Objetivo: Retrovirus Endógeno Humano (HERV) compreende ao redor de 8% do genoma humano. Apesar do fato de que em sua maioria são genes não-funcionais devido a processos de mutação ou perda de material genético no processo de retrotransposição, existem evidências do aumento da expressão de HERVs em tecido de câncer de próstata. Nós estudamos e comparamos a imunogenicidade de peptídeos da família HERV em 2 coortes de pacientes com câncer de próstata. Posteriormente examinamos o estado de ativação e senescência linfocitária nestas coortes. Desenho Experimental: Células Mononucleares de Sangue Periférico (CMSP) de 65 pacientes com câncer localizado da próstata em situação de hormônio-sensibilidade e de 24 pacientes com câncer de próstata metastático e em situação de resistência à castração, comparados a um grupo controle de 12 indivíduos normais foram avaliados em relação ao seu estado de resposta imune pela técnica de ELISPOT contra um conjunto de peptídeos derivados dos exons gag e env do gene da família HERV-K HML-2. Como parte de nosso estudo, foi realizado de forma preliminar uma análise genômica in silico de 500 pacientes com câncer de próstata sequenciados e disponíveis para análise pública do banco de dados TCGA, com o objetivo de reforçar o racional de nossa interrogação científica. Além disso , como estudo de correlação, fizemos uma análise por citometria de fluxo da ativação celular de linfócitos T de nossas coortes para determinarmos a imunofenotipagem e ontogenia linfocitária em nossos indivíduos investigados, no momento de nossa pesquisa de sua resposta imune. Resultados: Nossa análise da resposta imune contra peptídeos de HERV-K HML-2 por ELISPOT-Interferon Gama não mostrou nenhum resultado significativo. Nenhum paciente apresentou dados significativos de resposta de acordo com nossos critérios, apesar de nossos dados preliminares de expressão gênica terem mostrado expressão gênica em torno de 17% em pacientes com doença localizada. Nossos dados de ativação linfocitária mostraram maior ativação e senescência nos pacientes com doença disseminada e resistente à castração. Conclusões: Este parece ser o primeiro estudo a interrogar a presença de resposta celular imune contra peptídeos de HERV-K em pacientes com câncer de próstata. Nosso achados não mostraram resposta imune relevante em doença localizada ou disseminada e em diferentes estados de ativação linfocitária ou status de integridade hormonal. Apesar destes resultados, pesquisa posterior poderia utilizar diferente metodologia, como por exemplo a utilização de citometria de fluxo bem como a busca de diferentes citoquinas envolvidas, tais como as relacionadas a resposta Th2, ao invés de Th1 / Purpose: Human Endogenous Retrovirus (HERV) comprises 8% of human genome. Despite the fact that most of it is non-functional due to mutations or loss of genetic material in the process of retrotransposition, there are some evidence of increased expression of HERV in prostate cancer tissue. We studied the cellular immunogenicity of peptides from HERV-K family in 2 cohorts of prostate cancer patients. Experimental Design: PBMCs from 65 patients with hormone-intact localized prostate cancer and 24 patients with castrate-metastatic disease, matched with 12 normal controls were evaluated for cellular immune response by ELLISPOT against a pool of gag and env peptides from HERV-K family of HML-2 type. As an independent supportive study we did in silico genomic analysis of 500 prostate cancer patients from TCGA database to give another evidence of the prevalence of HERV-K gene expression in prostate cancer genome, reinforcing the rational of our questions. Results: Our analysis of cellular immune response against HERV-K HML-2 peptides by Interferon-gama ELISPOT did not show any meaningful results. No patient showed any minimal criteria of response, despite the fact that in our preliminary genomic analysis we obtained HERV expression in about 17% of a cohort of 500 patients with localized prostate cancer. In regards to the flow cytometry data of the lymphocytes we showed stronger activation and senescence status in the cohort of patients with castration sensitive and resistant disseminated disease, compared to the localized disease cohort. Conclusions: To the authors\'s knowledge this is the first study to look for cellular immune response against peptides derived from coding HERV-K transcripts in prostate cancer patients. Our findings did not show relevant immune response in neither localized nor metastatic castrate prostate cancer patients. Despite those results, further research could continue using different methodology, like flow cytometry as well as looking for different cytokines involved, such as those related to a Th2 response, instead of Th1

Indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) que controlam a replicação viral, mesmo na ausência de tratamento com drogas antirretrovirais, representam um exemplo de contenção bemsucedida do vírus. O entendimento das respostas imunes antivirais presentes nestes indivíduos pode auxiliar no delineamento de vacinas, particularmente no caso de estratégias vacinais desenvolvidas para induzir um fenótipo de controle da replicação viral e, assim, diminuir o ritmo da progressão à AIDS e/ou a taxa de transmissão para terceiros. A resposta imune celular contra HIV-1 é geralmente mapeada em ensaios de ELISPOT-IFN-γ empregando-se peptídeos pentadecâmeros sobrepostos por 11 aminoácidos sintetizados a partir de seqüências consensuais do vírus. Contudo, este método pode subestimar a detecção da real amplitude da resposta imune celular contra epitopos contidos na seqüência autóloga do vírus infectivo. Neste trabalho, foram comparadas respostas imunes celulares contra peptídeos 15-meros baseados nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1 e respostas imunes contra peptídeos HLA-restritos de nove ou 10 aminoácidos baseados tanto nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1, quanto nas seqüências autólogas dos vírus seqüenciados a partir de seis pacientes controladores da replicação do HIV-1. Nossa análise revelou que três dos seis pacientes investigados mostraram maior amplitude de resposta imune celular contra epitopos em Vif e Nef quando os peptídeos HLA-restritos foram empregados, tenham sido eles preditos a partir da seqüência consensual ou a partir das seqüências do vírus autólogo. O número de respostas positivas aumentou de quatro para 16 em Vif e de oito para 22 em Nef, com o uso dos reagentes HLA-restritos. Estes resultados sugerem que emprego de peptídeos 15-meros pode sub-representar a amplitude real da resposta imune celular envolvidas no controle da replicação do HIV-1 e que o conhecimento acerca das respostas imunes de sucesso em indivíduos controladores pode ser melhorado e ampliado com a revisão dos métodos empregados. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals who spontaneously control viral replication represent an example of successful containment of the AIDS virus. Understanding the anti-viral immune responses in these individuals may help in vaccine design, particularly vaccine strategies designed to induce a controller phenotype and thus, prevent disease progression and decrease risk of transmission. Immune responses against HIV-1 are normally screened using 15-mer peptides overlapped by 11 amino acids from HIV-1 consensus sequences in ELISPOT-IFN-γ assays. However, this method may underestimate the real breadth of the cellular immune responses against the autologous sequence of the infecting virus. We compared cellular immune responses against nef and vif-encoded consensus B 15-mer peptides to responses against HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from consensus B and autologous sequences in six patients who have controlled HIV-1 replication. Interestingly, our analysis revealed that three of our patients had broader cellular immune responses against Vif- and Nef-HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from either autologous viruses or from the consensus B sequence, when compared to responses against the 15-mer HIV-1 consensus B peptides. The number of positive responses against epitopes in these two HIV-1 proteins increased from four to 16 for Vif and from eight to 22 for Nef. These findings suggest that immune responses assessed using 15-mers peptides may underrepresent the real breadth of the immune control of the infecting virus and the knowledge about the successful responses in controller individuals could be improved after reviewing the employed methods.

INTRODUÇÃO: O fato do vírus da Hepatite C (HCV) estabelecer uma infecção crônica persistente, na maioria dos casos, mesmo sendo reconhecido e alvejado pelos sistemas imune inato e adaptativo sugere que o mesmo tenha desenvolvido estratégias eficazes para driblar a ação desses sistemas. O HCV interfere na fase inicial de ativação da resposta imune adaptativa alterando a função das células dendríticas (DCs), o que provavelmente leva a uma ativação deficiente das células natural killer (NKs) e de linfócitos T. Portanto, a realização de estudos sobre DCs e NKs na infecção pelo HCV se torna de fundamental importância para a compreensão da patogênese e persistência desta infecção. MÉTODOS: Foram selecionados indivíduos com resolução espontânea da infecção pelo HCV, indivíduos com infecção crônica e indivíduos saudáveis. A técnica de citometria de fluxo foi utilizada para a determinação da frequência e do fenótipo de células dendríticas e NKs nesses indivíduos. Além disso, foi avaliada a atividade citotóxica das células NKs sob estímulo de IL-12 e IL-18, e também da linhagem K-562. RESULTADOS: A frequência de DC mielóides (mDC) expressando CD86, nos indivíduos crônicos, foi elevada e uma correlação positiva com a carga viral foi observada. Na análise do ensaio funcional foi observado que as populações de células NKs CD7+ CD57+ apresentaram maior expressão da molécula CD107a e baixa produção de IFNy nos indivíduos com infecção crônica. A constante exposição das células imunes ao IFN-alfa, induzido durante a infecção pelo HCV, resulta na polarização do fenótipo citotóxico, caracterizado por células NK ativadas com elevado poder de degranulação, mas com deficiente produção de IFN-y. CONCLUSÕES: As frequências das células DCs e NKs eram semelhantes em todos os indivíduos. A expressão da molécula CD86 na superfície das mDCs pode ter sido induzida pela presença do HCV, uma vez que foi observada correlação positiva com a carga viral. Células NK citotóxicas, altamente diferenciadas e incapazes de produzir IFN-y foram as mais frequentes na infecção crônica pelo HCV. A baixa produção de IFN-y por parte dessas células é um dos fatores envolvidos na deficiente ativação de uma resposta imune adaptativa capaz de controlar a infecção pelo HCV / INTRODUCTION: Hepatitis C virus (HCV) develops a chronic persistent infection in most of the cases, even being recognized and targeted by the innate and adaptive immune systems, suggests that the virus have developed effective strategies to circumvent the action of these systems. HCV interferes in the initial activation of the adaptive immune response by altering the function of dendritic cells (DCs), which probably leads to a deficient activation of natural killer cells (NK) and T lymphocytes. Therefore, studies of DCs and NK in HCV infection are very important for understanding the pathogenesis and the persistence of this infection. METHODS: We selected subjects with spontaneous resolution of HCV infection, with chronic infection and healthy subjects. Flow Cytometry was used to determine the frequency and phenotype of dendritic cells and NK cells of these individuals. In addition, we evaluated the NK cell cytotoxic activity in response to stimulation of IL-12 and IL-18 and in co-cultivation with the cell line K-562. RESULTS: In individuals with chronic infection, the frequency of myeloid (m) DC cells expressing CD86 was elevated