En el desarrollo de esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de diferentes vías de señalización intracelular implicadas en los procesos de supervivencia y muerte neuronal en el contexto de la enfermedad de Huntington, con el objetivo de entender cómo la presencia de la proteína "htt" mutada afecta de forma específica a la normal viabilidad y supervivencia de las neuronas GABAérgicas del núcleo estriado.En un primer trabajo se estudió la implicación de los sistemas glutamatérgicos y dopaminérgicos en la mayor vulnerabilidad de las células estriatales. Los resultados obtenidos nos demostraron que la presencia de la htt mutada potencia la muerte celular inducida por la activación de los receptores glutamatérgicos y dopaminérgicos. Asimismo, demostramos que el efecto neurotóxico asociado a la activación glutamatérgica y dopaminérgica está mediado por una aberrante activación de la vía de la quinasa Cdk5. De esta manera, la htt mutada incrementa la sensibilidad estriatal al glutamato y a la dopamina, modificando una vía de señalización común a ambos sistemas, la vía de Cdk5.En un segundo trabajo se analizó si la alteración en los niveles del receptor TrkB asociada a la expresión de la htt mutada se traduce en una anómala señalización intracelular en respuesta a BDNF. Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que en presencia de la htt mutada se produce una específica alteración en la vía de señalización de TrkB-ERK1/2. Además, comprobamos que la menor activación de esta vía intracelular conlleva una mayor susceptibilidad de las células estriatales frente a un estímulo de estrés oxidativo inducido con H2O2.De acuerdo con los resultados obtenidos en esta tesis, la mayor vulnerabilidad de las neuronas estriatales frente a la presencia de la htt mutada podría ser el resultado de (1) una sobreactivación de vías intracelulares con un efecto neurotóxico, como sería, en este caso, la vía de Cdk5 tras una estimulación glutamatérgica y dopaminérgica, y (2) una menor activación de las vías intracelulares involucradas en el mantenimiento de la supervivencia neuronal, como es la vía de ERK1/2.La identificación y caracterización de los diferentes mecanismos moleculares responsables de la selectiva muerte neuronal en la enfermedad de Huntington puede ser de gran utilidad para el futuro diseño de nuevas terapias farmacológicas que permitan retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad.

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T17:09:57Z No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T17:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T17:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) Previous issue date: 2015 / CNPq / Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Fiocruz-PR, Curitiba, PR, Brasil / O tráfego vesicular mediado por clatrina, mecanismo pelo qual proteínas e lipídeos são transportados entre organelas envolvidas por membrana, é responsável por uma grande proporção de interiorização de membrana plasmática (endocitose) e de transporte a partir da Rede Trans Golgi para o sistema endossomal. Os eventos mediados por clatrina ainda são pouco conhecidos no protozoário Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas na América Latina. Além disso, estudos de sequências genômicas demonstram um extremo grau de divergência entre tripanosomatídeos, animais e fungos, com cerca de 1/3 das proteínas preditas sem função conhecida. Neste estudo, a expressão do gene e a localização das proteínas cadeias pesada (TcCHC) e leve (TcCLC) de clatrina foram investigadas em diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas), utilizando anticorpos policlonais e monoclonais produzidos contra as proteínas recombinantes de T. cruzi. A localização celular da proteína epsina (TcEpsina), uma importante proteína associada à clatrina, também foi investigada através de sua fusão com GFP e subsequente imunolocalização. Análise por microscopia confocal revelou um acúmulo de TcEpsina, TcCHC e TcCLC na porção anterior das células, onde a bolsa flagelar e complexo de Golgi estão localizados. A TcCLC parcialmente colocalizou com o marcador de Golgi TcRAB7-GFP e com albumina endocitada, mas não co-localizou com