofibromin. NF1 patients – around 50% – have abnormalities of the skeleton. Long bones are often affected, and the clinical signs range from tibial bowing to spontaneous fractures and even non-unions. Moreover, NF1 mice models could provide the understanding of the cell types involved in the resulting non-union and their behavior. This study analyzed the healing progress of femur fractures in a model of NF1 long bone dysplasia. Fracture callus was assessed at days 7, 10, 14, and 21 by µCT, histology, biomechanics, and molecular analyses. Bone healing was impaired in Nf1Prx1 mice femoral fracture. Results revealed increased periosteal bone deposition at the early stages of healing, decreased but persistent cartilage formation concomitant with fibrous tissue accumulation within the fracture site, decreased torsional stiffness, decreased bone mineral density, and increased fibrous tissue infiltration in the callus of mutant mice. This fibrous tissue accumulation hindered bone fracture healing, and was deposited by alpha smooth muscle actin-positive myofibroblasts, which were derived from a yet unidentified muscle fascia. This is further supported by the microarray analysis of callus tissues showing that genes crucial to muscle cells physiology, proliferation and differentiation were affected. In addition, extracellular matrix related genes were up-regulated in the mutants. In summary, this study shows a resemblance in the healing progression to the Nf1Prx1 mice model and NF1 patients, thereby, confirming the suitability of this mice model to explore the mechanism by which mutations in NF1 lead to non-unions. Moreover, in vitro and in vivo pilot assessments of MEK inhibitor treatment demonstrated a potential remedy for the lack of neurofibromin in bone healing.

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HMG-CoA-Reduktasehemmer, sogenannte Statine, und regelmäßige körperliche Aktivität sind mit vermindertem Auftreten zerebrovaskulärer Ereignisse und Zunahme der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) assoziiert. Die Erhöhung der eNOS-mRNA ist mit verbessertem zerebralen Blutfluß und Neuroprotektion bei einer zerebralen Ischämie verbunden. Vor dem Hintergrund, daß Thrombosen und Thrombembolien die häufigste Ursache zerebro- und kardiovaskulärer Ereignisse darstellen, sind NO-vermittelte antithrombotische Effekte jedoch kaum untersucht. Ebenso wenig ist über mögliche Absetzeffekte nach Beendigung einer Statintherapie bekannt. Daher untersuchten wir, ob die Statine Atorva- und Rosuvastatin eNOS-abhängig zu Neuroprotektion führen und verglichen die Effekte mit einem zweiten eNOS-regulierenden Mechanismus: der regelmäßigen körperlichen Aktivität. Dazu quantifizierten wir nach entsprechender Vorbehandlung eNOS auf mRNA- und Proteinebene aus Aorten, Hirngewebe sowie Thrombozyten und bestimmten die Läsionsvolumina im experimentellen Schlaganfallmodell. Außerdem untersuchten wir nach Statingabe Thrombozytenfunktionsparameter sowie Blutungszeit und Thrombusformation in vivo. Zwei bzw. vier Tage nach Absetzen der Statinbehandlung wiederholten wir die eNOS-Messungen, Schlaganfallexperimente und Gerinnungsanalysen. Wir fanden nach Statinvorbehandlung cholesterinunabhängig eine Zunahme der eNOS, was mit Neuroprotektion im Schlaganfallmodell und verminderter Gerinnungsaktivität verbunden war. Nach Absetzen der Behandlung kam es jedoch zu einer drastischen Abnahme der eNOS, was mit deutlichem Anstieg der Thrombozytenmarker im Plasma und schnellem Verlust der beobachteten positiven Effekte auf Läsionsgröße und Gerinnungssystem einherging. Regelmäßige körperliche Aktivität führt ebenfalls eNOS-abhängig zu verbessertem zerebralen Blutfluß und kleineren Läsionsvolumina bei zerebraler Ischämie. Diese Ergebnisse sind mit den Daten nach Statingabe vergleichbar. Wir demonstrieren einen Klasseneffekt der Statine für eNOS-vermittelte Neuroprotektion im zerebralen Ischämiemodell. Durch die zusätzliche gerinnungshemmende Wirkung könnte diese Wirkstoffklasse neue Ansätze zur prophylaktischen Schlaganfallbehandlung unabhängig vom Cholesterinspiegel eröffnen. Ein Absetzen der Statinbehandlung kann jedoch zu einer Zunahme der Schlaganfallgröße