A soja (Glycine max) contém uma variedade de compostos com comprovada atividade biológica, tais como as isoflavonas, que estão presentes em diferentes formas, glicosiladas e agliconas. Além disso, a soja contém uma grande quantidade de proteínas, que são consideradas fontes de peptídeos bioativos. As isoflavonas agliconas, daidzeína e genisteína, possuem maior atividade antioxidante que as glicosiladas, daidzina e genistina. No entanto, os grãos de soja são ricos nas formas glicosiladas das isoflavonas. Estudos mostram que a biotransformação da soja, por micro-organismos e enzimas, leva ao aumento dos teores das isoflavonas agliconas, as quais são liberadas pela ação de enzimas -glicosidases, que clivam as ligações -glicosídicas das isoflavonas glicosiladas, e também pode possibilitar a hidrólise das proteínas da soja. Além disso, pesquisadores têm demonstrado aumento na atividade antioxidante e na prevenção e/ou supressão de certos cânceres após biotransformação da soja. Neste contexto, foi realizada a biotransformação da soja pelo fungo A. awamori, e por uma mistura enzimática, proveniente do processo fermentativo deste fungo na soja. Os extratos da soja biotransformada, não biotransformada, e o extrato comercial isoflavin beta®, rico em isoflavonas, foram avaliados quanto aos perfis cromatográficos, teores de daidzeína, genisteína, proteínas, aminoácidos e/ou peptídeos, potencial antioxidante e atividade citotóxica frente a células de fibroblasto e melanoma. O modo de morte celular das células de melanoma, necrose ou apoptose, também foi avaliado. A biotransformação da soja, pelos dois processos, resultou em extratos enriquecidos com isoflavonas agliconas e aminoácidos e/ou peptídeos, e com maior atividade antioxidante que o extrato da soja não biotransformada. Os dois processos de biotransformação da soja resultaram em extratos com características químicas e biológicas diferentes. O conteúdo de daidzeína, proteínas, aminoácidos e/ou peptídeos encontrados no extrato da soja biotransformada pelo fungo foram 6%, 56% e 357%, respectivamente, superiores ao extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática. Ao contrário do observado para o teor de genisteína que foi 48% maior no extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática. O extrato da soja biotransformada pelo fungo apresentou maior atividade antioxidante que o extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática, além disso, foi o único dos extratos aqui estudados que apresentou citotoxicidade seletiva para as células de melanoma, induzindo morte celular por apoptose destas células cancerosas. Sendo assim, os resultados obtidos pelo extrato da soja biotransformada pelo fungo A. awamori fornecem boas perspectivas para futura utilização deste extrato como antitumoral. / Soybean (Glycine max) contains a variety of compounds with proven biological activity, such as isoflavones, which are present in different forms, glycosides and aglycones. In addition, soybean contains a lot of proteins, which are considered sources of bioactive peptides. The aglycone isoflavones, daidzein and genistein, have higher antioxidant activity than the glucoside ones, daidzin and genistin. However, soybean grains are rich in the glycosylated forms of isoflavones. Studies have shown that the soybean biotransformation, by microorganisms and enzymes, lead to increased levels of aglycone isoflavones, which are released by the action of -glycosidase enzymes, which cleave the -glycosidic bonds of isoflavone glucosides, and can also allow the hydrolysis of soybean proteins. Additionally, researchers have shown an increase in the antioxidant activity and in the prevention and/or suppression of certain cancers after soybean biotransformation. In this context, it was performed the biotransformation of soybeans with the fungus A. awamori, and with an enzyme mixture, from the fermentation process of the fungus in soybean. The biotransformed, the non biotransformed soybean extracts and the marketed isoflavin beta® extract rich in isoflavones, were evaluated regarding their chromatographic profiles, levels of daidzein, genistein, proteins, amino acids and/or peptides, the antioxidant potential and the cytotoxic activity against melanoma cells and fibroblasts. The mode of cell death of melanoma cells, necrosis or apoptosis, was also evaluated. The biotransformation of soybean by the two processes resulted in extracts enriched with aglycone isoflavones and aminoacids and/or peptides, and with antioxidant activity higher than the non biotransformed soybean extract. The two processes of soybean biotransformation resulted in extracts with different chemical and biological characteristics. The contents of daidzein, proteins, aminoacids and/or peptides found in soybean extract biotransformed by the fungus were 6%, 56% and 357%, respectively, higher than the soybeam extract biotransformed by the enzyme mixture. Contrary to what was observed with the genistein content that was 48% higher in the soybean extract biotransformed by the enzyme mixture. The soybean extract biotransformed by the fungus had a higher antioxidant activity than the soybean extract biotransformed by the enzyme mixture, moreover, it was the unique extract among the ones studied in this work that showed selective cytotoxicity to melanoma cells, inducing cell death by apoptosis of these cancer cells. Thus, the obtained results of the soybean extract biotransformed by the fungus A. awamori provide good prospects for future use of this extract as antitumoral.

