Orientador: Fernanda Ramos Gadelha, Sarah Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:55:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_MariaFernandaCastioni_M.pdf: 3658329 bytes, checksum: 103f7e9293b496d330ec2c6204037760 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Estima-se que existam de 18 a 24 milhões de portadores de doença de Chagas (DCR) no continente americano, entre os quais 5 a 6 milhões encontram-se no Brasil. Até o momento não foi descoberta a cura para a doença e no Brasil são registrados seis mil óbitos por ano relacionados à doença. Na evolução da DCR são descritas duas fases distintas: aguda e crônica. A denervação autonômica é fato bastante estudado e acredita-se que essa denervação esteja relacionada com as alterações no metabolismo dos hidratos de carbono, que são caracterizadas por recuperação deficiente dos níveis glicêmicos após a administração oral e intravenosa de glicose. Com base nesses dados, o presente estudo teve por objetivo avaliar os níveis glicêmicos e insulinêmicos em pacientes chagásicos crônicos, submetidos aos testes de tolerância à glicose oral (TTGO) e intravenosa (TTGIV), comparando-se os resultados a um grupo controle. O aumento das espécies reativas de oxigênio (EROs) apresenta um papel importante nas reações inflamatórias. Considerando a resposta do hospedeiro à infecção do T. cruzi, os níveis de duas enzimas antioxidantes catalase e glutationa redutase também foram determinados nos dois grupos. Não foram detectadas diferenças significativas entre os dois grupos tanto nos testes de tolerância a glicose com relação aos níveis plasmáticos de glicose, insulina e peptídeo C, assim como nas áreas sob as curvas desses parâmetros, quanto nas dosagens de catalase e glutationa redutase. Pode-se especular que os níveis de insulina e peptídeo C poderiam apresentar significância se esses parâmetros fossem avaliados nas diferentes formas da doença, já que na fase aguda o processo inflamatório é intenso / Abstract: It has been estimated that 18-24 million people in the American continent have Chagas' disease (DCR) and that 5-6 million live in Brazil. Up to now the cure for this disease has not been discovered and in Brazil occurs 6 thousand deaths / year related to this disease. In the evolution of DCR two phases are described: acute and chronic. The autonomic denervation is well studied. It is believed that this denervation is related to alterations in carbohydrate metabolism that is characterized by a deficient recovery in the glicemic levels after oral and intravenous administration of glucose. Based on these facts, the aim of this study was to evaluate the glicemic and insulinemic levels in chronic Chagas' disease patients, submitted to an oral (TTGO) and intravenous (TTGIV) glucose tolerance test, compared to a control group. The increase in the reactive oxygen species (ROS) has an important role in infIammatory reactions. Regarding the behavior ofthe host when infected with T. cruzi, the levels of two antioxidants enzymes ( catalase and glutathione reductase) were determined in both groups. No significant differences were observed in the two groups considering the glucose testes regarding the plasmatic levels of glucose, insulin and peptid C, and the area above the curve in ali parameters assayed and also in the catalase and glutathione reductase determinations. One hypothesis to explain these observations is that the insulin and peptid C levels may be significant if these parameters were evaluated in the different forros of the disease, since in the acute forro the infIammatory process is intense / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

El estrés crónico, en combinación con la sobrealimentación y la falta de ejercicio, contribuye al desarrollo del síndrome metabólico, aumentando el riesgo de enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2. Se ha demostrado que el estrés afecta a cada componente del síndrome metabólico y entre ellos, al síndrome de ovario poliquístico (SOP), principal causa de infertilidad en mujeres en edad fértil. Hemos descrito que el estrés por frío crónico en ratas provoca cambios morfológicos en los folículos ováricos similares a los encontrados en el SOP. Para conocer si este modelo de estrés está asociado a cambios metabólicos, determinamos la sensibilidad a insulina y el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa ovárica (factor involucrado en la génesis y mantención del SOP) y por ende, si el estrés es un factor potencial en el desarrollo del SOP. A nivel metabólico, los animales sometido a estrés por frío crónico aumentaron la sensibilidad a la insulina, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico. Al mismo tiempo, estos animales aumentaron su ingesta alimenticia, manteniendo la misma ganancia de peso que sus respectivos controles. La actividad nerviosa simpática ovárica aumentó cuando los ovarios de animales control fueron incubados con insulina, sin embargo, no hubo cambio en los ovarios de ratas estresadas. Estos resultados sugirieron una resistencia a la insulina tejido específico, la cual fue apoyada al determinar el nivel de mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4. Ambas moléculas de la ruta de señalización intracelular de insulina, disminuyeron en los ovarios de las ratas sometidas a estrés, siendo las células de la teca-intersticial en las que se observó preferencialmente esta disminución. Al administrar insulina intracerebroventricular (ICV), la actividad nerviosa ovárica no fue modificada, ni ocurrieron cambios en el desarrollo folicular, sin embargo, las ratas estresadas infundidas con insulina ICV no disminuyeron la ganancia de peso, la glicemia ni la insulinemia, como lo hicieron sus respectivos controles, apoyando una pérdida de sensibilidad a insulina hipotalámica inducida por el estrés. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por frío crónico intermitente provoca una resistencia a la insulina que es tejido específica, y que la insulina tiene un efecto estimulador de la actividad nerviosa simpática ovárica. Probablemente, la resistencia insulínica en ovario e hipotálamo son en parte responsables de los cambios en la función reproductiva y metabólica de la condición poliquística inducida por estrés crónico.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / A pesar de que el Ca+2 posee un papel fundamental en regular la función contráctil del cardiomiocito adulto, se desconoce si este ión media las acciones metabólicas de insulina, especialmente aquellas relacionadas con el ingreso de la glucosa a la célula. En esta tesis se investigó la participación del Ca+2 en la activación de AKT y en la captación de glucosa inducida por insulina en cultivos de cardiomiocitos aislados de rata adulta. La quelación del Ca+2 extracelular utilizando EGTA, no inhibió la fosforilación de AKT ni el transporte de glucosa estimulado por insulina, demostrando que el efecto de insulina es independiente de un influjo de Ca+2 desde el medio extracelular. Por el contrario la depleción del Ca+2 del medio intracelular utilizando BAPTA-AM, disminuyó drásticamente la fosforilación de AKT y el transporte de glucosa inducido por insulina, demostrando que ambas etapas de la señalización de insulina dependen de la presencia de Ca+2 intracelular. En la evaluación del componente de Ca+2 intracelular involucrado en la fosforilación de AKT, tanto el bloqueador del canal/receptor intracelular Ryanodina y el inhibidor de los procesos dependientes de IP3 2-APB tendieron a disminuir la fosforilación de AKT dependiente de insulina en el cardiomiocito adulto. En contraste, 2-APB pero no ryanodina afectó la captación de glucosa inducida por insulina en cardiomiocitos de rata adulta, lo que sugiere una interrelación entre la liberación de Ca+2 dependiente de IP3 y el transporte de glucosa inducido por insulina en el cardiomiocito adulto. Otros aspectos observados en la regulación por Ca+2 del transporte de glucosa indican que la captación de glucosa basal y dependiente de insulina es mayor en ausencia de Ca+2 en el medio extracelular, sugiriendo que el Ca+2 extracelular podría participar en los procesos de endocitosis de GLUT4. Además, se observó que el tratamiento de las células con el ionóforo divalente de Ca+2 Ionomicina, no afectó la captación basal de glucosa pero disminuyó la inducida por insulina, indicando que el Ca+2 necesario para la regulación del transporte de glucosa debe permanecer dentro de un rango de concentración. En conclusión, el Ca+2 intracelular es un importante mediador fisiológico de la fosforilación de AKT y del transporte de glucosa estimulado por insulina y, que este último proceso es fuertemente modulado por la liberación de Ca+2 desde los reservorios intracelulares dependientes de IP3R / Although Ca+2 has a key role in regulating the contractile function of adult cardiomyocytes, it still unknown if this ion mediates the metabolic actions of insulin, especially those related to glucose uptake. Chelation of extracellular Ca+2, using EGTA, did not inhibit insulin-dependent AKT activation and glucose uptake, demonstrating that the effect of insulin is independent of a Ca+2 influx from the extracellular environment. On the contrary, depletion of intracellular Ca+2, using BAPTA-AM, drastically reduced insulin-dependent AKT activation and glucose uptake, showing that both steps of insulin signaling depend on intracellular calcium. To investigate the intracellular Ca+2 component involved in AKT phosphorylation, ryanodine (RyR channel Ca2+ blocker) and 2-APB (IP3R inhibitor) were used. Both drugs trend to decrease the insulin-dependent AKT activation in adult cardiomyocytes. In contrast, 2-APB but not Ryanodine affects insulin induced glucose uptake in adult rat cardiomyocytes, suggesting an interrelationship between the IP3 dependent Ca+2 release and insulin induced glucose uptake in adult cardiomyocytes. Other aspects observed in Ca+2 regulation of glucose uptake show that basal and insulin stimulated glucose uptakes were greater in the absence of extracellular Ca+2, suggesting this Ca+2 might participate in GLUT4 endocytosis. In addition, treatment of cells with divalent calcium ionophore, Ionomycin, did not affect basal glucose uptake but decreased insulin-stimulated glucose uptake. These findings suggest that Ca+2 involved in the regulation of glucose transport must remain within a range of concentration. In conclusion, intracellular Ca+2 is an important physiological mediator of AKT phosphorylation and glucose transport stimulated by insulin, and that the latter process is strongly modulated by the release of Ca+2 from intracellular reservoirs IP3R-dependent

Orientador: Marta H. Krieger-Azzolini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Latorraca_MarciaQueiroz_M.pdf: 6621008 bytes, checksum: 63432fa26d4c46ce898f71f4c391c0ba (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Este trabalho teve o propósito de padronizar um modelo para estudo de intervenção hormonal, usando o teleósteo Piaractus mesopotamicus. O efeito da insulina in vivo sobre o metabolismo de carboidratos e lipídios, foi investigado em Piaractus mesopotamicus juvenis, com cânula crônica implantada na aorta dorsal e mantidos em caixa de experimentação especial. O estudo foi conduzido emtrês etapas: 1- verificou-se a viabilidade do implante da cânula crônica aortica nessa espécie, da sua manutenção em caixa de experimentação especial, do período de tempo necessário para a recuperação do estresse cirurgico e para o inicio da intervenção hormonal, através da monitoração dos níveis de glicose, ácidos graxos livres e cortisol plasmáticos; 2- determinou-se a menor dose capaz de promover hipoglicemia, os tempos de efeito máximo e