Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências / Made available in DSpace on 2013-06-25T23:46:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310212.pdf: 656191 bytes, checksum: de337c441270002382bc81c840b8828c (MD5) / Os inibidores da enzima 3-hidróxi-3-metilglutaril-Coenzima A redutase, chamados clinicamente de estatinas, são potentes redutores dos níveis séricos de colesterol através da inibição da síntese de mevalonato. Além dos efeitos protetores sobre doenças cardiovasculares, o tratamento com estatinas tem demonstrado efeito neuroprotetor em diversos modelos de doenças neurológicas. Nesse estudo, demonstramos que o tratamento com atorvastatina apresentou efeitos neuroprotetores em modelos de excitotoxicidade in vivo e in vitro. O tratamento de camundongos por 7 dias com atorvastatina 10 mg/kg/dia promoveu uma diminuição de 30% na incidência de convulsões induzidas pelo ácido quinolínico (AQ) e preveniu a morte celular no hipocampo induzida pelo AQ. Além disso, o tratamento com atorvastatina preveniu a diminuição na recaptação de glutamato, no entanto, sem efeito sobre o aumento na liberação de glutamato ou a diminuição na expressão de GLT-1 induzida pelo AQ. Esse efeito neuroprotetor da atorvastatina foi associado a um aumento nos níveis de fosforilação da Akt e ERK1/2, sem efeito sobre os níveis de fosforilação das proteínas JNK e p38MAPK. A inibição da via MEK/ERK, mas não da via da PI3K/Akt, aboliu o efeito protetor da atorvastatina sobre a diminuição da recaptação de glutamato induzida pelo AQ. Também demonstramos que o tratamento in vivo com atorvastatina preveniu a diminuição na viabilidade celular induzida pela privação de glicose e oxigênio (PGO) em fatias de hipocampo através da diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio, aumento nos níveis de tióis não-protéicos e aumento da captação de glutamato e da atividade da glutamina sintetase (GS). Esse efeito neuroprotetor sobre a viabilidade celular, captação de glutamato e atividade da GS foi abolido quando colesterol (50µM) foi adicionado às fatias previamente à indução da PGO. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com atorvastatina 1 e 10 mg/kg/dia aumentou a performance cognitiva dos animais no teste de realocação de objetos, sem alterações locomotoras avaliadas no teste do campo aberto ou alterações de comportamento tipo ansioso avaliadas no teste do labirinto em cruz elevado. Dessa forma, demonstramos que a atorvastatina apresenta efeitos comportamentais per se, através da melhora de performance dos camundongos em um modelo de memória espacial. Além disto, estendemos as observações de efeitos neuroprotetores para a atorvastatina, demonstrando proteção contra a excitotoxicidade glutamatérgica in vivo e in vitro, através da modulação do transporte e metabolização do glutamato. A modulação da captação de glutamato é dependente da sinalização de MAPK/ERK1/2 e a modulação da captação e atividade da glutamina sintetase envolvem o papel da atorvastatina de inibir a biossíntese do colesterol e derivados. Portanto, os efeitos terapêuticos da atorvastatina, associados à neuroproteção, envolvem a modulação da transmissão glutamatérgica. / The inhibitors of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase, named statins, are potent reductors of serum cholesterol levels through inhibition of mevalonate synthesis. Beyond the protective effects on cardiovascular diseases, the treatment with statins has been shown to present neuroprotective effects in a wide range of neurological disorders. In this study, we demonstrated that atorvastatin treatment presented protective effects on in vivo and in vitro models of excitotoxicity. The treatment with atorvastatin 10mg/kg/day during 7 days promoted a reduction of 30% in the incidence of seizures induced by quinolinic acid (QA) infusion. Furthermore, atorvastatin treatment prevented hippocampal cell death induced by QA. Atorvastatin treatment prevented the decrease in glutamate uptake, however, with no effect on the increase in glutamate release or the decrease in GLT-1 expression induced by QA. This protective effect of atorvastatin was associated with increased phosphorylation levels of Akt and ERK1, with no effect on the phosphorylation levels of JNK e p38MAPK. Inhibition of MEK/ERK