Das Oberflächenepithel (OSE) des Ovars besteht aus einer Schicht flacher oder kubischen Zellen, die am Hilus in das flache Peritonealepithel übergehen. Das OSE zeigt zyklusabhängige Veränderungen. OSE-Zellen sollen am Prozess der Ovulation aktiv teilnehmen und die Läsion nach der Follikelruptur reparieren. Die mitotische Aktivität der OSE-Zellen um den Reparatur-Prozess könnte das Überleben von mutierten Zellen begünstigen und zum Ovarialkarzinom führen. Hierbei spielen Zell-Zell-Kontakte eine Schlüsselrolle bei der Integrität von Gewebe und der Metastasierung von Tumoren. Um das Verständnis über die Pathogenese des Ovarialkarzinoms zu verbessern, untersuchte die vorliegende Arbeit die Zell-Zell-Kontakte des OSE sowie dessen Abhängigkeit von Interferon-γ (IFN-γ), welches u.a. bei der adjuvanten Therapie des Ovarialkarzinoms verwendet wird. Abstriche von humanen und bovinen Ovarien dienten als Quelle zur Kultivierung von OSE-Zellen. Konfluente Kulturen wurden mit 200 U/ml rekombinantem, speziesspezifischem IFN-γ für 72 h behandelt oder als Kontrolle unbehandelt gelassen. Die Morphologie der OSE-Zellen vor und nach der Behandlung wurde dargestellt. Weiterhin wurden mittels immunzytologischer Färbungen sowie Western Blot Analyse E- und N-Cadherin, β-Catenin, Cytokeratin sowie Vimentin nachgewiesen. Permeabilitätsmessungen von Meerrettichperoxidase (HRP) in einem Ko-Kultursystem wurden mit und ohne IFN-γ durchgeführt. Die Arbeit zeigt eine neue Wirkung von IFN-γ. Es hat die besondere Eigenschaft, das OSE komplett über Cadherin-vermittelte „tight juctions“ abzudichten. Dies könnte die Wirksamkeit des Zytokins bei der adjuvanten Therapie des Ovarialkarzinoms erklären. Möglicherweise werden Interzellularkontakte verstärkt und die Frühinvasion maligner Zellen eingeschränkt. Das erstmals beschriebene Cadherinmuster an den Zell-zu-Zell-Ecken verweist auf die Interaktion der „tight junctions“ mit E-Cadherin.

Central driving forces in the pathogenesis of liver disease are hepatocyte death and immune cell-driven inflammation. The interplay between outcomes, stemming from these two major cell types, is present from the earliest ethanol exposure, and are both determinants in advanced stages of liver disease particularly in alcoholic liver disease (ALD). The complexities associated with advanced ALD are many and therapies are limited. Due to the liver’s role in ethanol metabolism and filtering gut-derived products, it is becoming increasingly clear that innate immunity plays a central role in triggering activation of cell death and inflammatory pathways in ALD. We identified interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation as a mediator of hepatocyte death as the first event after ethanol exposure, and the inflammasome as a protein complex responsible for the subsequent inflammatory cascade, driven by the NLRP3 inflammasome. Our novel findings in murine samples and human patients with alcoholic hepatitis demonstrate that ethanol-induced inflammasome activity results in Caspase-1-mediated pyroptosis and extracellular ASC aggregates in the liver and circulation. Pyroptosis can be abrogated by therapeutic inhibition of inflammasome components, NLRP3 or Caspase-1. Taken together, the event leading to mtDNA release into the cytoplasm is the inception of the pathogenesis of ALD, triggering hepatocyte death, culminating in a pro-inflammatory cascade driven by the NLRP3 inflammasome and pyroptotic release of ASC.

Die zunehmende Ausbreitung des Usutu-Virus in Europa als Ursache für fatale Ausbruchsgeschehen innerhalb der Avifauna, insbesondere unter Sperlingsvögeln (Passeriformes) und Eulenartigen (Strigiformes), stellt in Zusammenhang mit einem neuroinvasiven sowie zoonotischen Potential ein Risiko für die Veterinär- sowie Humanmedizin dar. Trotz dieser Relevanz stehen derzeit keine zugelassenen Therapeutika gegen eine Usutu-Virus-Infektion zur Verfügung. Auf Basis indikationsfremder Substanzen mit pharmakologischer Zulassung im Sinne des drug repositioning sowie auf Grundlage der Gegenregulation viral-induzierter Modulationen des Zellmetabolismus wurde die Identifikation antiviraler Therapieoptionen gegen das Usutu-Virus in vitro angestrebt.