de recuperação frente a várias doses de insulina suma regular-BIOBRÁS (O.25U/Kg; 1.0U/Kg; 2.5U/Kg e 5.0U/Kg) ; 3- verificou-se o efeito da menor dose hipoglicemiante sobre as reservas de gIicogênio hepático. muscular esquelético branco e vermelho, muscular cardíaco. cerebral e a concentração de ácidos graxos livres plasmáticos. Os resultados demonstraram que a espécie estudada tolerou os procedimentos de implante de cânula e adaptou-se às condições experimentais. Houve aumento dos níveis de glicose, cortisol e ácidos graxos livres plasmáticos em resposta aos procedimentos de captura, manuseio, anestesia e cirurgia, sendo necessárias quarenta e oito horas para a estabilização dos indicadores mensurados e para o início da intervenção hormonal. A menor dose hipoglicemiante foi 1.0U/Kg de peso corporal, com efeito máximona terceira hora e retomo aos níveis iniciais na vigésima quarta hora após a administração hormonal, considerando a hipoglicemia invariavelmente presente nos animais controle no curso das seis horas iniciais. Devido a este fato. investigou-se a influência da coleta seriada e/ou adminstração de solução salina como agentes promotores da resposta hipoglicêmica dos animais controle. Os resultados indicaram que a hipoglicemia não foi promovida pelos procedimentos testados. enquanto o cortisol e os ácidos graxos livres plasmáticos sofreram alterações, verificando-se uma relação inversa entre ambos seis e doze horas após a primeira amostragem. A menor dose efetiva (l.OU/Kg peso corporal) produziu declinio imediato e pronunciado dos ácidos graxos livres plasmáticos, em contraste com a hipoglicemia mais lenta e duradoura. As reservas teciduais de glicogênio não foram alteradas, possivelmente por influência da queda da temperatura. Os resultados do presente trabalho indicam que o modelo padronizado permitiu a amostragem de sangue seriada, a administração hormonal (após adequado período de recuperação pós-cirúrgico) e minimizou os efeitos do estresse causado pelo manuseio. Em Piaractus mesopotamicus juvenis, a insulina exerceu um efeito anti-lipolftico e lipogênico. que parece ser mais rápido do que a ação hipoglicemiante, indicando função importante na regulação do metabolismo lipidico / Abstract: The main aim of this work was to standardize a model for studing the hormone intervention, using the teleost Piaractus mesopotamicus. It was investigated the effect of insulin in vivo on the carbohydrate and lipid metabolism of young Piaractus mesopotamicus, using a cronic cannulain serted into the dorsal aorta and kept in special experimentation boxes. The research was carried out in three stages: 1- It was verified the viability of implanting the aortic cronic cannula into Piaractus mesopotamicus and keeping it in a special experimentation box ;the period of time necessary for overcoming surgical stress, and the beginning of the hormone intervention by the monitoration of glucose. free fat and plasma cortisol levels; 2-It was also determined the lowest dose which is able to cause hypoglycemia, the maximum effect and recovering time towards several regular suine insulin doses-BIOBRAS (O.25U/Kg;1.0U/Kg; 2.5UIKge 5.0U/Kg); 3- It has been verified the effect of the lowest hypoglicemic dose upon the liver, white and red squeletic muscles, brain, myocardium glycogen contents and the concentration of plasmatic free fat. The results have shown that the studied species had tolerated the cannula implantation procedures and got used to the experimental conditions. There was an increase of glucose, cortisol and plasmatic free fat levels in response to the capture, handling, anesthesia and surgery procedures, being necessary 48 hours for the stabilization of the measured indicators and for beginning the hormones intervention.The lowest hypoglicemic dose was 1.0U/Kg of body weight, with maximmum effect in the third hour and the return to the beginning levels in the 24th hour after the hormone ministration, considering hypoglycemia invariably present in the control animals during the first 6 hours. Doe to this fact, it was investigated the influence of the repetead blood sampling and/or administration of saline solution as promoting agents ofthe response of the control animals. The results indicated that hypoglycemia was not promoted by the tested procedure, whereas cortisol and plasmatic free fat underwent alterations, showing an inverse relationship between cortisol and plasmatc free fat six and twelve hours after the first sampling. The lowest effective dose (l.OU/Kg body weigbt) caused immediate and pronounced decrease of the plasmatic free fat, contrasted to the slower and more lasting hypoglycemia. The glycogen tissue reservations did not altero possibly because of the influence of the temperature decrease. The results of the work have shown that the standardized model allowed the serial blood sampling and hormone administration (after adequate postsurgery recovery period), minimizing the effects of stress caused by handling. In young Piaractus mesopotamicus , insulin caused an antilipolitic and/or antilipogenic effect which seemed to be faster than the hypoglicemic action, indicating an important whole on the regulation of lipid metabolism / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T04:22:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alegre_SarahMonte_D.pdf: 1722619 bytes, checksum: 9f52c232fe3cdfeb33a536b700d294f7 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A deficiência de G-6-PD é um erro inato do metabolismo de carboidratos em que a atividade ou estabilidade da glicose-6-fosfato desidrogenase (enzima que cataliza a reação inicial da via das pentoses-fosfato) está reduzida. Uma variedade de alterações é esperada, pois a referida enzima está presente em diferentes células e tecidos, incluindo pâncreas e o córtex da adrenal. Em nosso estudo anterior demonstramos