As mulheres na fase reprodutiva apresentam menor incidência de doenças cardiovasculares (DCV), em relação aos homens de mesma idade. Porém, essa vantagem desaparece na pós-menopausa, sugerindo que os hormônios sexuais femininos exercem algum efeito cardioprotetor. Um dos mecanismos propostos para explicar essa proteção é o fato dos estrógenos promoverem a produção de importantes fatores vasoativos pelo endotélio vascular, entre eles o óxido nítrico e a prostaglandina I2. Com a diminuição da quantidade de estrógenos circulante, as mulheres na pós-menopausa, estão mais suscetíveis à disfunção endotelial e a doenças cardiovasculares. Estudos têm demonstrado que a terapia de reposição hormonal (TRH) utilizada por mulheres na pós-menopausa combate os sintomas deste período, melhora o quadro de disfunção endotelial e o perfil lipídico e aumenta a síntese de fatores vasoativos, que auxiliam na prevenção da DCV. Entretanto a TRH vem sendo questionada por grandes estudos como o WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) e o HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), que mostraram um risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e endometrial em mulheres fazendo uso da TRH. Entre as terapias alternativas para combater os sintomas indesejáveis da menopausa e as implicações mórbidas que acompanham esse período, sem expor as pacientes aos efeitos colaterais da TRH, a literatura aponta os fitoestrógenos, principalmente os extraídos da soja (Glycine max). O objetivo geral deste estudo é avaliar a ação das isoflavonas da soja, que vem sendo utilizadas por mulheres na pós-menopausa, na produção de óxido nítrico, prostaglandina E2 e endotelina-1, por células endoteliais, utilizando um modelo \"in vitro\", células endoteliais da linhagem ECV304. / During their reproductive years, women have a lower incidence of coronary heart disease (CHD) compared to men of similar age. However, this advantage disappears in post-menopause, suggesting that female sex hormones exert some cardio protective effect. One of the mechanisms proposed to explain this protection is the fact that estrogens promote the production of important vasoative factors by vascular endothelium, including nitric oxide and prostaglandin I2. By decreasing circulating estrogen, women in post-menopause are more susceptible of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases. Studies have shown that the hormone replacement therapy (HRT) used by post-menopausal women in combating the symptoms of this period, improve endothelial dysfunction and lipid profile and increases the synthesis of vasoative factors, which help in the prevention of CHD. Meanwhile the HRT has been questioned by two large trials, the WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) and HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), which showed an increased risk of developing breast cancer and endometrial cancer in women using HRT. Among the alternative therapies to combat the symptoms of menopause and undesirable morbid implications that accompany this period, without exposing the patients to the side effects of HRT, the literature suggests the phytoestrogens, especially those from the soybean (Glycine max). The aim of this study is to evaluate the effect of isoflavones from soy, which are used by women in post-menopause, in the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and endothelin-1 by endothelial cells, using an \"in vitro\" model: human endothelial cell line ECV304.

Resumo: O crescimento da demanda por alimentos saudáveis está estimulando a inovação e o desenvolvimento de novos produtos na indústria alimentícia. Os alimentos saudáveis são chamados de alimentos funcionais, que são alimentos consumidos como parte de uma dieta usual que produzem efeitos metabólicos ou fisiológicos, com capacidade de reduzirem o risco de doenças crônico - degenerativas, além de suas funções nutricionais básicas. Entre os alimentos funcionais, o presente estudo destaca os produtos derivados da soja e os probióticos. As isoflavonas da soja parecem ser os componentes principais no combate ao câncer, por apresentarem, atividade antioxidante, aumento da apoptose, inibição da angiogênese e modulação da resposta imune. O produto fermentado por bactérias láticas, induz resposta imune inata e adaptativa. Os mecanismos pelos quais o produto fermentado pode inibir o crescimento do tumor são diminuição da resposta inflamatória induzida pelo carcinógeno, aumento da IgA, aumento da apoptose celular e aumento da taxa de TNF-a . Considerando o efeito benéfico dos fitoestrogênios da soja em relação à inibição do câncer e considerando, também, o fato de que determinadas bactérias láticas apresentam atividade anti-tumoral, parece-nos plenamente justificável a realização do estudo para verificar se os alimentos: produto de soja não fermentado (PSNF); iogurte de soja (IS) e iogurte de soja suplementado com isoflavonas (ISS), e Ração (R) exercem efeito no desenvolvimento do câncer de mama e verificar os níveis das citocinas, bem como a concentração de óxido nítrico liberado por macrófagos, e IFN-g em cultura de células esplênicas, indução da apoptose/necrose em macrófagos e angiogêneses no tumor. / Abstract: The growing demand for healthy foods is encouraging the development of new products by the food industry. Functional foods are normally part of a regular diet, but besides their nutritional properties, they also elicit metabolic and physiologic responses that may reduce the risk of chronic degenerative diseases. This study focuses on probiotics and soy-derived products. Soy isoflavones seem to play the most important role in the fight against cancer because, besides their anti-oxidant effects, they stimulate apoptosis, inhibit angiogenesis and modulate the immune response. Probiotics may inhibit tumor growth by diminishing the inflammatory response provoked by the carcinogen and by increasing apoptosis and TNF-_ and IgA levels. Considering the beneficial effects of soy phytoestrogens on cancer and the fact that some lactic bacteria have antitumor activity, is seems reasonable to carry out a study that analyzes whether non-fermented soy product (PSNF), soy yoghurt (IS), soy yoghurt supplemented with is flavones (ISS) and regular feed (R) have an effect on the development of breast cancer by assessing: 1. levels and nitric oxide (NO) produced by macrophages; 2. levels of IL-10 and IFN-g in spleen cell cultures; 3. induction of apoptosis/necrosis in macrophages; and 4. tumor angiogenesis. / Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Coorientador: Elizeu Antônio Rossi / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira / Banca: Elaine Cristina Pereira de Martinis / Banca: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Doutor