transferrina, uma proteína endocitada principalmente via vesículas não revestidas formadas no complexo citóstoma/citofaringe. As cadeias leve e pesada de clatrina tipicamente localizaram-se na porção anterior ao cinetoplasto, região em que encontram-se a bolsa flagelar e o Complexo de Golgi. Nossos dados indicam que em formas epimastigotas de T. cruzi a endocitose de albumina mediada por clatrina ocorre na bolsa flagelar, enquanto endocitose de transferina independente de clatrina ocorre no complexo citóstoma/citofaringe. Para uma análise proteômica dos complexos proteicos associados à clatrina e epsina, a cadeia leve de clatrina foi fusionada às proteínas A e C e a epsina foi fusionada a GFP e ambas as proteínas foram submetidas à criomoagem seguida da imunoprecipitação dos complexos a elas associados. Esta metodologia permitiu a identificação de suas proteínas associadas por espectrometria de massas, tais como os Complexos Adaptadores AP-1 e AP-4, vSNAREs, Rab4, Rab 11, epsina, tepsina, AP180, Sec1, Auxilina e Scamp. Foi demonstrada também a presença de proteínas hipotéticas nesta análise. Esta metodologia nos permitiu sugerir a forma com a qual ocorre o tráfego de vesículas em T. cruzi e como ocorre a maturação dos reservossomos, os quais acumulam funções de endossomo inicial, endossomo tardio e lisossomo. Análises futuras são necessárias a fim de comprovar estas hipóteses.

El ATP es una molécula de señalización potente que, actuando a través de receptores P2 ó purinérgicos ubicados en la membrana plasmática, modula funciones biológicas importantes en diversos tipos celulares. En el presente trabajo de tesis se investigó la modulación por ATP de la concentración de calcio intracelular ([Ca2+]i), las cascadas de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), la vía fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K)/Akt, y su interrelación en células tumorales de mama (línea MCF-7). Los resultados demuestran que el ATP aumenta la [Ca2+]i por liberación del catión desde depósitos intracelulares sensibles a inositol trifosfato (IP3) involucrando a la fosfolipasa C (PLC). Además, se observó un influjo transitorio de calcio sensible a gadolinio y lantano, producido por la adición de vehículo posterior a la estimulación purinérgica, al que se denominó influjo SAC (por stress activated calcium influx). Se comprobó que el ATP estimula la fosforilación de las MAPKs ERK1/2, p38 y p46 JNK en forma dependiente de la dosis y tiempo de tratamiento, y de p54 JNK con un perfil diferente al observado para las otras MAPKs. La fosforilación de MAPKs mostró involucrar la vía PI-PLC/IP3/Ca2+ y la proteína quinasa C (PKC), pero resultó independiente del calcio extracelular y de la tirosina quinasa Src. También se comprobó que el ATP estimula la expresión del factor de transcripción c-Fos y la fosforilación de los factores ATF1, c-Jun y JunD en células MCF-7. Se estableció la participación de las MAPKs solamente en la inducción de c-Fos y en la fosforilación de c-Jun y JunD por ATP. Adicionalmente, se demostró que el ATP promueve, en forma dependiente de PKC, la fosforilación de la familia de tirosina quinasas Src en tirosina 416 y la fosforilación de Akt en serina. A diferencia de lo observado para las MAPKs, Src participó en la fosforilación de Akt inducida por ATP. Igualmente, PI3K medió la estimulación por ATP de la fosforilación de Akt y no la de MAPKs. La caracterización farmacológica realizada en base al empleo de agonistas de distintos subtipos de receptores P2Y, en conjunto con estudios de RT-PCR, sustentan la expresión de receptores P2Y2 y P2Y4. Los resultados presentados en este trabajo de tesis contribuyen al conocimiento de los mecanismos de transducción de señales de nucleótidos extracelulares, particularmente del ATP, en células mamarias tumorales. / ATP is a powerful signaling molecule that, acting through membrane bound P2 receptors, modulates important cellular functions of different cellular types. In the present work we investigated ATP modulation of intracellular calcium concentration ([Ca2+]i), mitogenactivated protein kinases (MAPKs) and phosphatidyl inositol 3 kinase/Akt (PI3K/Akt) signaling pathways and their relationship in