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Usutu-Virus 2.1.1 Ursprung, Klassifikation und Epidemiologie 2.1.1 Transmissionszyklus und Wirtstropismus 2.1.2 Aufbau des Virions und des Genoms 2.1.3 Veterinärmedizinische Relevanz und pathologische Ausprägung 2.1.4 Humanmedizinische Bedeutung als Zoonose-Erreger 2.1.5 Vergleichende Aspekte zum West-Nil-Virus 2.2 Antivirale Präventions- und Therapieoptionen 2.2.1 Möglichkeiten und Grenzen der Immunprophylaxe 2.2.2 Pharmaka mit potentiell antiviraler Wirkung gegen Flaviviren 2.2.3 Identifizierte Substanzen gegen das Usutu-Virus 2.3 Zelluläre Systeme als antivirale Zielobjekte 2.3.1 Das Interferon-System und seine antivirale Schutzfunktion 2.3.2 Viral-induzierte Modulation des Wirtszellmetabolismus 3 Zielstellungen der Dissertation 4 Material 4.1 Zelllinien 4.2 Viruslinien 4.3 Zellkulturmedien 4.4 Pharmakologische und andere Substanzen 4.5 Chemikalien 4.6 Lösungen und Puffer 4.7 Antikörper 4.8 Reagenzien und Kit-Systeme 4.9 Enzyme und Nukleotide 4.10 Primer 4.11 Verbrauchsmaterialen 4.12 Geräte 4.13 Datenbanken und Software 5 Methodik 5.1 Zellkultivierungstechnik und PBMC-Isolation 5.2 Isolation von Usutu-Virus-Linien aus Gewebeproben in Zellkultur 5.2.1 Aufbereitung aviären Organmaterials 5.2.2 Typisierung von in Deutschland zirkulierenden Usutu-Virus-Linien (2019, 2020) 5.2.3 Virusanzucht in verschiedenen Zellkulturen zur Virusstock-Generierung 5.3 Quantifizierung des extrazellulären Virustiters 5.4 Immunfluoreszenzanalyse 5.5 Präparation pharmakologischer und anderer Substanzen 5.6 Infektionsansätze mit dem Usutu-Virus und WNV 5.7 Durchflusszytometrische Analyse 5.8 Zytotoxizitätsstudien 5.9 Extrazelluläre Fluxanalyse mittels Agilent Seahorse XF-Technologie 5.10 Statistische Analyse 6 Ergebnisse 6.1 Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 6.2 Replikationsdynamik des Usutu-Virus in verschiedenen Zelllinien 6.3 Pharmakologisches Screening zur antiviralen Wirksamkeit gegen das Usutu-Virus 6.4 Identifikation und Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften von Ivermectin 6.5 Wirkung von Ivermectin gegen Linie 2 des West-Nil-Virus in einer aviären Zelllinie 6.6 Metabolischer Phänotyp Usutu-Virus-infizierter Zelllinien 6.7 Antivirale Inhibition der Glykolyse durch 2-Deoxy-D-Glukose 6.8 Einfluss von exogenem Interferon auf den Wirtszellmetabolismus unter Infektion 6.9 Auswirkung der Interferon-Rezeptor-Defizienz auf den Metabolismus unter Infektion 7 Diskussion 7.1 Typisierung und Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 7.2 Charakterisierung der zelltypspezifischen Permissivität und Replikationskinetik 7.3 Identifikation antiviral wirksamer Substanzen gegen das Usutu-Virus 7.4 Usutu-Virus-induzierte Modulation des Metabolismus als antiviraler Ansatz 8 Ausblick 9 Zusammenfassung 10 Summary 11 Literaturverzeichnis 12 Anhang 12.1 Zusatzmaterial 12.2 Publikation 1 12.3 Publikation 2 12.4 Publikation 3 12.5 Weitere Veröffentlichungen 13 Danksagung / The emerge of Usutu virus (USUV) in Europe as a causative agent of fatal outbreaks in avifauna, notably in Passeriformes and Strigiformes, as well as its neuroinvasive and zoonotic potential emphasize a considerable risk in veterinary and human medicine. Despite its relevance, recently, no approved drugs against USUV infections are available. The identification of antiviral therapeutic options against USUV in vitro was addressed based on the analysis of approved drugs of other medical indications in terms of drug repositioning and the counteraction of viral-induced alterations of the cellular metabolism.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Usutu-Virus 2.1.1 Ursprung, Klassifikation und Epidemiologie 2.1.1 Transmissionszyklus und Wirtstropismus 2.1.2 Aufbau des Virions und des Genoms 2.1.3 Veterinärmedizinische Relevanz und pathologische Ausprägung 2.1.4 Humanmedizinische Bedeutung als Zoonose-Erreger 2.1.5 Vergleichende Aspekte zum West-Nil-Virus 2.2 Antivirale Präventions- und Therapieoptionen 2.2.1 Möglichkeiten und Grenzen der Immunprophylaxe 2.2.2 Pharmaka mit potentiell antiviraler Wirkung gegen Flaviviren 2.2.3 Identifizierte Substanzen gegen das Usutu-Virus 2.3 Zelluläre Systeme als antivirale Zielobjekte 2.3.1 Das Interferon-System und seine antivirale Schutzfunktion 2.3.2 Viral-induzierte Modulation des Wirtszellmetabolismus 3 Zielstellungen der Dissertation 4 Material 4.1 Zelllinien 4.2 Viruslinien 4.3 Zellkulturmedien 4.4 Pharmakologische und andere Substanzen 4.5 Chemikalien 4.6 Lösungen und Puffer 4.7 Antikörper 4.8 Reagenzien und Kit-Systeme 4.9 Enzyme und Nukleotide 4.10 Primer 4.11 Verbrauchsmaterialen 4.12 Geräte 4.13 Datenbanken und Software 5 Methodik 5.1 Zellkultivierungstechnik und PBMC-Isolation 5.2 Isolation von Usutu-Virus-Linien aus Gewebeproben in