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-01-26 / Introdução: É sabido que tanto as isoflavonas da soja (ISO) e a vibração mecânica de baixa intensidade e alta freqüência (VIB) possuem efeitos protetores no tecido ósseo de ratas ooforectomizadas (OVX). Objetivos: estudar os efeitos dos tratamentos com ISO e VIB isolados e combinados no tecido ósseo de ratas OVX. Métodos: 50 ratas Wistar com 6 meses de idade foram SHAM operadas ou OVX e após três meses, divididas em 5 grupos: SHAM; OVX; OVX tratadas diariamente por gavage com 200mg/kg de ISO por 90 dias consecutivos (OVX-ISO); OVX tratadas com VIB, 20 min./dia, 30 Hz, 0.6g, 5 dias por semana por 90 dias (OVX-VIB) e OVX tratadas com ISO e VIB (OVX-ISO+VIB). Após o tratamento, os fêmures e tíbias foram coletados e seus comprimento e espessura foram medidos. Os fêmures foram processados para histomorfometria e aos métodos histoquímicos, bioquímico e do TUNEL. As tíbias foram congeladas e destinadas para testes físicos e biomecânicos. Resultados: Os tratamentos não exerceram efeitos significantes no peso corporal e nas medidas de comprimento e espessura, exceto na espessura das tíbias dos grupos OVX-ISO e OVX-ISO+VIB que foi significantemente maior comparado ao grupo SHAM. Os testes físicos mostraram que o peso imerso, a porcentagem de material orgânico e a densidade óssea foram maiores nos grupos SHAM, OVX-VIB e OVX-ISO+VIB quando comparados aos outros grupos, enquanto que o volume ósseo, a densidade mineral óssea, porc entagem de material mineral e o peso das cinzas foram maiores nos grupos OVX e OVX-ISO do que nos outros grupos e não houve diferenças significantes nos parâmetros biomecânicos analisados entre os grupos. Nos fêmures, os tratamentos não exerceram efeitos significantes no volume ósseo trabecular, porém, o tratamento combinado exerceu efeitos positivos no osso cortical. Os tratamentos tiveram efeitos positivos em relação à quantidade e na organização das fibras colágenas e esse efeito foi mais expressivo no grupo OVX-ISO+VIB. O método do TUNEL não detectou diferenças nas células TUNEL-positivas entre os grupos. Conclusão: Esses resultados demonstram que o tratamento combinado (ISO+VIB) exerce maior efeito nos constituintes do tecido ósseo de ratas ooforectomizadas osteopênicas, quando comparado aos tratamentos isolados. / Introduction: It has been shown that both soy isoflavones (ISO) and low intensity high frequency mechanical vibration (VIB) have protective effects in bone tissue of ovariectomized (OVX) rats. Objective: We investigated whether combined treatments with ISO and VIB would exhibit cooperative effects in bone tissue of OVX rats. Methods: Fifty female Wistar rats at the age of 6 months were either sham-operated or OVX. After operation, the rats were divided in five groups: SHAM; OVX; OVX treated daily by gavage with 200mg/kg/body weight of ISO for 90 days (OVX-ISO); OVX treated with VIB, 20 min./day, at 60 Hz, 0.5g, 5 days/ week for 90 days (OVX-VIB) and OVX treated with ISO and VIB (OVX-ISO+VIB). After treatment, the femurs and tibias were collected and its length and thickness were measured. The femurs were then processed for histomorphometry, histochemistry and biochemical assay. The tibias were frozen for subsequent physical and mechanical tests. Results: Treatments did not have significant effects on body weight and in the bone measurements, except in the tibial thickness of the OVX-ISO and OVX-ISO+VIB groups that was significant higher than the SHAM group. Physical tests showed that the immersed weight, content of organic material and bone density were higher in the SHAM, OVX-VIB and OVX-ISO+VIB groups than the other groups, while the bone volume, bone mineral density, mineral material and the ash weight were higher in the OVX and OVX-ISO groups than the other groups and there were no significant differences in the mechanical tests among the groups. Treatment did not have significant effects in the trabecular bone volume, but it was not detected cortical bone loss in the group treated with the combined therapy. The treatments showed positive effects in the content of glycosaminoglycans, as well as in the organization of collagen fibers and these effects was higher in the OVX-ISO+VIB group. The TUNEL-positive cell profile was similar among the groups. Conclusion: These results demonstrate that the combined treatment (ISO+VIB) have better effects in the bone tissue constituents of ovariectomized osteopenic rats, when compared with the treatments isolated. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Isoflavonas são substâncias fenólicas conhecidas por promoverem diversos efeitos benéficos à pele. Na soja, esses compostos são essencialmente encontrados nas formas glicosiladas. No entanto, as atividades biológicas são principalmente relacionadas com as suas formas agliconas. A presente tese teve como principal objetivo a obtenção de uma fração enriquecida em isoflavonas agliconas e a sua incorporação em formulações tópicas visando o aumento da retenção cutânea de tais compostos. Para tanto, foi realizada primeiramente a extração de soja em meio hidroetanólico seguida de processo clássico hidrolítico (hidrólise ácida) para obtenção das formas livres das isoflavonas. O extrato obtido foi avaliado por um método cromatográfico de ultraeficiência, o qual foi desenvolvido e validado para a determinação quantitativa das isoflavonas agliconas (IA), bem como para avaliação das principais impurezas furânicas formadas. O método mostrou-se específico, linear, preciso, robusto e exato para a quantificação das IA daidzeína, gliciteína e genisteína, e para a quantificação das impurezas hidroximetilfurfural (HMF) e etoximetilfurfural (EMF). Além disso, o método foi concomitantemente validado para a quantificação das IA em diferentes matrizes analíticas e bioanalíticas visando estudos de desenvolvimento de produtos tópicos e estudos de permeação/retenção cutânea. Devido à toxicidade relatada na literatura para o HMF, o presente estudo investigou in vitro o potencial genotóxico e mutagênico do EMF, principal impureza formada após degradação ácida dos açúcares presentes no extrato hidroetanólico de soja. O EMF apresentou potencial genotóxico em linhagem celular do tipo HepG2 nas concentrações próximas ao teor encontrado no extrato. Devido a isso, foi realizada uma investigação de métodos alternativos ao da hidrólise ácida visando à obtenção das IA da soja sem a presença de HMF e EMF, e facilitando, desta forma, os processos de purificação até