MCF-7 breast cancer cells. The results show that ATP increases [Ca2+]i due to cation release from IP3-sensitive intracellular stores involving phospholipase C (PLC) activation. In addition, we observed a transient calcium influx sensitive to gadolinium and lanthanum, induced by the addition of vehicle after purinergic activation, named stress activated calcium influx (SAC influx). ATP stimulated the phosphorylation of the MAPKs ERK1/2, p38 and p46 JNK in a time and dose dependent manner, and also induced the phosphorylation of p54 JNK with a different profile when compared with other members of this family of kinases. The phosphorylation of MAPKs by ATP was dependent both on the PI-PLC/IP3/Ca2+ pathway and protein kinase C (PKC) but independent of Src kinase and of calcium influx from extracellular space. In addition, ATP induced the expression of the transcription factor c-Fos and the phosphorylation of ATF1, c-Jun and JunD transcription factors in MCF-7 cells. The participation of the MAPKs in c-Fos induction and in c-Jun and JunD phosphorylation by ATP was established. Moreover, ATP induced the phosphorylation, in a PKC dependent manner, of Src at its tyrosine 416 and of Akt at serine. Opposite to what we previously saw for MAPKs, Src participated in the phosphorylation of Akt by ATP. Accordingly, PI3K participated in the phosphorylation of Akt but not in the phosphorylation of MAPKs by ATP. Pharmacological characterization by the use of different purinergic agonists together with RT-PCR studies supported the expression of P2Y2 and P2Y4 receptor subtypes. The results presented here help to understand the mechanisms and signal transduction pathways activated by extracellular nucleotides, particularly ATP, in breast tumor cells.

RALF é um peptídeo hormonal de aproximadamente 5kDa presente em diferentes espécies do reino vegetal regulando negativamente a expansão celular. AtRALF1 é uma isoforma específica de raiz das 37 presentes em Arabidopsis thaliana que regula negativamente o crescimento de raízes seguido de uma mobilização de Ca+2 intracelular e inibição na secreção de prótons (H+). Neste trabalho foi caraterizado a localização e tráfego intracelular do peptídeo AtRALF1. / RALF is a 5kDa peptide hormone ubiquitous in different species of the plant kingdom that regulates cell expansion. AtRALF1 is a root-specific isoform of 37 present in Arabidopsis thaliana that negatively regulates root growth by intracellular calcium mobilization and inhibition of proton secretion (H+). In this work was studied the localization and intracellular trafficking of the AtRALF1 peptide.

A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica com duas cadeias, pertencente à família das proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) do tipo 2. A cadeia A é enzimaticamente ativa e é capaz de remover uma adenina da porção 28S do rRNA; a cadeia B é uma lectina que se liga a resíduos de D-Galactose terminais, presentes na membrana. Das 4 isoformas da pulchellina (PI, PII, PIII, PIV), PII é a mais tóxica in vivo, sendo a atividade catalítica da cadeia A similar para todas as isoformas. A interação da cadeia B com os glicoreceptores de membrana e seu conseguinte processo de endocitose é crucial para que cadeia A tóxica entre na célula e torne-se disponível para atuar no seu sítio ribossomal. Assim, visando explorar e encontrar potenciais diferenças no mecanismo de ligação à célula e de endocitose das isoformas, foram realizados experimentos usando microscopia confocal com as toxinas marcadas com Alexa flúor® em células HeLa e MV3. As imagens obtidas mostraram que PII localiza-se na região perinuclear das células enquanto PIV predomina na região cortical. Esses resultados sugeriram que as isoformas apresentam distintos mecanismos de entrada e transporte nas células. Para esclarecer tal questão, a ação da pulchellina em células HeLa tratadas com diversas drogas que atuam em diferentes rotas endocíticas e de translocação, foi monitorada. Os resultados de inibição de síntese proteica mostraram que as células sofrem proteção contra a pulchellina na presença de brefeldina A, indicando que a pulchellina necessita ser transportada via Golgi para executar sua