que os portadores dessa deficiência enzimática apresentavam redução na fase rápida de secreção de insulina. No presente trabalho de pesquisa, tivemos como objetivo avaliar de forma mais precisa a secreção de insulina através da quantificação do peptídeo C plasmático após estimulo glicidico, assim como, após a L-arginina, outro estimulante da secreção de insulina, além da sensibilidade periférica à insulina. Constou dos objetivos avaliar a secreção de cortisol após estímulo com ACTH. Para tanto, foram estudados 11 individuos com deficiência de G-6-PD e 11 indivíduos controle que formaram o grupo I e foram submetidos aos testes par avaliar a função secretória da célula ß pancreática (Teste Endovenoso de Tolerância à Glicose - TETG e Teste da Arginina) e a sensibilidade periférica à insulina (Teste de Tolerdncia à Insulina - TTl). E, o grupo II composto com 12 indivíduos com deficiência de G-6-PD e 16 individuos controle que foram submetidos à estimulação das adrenais com ACTH (Teste do Cortisol). Para os dois grupos de estudo os procedimentos experimentais foram realizados após jejum de 12 -14 h. As amostras de sangue para as determinações séricos de glicose, insulina e peptideo C foram coletadas nos tempos: 0 (jejum}, 1, 3, 5, 7, 10, 30 e 60min. após a infusão de 0,5g de glicose/ Kg de peso corporal para o TETG e, 2, 3, 4, 5, 7 e 10 min. após o término da infusão de 50ml de L-arginina a 10% para o teste da arginina. A sensibilidade à insulina foi calculada pelo decaimento dos niveis séricos de glicose nos primeiros 15 min. após a infusão de 0,1 U de insulina regular humana / Kg de Peso corporal. A secreção de cortisol foi avaliada através de amostras basais de cortisol e, 30, 60 e 120 min. após infusão de 0,25mg de ACTH. Os resultados demonstram que pacientes com deficiência de G-6-PD e individuos controle apresentaram valores semelhantes de glicose plasmática durante o TETG. Os niveis séricos de insulina nos primeiros 10 min. do TETG, bem como os índices de avaliação da fase rápida de insulina foram significativamente menores nos pacientes com deficiência de G-6-PD. A quantificação do peptideo C está em concordância com esses resultados, pois os pacientes com deficiência enzimática apresentaram valores de peptideo C significativamente menores nos tempos: 1 min. (C: 3,2 ± 0,5 ng/ml X G-6-PD: 1,2 ± 0,5 ng/ml, p < 0,01); 3 min. (C: 4,5 ± 0,9 ng/ml X G-6-PD: 1,9 ± 0,4 ng/ml, p < 0,02); 5 min. (C: 4,8 ± 0,9 ng/ml X G-6-PD: 1,8 ± 0,3 ng/ml, p < 0,01); 7 min. (C: 4,1 ± 0,7 ng/ml X G-6-PD: 1,4 ± 0,3 ng/ml, p < 0,01); aos 10min. (C: 4,7 ± 1,0 ng/ml X G-6-PD: 1,5 ± 0,4 ng/ml, p < 0,01) e aos 30 min. (C: 4,3 ± 0,5 ng/ml X G-6-PD: 1,9 ± 0,5 ng/ml, p < 0,01) do T. E. T.G. Também a determinação das áreas sob as curvas de peptideo C, nos 60 min. do teste, bem como os índices de avaliação da fase rápida de secreção de insulina demonstram valores menores, estatisticamente significativos para o grupo de pacientes com deficiência de G-6-PD. A extração hepática de insulina,. após estimulo com glicose endovenosa, foi estatisticamente menor para os pacientes com deficiência de G-6-PD (C: 58,4 ± 4,1% X G-6-PD: 38,6 ± 8,8%, p < 0,05). O índice utilizado para avaliar a secreção de insulina no teste da arginna, a média dos três maiores valores nos primeiros 5 min., foi semelhante para os dois grupos quanto aos niveis de insulina, mas significativamente menor no grupo de individuos com deficiência de G-6-PD em relação ao peptideo C. A extração hepática de insulina, durante o teste da arginina, foi menor para o grupo, de portadores de deficiência de G-6-PD, embora esse resultado não tenha sido significativo. A sensibilidade periférica à insulina avaliada pela velocidade de decaimento da glicose foi semelhante nos dois grupos (C: 6,6 ± 1,0%/min. X G-6-PD: 5,56 ± 0.5%/min.). Para o grupo II, onde a secreção de cortisol foi avaliada durante a estimulação com ACTH, os niveis de cortisol plasmático foram significativamente menores nos pacientes com deficiência de G-6-PD aos 30 min. (C: 26 ± 1,2 µg/dl X G-6-PD: 21,1 ± 1,8 µg/dl, p < 0.05). No periodo restante do teste essa diferença desapareceu. A análise das áreas sob as curvas de cortisol foi semelhante nos dois grupos. Esses resultados demonstram que pacientes com deficiência de G-6-PD apresentam diminuição na secreção de insulina (fase rápida) após estimulo com glicose e L-arginina, sensibilidade periférica à insulina semelhante a de indivíduos controle e secreção de cortisol diminuida durante a primeira hora após estimulação com ACTH. / Abstract: Glucose - 6 - phosphate dehydrogenase deficiency ( G-6-PD ) is an inborn error of carbohydrate metabolism in which the activity and/or stability of G-6-PD ( enzyme that catalyses the initial reaction of the pentose phosphate pathway) is decreased. Recognition that deficiency of G-6-PD also occurs in other cells, tissues and biologic fluids raises the question that some specific functional alterations might happens in the affected persons. We demonstrated in our previous study that the patients with G-6-PD deficiency showed. Decreased first phase insulin release after glucose stimulation. The aim of the present study was to investigate the insulin secretory activity of pancreatic ß-cells through the determination of the C-peptide concentration after the intravenous glucose and L-arginine stimulation, and to evaluate the insulin sensitivity. It was also a purpose of this study to investigate the cortisol levels in response to stimulation with ACTH in those patients. The study included 11 male controls and 11 patients with G-6-PD deficiency ( group I ) that were studied with intravenous infusion of glucose, L-arginine and regular human insulin (0,1 UI/Kg B.W) to evaluate the secretion and action of insulin. The group II with 16 normal subjects and 12 G-6-PD deficient patients were submited to stimulation with ACTH ( 0,25 