uma fração enriquecida em IA. Para tanto, foram realizadas otimizações de processos hidrolíticos mais seletivos, tais como hidrólise enzimática com β-glicosidase e fermentação com Saccharomyces cerevisiae. Os processos foram primeiramente avaliados por desenho experimental de Plackett-Burman para determinação dos principais fatores que podem influenciar durante os bioprocessos hidrolíticos. Posteriormente, os métodos foram otimizados por meio de desenho experimental de Box-Behnken. Destaca-se que os processos foram realizados com um extrato equivalente ao extraído de 1,0 g de soja desengordurada. Para o método enzimático, as condições ótimas de processo compreenderam 838 unidades de β-glicosidase, em pH 6.0, durante 4,5 h à 37 ºC. Para o método fermentativo, as condições ótimas de processo hidrolítico compreenderam 1500 mg de fermento comercial contendo Saccharomyces cerevisiae, em pH 7.6, durante 24 h à 33 ºC. Os extratos foram avaliados quanto ao teor de IA, sempre realizando a sua comparação com um extrato não hidrolisado (controle negativo) e com um extrato hidrolisado pela via ácida (controle positivo). O teor de IA após hidrólise enzimática foi estatisticamente semelhante ao controle positivo. No entanto, o processo de fermentação não permitiu completa hidrólise das isoflavonas, sendo necessária a realização de um processo adicional de hidrólise ácida ao final do processo fermentativo. Todos os extratos hidrolisados, ou seja, os obtidos pelas vias ácida, enzimática, fermentativa, fermentativa+ácida, foram avaliados quanto à presença ou ausência de açúcares, compostos furânicos, triterpenos e saponinas. Além disso, todos passaram por processo de partição líquido-líquido com acetato de etila para obtenção de diferentes frações. A fração que apresentou maior pureza e que foi considerada a mais promissora para escalonamento de produção foi obtida após partição do extrato de soja hidrolisado pela via enzimática. Essa fração foi avaliada quanto ao seu potencial in vitro de proliferação de queratinócitos (HaCaT). Após 48 h de tratamento celular, os resultados demonstraram que a fração na concentração de 0,1 μg de IA/mL foi considerada não citotóxica para as células e apresentou promissora atividade proliferativa de queratinócitos. Desta forma, tal fração foi escolhida para ser incorporada em nanoemulsões visando uma futura aplicação tópica durante processos regenerativos de tecidos cutâneos. As formulações foram espessadas, ou não, até hidrogéis de ácido hialurônico. Por fim, foi realizada a avaliação da capacidade de permeação/retenção cutânea das IA a partir das formulações utilizando modelo experimental in vitro com pele de orelha suína. Tanto as nanoemulsões quanto os hidrogéis demonstraram ser promissores sistemas de liberação das IA na pele, aumentando sua retenção em camadas cutâneas consideradas importantes para exercerem seus efeitos benéficos. / Isoflavones are phenolic compounds that promote several benefic effects on the skin. In soybeans, these substances are present in different chemical conformations, mostly as glycoside conjugates. However, the beneficial activities are mainly credited to their aglycone forms. The main goal of this study was the production of an isoflavone aglycone-rich fraction to be incorportated into topical products intended to increase the skin retention of isoflavone aglycones (IA). For that, firstly it was performed a soybean extraction in a hydroethanolic media followed by a classical hydrolysis procedure (acid hydrolysis) to breakdown the conjugated forms until their respective aglycones. To analyze the obtained extract, an ultra-fast liquid chromatography method was developed and validated. The method showed to be specific, linear, precise, robust and accurate for quantification of daidzein, glycitein and genistein, as well as for hydroxymethylfurfural (HMF) and ethoxymethylfurfural (EMF), the main impurities present in the acid hydrolyzed extract. Besides, the method was concomitantly validated for determination of IA in different analytical and bioanalytical matrices during development of topical products and permeation/retention assays. Due to the well-documented toxicity of HMF, this study also investigated in vitro the genotoxic and mutagenic potential of EMF, a sugar degradation product formed after acid hydrolysis of soybean extract. EMF showed to be genotoxic for HepG2 cells at concentrations very close to those present in the extract. So, alternative hydrolysis methods were carried out aiming to obtain the IA from soybeans without the presence of HMF and EMF, and thus facilitating the processes of purification until new IA-rich fractions. For that, procedures with more selectivity properties were accomplished, such as enzymatic hydrolysis with β-glucosidase and fermentation with Saccharomyces cerevisiae. These methods were firstly evaluated by a Plackett-Burman design, to screen the main factors that could be influencing during the hydrolysis of isoflavones present in soybean extract. Further, the methods were optimized by Box-Behnken design. It is important to highpoint that the processes were always carried out with a sample corresponding to the extracted from 1.0 g of defatted soybeans. The highest IA content was achieved under the optimal conditions: enzymatic hydrolysis with 838 units of β-glucosidase, during 4.5 h at pH 6.0 and 37 ºC, or fermentative process with 1500 mg of commercial bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) during 24 h at pH 7.6 and 33 ºC. The extracts were investigated to evaluate the IA content, and the results were always compared with a non-hydrolyzed extract (negative control) and with an acid hydrolyzed extract (positive control). The IA amount after enzymatic hydrolysis was statistically similar than positive control. However, the fermentation did not hydrolyze completely the isoflavones, being necessary an additional acid hydrolysis at end of fermentative process. The extracts obtained by acid, enzymatic, fermentative and fermentative+acid processes were investigated to analyze the presence or absence of sugars, furanic compounds, triterpenes and saponins. Besides, all of them were partitioned with ethyl acetate to obtain IA-rich fractions. The most pure and easily achieved fraction was the one obtained from enzymatic hydrolyzed extract. This fraction was examined to explore its in vitro proliferation ability in keratinocytes cells (HaCaT). After 48 h of cellular treatment, the results showed that the fraction at 0,1 μg de IA/mL was considered non-cytotoxic for cells, and showed a promising proliferative activity. Therefore, this fraction was chosen to be incorporated in nanoemulsions viewing a future topic application during regenerative processes of skin. Moreover, the formulations were thickened, or not, until hyaluronic acid hydrogels. Lastly, it was performed the skin permeation/retention evaluation for IA from formulations using an in vitro experimental model with porcine ear skin. Both nanoemulsions and hydrogels were considered as promisor delivery systems for IA, increasing their retention in skin layers (epidermis and dermis).