Zellkultur 5.2.1 Aufbereitung aviären Organmaterials 5.2.2 Typisierung von in Deutschland zirkulierenden Usutu-Virus-Linien (2019, 2020) 5.2.3 Virusanzucht in verschiedenen Zellkulturen zur Virusstock-Generierung 5.3 Quantifizierung des extrazellulären Virustiters 5.4 Immunfluoreszenzanalyse 5.5 Präparation pharmakologischer und anderer Substanzen 5.6 Infektionsansätze mit dem Usutu-Virus und WNV 5.7 Durchflusszytometrische Analyse 5.8 Zytotoxizitätsstudien 5.9 Extrazelluläre Fluxanalyse mittels Agilent Seahorse XF-Technologie 5.10 Statistische Analyse 6 Ergebnisse 6.1 Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 6.2 Replikationsdynamik des Usutu-Virus in verschiedenen Zelllinien 6.3 Pharmakologisches Screening zur antiviralen Wirksamkeit gegen das Usutu-Virus 6.4 Identifikation und Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften von Ivermectin 6.5 Wirkung von Ivermectin gegen Linie 2 des West-Nil-Virus in einer aviären Zelllinie 6.6 Metabolischer Phänotyp Usutu-Virus-infizierter Zelllinien 6.7 Antivirale Inhibition der Glykolyse durch 2-Deoxy-D-Glukose 6.8 Einfluss von exogenem Interferon auf den Wirtszellmetabolismus unter Infektion 6.9 Auswirkung der Interferon-Rezeptor-Defizienz auf den Metabolismus unter Infektion 7 Diskussion 7.1 Typisierung und Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 7.2 Charakterisierung der zelltypspezifischen Permissivität und Replikationskinetik 7.3 Identifikation antiviral wirksamer Substanzen gegen das Usutu-Virus 7.4 Usutu-Virus-induzierte Modulation des Metabolismus als antiviraler Ansatz 8 Ausblick 9 Zusammenfassung 10 Summary 11 Literaturverzeichnis 12 Anhang 12.1 Zusatzmaterial 12.2 Publikation 1 12.3 Publikation 2 12.4 Publikation 3 12.5 Weitere Veröffentlichungen 13 Danksagung

Hintergrund Das Aicardi-Goutières Syndrom (AGS) ist eine genetisch bedingte Enzephalopathie, die durch Mutationen in neun verschiedenen Genen verursacht wird und zu einer Neurodegenration mit globaler Entwicklungsverzögerung führt. Die Mutationen führen zu einer Fehlregulation des Metabolismus und der immunologischen Erkennung intrazellulärer Nukleinsäuren sowie einer konstitutiven Aktivierung von Typ 1-Interferon (IFN). Bei AGS-Patienten sind Kalzifizierungen der Basalganglia sowie Demyelinisierungen der weißen Substanz charakteristisch. Fragestellung: Biallele Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, sind Ursache des AGS Typ 1 und AGS Typ 5. Die DNA-Exonuklease TREX1 degradiert intrazelluläre Nukleinsäure-Metabolite, die während zellulärer Prozesse gebildet werden. Die Triphosphohydrolase SAMHD1 spielt vorrangig in der Regulation des intrazellulären dNTP-Pools und des RNA-Metabolismus eine wichtige Rolle. Die Möglichkeit induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zu generieren und damit aus somatischen Zellen embryonale Stammzellen nachzubilden, um diese in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren, ermöglicht es, Zelltypen von schwer zugänglichen Geweben wie das Gehirn zu erforschen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Auswirkungen einer TREX1- und SAMHD1-Defizienz in neuronalen Zellen. Dazu wurden reprogrammierte neuronale Modelle für das AGS Typ 1 und AGS Typ 5 etabliert. Ziel war hierbei die Aufdeckung bisher unbekannter molekularer Mechanismen, die zur Entstehung einer Typ 1-IFN-induzierten Inflammation und Neurodegeneration bei Patienten mit AGS führt. Material und Methoden: Als Ausgangspunkt dieser Arbeit dienten primäre Fibroblasten und PBMCs, die aus Hautbiopsien bzw. Blutproben von AGS-Patienten mit Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, gewonnen wurden. Durch eine Reprogrammierung dieser patientenspezifischen Zellen wurden pluripotente Stammzellen induziert und anschließend über die Bildung von Embryonalkörperchen und neuronale Vorläuferzellen in neuronale Zellen differenziert. Um die etablierten neuronalen Zelllinien funktionell zu charakterisieren, wurden isogene Zelllinien etabliert. Hierbei wurde mittels Genomeditierung der patientenspezifischen iPS-Zellen die krankheitsassoziierte Mutation behoben und auf diese Weise isogene Zelllinien mit identischem genetischen Hintergrund generiert, die sich lediglich durch die Anwesenheit oder das Fehlen der krankheitsrelevanten Mutation unterscheiden. Unter Nutzung verschiedener molekularbiologischer Methoden wurden die patientenspezifischen neuronalen Zellen näher untersucht. Um die in Patienten-Fibroblasten nachgewiesene erhöhten Typ 1-IFN-Aktivität auch im neuronalen