mg corticotropin). All the tests were performed in the morning after a 12-14h overnight fast. Blood samples for glucose, insulin, and C-peptide determination were collected before and 1,3,5,7,10,30 and 60 min. after intravenous glucose infusion (0,5 g/Kg body weight) (IVTT), before and 2,3,4,5,7 and 10 min. after L-arginine infusion ( 5g as a 10% solution ). The insulin sensitivity was calculated by the glucose disappearance rate during the first 15 min. after intravenous injusion of 0,1U of human insulin/Kg B.W. The cortisol secretion was evaluated before and at 30,60 and 120 min. after 0,25 mg of ACTH infusion. In the intravenous glucose tolerance test no significant differences were demonstrated between the mean plasma glucose levels of the G-6-PD deficient patients and those of the control group. The serum insulin levels during IVGTT from G-6-PD deficient patients were significantly lower when compared to insulin levels in the normal men in the first 10 min. as the index of first phase insulin release. The serum C - peptide levels were significantly lower in the G-6-PD deficient patients than the control group at: 1,3,5,7,10 and 30 min., and as the area under the curve of C - peptide levels in IVGTI. The hepatic extraction of insulin during IVGTT were significantly lower in the patients than in the control group. The index used to evaluate insulin secretory response after arginine infusion, mean of the highest values during the first 5 min. were similar between patients and controls for insulin levels, but signiflcantly lower in G-6-PD deficient patients when we analysed C-peptide, after arginine infusion. Patients and controls showed similar hepatic extraction of insulin in the arginine test. In the group II, after stimulation with ACTH, the cortisol levels were significantly lower in the G-6-PD deficient patients than the normal men at 30 min., but this differences between the groups decreased gradually and were no statistically significant, after the first hour. The areas under the cortisol levels for the two groups were similar. These results demonstrate that the G-6-PD deficient patients showed decresead insulin secretion ( first phase ) after glucose and L-arginine stimulation, decreased hepatic insulin extraction during IVGTI, no alteration in insulin peripheral sensitivity and decreased cortisol production in the first 30 min. after corticotropin stimulation. / Doutorado / Doutor em Medicina

La resistencia a la insulina (RI) ha sido implicada en la carcinogénesis, pero no hay consenso con respecto a su participación en el cáncer de ovario. Realizamos una revisión sistemática y meta-análisis para evaluar la asociación entre RI y cáncer de ovario. MÉTODOS: Se realizaron búsquedas en cinco bases de datos evaluando marcadores de RI y riesgo de cáncer de ovario. Tres investigadores realizaron de forma independiente selección de estudios, extracción de datos y evaluación del riesgo de sesgo. Las asociaciones entre los marcadores de RI y cáncer de ovario se cuantificaron como diferencias de medias (MD) o MD estandarizados (SMD) y sus IC del 95% utilizando modelos de efectos aleatorios. RESULTADOS: Catorce estudios de casos y controles cumplieron con nuestros criterios de inclusión (n = 8130). Había poca información sobre los marcadores de RI, con la excepción del sistema de IGF. El cáncer de ovario se asoció con niveles más bajos de IGF-1 de IGFBP-3. Sin embargo, el cáncer de ovario se asoció con niveles más altos de IGFBP-2 e IGFBP-1. Los análisis de subgrupos según el estado de la menopausia y la edad (≤55 vs> 55y) para IGF-1 e IGFBP-3 mostraron que los subgrupos eran similares, aunque la heterogeneidad se mantuvo alta. CONCLUSIÓN: La evidencia sugiere que los niveles de IGF-1 e IGFBP-3 son más bajos en pacientes con cáncer de ovario. Por el contrario, se encuentran niveles más altos de IGBP-2 e IGBP-1 en pacientes con cáncer de ovario. / BACKGROUND: Insulin resistance (IR) has been implicated in carcinogenesis, but there is no consensus regarding its involvement in ovarian cancer. We performed a systematic review and meta-analysis to evaluate the association between IR and ovarian cancer. METHODS: Searches were conducted in five databases for studies evaluating IR markers (levels of serum insulin, C peptide, insulin growth factor [IGF] 1 and IGF-binding proteins [IGFBPs], homeostatic model assessment insulin resistance, and quantitative insulin-sensitivity check index) and ovarian cancer risk. Study selection, data extraction and an assessment of risk of bias were performed independently by three researchers. The associations between IR markers and ovarian cancer were quantified as mean differences (MDs) or standardized MDs (SMDs) and their 95% CIs using random-effects models. RESULTS: Fourteen case-control studies satisfied our inclusion criteria (n=8130). There was little information on IR markers with the exception of the IGF system. Ovarian cancer was associated with lower IGF-1 levels, and lower IGFBP-3 levels. However, ovarian cancer was associated with higher levels of IGFBP-2 and IGFBP-1. Subgroup analyses by menopausal status and age (≤55 vs >55y) for IGF-1 and IGFBP-3 showed the subgroups were similar, although heterogeneity remained high. CONCLUSION: The evidence suggests that levels of IGF-1 and IGFBP-3 are lower in patients with ovarian cancer. In contrast, higher levels of IGBP-2 and IGBP-1 are found in patients with ovarian cancer. / Tesis