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-12Bitstream added on 2014-06-13T20:37:31Z : No. of bitstreams: 1 castoldi_r_me_jabo.pdf: 271551 bytes, checksum: 70eaecbffef73c494f584a13c0f4a3d6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se avaliar o desempenho de cinco genótipos de soja-hortaliça, quanto às características agronômicas, funcionais e antinutricionais. O experimento foi conduzido em campo, no Setor de Olericultura e Plantas Aromático-Medicinais na UNESP-FCAV. O delineamento experimental adotado foi o de blocos ao acaso com cinco tratamentos (genótipos) e quatro repetições, sendo que cada parcela experimental foi constituída por quatro linhas de plantio com seis metros de comprimento e 0,60 m entrelinhas, considerando-se para avaliação 20 plantas por parcela, das duas linhas centrais. Para a formação das mudas, utilizou-se do sistema de semeadura em bandejas de poliestireno expandido, com capacidade para 128 células, contendo substrato Plantmax Hortaliças® HT. As mudas foram transplantadas aos 10 dias após a semeadura. Avaliaram-se os genótipos JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 e JLM030 quanto às características: precocidade; altura de inserção da primeira vagem (cm); número de vagens por planta; número de sementes por vagem; massa fresca das vagens por planta (g); massa fresca de 100 sementes (g); produtividade total estimada de grãos imaturos (kg ha-1); teor de umidade; proteínas; lipídeos; cinzas; carboidratos; isoflavonas e inibidores de tripsina Kunitz (KSTI). Na avaliação das principais características agronômicas, funcionais e antinutricionais, nas condições deste experimento, pode-se concluir que o genótipo de soja-hortaliça JLM010 é o mais recomendado para a região de Jaboticabal-SP, por apresentar melhores características agronômicas para produção como hortaliça (136,04 g para massa fresca das vagens por planta, 92,52 g para massa fresca de 100 sementes e 11.121,22 kg ha-1para produtividade total estimada de grãos imaturos) e também se destacar quanto às propriedades funcionais. / The aim of this study was to evaluate the performance of five genotypes of vegetable soybean with respect to agronomic, functional and antinutritional characteristics. The experiments were conducted in the field, in the Sector of Vegetable Crops and Aromatic Medicinal Plants, in the UNESP-FCAV. The experimental design adopted was a randomized block design with five treatments (genotypes) and four repetitions. Each experimental parcel comprised four planting rows of six meters in length and 0.60 m between rows, and 20 plants per parcel, from the two center rows, were evaluated. Seedlings were started in Polystyrene trays with 128 cells containing the substrate Plantmax Hortaliças® HT. The seedlings were transplanted at 10 days after planting. The genotypes JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 and JLM030 were evaluated with respect to the following characteristics: precocity, height to first pod (cm), number of pods per plant, number of seeds per pod, fresh weight of pods per plant (g), fresh weight of 100 seeds (g), estimated total productivity of immature seeds, moisture content, proteins, lipids, ash, carbohydrates, isoflavones and Kunitz trypsin inhibitor (KSTI). In the evaluated of principals characteristics agronomic, functional and antinutritional, in the conditions this study, conclude that: 1) the genotype JLM010 was found to be the most recommended for the region of Jaboticabal-SP, as it showed better agronomic characteristics for production as a vegetable (136,04 g for fresh weight of pods per plant, 92,52 g for fresh weight of 100 seeds and 11.121,22 kg ha-1 for estimated total productivity of immature seeds) and displayed better functional characteristics and also highlight on the functional properties.

Resumo: Objetivou-se avaliar o desempenho de cinco genótipos de soja-hortaliça, quanto às características agronômicas, funcionais e antinutricionais. O experimento foi conduzido em campo, no Setor de Olericultura e Plantas Aromático-Medicinais na UNESP-FCAV. O delineamento experimental adotado foi o de blocos ao acaso com cinco tratamentos (genótipos) e quatro repetições, sendo que cada parcela experimental foi constituída por quatro linhas de plantio com seis metros de comprimento e 0,60 m entrelinhas, considerando-se para avaliação 20 plantas por parcela, das duas linhas centrais. Para a formação das mudas, utilizou-se do sistema de semeadura em bandejas de poliestireno expandido, com capacidade para 128 células, contendo substrato Plantmax Hortaliças® HT. As mudas foram transplantadas aos 10 dias após a semeadura. Avaliaram-se os genótipos JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 e JLM030 quanto às características: precocidade; altura de inserção da primeira vagem (cm); número de vagens por planta; número de sementes por vagem; massa fresca das vagens por planta (g); massa fresca de 100 sementes (g); produtividade total estimada de grãos imaturos (kg ha-1); teor de umidade; proteínas; lipídeos; cinzas; carboidratos; isoflavonas e inibidores de tripsina Kunitz (KSTI). Na avaliação das principais características agronômicas, funcionais e antinutricionais, nas condições deste experimento, pode-se concluir que o genótipo de soja-hortaliça JLM010 é o mais recomendado para a região de Jaboticabal-SP, por apresentar melhores características agronômicas para produção como hortaliça (136,04 g para massa fresca das vagens por planta, 92,52 g para massa fresca de 100 sementes e 11.121,22 kg ha-1para produtividade total estimada de grãos imaturos) e também se destacar quanto às propriedades funcionais. / Abstract: The aim of this study was to evaluate the performance of five genotypes of vegetable soybean with respect to agronomic, functional and antinutritional characteristics. The experiments were conducted in the field, in the Sector of Vegetable Crops and Aromatic Medicinal Plants, in the UNESP-FCAV. The experimental design adopted was a randomized block design with five treatments (genotypes) and four repetitions. Each experimental parcel comprised four planting rows of six meters in length and 0.60 