função. Inibidores de glicosilação como tunicamicina, swainsonine e inibidores de síntese proteica, como a puromicina e cicloheximidina sensibilizaram as células à PII e PIV, mas em diferentes taxas. Por outro lado, a puromicina e a cicloheximidina não afetaram a taxa de endocitose das isoformas, o que indica que a pulchellina na ausência dos inibidores compete pelo transporte ou processamento de glicoproteínas recém-sintetizadas. Experimentos de ligação e captação da pulchellina mostraram que PII apresenta 30% menos afinidade pela superfície de células HeLa que PIV, além de apresentar menor taxa endocítica. Esses dados corroboram estudos de FCS (espectroscopia de correlação e fluorescência) que identificaram que a difusão de PIV em células HeLa é maior que de PII. Nos experimentos realizados com inibidores de dinamina, ambas isoformas tiveram as suas taxas de endocitose aumentadas, indicando um efeito compensatório para via endocítica independente de dinamina. Em células incubadas com PDMP e neuraminidase, PIV mostrou uma associação às células reduzida, enquanto PII não se alterou, indicando que PIV pode necessitar de esfingolipídeos e glicocomplexos contendo ácido siálico para ligar e se internalizar nas células testadas. Para investigar essa diferença na interação foram realizados ensaios in vitro de DSC (Calorimetria Diferencial de Varredura) e SPR (ressonância plasmônica de superfície) com as isoformas isoladas. Esses ensaios mostraram que PIV e PII apresentam interações distintas com o gangliosídeo GM1, sendo que a PIV interage mais hidrofobicamente e com uma maior taxa de associação com GM1 que a PII. / Pulchellin is a heterodimeric toxin found in Abrus pulchellus seeds. It is a type 2 ribosome inactivating protein, which consists of a toxic A-chain linked to a sugar binding B-chain. The B-chain mediates its binding to the galactose residues on the cellular membrane in a process that is then followed by an endocytic uptake. Once the A-chain reaches the cytosol it inhibits protein synthesis leading to cell death. In order to explore pulchellin isoforms II and IV (PII and PIV) cell entry and transport mechanisms, experiments monitoring toxin labelled with Alexafuor® in MV3 and HeLa cells were performed using confocal microscopy. We have investigated the pulchellin action in pre-treated HeLa cells with several drugs, targeting different endocytic and translocation routes. Confocal images showed PII tends to be localized in cells cortical region and PIV tend to be localized in cell\'s perinuclear region, suggesting that isoforms have different cell entry and transport mechanisms. The protein synthesis inhibition results showed that brefeldin A protects cells against the toxic effect of pulchellin, which indicates the pulchellin needs to be transported to Golgi to perform its toxic effect. When HeLa cells were incubated with protein synthesis inhibitors, such as puromycin and cycloheximidine and glycosilation inhibitors such as tunicamycin, swainsonine, they were sensitized to pulchellin, but to different extent for PII and PIV. Binding and uptake experiments showed that PII exhibits 30% less affinity than PIV on HeLa cells surface, PII also has lower endocytic rate than PIV in the cells. These data corroborate with FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) results, which identified that PIV diffuses faster than PII into the celIs. Dynamine inhibitors increased endocytosis rates in both isoforms, indicating that pulchellin is upregulating the dynamine-independent endocytosis, possibly pulchellin is being internalized into the cells by alternative endocytic routes. When HeLa cells were incubated with PDMP and neuraminidase, PIV showed a reduced cell association compared with PII and control, indicating that PIV may require glycocomplexes and sphingolipids containing sialic acid to enter into the cells. DSC (Differential Scanning Calorimetry) and SPR (Surface Plasmon Ressonance) experiments using biomimetic membranes were performed using GM1 ganglioside to check this interaction. The results showed PIV and PII interact with GM1. This results also evidence PIV interact more hidrophobically and with a higher association rate on GM1 than PII.