Zellmodell zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit AGS-patientenspezifische neuronale Zellen und deren Vorläufer auf eine Erhöhung der IFN-Signatur überprüft. Um die etablierten neuronalen Zellmodelle eines AGS auf zellulären Stress in Form von ROS zu untersuchen, wurden patientenspezifische NPCs im Vergleich zu WT-Linien mittels DHR-Assay analysiert. Weiterhin wurde aus neuronalen Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen mittels einer speziellen Kultivierungsmethode zur in vitro Separation von Axonen und Dendriten in proximale und distale Bereiche und einem nachfolgenden Tracking von Lysosomen und Mitochondrien per Live cell imaging die subzelluläre Verteilung dieser Organellen untersucht. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden zudem aus iPSC bzw. NPCs gewonnene neuronale Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen die zelluläre Expression von Proteinen, die eine Rolle bei neurodegenerativen Krankheiten spielen, untersucht. Ergebnisse Die Nutzung der iPSC-Technologie eröffnet besonders für neurodegenerative Krankheiten die Möglichkeit, geeignete zelluläre Krankheitsmodelle zu schaffen. So existieren bereits eine Reihe iPSC-basierter Studien für Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington oder amyotropher Lateralsklerose. Mit der vorliegenden Arbeit wurden iPSC-basierte Modelle für das AGS entwickelt. Als Grundstein dieser Arbeit konnten aus somatischen Zellen von AGS-Patienten pluripotente Stammzellen erzeugt und als iPSCLinien etabliert werden. Die funktionelle Charakterisierung der patientenspezifischen Zellen erfolgte durch die Etablierung isogener Kontrollen mit identischem genetischen Hintergrund, um phänotypische Unterschiede direkt auf die krankheitsspezifischen Mutationen zurückzuführen. Die vorhandenen SAMHD1- und TREX1-Mutationen in den iPS-Zellen der Patienten wurden zunächst mittels Genomeditierung korrigiert. Anschließend wurden iPSC-Linien etabliert. Die patientenspezifischen iPS-Zellen sowie die isogenen Kontrollen wurden über neuronale Vorläuferzellen zu Neuronen differenziert, validiert und funktionell untersucht. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die etablierten Zellmodelle teilweise den Phänotyp eines AGS rekapitulieren. So entsprach die im AGS-Modell neuronaler Vorläuferzellen untersuchte Expression von IFN-stimulierten Genen (ISGs) weitgehend dem typischen Bild einer Interferonopathie und konnte durch den Vergleich mit isogenen Zelllinien auf die TREX1-Mutation der neuronalen Vorläuferzellen zurückgeführt werden. Eine Variabilität der ISG-Expression in ausdifferenzierten neuronalen Zellen könnte verschiedene Ursachen haben. Die Untersuchungen auf zellulären Stress in Form von ROS konnten zeigen, dass sowohl in TREX1- als auch SAMHD1-defizienten neuronalen Vorläuferzellen ein erhöhtes zelluläres Level an ROS vorliegt. Möglicherweise ist dies mit dem festgestellten langsamen Zellwachstum der patientenspezifischen Vorläuferzellen assoziiert. Weiterhin konnte mittels Live cell imaging ein verringertes Mobilitätsverhalten von Lysosomen und Mitochondrien in patienten- spezifischen neuronalen Zellen festgestellt werden, was die Vermutung nahelegt, dass die untersuchten AGS-verursachenden Mutationen in TREX1 und SAMHD1 ursächlich an der Neurodegeneration bei AGS-Patienten beteiligt sind. Ausblick: Die in dieser Arbeit erfolgreich etablierten reprogrammierten neuronalen AGS-Modelle können zukünftig dazu dienen, pathogenetische Prozesse im Gehirn zu untersuchen. Es konnten Grundlagen zur Aufklärung bisher unbekannter molekularer Mechanismen der Neurodegeneration bei AGS-Patienten geschaffen werden. Weiterführend kann das etablierte Modell zur Untersuchung weiterer Aspekte wie der Messung von transkriptomweiten Expressionsprofilen verwendet werden und somit neue Einblicke in die zellintrinsische Aktivierung der Typ 1-IFN-Achse von AGS-Patienten liefen. Um die Rolle von neuronal vorkommenden Proteinen oder Vesikeln bei neuronalen Erkrankungen, insbesondere bei AGS,zu untersuchen, stellt das patientenspezifische AGS-Modell eine wichtige Grundlage dar. Die hier aufgeführten immunhistochemischen Untersuchungen neuronaler Proteine können vertieft und in einem größeren Umfang ausgewertet werden. Die vorteilhaften Eigenschaften der iPSC-basierten neurodegenerativen Modelle ermöglichen neben grundlagenwissenschaftlichen Untersuchungen zur Krankheitsursache auch die Bearbeitung von Fragestellungen zur Behandlung von AGS-Patienten.