m between rows, and 20 plants per parcel, from the two center rows, were evaluated. Seedlings were started in Polystyrene trays with 128 cells containing the substrate Plantmax Hortaliças® HT. The seedlings were transplanted at 10 days after planting. The genotypes JLM003, JLM004, JLM010, JLM024 and JLM030 were evaluated with respect to the following characteristics: precocity, height to first pod (cm), number of pods per plant, number of seeds per pod, fresh weight of pods per plant (g), fresh weight of 100 seeds (g), estimated total productivity of immature seeds, moisture content, proteins, lipids, ash, carbohydrates, isoflavones and Kunitz trypsin inhibitor (KSTI). In the evaluated of principals characteristics agronomic, functional and antinutritional, in the conditions this study, conclude that: 1) the genotype JLM010 was found to be the most recommended for the region of Jaboticabal-SP, as it showed better agronomic characteristics for production as a vegetable (136,04 g for fresh weight of pods per plant, 92,52 g for fresh weight of 100 seeds and 11.121,22 kg ha-1 for estimated total productivity of immature seeds) and displayed better functional characteristics and also highlight on the functional properties. / Orientadora: Leila Trevizan Braz / Coorientadora: Mercedes Concórdia Carrão-Panizzi / Banca: Arthur Bernardes Cecílio Filho / Banca: Marcelo Álvares de Oliveira / Mestre

Isoflavonas são substâncias fenólicas conhecidas por promoverem diversos efeitos benéficos à pele. Na soja, esses compostos são essencialmente encontrados nas formas glicosiladas. No entanto, as atividades biológicas são principalmente relacionadas com as suas formas agliconas. A presente tese teve como principal objetivo a obtenção de uma fração enriquecida em isoflavonas agliconas e a sua incorporação em formulações tópicas visando o aumento da retenção cutânea de tais compostos. Para tanto, foi realizada primeiramente a extração de soja em meio hidroetanólico seguida de processo clássico hidrolítico (hidrólise ácida) para obtenção das formas livres das isoflavonas. O extrato obtido foi avaliado por um método cromatográfico de ultraeficiência, o qual foi desenvolvido e validado para a determinação quantitativa das isoflavonas agliconas (IA), bem como para avaliação das principais impurezas furânicas formadas. O método mostrou-se específico, linear, preciso, robusto e exato para a quantificação das IA daidzeína, gliciteína e genisteína, e para a quantificação das impurezas hidroximetilfurfural (HMF) e etoximetilfurfural (EMF). Além disso, o método foi concomitantemente validado para a quantificação das IA em diferentes matrizes analíticas e bioanalíticas visando estudos de desenvolvimento de produtos tópicos e estudos de permeação/retenção cutânea. Devido à toxicidade relatada na literatura para o HMF, o presente estudo investigou in vitro o potencial genotóxico e mutagênico do EMF, principal impureza formada após degradação ácida dos açúcares presentes no extrato hidroetanólico de soja. O EMF apresentou potencial genotóxico em linhagem celular do tipo HepG2 nas concentrações próximas ao teor encontrado no extrato. Devido a isso, foi realizada uma investigação de métodos alternativos ao da hidrólise ácida visando à obtenção das IA da soja sem a presença de HMF e EMF, e facilitando, desta forma, os processos de purificação até uma fração enriquecida em IA. Para tanto, foram realizadas otimizações de processos hidrolíticos mais seletivos, tais como hidrólise enzimática com β-glicosidase e fermentação com Saccharomyces cerevisiae. Os processos foram primeiramente avaliados por desenho experimental de Plackett-Burman para determinação dos principais fatores que podem influenciar durante os bioprocessos hidrolíticos. Posteriormente, os métodos foram otimizados por meio de desenho experimental de Box-Behnken. Destaca-se que os processos foram realizados com um extrato equivalente ao extraído de 1,0 g de soja desengordurada. Para o método enzimático, as condições ótimas de processo compreenderam 838 unidades de β-glicosidase, em pH 6.0, durante 4,5 h à 37 ºC. Para o método fermentativo, as condições ótimas de processo hidrolítico compreenderam 1500 mg de fermento comercial contendo Saccharomyces cerevisiae, em pH 7.6, durante 24 h à 33 ºC. Os extratos foram avaliados quanto ao teor de IA, sempre realizando a sua comparação com um extrato não hidrolisado (controle negativo) e com um extrato hidrolisado pela via ácida (controle positivo). O teor de IA após hidrólise enzimática foi estatisticamente semelhante ao controle positivo. No entanto, o processo de fermentação não permitiu completa hidrólise das isoflavonas, sendo necessária a realização de um processo adicional de hidrólise ácida ao final do processo fermentativo. Todos os extratos hidrolisados, ou seja, os obtidos pelas vias ácida, enzimática, fermentativa, fermentativa+ácida, foram avaliados quanto à presença ou ausência de açúcares, compostos furânicos, triterpenos e saponinas. Além disso, todos passaram por processo de partição líquido-líquido com acetato de etila para obtenção de diferentes frações. A fração que apresentou maior pureza e que foi considerada a mais promissora para escalonamento de produção foi obtida após partição do extrato de soja hidrolisado pela via enzimática. Essa fração foi avaliada quanto ao seu potencial in vitro de proliferação de queratinócitos (HaCaT). Após 48 h de tratamento celular, os resultados demonstraram que a fração na concentração de 0,1 μg de IA/mL foi considerada não citotóxica para as células e apresentou promissora atividade proliferativa de queratinócitos. Desta forma, tal fração foi escolhida para ser incorporada em nanoemulsões visando uma futura aplicação tópica durante processos regenerativos de tecidos cutâneos. As formulações foram espessadas, ou não, até hidrogéis de ácido hialurônico. Por fim, foi realizada a avaliação da capacidade de permeação/retenção cutânea das IA a partir das formulações utilizando modelo experimental in vitro com pele de orelha suína. Tanto as nanoemulsões quanto os hidrogéis demonstraram ser promissores sistemas de liberação das IA na pele, aumentando sua retenção em camadas cutâneas consideradas importantes para exercerem seus efeitos benéficos. / Isoflavones are phenolic compounds that promote several benefic effects on the skin. In soybeans, these substances are present in different chemical conformations, mostly as glycoside conjugates. However, the beneficial activities are mainly credited to their aglycone forms. The main goal of this study was the production of an isoflavone aglycone-rich fraction to be incorportated into topical products