signaling, but not PI3K/Akt signaling, abolished the protective effect of atorvastatin treatment on the reduction of glutamate uptake induced by QA. We further demonstrated that in vivo treatment with atorvastatin prevented the reduction in cell viability induced by oxygen and glucose deprivation (OGD) in hippocampal slices through reduction in oxidative stress damage, increase in glutamate uptake and glutamine synthetase activity (GS). These effects on cell viability, glutamate uptake and GS activity were abolished when slices were pre-incubated with cholesterol (50ìM) before OGD induction. Additionally, we demonstrated that atorvastatin treatment (1 or 10mg/kg/day) during 7 days improved the cognitive performance of mice in the object recognition test, with no alterations in the locomotor activity evaluated in the open field test and with no alteration in the anxiety-like behavior evaluated in the elevated plus maze test. In this way, we demonstrated that atorvastatin presents behavioral effects per se and neuroprotective effects against glutamatergic excitotoxicity in vivo and in vitro through modulation of glutamate transport and metabolization. These effects were, at least partially, related to Akt and ERK signaling and inhibition of cholesterol synthesis pathway. The modulation of glutamate uptake is dependent of MAPK/ERK1/2 signaling and the modulation of glutamine synthetase activity and glutamate uptake are related to inhibition of cholesterol and derivatives synthesis by atorvastatin. In this way, the therapeutic effects of atorvastatin, related to neuroprotection, involve the modulation of glutamatergic transmission.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:18:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309989.pdf: 2939881 bytes, checksum: 95364d002ffeed32f2daee831619ba4f (MD5) / A guanosina (GUO) é um modulador endógeno da excitotoxicidade glutamatérgica e promove neuroproteção em modelos de neurotocixidade in vivo e in vitro. A guanosina promove neuroproteção frente à privação de glicose e oxigênio (PGO) através da modulação da atividade do canal de potássio do tipo BK (canal de K+ de larga condutância ativado por Ca2+), ativação da via da PI3K e aumento da captação de glutamato. Neste trabalho demonstramos que a GUO (1 mM) protege culturas de células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) da morte neuronal decorrente da superprodução de espécies reativas de oxigênio induzidas pela co-administração de rotenona e oligomicina A, através da ativação da via de sinalização celular proteína cinase dependente de fosfatidilinositol (PI3K)/proteína cinase B (Akt), inibição da enzima glicogênio sintase cinase (GSK-3?)PI3K/GSK-3? e indução da enzima antioxidante heme oxygenase-1. Estes efeitos foram mediados pelo BK, e pelos receptores de adenosina do subtipo A1R e A2AR. Em fatias de hipocampo submetidas a um modelo de isquemia in vitro (PGO), o tratamento com GUO (100 ?M) previne o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), a despolarização da membrana mitocondrial, inibiu a ativação do fator de transcrição NF- B e reduziu os níveis da iNOS induzidos pela PGO. A presença do inibidor da proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) /proteína cinase regulada por sinal extracelular (ERK) e do antagonista de A1R reverteram os efeitos neuroprotetores promovidos pelo tratamento com GUO. A GUO estimula a captação de glutamato através da ativação da via MAPK/ERK, mas não envolve ativação de A1R. A GUO também reduz a liberação de glutamato e protege as fatias de hipocampo através da modulação do transporte reverso de glutamato. Adicionalmente, a PGO induz uma diminuição na atividade da glutamina sintetase e o tratamento com GUO reverte parcialmente este efeito. No entanto, a GUO não apresenta efeito sobre a redução da atividade dos complexos da cadeia respiratória e não previne a inibição da fosforilação oxidativa induzida pela PGO nas fatias de hipocampo de ratos. Avaliando-se o papel da GUO sobre as células astrocitárias corticais observamos que a GUO (10 µM) protege contra a PGO através da estimulação da atividade dos transportadores de glutamato e diminuição da produção de EROs. Os efeitos da GUO sobre a modulação dos transportadores astrocitários de glutamato envolvem a