No presente estudo, analisamos a regulação das etapas iniciais da ação insulínica através de imunoprecipitação e imunobloting do tecido hipotalâmico, hepático, adiposo e músculo esquelético de ratos idosos tratados cronicamente com melatonina. O tratamento crônico com melatonina induziu aumento da sensibilidade à insulina acompanhada de regulação positiva das etapas iniciais da ação do hormônio em hipotálamo, fígado, músculo esquelético e tecido adiposo de ratos com 13 meses de idade. Os efeitos da ação da melatonina sobre a sinalização insulínica também ocorreu de forma tecido-específica, de maneira semelhante aos efeitos pleiotrópicos da insulina. Nosso estudo reafirma o papel da melatonina como um fator regulador da ação insulínica e permitem a conclusão de que a reposição desse hormônio pode contribuir com a reversão da resistência à insulina e redução do peso corporal que acompanha o processo normal de envelhecimento. / Melatonin can negate several morphological and metabolic aged-induced changes. Although, this has been known for some time, the mechanism underlying melatonins actions are unclear. As suggested by some studies, a putative interaction between insulin and melatonin could be involved. In the present study, we have examined the regulation of the insulin signaling pathways by using immunoprecipitation and immunoblotting in hypothalamus, liver, adipose tissue and skeletal muscle of aged rats chronically treated with melatonin. Melatonin treatment promoted increase in insulin sensitivity and a reduction of visceral fat. These modifications were accompanied by the increased phosphorylation of insulin signaling downstream compounds associated with food ingestion in hypothalamus, glucose homeostasis in liver and adipose tissue (e.g. IRS-1) and mitogenic action on insulin in skeletal muscle (e.g. ERK-1/2). These results indicate that, in aged rats, melatonin regulates insulin signaling downstream components in a tissue-specific manner.

Objetivos de este trabajo: 1) Explorar mediante un anticuerpo policlonal antiAE3 con acción inhibitoria, si esta isoforma es responsable de la mayor actividad AE observada en el MH. 2) Determinar si la hiperactividad AE causa hiperactividad compensatoria del NHE-1. 3) Verificar si la inhibición prolongada de la AE modifica la hipertrofia del MH.

ALMEIDA, Thiago Silva de. Identificação, Atividade Antioxidante e Análise Toxicogenômica de Compostos Fenólicos de Sementes de Triplaris gardneriana Wedd. 2016. 214 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-01-27T17:06:11Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_tsandrade.pdf: 5012526 bytes, checksum: ddff547ffaee40b26af1111578a5cf9e (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-27T20:24:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_tsandrade.pdf: 5012526 bytes, checksum: ddff547ffaee40b26af1111578a5cf9e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T20:24:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_tsandrade.pdf: 5012526 bytes, checksum: ddff547ffaee40b26af1111578a5cf9e (MD5) Previous issue date: 2016 / Antioxidants can act in the treatment of various diseases related to oxidative stress. The Caatinga biome from Northeast, has a vegetation adapted to adverse conditions that can increase the concentration of antioxidants. Triplaris gardneriana Wedd. (Poligonaceae), known as Pajeú is used in the treatment of venereal disease and intestinal inflammation. This work aims to obtain the ethanol extract and fractions of Pajeú seeds and identify the phenolic compounds, and evaluate its antioxidant and toxicity activities. The chemical composition was assessed by quantification of flavonoids, phenolics and tannins and by high-performance liquid chromatography (HPLC). The antioxidant potential was assessed by testing scavenging free radical DPPH (diphenyl-picryl-hydrazyl), inhibition of lipid peroxidation, iron chelator capacity and assessment of the ability to prevent stress and restore the oxidative balance in cells. Toxicity was assessed by hemolytic activity, cytotoxicity using Artemia sp., Cytotoxicity against breast (MCF7) and