and a positive correlation between these cells and viral load was observed. It was observed in chronic infected individuals that NK cells co-expressing CD7 and CD57 showed higher expression of CD107a and low production of IFN gamma. The constant exposure of immune cells to IFN-alfa induced during HCV infection results in the polarization of cytotoxic phenotype characterized by activated NK cells with high power degranulation, but with impaired production of IFN-y. CONCLUSIONS: The frequency of DCs and NK cells were similar in all individuals. The expression of CD86 molecule on the surface of mDCs may have been induced by the presence of HCV, since a positive correlation was observed with viral load. Cytotoxic NK cells, highly differentiated and unable to produce IFN-y, were the most frequent in chronic HCV infection. The low production of IFN-y by these cells is one of the factors involved in the poor activation of an adaptive immune response able to control HCV infection

Introdução: Hanseníase, doença crônica, incapacitante, causada pelo M.leprae, que afeta a pele e os nervos periféricos. Manifesta-se como doença espectral, que exibe dois polos imunologicamente distintos, denominados hanseníase virchowiana (lepromatous - LL), caracterizada por uma resposta celular ineficiente; e hanseníase tuberculoide (Tuberculoid - TT), com resposta imune celular efetiva. A ativação de células T requer a sinalização através de moléculas coestimulatórias expressas em células apresentadoras de antígeno e seus ligantes nas células T. As células T regulatórias (Treg) exercem importante papel no mecanismo de falha do controle da disseminação antigênica nas formas graves das doenças crônicas granulomatosas, mas seu real papel na hanseníase ainda não foi elucidado. Métodos: Estudamos a expressão das moléculas coestimulatórias e células Treg na resposta imune de pacientes nos diferentes espectros da doença. A expressão de células Treg foi quantificada por citometria de fluxo (CD4+CD25+FoxP3+) nas células mononucleares do sangue periférico de pacientes e controles (16 eram virchowianos, 12 tuberculoides e 6 controles) estimulados in vitro com o antígeno do M. leprae e com o mitógeno phytohemaglutinina, bem como nas lesões de pele por imunohistoquímica. A expressão de moléculas coestimulatorias (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) foi avaliada por citometria de fluxo in vitro, a partir do estimulo de células mononucleares provenientes de 14 pacientes virchowianos, 14 tuberculoides e 10 indivíduos saudáveis expostos ao bacilo. A resposta linfoproliferativa, a produção de citocinas (IL10 e IFN-?) in vitro e a expressão in situ de IL-10, TGF? e CTLA-4 também foram determinadas. Resultados: Nós demonstramos que pacientes virchowianos apresentam deficiência na expressão da molécula CD86 na superfície de monócitos, e isso contribui para uma apresentação antigênica ineficiente, favorecendo o estado de anergia observado nesse grupo de pacientes. Observamos ainda, que o bloqueio da expressão dessa molécula, mas não do CD80 inibe a resposta linfoproliferativa ao M.leprae. Ainda no polo virchowiano anérgico, observamos redução da expressão de moléculas coestimulatórias de sinalização positiva (CD28, CD86) na superfície dos linfócitos. Em contraste, nos pacientes tuberculoides notamos um aumento da expressão de moléculas de sinalização negativa (CTLA-4 e PD-1), que pode representar uma provável modulação da resposta imune exacerbada, regulando dessa forma os efeitos deletérios da hiperreatividade celular. Notavelmente, os contatos também expressão em menor intensidade CD86 e CD28, mas não se observou expressão exacerbada de CTLA-4 ou PD-1, sugerindo que eles provavelmente desenvolvem resposta imune balanceada sem que haja necessidade de sinalização imunossupressora. Observamos ainda, que o antígeno do M.leprae induz uma significativa redução da resposta linfoproliferativa, mas um aumento significativo de células Treg no sangue e na pele dos pacientes virchowianos, quando comparado ao grupo tuberculoide. Em paralelo, notamos o aumento da expressão de moléculas anti-inflamatórias (IL-10 e CTLA-4) nas lesões cutâneas desses pacientes virchowianos. Conclusão: Nossos resultados sugerem que células Treg e moléculas coestimulatórias desempenham papel importante na patogênese da hanseníase, especialmente no polo virchowiano, em que favoreceria a anergia e a multiplicação bacilar / Introduction: Leprosy, caused by the bacillus Mycobacterium leprae, is a chronic, incapacitating disease that affects the peripheral nerves and skin. Leprosy manifests as a spectral disease, exhibiting two polar sides, namely, lepromatous leprosy (LL) characterised by impaired T-cell responses and tuberculoid leprosy in which T-cell responses are strong. Proper T-cell activation requires signalling through costimulatory molecules expressed by antigen presenting cells and their ligands on T-cells. T regulatory cells (Tregs) play an important role in the mechanism of host\'s failure to control pathogen dissemination in severe forms of different chronic granulomatous diseases, but their role in leprosy has not yet been elucidated. The objective of this study was to investigate the influence of costimulatory molecules and Tregs cels on the immune responses of subjects along the leprosy spectrum. Patients and Methods: Tregs were quantified by flow cytometry (CD4+ CD25+ Foxp3+) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients (16 lepromatous, 12 tuberculoids and controls (n = 6) stimulated in vitro with a M. leprae antigenic preparation and phytohemagglutinin as well as in skin lesions by immunohistochemistry. The expression of the costimulatory molecules (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) was evaluated in in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells isolated from 14 lepromatous and 14 tuberculoid patients, and 10 healthy individuals exposed to the bacillus. The lymphoproliferative (LPR), interleukin-10 (IL-10), and interferon-g (IFN-g) responses of the in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells and the in situ expression of IL-10, transforming growth factor-b (TGF-b), and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) were also determined. Results: We show that lepromatous patients have defective monocytes\' CD86 expression, likely contributing to the impairment of the antigen presentation process and to their anergy. Accordingly, anti-CD86 blocking monoclonal antibody, but not anti-CD80 antibody, inhibited the lymphoproliferative response to Mycobacterium leprae. Consistent with the lepromatous pole anergy, there was reduced T-cells\' expression of the positive signaling costimulatory molecules CD28 and CD86 in these patients. Tuberculoid patients, on the other hand, had increased expression of the negative signaling CTLA-4 and PD-1 molecules, probably representing a means of modulating exacerbated immune response and avoiding immunopathology. Interestingly, contacts exhibited proper CD86 and CD28 expression, but not exacerbated CD152 and PD-1 expression, suggesting that they tend to develop a balanced immunity without requiring immunosuppressive costimulatory signaling. We also observed that M. leprae antigens induced significantly lower lymphoproliferation but significantly higher Treg numbers in lepromatous than tuberculoid patients and contacts. Mitogen-induced lymphoproliferation and Treg frequencies were not significantly different between the three groups. Tregs were also more frequent in situ in multibacillary patients, and this was paralleled by increased expression of the anti-inflammatory molecules IL-10 and CTLA-4, but not TGF. Conclusion: Our results suggest that Tregs and costimuatory molecules play a major role in the pathogenesis of leprosy, especially the lepromatous pole, in which they would act to favor the anergy and the unrestricted multiplication of the bacilli

O curso da infecção pelo HCV é determinado pela competência da resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro. A IL-18 é uma citocina pró-inflamatória importante em ambas as respostas imunes e atua sinergicamente com IL-12 induzindo a expressão de IFN-y pelas células T e natural killer. O IFN-? por sua vez possui um papel chave no combate de infecções intracelulares, induzindo um estado antiviral nas células infectadas. O balanço de IL-18 é controlado pela IL18BP, uma citocina importante que atua como um antagonista natural. Estudos mostram que indivíduos cronicamente infectados pelo HCV possuem elevados níveis séricos de IL-18 e IL18BP. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivos: 1) determinar o genótipo de polimorfismos de base única (SNPs) localizados nos genes da IL-18 (-607 C > A e -137 G > C), IL18BP (rs2298455 e rs1541304) e IFN-y +874 T > A; 2) quantificar a expressão de seus respectivos mRNAs; e por fim, 3) dosagem dos níveis séricos das respectivas citocinas. Para isto, foram selecionados 51 indivíduos com resolução espontânea e 50 com infecção crônica pelo HCV genótipo 1 que submetidos a técnica de PCR em tempo real para a genotipagem dos polimorfismosIL-18 (-607 C > A e -137 G > C), IL18BP (rs2298455 e rs1541304) e IFN-? +874 T > A; posteriormente foi feita a análise da expressão gênica destes mRNA utilizando como controle endógeno o GAPDH e a dosagem das citocinas foi determinada peta técnica de ELISA. A distribuição dos genótipos nos polimorfismos nos genes IL-18 e IL18BP foram semelhantes nos dois grupos de estudo. No entanto, para o polimorfismo no gene do IFN-?, observamos frequência maior do genótipo TA no grupo de infecção crônica, enquanto que no grupo de resolução espontânea foi mais frequente o genótipo AA (p=0.006). Em contrapartida a expressão gênica nos permitiu observar que nos indivíduos com infecção crônica o mRNA de IL-18 (p < 0.001) e IL18BP (p < 0.001) estavam com uma maior expressão quando comparados com os indivíduos com resolução espontânea, e que isto refletia nas dosagens séricas, onde os indivíduos cronicamente infectados pelo HCV apresentavam altos níveis séricos de IL-18 (p < 0.001) e IL18BP (p=0.012) do que os indivíduos com resolução espontânea. O alelo G foi associado com uma maior produção de IL-18(p=0.02) nos indivíduos com resolução espontânea. Em relação à expressão gênica do mRNA do IFN-y não foi possível observar nenhuma diferença entre os grupos estudados (p=0.322) e a dosagem sérica não foi detectada em ambos os grupos. Os resultados sugerem que apesar do sistema imune ser estimulado durante a infecção pelo HCV, a persistência viral leva a um estado de anergia onde a produção de IFN- y parece ser escassa para uma resposta imune eficaz, sendo que os meios nos quais modulam a expressão gênica do IFN- y ainda parecem obscuros, no entanto já foram descritos mecanismos pós-transcricionais que tem como alvo a região 3\'UTR do mRNA do IFN- y podendo interferir na sua expressão / The course of HCV infection is determined by the competence of the innate and adaptive immune response of the host. IL-18 is an important proinflammatory cytokine in both immune responses and acts synergistically with IL-12 induces the expression of IFN-y by T and natural killer cells. The IFN-yturn plays a key role in fighting intracellular infections, inducing an antiviral state in infected cells. The balance of IL-18 is controlled by IL18BP, an important cytokine that acts as a natural antagonist. Studies show that individuals chronically infected with HCV have elevated serum levels of IL-18 and IL18BP. Therefore, this study aimed to: 1) determine the genotype of single nucleotide polymorphisms (SNPs) located in genes of IL-18 (-607 C > A and -137 G > C), IL18BP (rs2298455 and rs1541304) and IFN-y +874 T > A; 2) to quantify the expression of their respective mRNAs; and finally 3) the determination of serum levels of the respective cytokines. Fifty-one individuals with spontaneous clearance and 50 were selected with chronic HCV