Pat. mit Multipler Sklerose haben ein erhöhtes Risiko, einen schweren Verlauf einer SARS- CoV-2 Infektion zu entwickeln. Durch das fehlregulierte Immunsystem und durch die mit dem Krankheitsbild verbundenen vielen körperlichen Einschränkungen treten bei MS Pat. häufiger schwere Infektionen auf. Eine Anti-CD20-Antikörpertherapie depletiert vor allem B-Zellen, zu einem geringen Teil auch T-Zellen. Mit dieser immunsupprimierenden Therapie haben Pat. ein nochmals erhöhtes Infektionsrisiko. Zur B-Zell depletierenden Therapie (BZDT) werden aktuell Ocrelizumab, Ofatumumab und Rituximab verwendet. Durch eine Impfung könnten die MS Pat. mit BZDT vor einer SARS-CoV-2 Infektion geschützt werden bzw. ein schwerer Verlauf durch sie verhindert werden. Die Beurteilung der Effektivität einer Impfung kann durch die Analyse der B-Zell spezifischen und T-Zell spezifischen Impfantwort untersucht werden. Ziel der Studie ist es, herauszufinden, ob Pat. trotz der MS-Erkrankung und einer Anti-CD20 Antikörpertherapie eine Impfantwort entwickeln und ob die Pat. dadurch von einer SARS- CoV2-Impfung profitieren.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Multiple Sklerose 1.1.1 Epidemiologie 1.1.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.1.3 Pathophysiologie 1.1.4 Symptome 1.1.5 Verlaufsformen 1.1.6 Diagnostik 1.1.7 Prognosefaktoren 1.1.8 Therapie 1.2 SARS-CoV-2 1.2.1 Epidemiologie 1.2.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.2.3 Infektion und ihre Immunantwort 1.2.4 Impfung 2. Fragestellung und Zielsetzung 3. Material und Methode 3.1 Einschlusskriterien 3.2 Methode 3.2.1 B-Zell Antwort 3.2.2 T-Zell Antwort 3.3 Statistik 3.4 Pat.kollektiv 4. Ergebnisse 4.1 Ergebnisse nach der Grundimmunisierung 4.1.1 B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.1.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.2 Ergebnisse nach der Booster Impfung 4.2.1 B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.2.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.3 SARS-CoV-2 spezifische B- und T-Zell Antwort im Verlauf 4.4 Bedeutung des zeitlichen Beginns einer BZDT auf die SARS-CoV-2 spezifische Impfantwort 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Danksagung 10. Anhang (einschließlich Originalpublikationen) / Patients with multiple sclerosis generally face an elevated risk of experiencing a severe course of SARS-CoV-2 infection. This heightened susceptibility results from the dysregulated immune system and various physical limitations associated with the disease. Anti-CD20 therapy primarily leads to B-cell depletion and, to a lesser extent, T-cell depletion. Consequently, patients undergoing BCDT, which includes ocrelizumab, ofatumumab, and rituximab, are at an even greater risk of infection due to this immunosuppressive therapy. Vaccination emerges crucial of protecting MS patients undergoing BCDT from SARS-CoV-2 infection or mitigating the severity of the disease. The effectiveness of a vaccination can be assessed by analyzing the B-cell specific and T-cell specific vaccination response. The study aims to ascertain whether patients with MS, despite the disease and anti-CD20 antibody therapy, develop a vaccination response and whether they indeed benefit from a SARS-CoV-2 vaccination.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Multiple Sklerose 1.1.1 Epidemiologie 1.1.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.1.3 Pathophysiologie 1.1.4 Symptome 1.1.5 Verlaufsformen 1.1.6 Diagnostik 1.1.7 Prognosefaktoren 1.1.8 Therapie 1.2 SARS-CoV-2 1.2.1 Epidemiologie 1.2.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.2.3 Infektion und ihre Immunantwort 1.2.4 Impfung 2. Fragestellung und Zielsetzung 3. Material und Methode 3.1 Einschlusskriterien 3.2 Methode 3.2.1 B-Zell Antwort 3.2.2 T-Zell Antwort 3.3 Statistik 3.4 Pat.kollektiv 4. Ergebnisse 4.1 Ergebnisse nach der Grundimmunisierung 4.1.1 B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.1.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.2 Ergebnisse nach der Booster Impfung 4.2.1 B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.2.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.3 SARS-CoV-2 spezifische B- und T-Zell Antwort im Verlauf 4.4 Bedeutung des zeitlichen Beginns einer BZDT auf die SARS-CoV-2 spezifische Impfantwort 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Danksagung 10. Anhang (einschließlich Originalpublikationen)

Ein Schlüsselprozess in der Immunantwort ist die durch das proinflammatorische Zytokin Interferon-gamma (IFNg) induzierte transiente Akkumulation von neu synthetisierten defekten Proteinen, die durch Anknüpfen von Polymeren des Proteins Ubiquitin (Ub) post-translational modifiziert werden. Die Ubiquitinierung ist das Schlüsselsignal für den Abbau dieser Proteine. Die Abbauprodukte dienen unter anderem als Quelle für die Prozessierung von Antigenen. Um die frühe Immunantwort besser zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Identität und Charakteristika dieser neu synthetisierten Proteine, sowie die Topologie ihrer post-translationalen Modifizierung durch Ub untersucht. Dazu wurde die massenspektrometrischen Analyse ubiquitinierter Proteine weiterentwickelt, indem die experimentellen Konditionen auf deren Analyse optimiert wurden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die kombinierte Verdauung der Ub-Konjugate mittels zweier Peptidasen die Identifizierung der Proteinpeptide und der Indikatorpeptide für Ubiquitinierungsstellen entscheidend verbessert. Es wurde demonstriert, dass eine selektive Isotopenmarkierung der neu synthetisierten Proteine möglich ist. Mit Hilfe dieser Methode gelang es, Veränderungen der Ub Modifikationen bezüglich der Topologie sowie quantitative Unterschiede der ubiquitinierten Proteine aus humanen HeLa-Zellen in An- und Abwesenheit von IFNg zu identifizieren. Nach Induktion durch IFNg wurden drei polyubiquitinierte, drei mono- oder polyubiquitinierte und 111 potentiell ubiquitinierte Proteine identifiziert. Diese Proteine zeigten, dass keine generelle Ubiquitinierungspräferenz für die durch IFNg verstärkt transkribierten Gene besteht. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Verständnis der frühen zellulären Immunantwort und tragen zum Verständnis von Krebs- und Autoimmunerkrankungen sowie chronischen Entzündungsprozessen bei. Möglicherweise bilden sie die Grundlage für die Weiterentwicklung entsprechender Therapien. / A key process within the immune response of organisms is the transient accumulation of newly synthesized defective proteins affected by the proinflammatory cytokine interferon-gamma(IFNg). These proteins are post-translationally modified by attachment of polymers of the protein ubiquitin (Ub), which represents the key signal for targeting them to degradation. The resulting peptides can serve as sources for antigen processing. In order to get an insight into the details of the cellular early immune response, the identity and characteristics of the newly synthesized proteins and the topology of their post-translational modification with Ub were investigated. An essential progress of the mass spectrometric approach was achieved by optimizing the experimental conditions with regard to the requirements of the analysis of the targeted proteins. In particular, it could be shown that a combined digestion of Ub-conjugates with two peptidases leads to an improved detection of protein peptides and indicator peptides for ubiquitination sites. It was shown that a selective isotopic labeling of the newly synthesized proteins was possible. With this method, a decisive step forward was made in the understanding of changes of the Ub modifications with respect to the topology and in clarifying the quantitative differences between Ub-conjugates from IFNg treated and untreated human HeLa cells. Three IFNg induced polyubiquitinated proteins, three mono- or polyubiquitinated as well as 111 potential Ub-substrates could be identified. These proteins did not show any general ubiquitination preference for genes whose transcription is enhanced in presence of IFNg. The results obtained in this work help to broaden and refine the general picture of the early cellular immune response. They contribute to the knowledge on molecular processes of cancer, autoimmune diseases or chronic inflammation and, potentially, can give hints for the continued development of corresponding therapies.

Das Gen H-rev107 wurde mit einer subtraktiven cDNS-Bibliothek zwischen H-ras-transformierten und H-ras-resistenten Fibroblasten isoliert. Es wurde als ein Klasse II Tumorsuppressorgen bezeichnet, dessen Expression die H-ras-induzierte maligne Transformation unterdrückt. Weitere Untersuchungen zeigten die Existenz einer Genfamilie mit dem Gen H-rev107-1 auf Chromosom 11q11-12 und H-rev107-2/TIG3/RARRES3 auf 11q23. Die Induzierbarkeit in epithelialen Zellen durch Interferon-gamma (H-rev107-1) und Retinoide (H-rev107-2) legten eine Beteiligung der Expression beider Gene bei der Regulation der Hämatopoese nahe. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels RT-PCR in 8/15 Patientenproben (10 AML, 5 ALL) eine Expression von H-rev107-2 gefunden. H-rev107-2 wurde durch IFN-gamma in 14/14 Proben und durch all-trans Retinsäure (ATRA) in 5/15 Proben induziert. In Zelllinien maligner hämatopoetischer Erkrankungen konnte mit RT-PCR und Northern-Blot-Analysen bei CEM eine deutliche, bei Raji und HL-60 eine schwache Expression und bei NB-4, U937, K562 und Jurkat keine Expression von H-rev107-2 nachgewiesen werden. In allen 7 Zelllinien konnte H-rev107-2 durch IFN-gamma induziert werden. Die Induzierbarkeit durch ATRA und IFN-alpha war Zelllinien abhängig. Die stärkste Induktion durch ATRA erfolgte bei der akuten Promyelozytenleukämie-Zelllinie NB-4. Eine Induktionskinetik erbrachte eine H-rev107-2-Expression frühestens nach 4 h Inkubation mit IFN-gamma oder ATRA. Die Inhibition des MAPK-Signalwegs durch den MEK-Inhibitor PD098059 und des Signaltransduktors JAK2 durch AG490 hatte bei den myeloischen Zelllinien weder Einfluss auf die H-rev107-2-Expression noch auf die H-rev107-2-Induktion durch IFN-gamma oder ATRA. Die Expression von H-rev107-1 konnte bei U937, CEM und K562 gezeigt werden, wogegen die RT-PCR-Analysen bei NB-4, HL-60, Raji und Jurkat sowie bei 8 Patientenproben (6 AML, 2 ALL) keine H-rev107-2-Transkripte nachwiesen. Eine schwache Induktion von H-rev107-1 konnte nur bei den Zelllinien NB-4 durch ATRA und IFN-gamma und bei K562 durch IFN-gamma und IFN-alpha erzielt werden. Zusammenfassend legen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung von H-rev107-2/TIG3/RARRES3 bei der Regulation der Hämatopoese als ein mögliches Interferon- und ATRA-Target nahe. / The H-rev107 gene has been isolated by cDNA subtraction from a cell culture model of H-ras transformed fibroblasts. It was characterized as a class II tumor suppressor gene confering resistance to H-ras induced transformation. Further investigation has demonstrated the presence of a human gene family with H-rev107-1 localized on chromosome 11q11-12 and H-rev107-2/TIG3/RARRES3 on 11q23. Inducibility of the genes in epithelial cells by interferon-gamma (H-rev107-1) and retinoids (H-rev107-2) has suggested that expression of the H-rev107 genes might be relevant in hematopoesis. In the present study RT-PCR analysis revealed an expression of H-rev107-2 in 8/15 samples of leukaemic blasts derived from patients suffering from acute leukaemias (10 AML, 5 ALL). H-rev107-2 was induced upon incubation with IFN-gamma ?in 14/14 samples and with ATRA in 5/15 samples. In cell lines derived from myeloid and lymphoid tumors an expression of H-rev107-2 was found in CEM (strong), Raji and HL-60 (both weak), whereas in NB-4, U937, K562 and Jurkat no H-rev107-2 transcripts were detected by RT-PCR and Northern Blot analysis. In all cell lines H-rev107-2 could be strongly induced by IFN-gamma. Inducibility of H-rev107-2 upon treatment with IFN-alpha or ATRA was dependent on the type of cell line. In contrast to the weak effect seen in the myeloblastic cell line HL-60 a strong induction of H-rev107-2 by ATRA occurred in the acute promyelocytic leukaemia cell line NB-4. Transcripts of H-rev107-2 in NB-4 were detected at the earliest after 4 h incubation with ATRA or IFN-gamma. Inhibition of the MAPK-pathway by the MEK-inhibitor PD089059 or the signal transducer JAK2 by AG490 had neither influence on the H-rev107-2 expression nor on the IFN-gamma- and ATRA-dependent H-rev107-2 induction. H-rev107-1 expression was detectable in U937, CEM and K562, whereas RT-PCR analysis of the other cell lines and of 8 samples of primary leukaemic blasts (6 AML, 2 ALL) revealed no H-rev107-1 expression. An induction of H-rev107-1 occurred exclusively in NB-4 by ATRA and IFN-gamma and in K562 by IFN-gamma and IFN-alpha? to a weak extend. In conclusion, this work revealed a likely involvement of the class II tumor suppressor gene H-rev107-2/TIG3/RARRES3 in the regulation of hematopoesis being a potential IFN and ATRA target.