El diacilglicerol (DAG) es un importante intermediario en la síntesis de muchas clases de lípidos, y es, además, un segundo mensajero producido en respuesta a diversos estímulos extracelulares, capaz de modular la actividad de numerosas enzimas. Una de las vías de metabolización del DAG es la fosforilación llevada a cabo por las DAGK, para dar ácido fosfatídico (PA). El ácido fosfatídico es también un importante segundo mensajero lipídico involucrado en una gran variedad de respuestas celulares. Dada la importancia fisiológica del DAG y del PA como segundos mensajeros lipídicos, y, teniendo en cuenta los numerosos resultados que indican la presencia de las vías de señalización responsables de la síntesis y degradación de estos segundos mensajeros a nivel nuclear, iniciamos nuestros estudios analizando la actividad de las DAGK en los núcleos de la retina bovina, proyectando la investigación hacia la interpretación de su participación en las funciones esenciales de la retina, la recepción y transmisión de la luz. Además, analizamos a nivel nuclear, en las células fotorreceptoras de la retina, los efectos de la insulina, un reconocido protector del sistema nervioso central (SNC) y modulador de la actividad DAGK en otros tipos celulares del SNC. Mediante un protocolo diseñado en nuestro laboratorio, obtuvimos a partir de la retina entera una fracción nuclear enriquecida en los núcleos de las células fotorreceptoras (FNF). En esta fracción nuclear, se pudo detectar actividad DAGK, transformadora del DAG endógeno y exógeno. Se determinó linealidad en función del tiempo de ensayo, el contenido proteico de la fracción nuclear y se analizaron parámetros cinéticos aparentes (Km y Vmax para cada sustrato). Los resultados con detergentes y sustratos diferentes permitieron sugerir la coexistencia de varios tipos de DAGK. Esto fue confirmado por Western Blot (WB) y se detectaron, además, efectos significativos en el contenido nuclear de estas isoformas por efecto de la luz (aumento de la DAGKδ y disminución de las DAGKe, ß y B). Nuestros hallazgos se reforzaron con ensayos enzimáticos en los que se utilizaron condiciones selectivas (preferenciales) para medir la actividad de las isoformas δ y e.En ellos se observó, por efecto de la exposición de la retinas a la luz, una fuerte correlación entre los cambios en el contenido y la actividad de ambas isoformas en la FNF. Se demostró asimismo que el aumento de la actividad DAGK nuclear en respuesta a la luz es dependiente de la actividad PIP2-PLC, y se observó que dicho incremento en la condición lumínica no es debido exclusivamente a un aumento del sustrato de la reacción enzimática, DAG, sino que también participa en la activación el PIP2. También demostramos la presencia de la PKCα en la FNF, PKC de tipo convencional que es activada en presencia de Ca2+ y DAG. La exposición de las retinas a la luz produjo un aumento del estado de fosforilación de la PKCα. Dado que la fosforilación de PKC puede ser mediada por la activación de PDK1, que es dependiente de la activación previa de PI3K, enzima participante de la vía de señalización de insulina, el siguiente objetivo fue determinar la presencia de los principales componentes de las vías de señalización de insulina en la FNF. Nuestros resultados demostraron la presencia de Akt total y en su estado fosforilado (proteína quinasa de la via de la PI3K), y de ERK1/2, pERK1/2 y p38 fosforilada (quinasas correspondientes a la vía de las MAPK). Nuestros estudios demostraron, además, que la exposición de las retinas bovinas a la luz produce un aumento en el estado de fosforilación de Akt, y que induce la translocación de ERK1/2 activada a la FNF. Por otro lado, al analizar los efectos directos e indirectos de la insulina sobre la actividad DAGK nuclear en la FNF de retinas expuestas a la luz o a la oscuridad, fue posible demostrar que la insulina es capaz de modular la actividad DAGK nuclear tanto de forma directa (incubación de los núcleos aislados con insulina) como de manera indirecta (incubación de las retinas bovinas con insulina y posterior análisis de la actividad DAGK en la FNF). Además, se observó que la insulina cumple un rol en los cambios de la actividad DAGK nuclear en respuesta a la luz, y que los efectos de la insulina sobre la actividad DAGK son dependientes de su concentración (los efectos se incrementan con un aumento concomitante de la concentración de insulina empleada en el ensayo enzimático). Teniendo en cuenta los efectos directos de la insulina sobre la actividad DAGK nuclear, analizamos la presencia del receptor de insulina en la FNF por WB e inmunofluorescencia (IF) y demostramos la presencia del mismo en los núcleos de las células fotorreceptoras. Un hallazgo de particular interés fue el de haber demostrado que el contenido del RI aumenta en la FNF cuando las retinas bovinas son expuestas a la luz, lo cual sugiere que la luz puede ser un estímulo capaz de promover la translocación del RI al núcleo de las células fotorreceptoras. Por último, analizamos si la insulina es capaz de participar en la translocación del receptor de insulina al núcleo de las células fotorreceptoras y de mediar la activación de las vías de señalización activadas por la misma a nivel nuclear. Nuestros resultados indicaron que la insulina produce un aumento en el contenido del receptor de insulina nuclear con respecto a la condición luz en ausencia de hormona. Además, la insulina produjo un aumento de ERK1/2 activado en la FNF. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez que la exposición de las retinas bovinas a su estímulo natural, la luz, paralelamente a la activación de la típica vía de la fototransducción que se inicia en los segmentos externos, induce a nivel nuclear, la activación de distintas vías de señalización responsables de funciones críticas para la célula, y que a nivel nuclear, pueden intervenir en la transcripción de genes. Nuestros resultados demostraron también que la luz y la insulina son capaces de intervenir en la translocación del receptor de insulina desde la membrana plasmática hacia el núcleo de las células fotorreceptoras, y que la insulina promueve la activación de vías de señalización tanto de forma indirecta, actuando sobre la retina entera, como directa a nivel nuclear, sugiriendo para este último caso que mediaría sus efectos a través de la población nuclear de dicho receptor. / Diacylglycerol (DAG) is an important intermediate in the synthesis of several types of lipids, and it is also a second messenger produced in response to various extracellular stimuli, with the ability to modulate the activity of numerous enzymes. One route of metabolism of DAG is phosphorylation by DAGK to yield phosphatidic acid (PA). PA is also an important lipid second messenger that has been involved in a variety of cellular responses. Given the physiological importance of DAG and PA as lipid second messengers and taking into account the many results that indicate the presence of the signaling pathways responsible for the synthesis and degradation of these second messengers at the nuclear level, we initiated our studies assessing the activity of DAGK in the nuclei of bovine retina, projecting them to the interpretation of their participation in the essential functions of the retina, the receipt and transmission of light. We also analyzed at the nuclear level in retina photoreceptor cells, the effects of insulin, a known protector of the central nervous system (CNS) and DAGK activity modulator in other cell types of the CNS. Using a protocol designed in our laboratory, we obtained from the entire retina a nuclear fraction enriched in photoreceptor cell nuclei (PNF). In the nuclear fraction, DAGK activity could be detected, which is responsible for the transformation of endogenous and exogenous DAG. A linear response was obtained as a function of protein content of the nuclear fraction and as a function of time. The apparent kinetic parameters (Vmax and Km for each substrate) were also determined. The results derived from the different substrates and detergents used suggest the coexistence of various types of DAGK. This was confirmed by Western Blot (WB), and significant effects were detected in the nuclear content of these isoforms by the effect of light (increased of DAGKδ and decreased of DAGK E, ß and B). Our findings were strengthened by further enzyme assays using selective conditions to measure the activity of E and δ isoforms in which, due to the exposure of retina to light, strong correlation was observed between changes in the content and the activity of both isoforms in the PNF. It was also demonstrated that the increase in nuclear DAGK activity in response to light is dependent on PIP2-PLC activity and that this increase in light condition is not due only to an increase of the substrate of the enzymatic reaction, DAG, but also to the fact that PIP2 participates in DAGK activation. We also showed the presence of PKCα in FNF, conventional PKC which is activated in the presence of Ca2+ and DAG. Retina light exposure produced an increase in the phosphorylation status of PKCα. In addition, because phosphorylation of PKC could be mediated by the activation of PDK1, which is dependent on the prior activation of PI3K, an enzyme participant of insulin signaling pathway, our second main objective in the present study was to determine the presence of the main components of the insulin signaling pathway in PNF. Our results showed the presence of total Akt and its phosphorylated state (protein kinase of PI3K pathway) and ERK1/2, pERK1/2 and phospho-p38 (components of the MAP kinases pathway). Our results also showed that light exposure to bovine retinas causes an increase in the phosphorylation status of Akt and induces the translocation of ERK1/2 activated to PNF. In assessing the direct and indirect effects of insulin on nuclear DAGK activity in the FNF from retinas exposed either to light or darkness, it was demonstrated that insulin can modulate DAGK activity nuclear both directly (the incubation of isolated nuclei with insulin), and indirectly (the incubation of bovine retinas with insulin and the subsequent analysis of the DAGK activity in the FNF). We also observed that insulin has a role in the changes of nuclear DAGK activity in response to light, and that these effects on DAGK activity are dependent on its concentration (the effects are increased with a concomitant increase in the insulin concentration used in the enzyme assay). Taking into account the direct effects of insulin on nuclear DAGK activity, we analyzed the presence of the insulin receptor in the FNF by WB and IF and we could interest was to have shown that the contents of RI increase in FNF when bovine retinas are exposed to light, thus suggesting that light can be a stimulus capable of promoting the translocation of RI to the nucleus of the photoreceptor cells. Finally, we examined whether or not insulin is able to participate in insulin receptor translocation to the nucleus of the photoreceptor cells and to mediate the activation of signaling pathways related with insulin at the nuclear level. Our results indicated that insulin causes an increase in the content of the nuclear insulin receptor with respect to light condition in the absence of the hormone. Furthermore, incubation of PNF with insulin resulted in an increase of nuclear, activated ERK1/2. Summing up, our results demonstrate for the first time that light exposure of bovine retinas, its natural stimulus, in parallel to the typical activation of phototransduction pathways which starts in the outer segments, induces, at the nuclear level, the activation of different signaling pathways known to be responsible for critical functions to the cell, as gene transcription. Our results also reveal that light and insulin are involved in the translocation of the insulin receptor from the plasma membrane to the nucleus of the photoreceptor cells. Insulin also promotes the activation of cell signaling pathways, thus indirectly acting on the retina, or directly in the nucleus, suggesting that it mediates their effects through a nuclear population of the insulin receptor.