intestinal (Caco 2) carcinogenic cells, evaluation of the alteration of gene expression in exposed MCF7 cells to samples for 6 h. Were identified 4 phenolic acids and 8 flavonoids by HPLC, many of these are being described for the first time for this specie. The methanol fraction showed the best results for DPPH (NC50 11.45 µg/mL). The acetate fraction showed the best result in the inhibition of lipid peroxidation (IC50 6.14 µg/mL). The ethyl acetate fraction had the best performance in the chelating ability (48% complexation to 1.000 µ/mL). The ethanol extract protected MCF 7 cells against oxidative stress and was able to restore the oxidative balance after stress have already been established. Haemolytic activity was weaker by the extract with maximum values of 40%. Front of Artemia sp the extract showed LC50 67.85 mg / mL. The extract showed low toxicity values against both cell lines and changed in toxicogenomics a small number of genes (14 genes, 0.22% of total), the main act in the interaction with various types of viruses (IFIT1, MX1, OAS1), the same genes were altered in the same way by quercetin, a flavonoid present in the extract. Drugs with similar gene signature submitted by the extract has the antimicrobial function, which is a characteristic of phenolic compounds such as those identified in the extract. Thus, this study contributed to the identification of novel bioactive molecules with antioxidant activity, with low risk of use and which may be useful as potential phytotherapeutic / Antioxidantes podem atuar no tratamento de diversas doenças relacionadas com estresse oxidativo. A Caatinga, bioma da região Nordeste, possui uma vegetação adaptada a condições adversas que influenciam no aumento da concentração de antioxidantes. Triplaris gardneriana Wedd. (Poligonaceae), conhecida como Pajeú, é utilizada no tratamento de doenças venéreas e inflamações intestinais. Este trabalho objetiva obter o extrato etanólico e frações das sementes de pajeú e identificar os compostos fenólicos, e avaliar suas atividades antioxidante e toxicidade. A composição química foi avaliada por quantificação de flavonoides, fenóis e taninos totais e por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O potencial antioxidante foi avaliado através do ensaio de sequestro de radicais livres DPPH (difenil-picril-hidrazil), inibição da peroxidação lipídica, capacidade quelante de ferro e avaliação da capacidade de prevenir o estresse e restaurar o balanço oxidativo em células. A toxicidade foi avaliada através de atividade hemolítica, citotoxicidade frente a nauplios de Artêmia sp., citotoxicidade frente a células carcinogênicas de mama (MCF7) e intestino (Caco 2), avaliação da alteração da expressão gênica em células MCF 7 expostas às amostras por 6 h. Foram identificados 4 ácidos fenólicos e 8 flavonoides através da CLAE, muitos descritos pela primeira vez para a espécie. A fração metanólica apresentou os melhores resultados para o DPPH (CN50 11,45 µg/mL). A fração acetato apresentou o melhor resultado na inibição da peroxidação lipídica (CI50 6,14 µg/mL). A fração acetato teve o melhor desempenho na capacidade quelante (48% de complexação à 1,000 µg/mL). O extrato etanólico protegeu células MCF 7 contra o estresse oxidativo restaurou o equilíbrio oxidativo após o estresse já ter sido estabelecido. A Atividade hemolítica do extrato foi fraca, com valores máximos de 40%. Frente aos nauplios de Artêmia sp o extrato apresentou CL50 de 67,85 µg/mL. O Extrato mostrou valores baixos de toxicidade frente ambas linhagens celulares e alterou na toxicogenômica uma quantidade pequena de genes (14 genes, 0,22% do total), os principais atuam na interação com vários tipos de vírus (IFIT1, MX1, OAS1), os mesmos genes foram alterados pela quercetina, um flavonoide presente no extrato. Drogas com assinatura gênica semelhante ao apresentado pelo extrato, tem função antimicrobiana, que é uma característica de compostos fenólicos como os identificados no extrato. Assim, o presente estudo contribuiu para a identificação de novas moléculas bioativas com potencial antioxidante, com baixo risco de uso e que podem ser úteis como potenciais fitoterápicos