führen und sollte möglicherweise bei Risikopatienten vermieden werden. Regelmäßiges körperliches Training führt zu vergleichbarer Erhöhung der eNOS sowie Neuroprotektion und bietet damit eine sinnvolle Verknüpfung aus prophylaktischer Schlaganfallbehandlung und Rehabilitation. / HMG-CoA-reductase inhibitors, so called statins and regular physical activity are associated with less cerebrovascular events and increase of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Raise of eNOS-mRNA results in cerebral blood flow (CBF) augmentation which refers neuroprotection after ischemic stroke. It is known that thromboses cause the most cerebrovascular events, but nitric oxide (NO) dependent antithrombotic effects are poor examined. In addition there are little information about effects after withdrawal of statin treatment. That is why we investigated Atorva- and Rosuvastatin regarding eNOS dependent neuroprotection and compared the effects with regular physical activity, the second eNOS enhancing mechanism. Therefore after corresponding pretreatment we quantified eNOS-mRNA and protein from aortas, brain tissue and thrombocytes and determined lesion volume after experimental middle cerebral artery occlusion (MCAo). Furthermore after statin treatment we measured marker of thrombocyte activation, as well as bleeding time and thrombus formation in vivo. Two and four days after withdrawal of statin treatment we repeated eNOS measurements, neuroprotection studies and coagulation analyses. We found eNOS upregulation independent from serum cholesterol level after statin pretreatment and this was associated with neuroprotection after ischemic stroke and decreased platelet activation. But after withdrawal of statin treatment eNOS expression was downregulated, which went along with clear upregulation of platelet activation and a rapid loss of the observed positive effects on lesion volume and hemostasis. Regular physical activity leads to an increase of eNOS, which we could correlate with CBF augmentation and improved outcome after MCAo. These results were comparable to the data after statin treatment. We demonstrate a class effect of statins for eNOS-dependent neuroprotection in our ischemia modell. Because of the additional antithrombotic effects statins may present a new approach to prophylactic stroke treatment independent from cholesterol level. Withdrawal of statin treatment may refer increased cerebral lesion volume and should be avoided in patients with risk for cerebrovascular events. Regular physical activity results in comparable eNOS dependent neuroprotection and offers a useful combination between prophylactic stroke treatment and rehabilitation.

HINTERGRUND: Gastrointestinale Nebenwirkungen unter NSAR, ASS und Phenprocoumon spielen eine bedeutende Rolle im klinischen Alltag. Im Rahmen der Einführung der COX-2 Inhibitoren sollten relevanten Ursachen für Ulcera und Blutungen im Bereich des oberen Gastrointestinaltraktes dargestellt und die Behandlungsstrategien verschieden ausgerichteter Krankenhäuser im klinischen Alltag verglichen werden. METHODEN: Es wurden stationär gastroduodenoskopierte Patienten einer Rheumaklinik und von Krankenhäusern der Grund- und Regelversorgung unter der Therapie mit NSAR, ASS, Phenprocoumon, Glukokortikoiden und COX-2 Inhibitoren im Rahmen einer offenen, multizentrischen Fallkontrollstudie verglichen. Des Weiteren wurden alle Patienten mit einer oberen gastrointestinalen Blutung oder einem Ulcus im Bereich des oberen Gastrointestinaltraktes in die Studie eingeschlossen. Der Einfluss einer Helicobacter pylori Infektion und einer Magenschutzprophylaxe wurde überprüft. ERGEBNISSE: Die höchsten Ulcusraten traten unter der Kombinationstherapie von NSAR und ASS auf. Patienten mit NSAR oder ASS hatten eine Ulcusrate von 35% bzw. 31%. Die Blutungsrate der Patienten mit ASS lag jedoch um 15% höher. Die COX-2 Inhibitoren zeigten mit einer Ulcusrate von 10% deutlich bessere Ergebnisse. Patienten mit einer Helicobacter pylori Besiedlung hatten eine signifikant erhöhte Ulcusrate (48% zu 34%), zeigten aber keine Unterschiede in der Blutungsrate. Der Anteil der Patienten mit einer Magenschutzprophylaxe betrug nur 17%. Die Blutungsrate der Patienten ohne Magenschutz lag bei 87%. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Im klinischen Alltag einer rheumatologischen Fachklinik treten gehäuft Ulcera unter NSAR auf. Unter den COX-2 Inhibitoren zeigte sich eine geringere Ulcusrate. Im Unterschied dazu haben in den Krankenhäusern der Regel -und Grundversorgung die Patienten mit einem Ulcus an erster Stelle eine Therapie mit ASS. Eine konsequent durchgeführte Magenschutzprophylaxe mit Protonenpumpeninhibitoren verhindert das Auftreten von gastrointestinalen Ulcera und Blutungen. / BACKGROUND: Gastrointestinal side effects under NSAR, ASS and Phenprocoumon play an important role in the clinical everyday life. In the context of the introduction of the COX-2 inhibitors relevant causes for ulcera and bleedings within the range of the upper gastrointestinal section should be represented and the treatment strategies of differently aligned hospitals in the clinical everyday life be compared. METHODS: Gastro duodenal syncopated in-patients of a hospital for rheumatic diseases and from state hospitals under the therapy with NSAR, ASS, Phenprocoumon, Glukokortikoiden and COX-2 inhibitors were compared within the context of an open, multi-centric drop control study. All patients with an upper gastrointestinal bleeding or an ulcus were included in the area of the upper gastrointestinal section of the study. The influence of a Helicobacter pylori infection and a stomach protection prophylaxis was examined. RESULTS: The highest ulcus rate arose under the combination therapy of NSAR and ASS. Patients with NSAR or ASS had a ulcus rate of 35% and 31% respectively. The bleeding rate of the patients with ASS was however around 15% higher. The COX-2 inhibitors showed clearly better results with an ulcus rate of 10 percent. Patients with a Helicobacter pylori colonization had a significantly increased ulcus rate (48% to 34%), however they showed no differences in the bleeding rate. The proportion of the patients with a stomach protection prophylaxis amounted to only 17 percent. The bleeding rate of the patients without stomach protection was 87%. CONCLUSIONS: In the clinical everyday life of a rheumatological specialized clinic ulcera under NSAR arise. Under the COX-2 inhibitors a smaller ulcus rate shows itself. In contrast to it, patients with an ulcus receive a therapy with ASS in the state hospitals. A consistently implemented stomach protection prophylaxis with proton pump inhibitors prevented the appearance of gastrointestinal ulcera and bleedings.

Amadori-Produkte werden spontan während der ersten Phase der Maillard-Reaktion aus reduzierenden Zuckern und Aminen wie Lysin gebildet. Sie entstehen während der Erhitzung von Lebensmitteln und in vivo. Der enzymatische Abbau solcher spontan gebildeten Produkte ist Thema dieser Arbeit. Ein Teil untersuchte die Rolle von Oligosaccharid-Amadori-Produkten während der Verdauung von Kohlenhydraten im Dünndarm. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit bekannten Glycosidase-Inhibitoren wurde eine hemmende Wirkung der Amadori-Produkte auf die Kohlenhydratverdauung vermutet. Der andere Teil beschäftigte sich mit Fructosamin-3-kinase (FN3K) und dessen verwandtem Enzym Fructosamin-3-kinase-related Protein (FN3K-RP) aus humanen Erythrocyten. Diese Ketosaminkinasen werden als Proteinreparaturenzyme betrachtet, sogar als enzymatische Verteidigung gegen Glykierung in vivo diskutiert. Durch ihre Reaktion entstehen jedoch auch hoch-reaktive 1,2-Dicarbonylverbindungen, die weitere Proteinschäden bewirken können. Noch ist nicht klar, ob die Ketosaminkinasen die pathophysiologischen Folgen der Glykierung verhindern oder fördern. In dieser Arbeit wurde die Substratspezifität von Ketosaminkinasen mit einer Reihe von Amadori-Produkten untersucht. Damit könnten Inhibitoren zur weiteren Enzymcharakterisierung oder sogar für pharmazeutische Anwendungen identifiziert werden. Außerdem wurde die Variabilität der Enzymaktivitäten von Mensch zu Mensch in einer Kohorte von 100 Probanden untersucht. Als Modell für die menschliche Kohlenhydratverdauung im Dünndarm wurden Caco-2-Zellen als Monolayer etabliert. Deren Sucrase-Isomaltase