genotype 1 infection who underwent the technique of real-time PCR for genotyping polymorphisms of IL-18 (-607 C > A and -137 G > C), IL18BP (rs2298455 and rs1541304) and IFN-y +874 T > A; later analysis of gene expression of these mRNA was performed using GAPDH as endogenous control and used the ELISA method for the serum of these cytokines. The distribution of genotypes in the IL-18 polymorphisms and IL18BP genes were similar in both study groups. However, for the polymorphism in the IFN-y gene, the genotype most frequently observed in the group of TA chronic infection, whereas in the group of spontaneous clearance AA was more frequent (p = 0.006) genotype. In contrast to gene expression allowed us to observe that in individuals with chronic infection the mRNA of IL-18 (p < 0.001) and IL18BP (p < 0.001) had a higher expression when compared with individuals with spontaneous resolution, and that this reflected in serum using the ELISA technique, where individuals chronically infected with HCV had higher serum levels of IL-18 (p < 0.001) and IL18BP (p = 0.012) than subjects with spontaneous clearance. The G allele was associated with increased production of IL-18 (P = 0.02)in spontaneous clearance group. Regarding the gene expression of IFN-y mRNA was not observed any difference between the groups (p = 0.322) and the serum was not detected in both groups. The results suggest that although the immune system is stimulated during HCV infection leads to viral persistence of anergy a state where the production of IFN-? appears to be scarce for an effective immune response, and the means in which modulate the expression the IFN-y gene still seem unclear, however have been described post-transcriptional mechanisms which target the 3\'UTR of the mRNA of IFN-y may interfere with its expression

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Introdução: Hanseníase, doença crônica, incapacitante, causada pelo M.leprae, que afeta a pele e os nervos periféricos. Manifesta-se como doença espectral, que exibe dois polos imunologicamente distintos, denominados hanseníase virchowiana (lepromatous - LL), caracterizada por uma resposta celular ineficiente; e hanseníase tuberculoide (Tuberculoid - TT), com resposta imune celular efetiva. A ativação de células T requer a sinalização através de moléculas coestimulatórias expressas em células apresentadoras de antígeno e seus ligantes nas células T. As células T regulatórias (Treg) exercem importante papel no mecanismo de falha do controle da disseminação antigênica nas formas graves das doenças crônicas granulomatosas, mas seu real papel na hanseníase ainda não foi elucidado. Métodos: Estudamos a expressão das moléculas coestimulatórias e células Treg na resposta imune de pacientes nos diferentes espectros da doença. A expressão de células Treg foi quantificada por citometria de fluxo (CD4+CD25+FoxP3+) nas células mononucleares do sangue periférico de pacientes e controles (16 eram virchowianos, 12 tuberculoides e 6 controles) estimulados in vitro com o antígeno do M. leprae e com o mitógeno phytohemaglutinina, bem como nas lesões de pele por imunohistoquímica. A expressão de moléculas coestimulatorias (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) foi avaliada por citometria de fluxo in vitro, a partir do estimulo de células mononucleares provenientes de 14 pacientes virchowianos, 14 tuberculoides e 10 indivíduos saudáveis expostos ao bacilo. A resposta linfoproliferativa, a produção de citocinas (IL10 e IFN-?) in vitro e a expressão in situ de IL-10, TGF? e CTLA-4 também foram determinadas. Resultados: Nós demonstramos que pacientes virchowianos apresentam deficiência na expressão da molécula CD86 na superfície de monócitos, e isso contribui para uma apresentação antigênica ineficiente, favorecendo o estado de anergia observado nesse grupo de pacientes. Observamos ainda, que o bloqueio da expressão dessa molécula, mas não do CD80 inibe a resposta linfoproliferativa ao M.leprae. Ainda no polo virchowiano anérgico, observamos redução da expressão de moléculas coestimulatórias de sinalização positiva (CD28, CD86) na superfície dos linfócitos. Em contraste, nos pacientes tuberculoides notamos um aumento da expressão de moléculas de sinalização negativa (CTLA-4 e PD-1), que pode representar uma provável modulação da resposta imune exacerbada, regulando dessa forma os efeitos deletérios da hiperreatividade celular. Notavelmente, os contatos também expressão em menor intensidade CD86 e CD28, mas não se observou expressão exacerbada de CTLA-4 ou PD-1, sugerindo que eles provavelmente desenvolvem resposta imune balanceada sem que haja necessidade de sinalização imunossupressora. Observamos ainda, que o antígeno do M.leprae induz uma significativa redução da resposta linfoproliferativa, mas um aumento significativo de células Treg no sangue e na pele dos pacientes virchowianos, quando comparado ao grupo tuberculoide. Em paralelo, notamos o aumento da expressão de moléculas anti-inflamatórias (IL-10 e CTLA-4) nas lesões cutâneas desses pacientes virchowianos. Conclusão: Nossos resultados sugerem que células Treg e moléculas coestimulatórias desempenham papel importante na patogênese da hanseníase, especialmente no polo virchowiano, em que favoreceria a anergia e a multiplicação bacilar / Introduction: Leprosy, caused by the bacillus Mycobacterium leprae, is a chronic, incapacitating disease that affects the peripheral nerves and skin. Leprosy manifests as a spectral disease, exhibiting two polar sides, namely, lepromatous leprosy (LL) characterised by impaired T-cell responses and tuberculoid leprosy in which T-cell responses are strong. Proper T-cell activation requires signalling through costimulatory molecules expressed by antigen presenting cells and their ligands on T-cells. T regulatory cells (Tregs) play an important role in the mechanism of host\'s failure to control pathogen dissemination in severe forms of different chronic granulomatous diseases, but