Mit durchflusszytometrischen und molekularbiologischen Verfahren wurden verschiedene Subpopulationen peripherer T-Lymphozyten bei gesunden Spendern und Nierentransplantatempfängern phänotypisch und funktionell untersucht. Wir fanden, dass eine T-Zell-Population, welche unter anderem die Oberflächenmarker LFA-1 und CD57 exprimierte, nicht aber CD28, terminale Effektorzellen enthielt. Wegen der bekannten Assoziation der Expansion CD57-positiver CD8-positiver T-Zellen mit einer Infektion mit dem Zytomegalievirus (CMV), wollten wir untersuchen, ob auch CMV-spezifische Effektorzellen darin enthalten waren. Um diesen möglichen Zusammenhang zwischen Phänotyp und Spezifität zu untersuchen, wurde ein bekanntes durchflusszytometrisches Verfahren zur Erfassung antigen-spezifischer CD4-T-Zellen so modifiziert, dass damit auch antigen-spezifische CD8-T-Zellen erfasst werden konnten. Dazu wurden frisch isolierte periphere mononukleäre Zellen in vitro mit löslichen Peptiden oder Peptidgemischen inkubiert (anstelle von Erregerlysaten oder Proteinantigenen wie im bekannten Verfahren), so dass durch direkte externe Beladung von MHC-I- und MHC-II- Molekülen nicht nur CD4- sondern auch CD8-T-Zellen stimuliert wurden. Anschließend konnten CD4 - und/oder CD8-positive T-Zellen nachgewiesen werden, in welchen es zur Synthese von Interferon-gamma gekommen war (intrazelluläre Färbung), wodurch diese Zellen als antigen-spezifisch identifiziert wurden. Diese Zellen konnten dann weiter phänotypisch analysiert werden. Unter Verwendung bekannter CD8-T-Zellen-stimulierender CMV-Peptide konnte der Phänotyp CMV-spezifischer CD8-T-Zellen untersucht werden, wobei sich zeigte, dass das CD57-positive Subset tatsächlich den gößeren Teil der CMV-spezifischen CD8 T-Zellen enthielt. Andererseits konnte das neue Verfahren verwendet werden, um weitere Peptide zu identifizieren, welche eine T-Zellstimulation bewirkten (Epitopkartierung). In zwei von uns untersuchten Proteinen des CMV (pp65 und IE-1) wurden so mehrere neue CD4- und CD8-T-Zellepitope beschrieben. Die Vewendung komplexer Peptidgemische erlaubte darüber hinaus die Untersuchung der T-Zellantwort gegen ganze Proteine (repräsentiert durch die Gesamtheit aller denkbaren Epitope), was insbesondere für die Untersuchung von CD8-T-Zellen eine große Bereicherung darstellte und vom MHC-Typ unabhängig war. Wir verwendeten dieses neue Verfahren bisher zur Analyse und zum Monitoring der T-Zellantwort gegen bestimmte Erregerproteine oder -peptide (z.B. aus CMV oder HIV). Es eignet sich darüber hinaus auch zur Untersuchung der Immunantwort gegen Impfstoffe, welche zur Induktion von T-Zellen führen sollen. / Using flow-cytometric and molecular-biology methods subpopulations of peripheral blood T-lymphocytes were examined in healthy donors and renal transplant recipients with respect to phenotype and function. We found that a T-cell population that expressed the surface markers LFA-1 and CD57 (among others), but not CD28, contained terminal effector cells. Because of the known association of an expansion of CD57-positive CD8-positive T-cells with an infection with Cytomegalovirus (CMV), we wanted to examine if CMV-specific effector cells were also contained in this subset. In order to investigate this association between phenotype and specificity, we modified a known flow-cytometric method for the detection of antigen-specific CD4 T-cells in such a way that antigen-specific CD8 T-cells could also be detected. For this purpose freshly isolated mononuclear cells were incubated in vitro with soluble peptides or peptide mixes (instead of pathogen lysates or protein antigens as used in the original method) so that following direct external loading of MHC-I and MHC-II molecules not only CD4 T-cells but also CD8-T-cells were stimulated. Subsequently, CD4 and/or CD8 T-cells that had synthesized Interferon-gamma (intracellular staining), which identified them as being antigen-specific, could be detected. These cells could then be analyzed with regard to phenotype. Using known CD8-T-cell stimulating CMV-peptides, the phenotype of CMV-specific CD8 T-cells could be analyzed. Thus it was demonstrated that the majority of CMV-specific CD8 T-cells was indeed contained in the CD57-positive subset. On the other hand, this new approach allowed the identification of additional peptides that stimulated T-cells (epitope mapping). In two CMV-proteins that we examined (pp65 and IE-1) several new CD4 and CD8-T-cell epitopes were described. The use of complex peptide mixes in this approach allowed the analysis of T-cell responses to complete proteins (represented by the entirety of all possible epitopes), which was a great benefit to the analysis of CD8 T-cells and independent of MHC-type. Until now, we have used this new method for the analysis and the monitoring of the T-cell response to specific pathogen proteins or peptides (e.g. from CMV or HIV). It is suitable, moreover, for the analysis of the immune response to vaccinations that aim at the induction of T-cells.