kann die alpha-glycosidische Bindung in Amadori-Produkten von Maltose und Maltotriose mit Lysin und auch in Maltulose hydrolysieren. Trotz der Aminogruppe hemmen diese Amadori-Produkte die Maltosehydrolyse nur schwach als konkurrierende Substrate. Lactulosyllysin konnte nicht durch die Lactase der Caco-2-Zellen hydrolysiert werden. Tagatosyllysin und die Heyns-Produkte Glucosyllysin und Mannosyllysin hemmten die Lactosehydrolyse schwach. Alle beobachteten Hemmeffekte sind wahrscheinlich zu schwach, um während der Verdauung in vivo bedeutsam zu sein. Für FN3K konnte Desoxypiperidinofructose als kompetitiver Inhibitor identifiziert werden (Kic 0,006 mM). FN3K zeigte nur geringe Selektivität gegenüber Amadori-Produkten verschiedener Amine, ausgenommen aromatischer Amine. FN3K-RP war in Erythrocyten wesentlich aktiver als FN3K, auch wenn die Aktivität nicht selektiv inhibiert werden konnte. Beide Enzymaktivitäten unterscheiden sich unter den 100 Probanden, mit einer Spannweite von 3 bis 12 mU/g Hämoglobin für FN3K und 60 bis 135 mU/g Hb für FN3K und FN3K-RP zusammen. Es scheint eine Verbindung zwischen der Ketosaminkinase-Aktivität in Erythrocyten und Nierenerkrankungen, familiär auftretendem Diabetes mellitus, sowie familiär aufgetretenen Herzinfarkten oder Schlaganfällen zu bestehen, wie orientierende Auswertungen zeigten. Deshalb ist eine genauere Untersuchung der physiologischen Bedeutung der Ketosaminkinasen nötig. / Amadori products are formed spontaneously from reducing sugars and amines, e.g. lysine, during the first phase of the Maillard reaction. They occur in heated food and in vivo. The thesis focuses on the enzymatic degradation of such spontaneously formed compounds. One part of this work investigated the faith and impact of oligosaccharide derived Amadori products during small intestinal carbohydrate digestion. Due to their structural similarity with known glycosidase inhibitors, an inhibitory action of Amadori products towards carbohydrate digestions was assumed. The other part dealt with fructosamine-3-kinase (FN3K) and its related protein (FN3K-RP) from human erythrocytes. Such ketosamine kinases are regarded as protein repair enzymes, maybe even an enzymatic defence against glycation in vivo. While deglycating protein bound Amadori products, however, they produce highly reactive 1,2-dicarbonyl compounds, which can lead to further protein damage. It is unclear, whether the ketosamine kinase action prevents or supports the pathophysiological effects of glycation. This work studied the substrate specifity of ketosamine kinases with a variety of Amadori products, which could result in inhibitors for further enzyme characterisation or even pharmaceutical uses. Further, the variability of both enzyme activities in a cohort of 100 subjects was examined. As a model for human small intestinal carbohydrate digestion, a Caco-2 cell monolayer was employed. Their sucrase-isomaltase is able to hydrolyse the alpha-glucosidic linkage in Amadori products of maltose and maltotriose with lysine, as well as in maltulose. Despite their amino group, those amadori products inhibited maltose hydrolysis merely weakly as competing substrates. Lactulosyl lysine on the other hand could not be hydrolysed by Caco-2 lactase. Tagatosyl lysine and the Heyns products glucosyl lysine and mannosyl lysine showed weak inhibition of lactose hydrolysis. All observed inhibitory effects are probably too weak to be of importance during carbohydrate digestion in vivo. Deoxypiperidinofructose was identified as a competitive inhibitor of FN3K (Kic 0,006 mM). FN3K acted rather non-specific towards Amadori products of different amines, except aromatic amines. FN3K-RP showed much higher activity in erythrocytes than FN3K, although its activity could not be inhibited selectively. Both enzyme activities vary among 100 subjects, with a range of 3 to 12 mU/g hemoglobin for FN3K and 60 to 135 mU/g hb for FN3K and FN3K-RP together. Relations of ketosamine kinase activity in erythrocytes with renal diseases, familial diabetes mellitus and familial cardiovascular events seem to exist. Thus, investigating the physiological impact of ketosamine kinases is necessary.