ativação da via MAPK/ERK. Desta forma, a GUO um nucleosídeo endógeno e não tóxico pode conter a neuroinflamação e excitotoxicidade induzida pelo dano oxidativo mitocondrial e pela isquemia apresentando um importante papel neuroprotetor. / Guanosine (GUO) is an endogenous modulator of glutamatergic excitotoxicity and promotes neuroprotection in in vitro and in vivo models of neurotoxicity. Guanosine promotes neuroprotection against oxygen and glucose deprivation (OGD) by increasing glutamate uptake trough modulation of BK potassium channels (Ca2 +-activated large conductance K+ channels) and phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) pathway. In the present study, GUO (1 mM) protected human neuroblastoma cell cultures (SH-SY5Y) from neuronal death due overproduction of reactive oxygen species (ROS) induced by coadministration of rotenone and oligomycin-A, by activating the PI3K/protein kinase B (Akt) cell signaling pathway, glycogen synthase kinase-3 beta (GSK3B]) and induction of the antioxidant enzyme heme oxygenase-1. These effects on SH-SY5Y were mediate via BK channels and the adenosine receptors A1R and A2AR. In hippocampal slices subjected to an ischemic in vitro model (OGD), GUO (100 uM) treatment prevented the excessive ROS production, mitochondrial membrane depolarization, inhibited the activation of the nuclear transcription factor NF-k B and reduced inducible Nitric oxide synthase (iNOS) levels induced by OGD. The mitogen-activated protein kinase (MAPK)/extracellular-signal regulated kinase (ERK) kinase (MEK) inhibitor, PD98059 and the A1R antagonist, DPCPX, abolished GUO induced neuroprotective effects. GUO stimulated glutamate uptake through activation of MAPK/ERK pathway, but did not involve activation of A1R. GUO also counteracted the glutamate release induced by OGD in hippocampal slices through modulation of the reverse activity of glutamate transporters. Additionally, OGD induced a decrease in glutamine synthetase activity and GUO treatment partially reversed this effect. However, GUO has not able to prevent the reduction of respiratory chain complexes activity and inhibition of oxidative phosphorylation induced OGD in rat hippocampal slices. The evaluation of GUO role on cortical astrocytic cells showed that GUO (10 uM) protects against OGD by stimulating the activity of glutamate transporters and decreasing ROS production. GUO effects on modulation of astrocytic glutamate transporters involved MAPK/ERK activation. In conclusion, GUO afford neuroprotection against ischemic and oxidative damage through the modulation of glutamatergic and purinergic systems, activation of BK potassium channels and involving the activation of PI3K and MAPK/ERK signaling pathways. Therefore, GUO is an endogenous and non-toxic nucleoside that may counteract neuroinflammation and excitotoxicity, presenting a potential neuroprotective role.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-12-16Bitstream added on 2014-06-13T19:24:37Z : No. of bitstreams: 1 santos_pss_dr_botfm.pdf: 1256357 bytes, checksum: 4a195c65f3afc4f558db0dacf2c3985a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A lesão renal aguda pode ter seu curso minimizado quando reconhecida e tratada adequadamente. NGAL surge como um novo biomarcador precoce desta lesão e poderá ser um marcador semelhante à troponina para o infarto agudo do miocárdio. O objetivo deste estudo foi quantificar a NGAL plasmática em ratos submetidos à isquemia renal sob anestesia venosa total (AVT) com reposição volêmica com cristalóide (RL) ou colóide (HES) e correlacionar com alterações histológicas renais. Trinta ratos, Wistar machos, foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos: G1 (AVT + RL + isquemia artéria renal esquerda), G2 (AVT + HES + isquemia artéria renal esquerda) e G3 (AVT + RL). A anestesia foi mantida com propofol na dose de 1 mg.kg-1.min-1 e remifentanil na dose de 0,05 a 0,1 μg.kg-1.min-1. Os valores plasmáticos da NGAL foram determinados a partir de coleta sanguínea estabelecidas em quatro momentos: M1, após a monitorização do animal; M2, após 30 minutos de isquemia; M3, após 30 minutos de reperfusão e M4, 12 horas após o início do experimento. Os atributos estudados foram pressão arterial média (PAM), temperatura retal (T), dosagem plasmática