alpha-Interferon (alpha IFN) ist derzeit die Grundlage jeder Behandlung der chronischen Hepatitis C. Zu den unerwünschten Effekten von alpha-IFN gehört die Entwicklung psychiatrischer Nebenwirkungen, die sich häufig als Depressivität äussern. Deren Häufigkeit, Schweregrad und Behandlungsbedarf wurden jedoch bisher nur unzureichend erforscht. 66 Patienten mit chronischer Hepatitis C wurden in einer Pilotstudie mit alpha-IFN als Monotherapie (3x3 MU/ Woche) oder in Kombination mit Ribavirin (1000-1200 mg/ Woche) behandelt. Sämtliche Patienten wurden vor, während und nach der Therapie hinsichtlich ihrer Depressivität beurteilt. Dies geschah sowohl im persönlichen Gespräch als auch mit Hilfe der Selbstbeurteilungsinstrumente ADS (Allgemeine Depressions Skala) und BDI (Beck Depressions Inventar). Die Ausgangsdepressivität der Hepatitispatienten entsprach dem gesunden Eichkollektiv. Im Gesamtdurchschnitt stieg die Depressivität innerhalb der ersten drei Behandlungsmonate um 5,15 (+/-8,94) Punkte auf der ADS und um 3,85 (+/-6,94) Punkte im BDI an. Weniger als ein Drittel der Patienten erlebte keine Zunahme der Depressivität. Patienten, die vor Therapiebeginn eine geringe Depressivität aufwiesen, beschrieben eine stärkere Zunahme depressiver Symptome als Patienten, die initial als depressiv beurteilt wurden. Letztere blieben während des Therapieverlaufs jedoch weiterhin depressiver als die anfangs nicht-depressiven Patienten. Vier Patienten wurden wegen schwerster depressiver Nebenwirkungen stationär psychiatrisch behandelt. Es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen Ausgangsdepressivität und Behandlungserfolg festgestellt. Um stark gefährdete Patienten frühzeitig zu erkennen, wird vorgeschlagen, sowohl ADS als auch BDI vor und während der Therapie zu verwenden. Anhand eines ADS-Grenzwertes von > 17 vor und >= 30 während der Behandlung konnten 75% derjenigen Patienten, die im Verlauf der Therapie mit alpha-IFN schwerste depressive Symptome entwickelten, identifiziert werden. / Interferon-alpha (alpha-IFN) is presently the mainstay of the treatment of chronic hepatitis C. Side effects include a range of psychiatric symptoms, most frequently the development of depressive symptoms. Their incidence, severity and necessity for therapeutic intervention has not yet been sufficiently studied. 66 patients with chronic hepatitis C were enrolled in a pilot study and treated with either alpha-IFN alone (3x3 MU/ week) or in combination with Ribavirin (1000-1200 mg/ week). All patients went through repeated evaluations concerning their depressive symptoms before, during, and after treatment. Apart from individual interviews with the psychosomatic staff, the psychometric instruments used were the ADS (Allgemeine Depressions Skala, the German version of the Center for Epidemiological Studies Depression Scale, CES-D) and the BDI (Beck Depression Inventory). The initial depression score of the hepatitis C patients was comparable to that of a healthy population. On average, depression scores increased by 5,15 points (+/-8,94) on the ADS and 3,85 points (+/-6,94) on the BDI during the first 3 months of treatment. Less than a third of all patients did not show an increase of depressive symptoms. Patients with an initially low depression score experienced a greater increase of depressive symptoms than patients initially diagnosed as depressive. Nevertheless, the latter patients remained more depressive throughout the study period. Four patients developed severe depressions that necessitated admission to a psychiatric clinic. There was no significant correlation between the initial depression score and the treatment response. In order to recognize those patients at high risk for the development of severe depressions at an early stage, the author proposes the use of ADS and BDI both before and during treatment with alpha-IFN. Using a cut-off score of more than 17 points on the ADS before, and >=30 points during treatment, 75% of all patients developing severe depressions during treatment with alpha-IFN could be identified.

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche / Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response.