Referat: Background: Human African Trypanosomiasis (HAT) also called sleeping sickness is an infectious disease of humans caused by an extracellular protozoan parasite. The disease, if left untreated, results in 100% mortality. However, the available drugs are full of severe drawbacks and fail to escape the fast development of trypanosoma resistance. Due to the probable similarities in cell metabolism among tumor and trypanosoma cells, some of the current registered drugs against HAT were derived from cancer chemotherapeutic research. Here too, for the first time, we have demonstrated that the simple ester, ethyl pyruvate, comprises such properties. On the other hand initial studies have confirmed the efficacy of protease inhibitors in treatment of Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum and Leishmania major. However, studies on efficacy and specific proteases inhibition using HIV-1 protease inhibitors on T. brucei cells remain untouched. Methodology/Principal findings: The current study covers efficacy and corresponding target evaluation of ethyl pyruvate and HIV-1 protease inhibitors (ritonavir and saquinavir) on T. brucei cell lines using a combination of biochemical techniques including cell proliferation assays, enzyme kinetics, zymography, phase contrast microscopic video imaging and ex vivo drug toxicity tests. We have shown that ethyl pyruvate effectively kills trypanosomes most probably by net ATP depletion through inhibition of pyruvate kinase (Ki=3.0±0.29 mM). The potential of this compound as an anti-trypanosomal drug is also strengthened by its fast acting property, killing cells within three hours post exposure. This was demonstrated using video imaging of live cells as well as concentration and time dependency experiments. Most importantly, this drug produced minimal side effects in human erythrocytes and is known to easily cross the blood-brain-barrier (BBB) which makes it a promising candidate for effective treatment of the two clinical stages of sleeping sickness. Trypanosome drug resistance tests indicate irreversible killing of cells and a low chance of drug resistance development under applied experimental conditions. In addition to ethyl pyruvate our experimental study on HIV-1 protease inhibitors showed that both ritonavir (RTV) (IC50=12.23 µM) and saquinavir (SQV) (IC50=11.49 µM) effectively inhibited T. brucei cells proliferation. The major proteases identified in these cells were the cysteine- (~29kDa Mr) and metallo- (~66kDa Mr) proteases. Their proteolytic activity was, however, not hampered by either of these two protease inhibitors. Conclusion/Significance: Our results present ethyl pyruvate as a safe and fast acting drug. Hence, because of its predefined property to easily cross the BBB, it can probably be a new candidate agent to treat the heamolymphatic as well as neurological stages of sleeping sickness. Similarly, HIV-1 protease inhibitors, SQV and RTV, exhibited their antitrypanosomal potential but require further anlysis to identify their specific targets.

The development of new therapeutical approaches, devised to foster the regeneration of neuronal circuits after injury and/or in neurodegenerative diseases, is of great importance. The impairment of dopaminergic projections is especially severe, because these projections are involved in crucial brain functions such as motor control, reward and cognition. In the work presented here, organotypic brain slice co-cultures of (a) the mesostriatal and (b) the mesocortical dopaminergic projection systems consisting of tissue sections of the ventral tegmental area/substantia nigra (VTA/SN), in combination with the target regions of (a) the striatum (STR) or (b) the prefrontal cortex (PFC), respectively, were used to evaluate different approaches to stimulate neurite outgrowth: (i) inhibition of cAMP/cGMP turnover with 3’,5’ cyclic nucleotide phosphodiesterase inhibitors (PDE-Is), (ii) blockade of calcium currents with nimodipine, and (iii) the co-cultivation with bone marrow-derived mesenchymal stromal/stem cells (BM-MSCs). The neurite growth-promoting properties of the tested substances and cell populations were analyzed by neurite density quantification in the border region between the two brain slices, using biocytin tracing or tyrosine hydroxylase labeling and automated image processing procedures. In addition, toxicological tests and gene expression analyses were conducted. (i) PDE-Is were applied to VTA/SN+STR rat co-cultures. The quantification of neurite density after both biocytin tracing and tyrosine hydroxylase labeling revealed a growth promoting effect of the PDE2A-Is BAY60-7550 and ND7001. The application of the PDE10-I MP-10 did not alter neurite density in comparison to the vehicle control. (ii) The effects of nimodipine were evaluated in VTA/SN+PFC rat co-cultures. A neurite growth-promoting effect of 0.1 µM and 1 µM nimodipine was demonstrated in a projection system of the CNS. In contrast, the application of 10 µM nimodipine did not alter neurite density, compared to the vehicle control, but induced the activation of the apoptosis marker caspase 3. The expression levels of the investigated genes, including Ca2+ binding proteins (Pvalb, S100b), immediate early genes (Arc, Egr1, Egr2, Egr4, Fos and JunB), glial fibrillary acidic protein, and myelin components (Mal, Mog, Plp1) were not significantly changed (with the exception of Egr4) by the treatment with 0.1 µM and 1 µM nimodipine. (iii) Bulk BM-MSCs that were classically isolated by plastic adhesion were compared to the subpopulation Sca-1+Lin-CD45--derived MSCs (SL45-MSCs). The neurite growth-promoting properties of both MSC populations were quantified in VTA/SN+PFC mouse co-cultures. For this purpose, the MSCs were seeded on glass slides that were placed underneath the co-cultures. A significantly enhanced neurite density within the co-cultures was induced by both bulk BM-MSCs and SL45-MSCs. SL45-MSCs increased neurite density to a higher degree. The characterization of both MSC populations revealed that the frequency of fibroblast colony forming units (CFU-f ) is 105-fold higher in SL45-MSCs. SL45-MSCs were morphologically more homogeneous and expressed higher levels of nestin, BDNF and FGF2 compared to bulk BM-MSCs. Thus, this work emphasizes the vast potential for molecular targeting with respect to the development of therapeutic strategies in the enhancement of neurite regrowth.