A influência da obesidade e da resistência à insulina (induzidas em ratos por injeção de glutamato monossódico em neonatos) sobre o desenvolvimento tumoral (5x105 células do tumor de Walker-256) e os efeitos da metformina (300mg/kg, v.o., 15 dias) nessa condição foram investigados. Na 16ª semana de vida, inocularam-se as células e iniciou-se o tratamento. Após 15 dias de tratamento, caracterizou-se a obesidade e a analisou-se o crescimento tumoral. O desenvolvimento tumoral e a caquexia foram maiores nos obesos. A metformina reduziu o desenvolvimento do tumor, mas não a caquexia. Apesar da metformina não ter melhorado a sensibilidade à insulina, corrigiu a dislipidemia, reduziu a peroxidação lipídica e as gorduras periepididimal e retroperitoneal. Conclui-se que a obesidade aumenta o desenvolvimento tumoral e que a metformina é eficaz em diminui-lo. O mecanismo envolvido parece não depender da melhora da sensibilidade à insulina / The influence of obesity and insulin resistance (induced in rats by monosodium glutamate in neonates) on tumor development (5x105 Walker-256 tumor cells) and the effect of metformin (300mg/kg, by gavage, for 15 d) on it. On the 16th week, tumor cells were subcutaneously injected and the treatment started. On the 18th week, the obesity was characterized and the tumor was evaluated. The tumor development and the cachexia were higher in obese rats. The tumor development was reduced by metformin, but not cachexia. Although metformin did not improve insulin sensitivity it did correct the dislypidemia, reduced the periepididimal and retroperitoneal adipose tissues and lipid peroxidation. In conclusion obesity increases tumor development and metformin is able to reduce it. The reduction occurred independently of the correction of insulin resistance

O aumento da prevalência do diabete melito do tipo 2 (DM2) é intenso e implica ampla busca pela prevenção e tratamento da doença. Estudos têm mostrado a participação do zinco na síntese, secreção e via de sinalização da insulina e sobre o controle glicêmico. Este trabalho objetivou analisar o mecanismo de ação do zinco no controle da secreção de insulina e no controle glicêmico, de modo a entender se a suplementação com o zinco previne ou retarda a manifestação do DM2. O projeto foi aprovado pela CEUA-ICB (USP). Camundongos machos C57BL/6 foram divididos em 4 grupos experimentais: dieta controle (NFD); dieta controle suplementada com ZnCl2 (NFDZ); dieta hiperlipídica (HFD); e dieta hiperlipídica suplementada com ZnCl2 (HFDZ). A massa corporal, a ingestão de ração e água e a glicemia foram acompanhados semanalmente. Testes intraperitoneais de tolerância à glicose (ipGTT) e à insulina (ipITT) foram realizados na 14ª semana de tratamento. Completado as 15 semanas de tratamento a glicemia, a insulinemia e a zincemia foram analisadas, sendo aplicados os testes de HOMA-IR e HOMA-&#946;. Em ilhotas pancreáticas isoladas foi analisada a secreção estática de insulina em diferentes concentrações de glicose. O teste de captação e metabolismo de glicose foi feito no músculo sóleo e a análise do conteúdo das proteínas AKT e GSK3-&#946; foi feita no músculo sóleo e no fígado. Os dados (média±SEM) foram analisados por Two-way ANOVA com pós-teste Bonferoni ou por teste t de Student (P 0,05). A suplementação com zinco melhorou a disfunção glicêmica induzida por dieta hiperlipídica, sem no entanto afetar a resistência à insulina ou a secreção de insulina por ilhotas isoladas. / The increase in prevalence of type 2 diabetes mellitus (DM2) is intense and implies broad quest for prevention and treatment of disease. Studies have shown the participation of zinc in the synthesis, secretion and signaling pathway of insulin and the glucose control. This study aimed to analyze the mechanism of action of zinc in the control of insulin secretion and glucose control in order to understand whether supplementation with zinc prevents or delays the manifestation of DM2. The project was approved by CEUA-ICB (USP). Male mice C57BL/6 were divided en 4 groups: control diet (NFD); control diet supplemented with ZnCl2 (NFDZ); high fat diet (HFD); and high fat diet supplemented with ZnCl2 (HFDZ). Body weight, feed intake and water and the glucose levels were monitored weekly. Intraperitoneal glucose tolerance test (ipGTT) and insulin (ipITT) were performed at the 14th week of treatment. Completing the 15 weeks of the treatment glycemia, insulinemia and zincemia were analyzed, being applied HOMA-IR and HOMA-&#946; tests. In isolated islets was assessed the static insulin secretion at different glucose concentrations. The uptake and glucose metabolism test was done in the soleus muscle and the content analysis of the AKT and GSK3-&#946; protein was made in the soleus muscle and liver. The data (mean ± SEM) were analyzed by two-way ANOVA with Bonferoni post-test or Student\'s t test (P < 0,05). Zinc supplementation improves glucose dysfunction induced by high fat diet, without nonetheless affecting insulin resistance and insulin secretion by isolated islets.

Em machos, tanto o envelhecimento quanto a obesidade induzida por dieta hiperlipídica (DHL) apresentam defeitos na ação insulínica, no entanto há carência de informações sobre fêmeas. Avaliamos a sensibilidade à insulina, tolerância à glicose, o padrão estral e a expressão de proteínas da via insulínica em hipotálamo e músculo de fêmeas C57BL6. Camundongos com 10 meses de vida e com 4 meses alimentados com DHL apresentaram aumento de coxins gordurosos, resistência à insulina e intolerância à glicose em relação a seus controles. A DHL induziu redução no número de corpos lúteos, precedido de alteração do padrão estral; aumento da expressão do IR e PI3K no hipotálamo e de PI3K/AKT1 e IL-6 em músculo gastrocnêmio. No hipotálamo dos animais com 10 meses foi detectada redução na expressão do IR e TNF alpha. Confirmamos a associação entre obesidade, resistência à insulina e intolerância a glicose induzidas por dieta hiperlipídica e envelhecimento em fêmeas. Além disso, nestes modelos foi detectada modificação na expressão do IR hipotalâmico de modo distinto. / In males, aging and obesity induced by high-fat diet (HFD) show defects in insulin action, but there is a lack of information about females. We evaluated the insulin sensitivity, glucose tolerance, estrous cycle and proteins expression of the intracellular insulin pathway in the hypothalamus and skeletal muscle of female C57BL6. Ten month-old mice and 4 mo HFD fed mice had increased fat pads, insulin resistance and glucose intolerance. The HFD fed group showed impaired estrous cycle pattern followed by reduced number of corpora lutea. There were also, increased IR and PI3K protein levels in the hypothalamus and increased PI3K/AKT1 and IL-6 proteins in skeletal muscle. In hypothalamus of 10 month-old mice there was a decreased IR and TNF alpha proteins level. Thus, our data confirm the association between obesity, insulin resistance and glucose intolerance induced by HFD and aging in female mice. Moreover, there were distinct change proteins in expression of the hypothalamic IR in both animal models.