their role in leprosy has not yet been elucidated. The objective of this study was to investigate the influence of costimulatory molecules and Tregs cels on the immune responses of subjects along the leprosy spectrum. Patients and Methods: Tregs were quantified by flow cytometry (CD4+ CD25+ Foxp3+) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients (16 lepromatous, 12 tuberculoids and controls (n = 6) stimulated in vitro with a M. leprae antigenic preparation and phytohemagglutinin as well as in skin lesions by immunohistochemistry. The expression of the costimulatory molecules (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) was evaluated in in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells isolated from 14 lepromatous and 14 tuberculoid patients, and 10 healthy individuals exposed to the bacillus. The lymphoproliferative (LPR), interleukin-10 (IL-10), and interferon-g (IFN-g) responses of the in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells and the in situ expression of IL-10, transforming growth factor-b (TGF-b), and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) were also determined. Results: We show that lepromatous patients have defective monocytes\' CD86 expression, likely contributing to the impairment of the antigen presentation process and to their anergy. Accordingly, anti-CD86 blocking monoclonal antibody, but not anti-CD80 antibody, inhibited the lymphoproliferative response to Mycobacterium leprae. Consistent with the lepromatous pole anergy, there was reduced T-cells\' expression of the positive signaling costimulatory molecules CD28 and CD86 in these patients. Tuberculoid patients, on the other hand, had increased expression of the negative signaling CTLA-4 and PD-1 molecules, probably representing a means of modulating exacerbated immune response and avoiding immunopathology. Interestingly, contacts exhibited proper CD86 and CD28 expression, but not exacerbated CD152 and PD-1 expression, suggesting that they tend to develop a balanced immunity without requiring immunosuppressive costimulatory signaling. We also observed that M. leprae antigens induced significantly lower lymphoproliferation but significantly higher Treg numbers in lepromatous than tuberculoid patients and contacts. Mitogen-induced lymphoproliferation and Treg frequencies were not significantly different between the three groups. Tregs were also more frequent in situ in multibacillary patients, and this was paralleled by increased expression of the anti-inflammatory molecules IL-10 and CTLA-4, but not TGF. Conclusion: Our results suggest that Tregs and costimuatory molecules play a major role in the pathogenesis of leprosy, especially the lepromatous pole, in which they would act to favor the anergy and the unrestricted multiplication of the bacilli

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-30T13:18:28Z No. of bitstreams: 1 fatima_m_f_vergara_ioc_bcm_0016_2010.pdf: 988755 bytes, checksum: 3aad77ef91c57a6b8ccd02597caa98df (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T13:18:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fatima_m_f_vergara_ioc_bcm_0016_2010.pdf: 988755 bytes, checksum: 3aad77ef91c57a6b8ccd02597caa98df (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A tuberculose é uma doença infecto contagiosa que compromete, principalmente, as vias aéreas superiores e acomete humanos e outros animais. É causada por micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB). Atualmente, aproximadamente, 1,7 bilhões de pessoas, em todo o mundo, estão infectadas e destes, cerca de 20 milhões são portadores de tuberculose ativa. Dados da OMS de 2009 estimam que 9,4 milhões de novos casos de tuberculose ocorreram em todo o mundo em 2008. Atualmente o tratamento da tuberculose se dá basicamente com medicamentos desenvolvidos na década de 60 e que não vem se mostrando eficazes nos casos de tuberculose resistente e na co-infecção com o HIV. Considerando esses fatos, é crescente a busca pelo desenvolvimento de fármacos capazes de atuar com eficácia e baixa toxicidade. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a ação bactericida do derivado tiofenólico, tiofenoacetamida (TAA), sobre o Mycobacterium bovis (BCG), sua ação imunomoduladora, sobre macrófagos murinos infectados e, ainda, sua ação in vivo no modelo experimental de pleurisia induzida em camundongos. O ensaio de Alamar blue demonstrou que o TAA tem ação bacteriostática sobre o M. bovis (BCG). A capacidade bactericida indireta sobre os macrófagos infectados com o M. bovis (BCG) foi avaliada pela contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC), e o tratamento com TAA foi eficaz em diminuí-las. Analisamos também se o TAA teria uma ação imunomoduladora sobre o macrófago infectado. Observamos que no macrófago infectado e pré-tratado com o TAA há diminuição de IL-12, TNF-α e óxido nítrico (NO), e ainda uma inibição da translocação de NF-κB, indicando uma ação antiinflamatória. Já o macrófago infectado e pós-tratado apresenta um aumento de NO, e mantém a inibição parcial de TNF-α, INF-γ, e IL-6. No modelo in vivo de pleurisia induzida pelo M. bovis (BCG), os camundongos foram pré-tratados em três doses distintas, 5; 25 ou 50 mg/kg, observando-se que o TAA é capaz de modular a migração de neutrófilos em 24 hs e em 15 dias e de células mononucleares em 24 hs. Constatamos que o TAA apresenta ação bactericida, diminuindo o número de UFC na cavidade pleural, discreta em 6 hs, mas intensa em 24 hs, assim como em 15 dias, em todas as doses utilizadas. Ao avaliarmos a ação do TAA sobre a liberação de NO, observamos que em 6 hs há uma diminuição na liberação que aumenta significativamente em 24 hs e que volta a diminuir em 15 dias. Ao avaliarmos a ação do TAA sobre a liberação de citocinas, observamos que há diminuição de IL-1β, a partir de 6 hs, de INF-γ a partir de 24 hs, e de IL-6 apenas no tempo de 6 hs e há aumento da liberação de IL-6, em 24 hs e 15 dias, e de IL-12 em todos