de NGAL e avaliação histológica. Todos os animais foram submetidos à laparotomia mediana para nefrectomia à direita e ao final do experimento procedeu-se nefrectomia à esquerda. A avaliação histológica foi realizada por meio de escala para avaliação de necrose tubular nos rins retirados dos grupos de estudo. As variáveis PAM, T, NGAL e escore de lesão histológica após análise, foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. Os valores da NGAL plasmática nos grupo G1 e G2 foram elevados alcançando 400 ng.mL-1 especificamente no M4, sendo esta diferença estatisticamente significativa quando comparado com G3; quando se comparou os diversos... / The course of acute renal injury can be minimized when it is adequately recognized and treated. NGAL arises as a new early biomarker for such injury, and it may be used similarly to troponin, which is a marker for acute myocardial infarction. This study aimed at quantifying plasma NGAL in rats submitted to renal ischemia under total venous anesthesia (TVA) with crystalloid (RL) or colloid (HES) volemic replacement and at correlating it with renal histological alterations. Thirty male Wistar rats were randomly distributed into three groups: G1 (TVA + RL + left renal arterial ischemia), G2 (TVA + HES + left renal arterial ischemia) and G3 (TVA + RL). Anesthesia was maintained with propofol at a dose of 1 mg.kg-1.min-1 and remifentanil at a dose of 0.05 to 0.1 μg.kg-1.min-1. NGAL plasma levels were determined from blood collections established at four moments: M1, after animal monitorization; M2, after 30 minutes of ischemia; M3, after 30 minutes of reperfusion and M4, twelve hours after commencement of the experiment. The studied attributes were mean arterial pressure (MAP), rectal temperature (T), plasma NGAL dosing and histological evaluation. All the animals were submitted to median laparotomy for right nephrectomy and, at the end of the experiment, left nephrectomy was performed. Histological evaluation was performed by means of a scale for assessment of tubular necrosis in the kidneys removed from the study groups. Variables MAP, T, NGAL and histological lesion scores were considered to be statistically significant when p<0.05. Plasma NGAL values in Groups G1 and G2 were high and reached 400 ng.mL-1 specifically at M4. Such difference was statistically significant when comparing with G3. When the various moments were compared within the same group, the difference was statistically significant only at M4 in relation to the other moments. As regards histological lesion... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-14Bitstream added on 2014-06-13T20:46:14Z : No. of bitstreams: 1 azevedo_vlf_dr_botfm.pdf: 523479 bytes, checksum: c48cd245cf1900b4ee620b31cba525a8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A lesão renal aguda (LRA) caracterizada como redução abrupta da função renal tem incidência variável, dependendo dos critérios utilizados para sua definição. Atualmente, o mais empregado para avaliação de função renal é a dosagem de creatinina plasmática, porém, por sofrer interferência de vários fatores faz com que a mesma não seja o marcador ideal. Um novo biomarcador da função renal, a lipocalina associada à gelatinase dos neutrófilos (NGAL), tem sido estudado como um dos mais precoces e sensíveis marcadores de lesão de rins após isquemia/reperfusão ou lesão nefrotóxica, sendo facilmente identificada no sangue e na urina. A classificação RIFLE para LRA com a validação da NGAL é uma nova perspectiva para o diagnóstico precoce da LRA e instituição de medidas preventivas e protetoras em situações de risco. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a LRA por meio da dosagem plasmática da NGAL em ratos submetidos à isquemia renal sob anestesia geral balanceada e hidratados com Ringer lactato ou com hidroxietilamido e correlacionar a dosagem da NGAL plasmática com a lesão histológica renal. Em trinta ratos Wistar machos (>350g) distribuídos aleatoriamente em três grupos de dez animais, induzidos com isoflurano a 4%, foi realizada intubação orotraqueal e colocados sob ventilação mecânica. Foram cateterizadas a artéria carótida esquerda e a veia jugular direita para monitorização e coletas sanguíneas. ETCO2, PAMI, T foram continuamente monitorizados (Datex, AS3). A