intended to increase the skin retention of isoflavone aglycones (IA). For that, firstly it was performed a soybean extraction in a hydroethanolic media followed by a classical hydrolysis procedure (acid hydrolysis) to breakdown the conjugated forms until their respective aglycones. To analyze the obtained extract, an ultra-fast liquid chromatography method was developed and validated. The method showed to be specific, linear, precise, robust and accurate for quantification of daidzein, glycitein and genistein, as well as for hydroxymethylfurfural (HMF) and ethoxymethylfurfural (EMF), the main impurities present in the acid hydrolyzed extract. Besides, the method was concomitantly validated for determination of IA in different analytical and bioanalytical matrices during development of topical products and permeation/retention assays. Due to the well-documented toxicity of HMF, this study also investigated in vitro the genotoxic and mutagenic potential of EMF, a sugar degradation product formed after acid hydrolysis of soybean extract. EMF showed to be genotoxic for HepG2 cells at concentrations very close to those present in the extract. So, alternative hydrolysis methods were carried out aiming to obtain the IA from soybeans without the presence of HMF and EMF, and thus facilitating the processes of purification until new IA-rich fractions. For that, procedures with more selectivity properties were accomplished, such as enzymatic hydrolysis with β-glucosidase and fermentation with Saccharomyces cerevisiae. These methods were firstly evaluated by a Plackett-Burman design, to screen the main factors that could be influencing during the hydrolysis of isoflavones present in soybean extract. Further, the methods were optimized by Box-Behnken design. It is important to highpoint that the processes were always carried out with a sample corresponding to the extracted from 1.0 g of defatted soybeans. The highest IA content was achieved under the optimal conditions: enzymatic hydrolysis with 838 units of β-glucosidase, during 4.5 h at pH 6.0 and 37 ºC, or fermentative process with 1500 mg of commercial bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) during 24 h at pH 7.6 and 33 ºC. The extracts were investigated to evaluate the IA content, and the results were always compared with a non-hydrolyzed extract (negative control) and with an acid hydrolyzed extract (positive control). The IA amount after enzymatic hydrolysis was statistically similar than positive control. However, the fermentation did not hydrolyze completely the isoflavones, being necessary an additional acid hydrolysis at end of fermentative process. The extracts obtained by acid, enzymatic, fermentative and fermentative+acid processes were investigated to analyze the presence or absence of sugars, furanic compounds, triterpenes and saponins. Besides, all of them were partitioned with ethyl acetate to obtain IA-rich fractions. The most pure and easily achieved fraction was the one obtained from enzymatic hydrolyzed extract. This fraction was examined to explore its in vitro proliferation ability in keratinocytes cells (HaCaT). After 48 h of cellular treatment, the results showed that the fraction at 0,1 μg de IA/mL was considered non-cytotoxic for cells, and showed a promising proliferative activity. Therefore, this fraction was chosen to be incorporated in nanoemulsions viewing a future topic application during regenerative processes of skin. Moreover, the formulations were thickened, or not, until hyaluronic acid hydrogels. Lastly, it was performed the skin permeation/retention evaluation for IA from formulations using an in vitro experimental model with porcine ear skin. Both nanoemulsions and hydrogels were considered as promisor delivery systems for IA, increasing their retention in skin layers (epidermis and dermis).

Com o aumento da população mundial, são necessárias estratégias criativas para aumentar a produção de alimentos. Para superar esse imenso desafio, novos cultivares vem sendo desenvolvidos, através de diferentes técnicas, e com diferentes características, para alcançar uma maior produção de alimentos. Para conservação dessa produção vários métodos podem ser empregados, e a irradiação com cobalto constitui um método seguro e eficaz para o aumento no tempo de vida útil dos alimentos. Devido à importância comercial e nutricional da soja, possíveis alterações promovidas devem ser estudadas. O presente trabalho visa determinação dessas possíveis alterações causadas pela irradiação (com doses de 2, 4 e 8 kGy) em dois diferentes cultivares de soja (BRS 213 e Embrapa48) realizando análises químicas de perfil lipídico, isoflavonas, polifenóis totais, livres e ligados a proteínas, análise sensorial descritiva quantitativa, ensaio biológico para determinação da qualidade proteíca e ensaio com insetos para determinação de quebra de ressitência dos grãos e desinfestação. Os dois cultivares apresentaram perfil lipídico semelhante, e a irradiação promoveu pequena redução nas quantidades de ácidos linolênico e linoléico. Com relação as isoflavonas, o tratamento de radiação promoveu aumento nas quantidades das glicosiladas com dose de 2 kGy e diminuição com doses de 4 e 8 kGy enquanto aumentou a capacidade antioxidante e reduziu as proteínas ligadas à polifenóis. As alterações nas qualidades sensoriais dos grãos foram com relação a aparência e textura. Foi comprovada a eficiência da irradiação na desinfestação dos grãos e perda da resistência natural. As amostras irradiadas com 4 e 8 kGy se aproximaram dos índices de qualidade protéica aparente do padrão caseína. Os resultados obtidos indicam que o tratamento de radiação se oferece como um processo efetivo de desinfestação, sem prejudicar a qualidade da valiosa proteína de soja e com mínima alteração sensorial / With the increasement of the world population, criative strategies will be necessary to increase food prodution. To achieve this chalenge, new cultivars have been development, though different tecniques and with characteristics to improve the production. To maintain food conservation, several methods can be used. The use of Cobalto-60 radiation is a secure and useful method to increase the life time of foods. Due to the commercial and nutritional importance of soybean, some alterations must be studied. This study has the objective to determinate this alterations caused by irradiation (with doses of 2, 4 and 8 kGy) in grain of two different cultivars of soybean (BRS 213 e Embrapa 48), this study includes chemical analysis of lipid profile, isoflavones, total, free and protein-bound polyphenols, analysis sensory descriptive