os tempos avaliados. Analisando nossos resultados, pode-se sugerir que o TAA tem ação bactericida in vitro e in vivo sobre o M. bovis (BCG) e uma acentuada ação antiinflamatória quando utilizada como pré-tratamento. Entretanto na modulação do NO essa ação é revertida quando utilizado o pós-tratamento. O tratamento com TAA modula o processo inflamatório in vivo, auxiliando na sua resolução / Tuberculosis is a contagious infectious disease that compromises mainly the upper airways. This affects specially humans and also other animals. It is caused by mycobacterias from the Mycobacterium tuberculosis (MTB) complex. Nowadays approximately 1.7 billion people in the whole world are infected. Around 20 million are suffering with active tuberculosis. Data from WHO estimate that in 2008, 9.4 million new tuberculosis cases occurred all over the world. Tuberculosis treatment basically happens with drugs developed in the 60’s which has not been shown effective in treatment of resistant tuberculosis or in HIV co-infection. Considering these facts, is increasing the search in developing drugs able to act effectively and with low toxicity. The aim of this study was to evaluate the bactericidal action of thiophen derivative, thiopheacetamide (TAA), over Mycobacterium bovis (BCG), and its action in vivo in the experimental model of pleurisy induced by M. bovis (BCG), in mice. The test of Alamar Blue indicated that TAA present bacteriostatic action over M. bovis (BCG). The indirect bactericidal capacity over M. bovis (BCG) infected macrophages was evaluated through the counting of the colony-forming unit (CFU), and TAA treatment was efficient in decreasing those. We also analyzed whether TAA would have an immunomodulating action over the infected macrophage. We observed that the pre-treatment with TAA of infected macrophage promote a decrease in IL-12, TNF-α and nitric oxide (NO) levels, and inhibition of NF-κB translocation, indication a possible anti-inflammatory action. The pos-treated and infected macrophage presented an increase in NO, and keeps partial inhibition of TNF-α, INF-γ, e IL-6. We used the in vivo model of induced pleurisy through M. bovis (BCG) in mice, which were pre-treated with the doses of 5; 25 or 50 mg/kg. It is observed that TAA was capable of modeling the migration of neutrophil in 24 hours and in 15 days and also the mononuclear cells in 24 hours. We noted that TAA presents bactericidal action, decreasing the CFU number at the pleural cavity, discrete in 6 hours, but intense in 24 hours, such as in 15 days, at all tested doses. The evaluating of TAA action over the release of NO, show us that in 6 hours there was a decrease on the release of this mediator on the other hand NO increased significantly in 24 hours but decreased again in 15 days. The analysis of TAA action over the released of cytokines, demonstrated that there was a diminution of IL-1β and IFN-γ beginning at 6 and 24 hours after infection, respectively, and a inhibition of IL-6 production only 6 hours post infection. We noted an increased on the release of IL-12 in all evaluated times and of IL-6, in 24 hours and in 15 days after the M. bovis (BCG) infection. Our data indicate that this new compound, tiophenacetamide, presents in vitro and in vivo, an important antimicobacterial activity over M. bovis (BCG) and an immunomodulatory effect when used as a pretreatment

Objetivo: Retrovirus Endógeno Humano (HERV) compreende ao redor de 8% do genoma humano. Apesar do fato de que em sua maioria são genes não-funcionais devido a processos de mutação ou perda de material genético no processo de retrotransposição, existem evidências do aumento da expressão de HERVs em tecido de câncer de próstata. Nós estudamos e comparamos a imunogenicidade de peptídeos da família HERV em 2 coortes de pacientes com câncer de próstata. Posteriormente examinamos o estado de ativação e senescência linfocitária nestas coortes. Desenho Experimental: Células Mononucleares de Sangue Periférico (CMSP) de 65 pacientes com câncer localizado da próstata em situação de hormônio-sensibilidade e de 24 pacientes com câncer de próstata metastático e em situação de resistência à castração, comparados a um grupo controle de 12 indivíduos normais foram avaliados em relação ao seu estado de resposta imune pela técnica de ELISPOT contra um conjunto de peptídeos derivados dos exons gag e env do gene da família HERV-K HML-2. Como parte de nosso estudo, foi realizado de forma preliminar uma análise genômica in silico de 500 pacientes com câncer de próstata sequenciados e disponíveis para análise pública do banco de dados TCGA, com o objetivo de reforçar o racional de nossa interrogação científica. Além disso , como estudo de correlação, fizemos uma análise por citometria de fluxo da ativação celular de linfócitos T de nossas coortes para determinarmos a imunofenotipagem e ontogenia linfocitária em nossos indivíduos investigados, no momento de nossa pesquisa de sua resposta imune. Resultados: Nossa análise da resposta imune contra peptídeos de HERV-K HML-2 por ELISPOT-Interferon Gama não mostrou nenhum resultado significativo. Nenhum paciente apresentou dados significativos de resposta de acordo com nossos critérios, apesar de nossos dados preliminares de expressão gênica terem mostrado expressão gênica em torno de 17% em pacientes com doença localizada. Nossos dados de ativação linfocitária mostraram maior ativação e senescência nos pacientes com doença disseminada e resistente à castração. Conclusões: Este parece ser o primeiro estudo a interrogar a presença de resposta celular imune contra peptídeos de HERV-K em pacientes com câncer de próstata. Nosso achados não mostraram resposta imune relevante em doença localizada ou disseminada e em diferentes estados de ativação linfocitária ou status de integridade hormonal. Apesar destes resultados, pesquisa posterior poderia utilizar diferente metodologia, como por exemplo a utilização de citometria de fluxo bem como a