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:48Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10866.pdf: 1428796 bytes, checksum: 3e8b3b83a47e7f481fd590e1f74949b4 (MD5) / A degradacao de proteinas pelo sistema ubiquitina-proteassoma gera uma grande quantidade de oligopeptideos dentro das celulas. Para investigar possiveis efeitos desses oligopeptideos, alguns deles foram isolados do cerebro de rato, sintetizados acoplados a sequencia peptidica TAT atraves de pontes dissulfeto, sendo entao analisados nas vias de transducao de sinal de receptores acoplados a proteina G. A mistura contendo os quatro peptideos analisados (20-80 ƒÊM) inibiu de forma significativa o aumento da taxa de acidificacao do meio extracelular induzido pela angiotensina II em celulas CHO-S que expressam o receptor AT1 (CHO-S-AT1). Adicionalmente, tanto sozinhos quanto em mistura, estes peptideos aumentaram a transcricao do gene reporter da luciferase induzida pela angiotensina II em celulas CHO-S-AT1, assim como aquela induzida pelo isoproterenol em celulas HEK293. Os peptideos sem TAT, incapazes de atravessar a membrana das celulas, nao alteraram as respostas a estimulacao dos receptores, sugerindo um efeito intracelular dos peptideos nas cascatas de transducao de sinal. Alem disso, todos os peptideos estudados inibiram competitivamente a degradacao de um substrato sintetico da oligopeptidase EP24.15 in vitro. O aumento da expressao da EP24.15 em celulas CHO-S e HEK293 foi suficiente para reduzir a atividade do gene reporter luciferase induzida pela angiotensina II ou pelo isoproterenol. Finalmente, a utilizacao dos peptideos como gisca h em colunas de afinidade revelou que diversas proteinas envolvidas na sinalizacao de receptores acoplados a proteina G interagem com os peptideos, incluindo a adaptina A-alfa e a dinamina-1. Estes resultados sugerem que antes de serem completamente degradados, os peptídeos intracelulares semelhantes àqueles gerados pelo proteassoma podem afetar ativamente a sinalização intracelular, delineando-se como novas moléculas bioativas dentro das células. / TEDE

No presente estudo, analisamos a regulação das etapas iniciais da ação insulínica através de imunoprecipitação e imunobloting do tecido hipotalâmico, hepático, adiposo e músculo esquelético de ratos idosos tratados cronicamente com melatonina. O tratamento crônico com melatonina induziu aumento da sensibilidade à insulina acompanhada de regulação positiva das etapas iniciais da ação do hormônio em hipotálamo, fígado, músculo esquelético e tecido adiposo de ratos com 13 meses de idade. Os efeitos da ação da melatonina sobre a sinalização insulínica também ocorreu de forma tecido-específica, de maneira semelhante aos efeitos pleiotrópicos da insulina. Nosso estudo reafirma o papel da melatonina como um fator regulador da ação insulínica e permitem a conclusão de que a reposição desse hormônio pode contribuir com a reversão da resistência à insulina e redução do peso corporal que acompanha o processo normal de envelhecimento. / Melatonin can negate several morphological and metabolic aged-induced changes. Although, this has been known for some time, the mechanism underlying melatonins actions are unclear. As suggested by some studies, a putative interaction between insulin and melatonin could be involved. In the present study, we have examined the regulation of the insulin signaling pathways by using immunoprecipitation and immunoblotting in hypothalamus, liver, adipose tissue and skeletal muscle of aged rats chronically treated with melatonin. Melatonin treatment promoted increase in insulin sensitivity and a reduction of visceral fat. These modifications were accompanied by the increased phosphorylation of insulin signaling downstream compounds associated with food ingestion in hypothalamus, glucose homeostasis in liver and adipose tissue (e.g. IRS-1) and mitogenic action on insulin in skeletal muscle (e.g. ERK-1/2). These results indicate that, in aged rats, melatonin regulates insulin signaling downstream components in a tissue-specific manner.