quantitative, biological assay for the determination of protein quality and insects assay for determination of break of resistance in the grains and desinfestation. Two cultivars presented similar lipid profile, and the irradiation promoted small reduction in the amounts of linoleic and linolenic acids. Regard to the isoflavones, the radiation treatment promoted increase in the amounts of the glycosides with dose of 2 kGy and decrease with doses of 4 and 8 kGy promoted increase in the antioxidant capacity and reduced protein-bound polyphenols. The alterations in the sensory qualities of the grains were regarding appearance and texture. It was proven the efficiency of the irradiation in the desinfestation of the grains and loss of the natural resistance. Samples irradiated with 4 and 8 kGy approached of the indices for apparent protein quality to the pattern casein. The results of this study indicating that radiation treatment of soybean offers considerable promise as an effective desinfestations process, without impairing the quality of the valuable soybean protein and with low sensory alteration

A soja (Glycine max) contém uma variedade de compostos com comprovada atividade biológica, tais como as isoflavonas, que estão presentes em diferentes formas, glicosiladas e agliconas. Além disso, a soja contém uma grande quantidade de proteínas, que são consideradas fontes de peptídeos bioativos. As isoflavonas agliconas, daidzeína e genisteína, possuem maior atividade antioxidante que as glicosiladas, daidzina e genistina. No entanto, os grãos de soja são ricos nas formas glicosiladas das isoflavonas. Estudos mostram que a biotransformação da soja, por micro-organismos e enzimas, leva ao aumento dos teores das isoflavonas agliconas, as quais são liberadas pela ação de enzimas -glicosidases, que clivam as ligações -glicosídicas das isoflavonas glicosiladas, e também pode possibilitar a hidrólise das proteínas da soja. Além disso, pesquisadores têm demonstrado aumento na atividade antioxidante e na prevenção e/ou supressão de certos cânceres após biotransformação da soja. Neste contexto, foi realizada a biotransformação da soja pelo fungo A. awamori, e por uma mistura enzimática, proveniente do processo fermentativo deste fungo na soja. Os extratos da soja biotransformada, não biotransformada, e o extrato comercial isoflavin beta®, rico em isoflavonas, foram avaliados quanto aos perfis cromatográficos, teores de daidzeína, genisteína, proteínas, aminoácidos e/ou peptídeos, potencial antioxidante e atividade citotóxica frente a células de fibroblasto e melanoma. O modo de morte celular das células de melanoma, necrose ou apoptose, também foi avaliado. A biotransformação da soja, pelos dois processos, resultou em extratos enriquecidos com isoflavonas agliconas e aminoácidos e/ou peptídeos, e com maior atividade antioxidante que o extrato da soja não biotransformada. Os dois processos de biotransformação da soja resultaram em extratos com características químicas e biológicas diferentes. O conteúdo de daidzeína, proteínas, aminoácidos e/ou peptídeos encontrados no extrato da soja biotransformada pelo fungo foram 6%, 56% e 357%, respectivamente, superiores ao extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática. Ao contrário do observado para o teor de genisteína que foi 48% maior no extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática. O extrato da soja biotransformada pelo fungo apresentou maior atividade antioxidante que o extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática, além disso, foi o único dos extratos aqui estudados que apresentou citotoxicidade seletiva para as células de melanoma, induzindo morte celular por apoptose destas células cancerosas. Sendo assim, os resultados obtidos pelo extrato da soja biotransformada pelo fungo A. awamori fornecem boas perspectivas para futura utilização deste extrato como antitumoral. / Soybean (Glycine max) contains a variety of compounds with proven biological activity, such as isoflavones, which are present in different forms, glycosides and aglycones. In addition, soybean contains a lot of proteins, which are considered sources of bioactive peptides. The aglycone isoflavones, daidzein and genistein, have higher antioxidant activity than the glucoside ones, daidzin and genistin. However, soybean grains are rich in the glycosylated forms of isoflavones. Studies have shown that the soybean biotransformation, by microorganisms and enzymes, lead to increased levels of aglycone isoflavones, which are released by the action of -glycosidase enzymes, which cleave the -glycosidic bonds of isoflavone glucosides, and can also allow the hydrolysis of soybean proteins. Additionally, researchers have shown an increase in the antioxidant activity and in the prevention and/or suppression of certain cancers after soybean biotransformation. In this context, it was performed the biotransformation of soybeans with the fungus A. awamori, and with an enzyme mixture, from the fermentation process of the fungus in soybean. The biotransformed, the non biotransformed soybean extracts and the marketed isoflavin beta® extract rich in isoflavones, were evaluated regarding their chromatographic profiles, levels of daidzein, genistein, proteins, amino acids and/or peptides, the antioxidant potential and the cytotoxic activity against melanoma cells and fibroblasts. The mode of cell death of melanoma cells, necrosis or apoptosis, was also evaluated. The biotransformation of soybean by the two processes resulted in extracts enriched with aglycone isoflavones and aminoacids and/or peptides, and with antioxidant activity higher than the non biotransformed soybean extract. The two processes of soybean biotransformation resulted in extracts with different chemical and biological characteristics. The contents of daidzein, proteins, aminoacids and/or peptides found in soybean extract biotransformed by the fungus were 6%, 56% and 357%, respectively, higher than the soybeam extract biotransformed by the enzyme mixture. Contrary to what was observed with the genistein content that was 48% higher in the soybean extract biotransformed by the enzyme mixture. The soybean extract biotransformed by the fungus had a higher antioxidant activity than the soybean extract biotransformed by the enzyme mixture, moreover, it was the unique extract among the ones studied in this work that showed selective cytotoxicity to melanoma cells, inducing cell death by apoptosis of these cancer cells. Thus, the obtained results of the soybean extract biotransformed by the fungus A. awamori provide good prospects for future use of this extract as antitumoral.