busca de diferentes citoquinas envolvidas, tais como as relacionadas a resposta Th2, ao invés de Th1 / Purpose: Human Endogenous Retrovirus (HERV) comprises 8% of human genome. Despite the fact that most of it is non-functional due to mutations or loss of genetic material in the process of retrotransposition, there are some evidence of increased expression of HERV in prostate cancer tissue. We studied the cellular immunogenicity of peptides from HERV-K family in 2 cohorts of prostate cancer patients. Experimental Design: PBMCs from 65 patients with hormone-intact localized prostate cancer and 24 patients with castrate-metastatic disease, matched with 12 normal controls were evaluated for cellular immune response by ELLISPOT against a pool of gag and env peptides from HERV-K family of HML-2 type. As an independent supportive study we did in silico genomic analysis of 500 prostate cancer patients from TCGA database to give another evidence of the prevalence of HERV-K gene expression in prostate cancer genome, reinforcing the rational of our questions. Results: Our analysis of cellular immune response against HERV-K HML-2 peptides by Interferon-gama ELISPOT did not show any meaningful results. No patient showed any minimal criteria of response, despite the fact that in our preliminary genomic analysis we obtained HERV expression in about 17% of a cohort of 500 patients with localized prostate cancer. In regards to the flow cytometry data of the lymphocytes we showed stronger activation and senescence status in the cohort of patients with castration sensitive and resistant disseminated disease, compared to the localized disease cohort. Conclusions: To the authors\'s knowledge this is the first study to look for cellular immune response against peptides derived from coding HERV-K transcripts in prostate cancer patients. Our findings did not show relevant immune response in neither localized nor metastatic castrate prostate cancer patients. Despite those results, further research could continue using different methodology, like flow cytometry as well as looking for different cytokines involved, such as those related to a Th2 response, instead of Th1

Indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) que controlam a replicação viral, mesmo na ausência de tratamento com drogas antirretrovirais, representam um exemplo de contenção bemsucedida do vírus. O entendimento das respostas imunes antivirais presentes nestes indivíduos pode auxiliar no delineamento de vacinas, particularmente no caso de estratégias vacinais desenvolvidas para induzir um fenótipo de controle da replicação viral e, assim, diminuir o ritmo da progressão à AIDS e/ou a taxa de transmissão para terceiros. A resposta imune celular contra HIV-1 é geralmente mapeada em ensaios de ELISPOT-IFN-&#947; empregando-se peptídeos pentadecâmeros sobrepostos por 11 aminoácidos sintetizados a partir de seqüências consensuais do vírus. Contudo, este método pode subestimar a detecção da real amplitude da resposta imune celular contra epitopos contidos na seqüência autóloga do vírus infectivo. Neste trabalho, foram comparadas respostas imunes celulares contra peptídeos 15-meros baseados nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1 e respostas imunes contra peptídeos HLA-restritos de nove ou 10 aminoácidos baseados tanto nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1, quanto nas seqüências autólogas dos vírus seqüenciados a partir de seis pacientes controladores da replicação do HIV-1. Nossa análise revelou que três dos seis pacientes investigados mostraram maior amplitude de resposta imune celular contra epitopos em Vif e Nef quando os peptídeos HLA-restritos foram empregados, tenham sido eles preditos a partir da seqüência consensual ou a partir das seqüências do vírus autólogo. O número de respostas positivas aumentou de quatro para 16 em Vif e de oito para 22 em Nef, com o uso dos reagentes HLA-restritos. Estes resultados sugerem que emprego de peptídeos 15-meros pode sub-representar a amplitude real da resposta imune celular envolvidas no controle da replicação do HIV-1 e que o conhecimento acerca das respostas imunes de sucesso em indivíduos controladores pode ser melhorado e ampliado com a revisão dos métodos empregados. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals who spontaneously control viral replication represent an example of successful containment of the AIDS virus. Understanding the anti-viral immune responses in these individuals may help in vaccine design, particularly vaccine strategies designed to induce a controller phenotype and thus, prevent disease progression and decrease risk of transmission. Immune responses against HIV-1 are normally screened using 15-mer peptides overlapped by 11 amino acids from HIV-1 consensus sequences in ELISPOT-IFN-&#947; assays. However, this method may underestimate the real breadth of the cellular immune responses against the autologous sequence of the infecting virus. We compared cellular immune responses against nef and vif-encoded consensus B 15-mer peptides to responses against HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from consensus B and autologous sequences in six patients who have controlled HIV-1 replication. Interestingly, our analysis revealed that three of our patients had broader cellular immune responses against Vif- and Nef-HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from either autologous viruses or from the consensus B sequence, when compared to responses against the 15-mer HIV-1 consensus B peptides. The number of positive responses against epitopes in these two HIV-1 proteins increased from four to 16 for Vif and from eight to 22 for Nef. These findings suggest that immune responses assessed using 15-mers peptides may underrepresent the real breadth of the immune control of the infecting virus and the knowledge about the successful responses in controller individuals could be improved after reviewing the employed methods.