manutenção foi realizada com isoflurano na concentração de 1% a 3% e remifentanil 0,05 a 0,1 μg.kg-1min-1 em infusão continua conforme o grupo pertencente: G1 (Anestesia geral balanceada + Ringer lactato + isquemia/reperfusão renal); G2 (Anestesia geral balanceada + hidroxietilamido (HES) + isquemia/reperfusão renal) e G3... / Acute renal injury (ARI), characterized by abrupt renal function decline, has variable incidence, depending on the criteria used for its definition. Presently, the criterion most often used for kidney function evaluation is plasma creatinine dosing; however, because it suffers interference, it is not an ideal marker. A new renal function biomarker, neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) has been studied as one of the earliest and most sensitive kidney injury marker following ischemia/reperfusion or nephrotoxic injury, and it is easily identified in blood and urine. The RIFLE classification for ARI with NGAL validation is a new perspective for early ARI diagnosis and institution of preventive and protective measures in risk situations. This study aimed at evaluating ARI by means of NGAL plasma dosing in rats submitted to renal ischemia under general balanced anesthesia and hydrated with ringer lactate or hydroxyethylamide and at correlating plasma NGAL dosing with histological renal injury. Thirty male Wistar rats (>350g) were used. They were randomly distributed into three groups with ten animals each and induced by 4% isoflurane. Orotracheal intubation was performed and the animals were placed under mechanical ventilation. The left carotid artery and the right jugular vein were catheterized for monitorization and blood collection. ETCO2, PAMI, T were continuously monitorized (Datex, AS3). Maintenance was performed by 1% to 3% isoflurane and 0.05 remifentanil at 0.1 μg.kg-1min-1 in continuous infusion according to the group to which the animals belonged: G1 (General balanced anesthesia + Ringer lactate + renal ischemia/reperfusion); G2 (General balanced anesthesia + hydroxyethylamide (HES) + renal ischemia/reperfusion) and G3 - Control (General balanced anesthesia + Ringer lactate, without renal... (Complete abstract click electronic access below)

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Resultados controversos têm sido obtidos em estudos experimentais e clínicos com a infusão de insulina e glicose na lesão isquemia-reperfusão, havendo muito á ser esclarecido sobre os mecanismos deste tratamento. No coração, a insulina tem efeitos sobre a utilização dos substratos, fluxo coronariano, atua como antiinflamatório e, propõem-se efeitos diretos na sobrevivência celular; estes efeitos devem-se a ativação da via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3k)-Akt. As interações intracelulares entre os sistemas de sinalização da insulina e da angiotensina-II são muitas, salientando-se a possível importância do cross-talk angiotensina-II/insulina. Apesar da popularidade das preparações em corações isolados no estudo das lesões isquemia-reperfusão, diversos protocolos vêm sendo utilizados quanto a duração da isquemia, dificultanto a escolha do melhor período de isquemia para se testar os efeitos de fármacos sobre a recuperação da função cardíaca. Nesse trabalho objetivamos: determinar o melhor tempo de isquemia para investigar a recuperação funcional e a capacidade de resposta do sistema reninaangiotensina (SRA) tecidual em coração isolado e os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. No estudo 1 investigamos a recuperação funcional e a capacidade de resposta do SRA tecidual em corações isolados e submetidos a diferentes períodos de isquemia. Os corações foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: Krebs-Henseleit (KH) (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio) ou KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC). O índice de contratilidade ventricular (dP/dtmax) e o duplo produto foram reduzidos nos corações expostos à 25 min (~73%) e 30 min de isquemia (~80%) vs 20 min de isquemia. A pressão ventricular diastólica (PVD) e a pressão de perfusão (PP) aumentaram nos corações expostos à 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e 30 min de isquemia (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma diminuição no dP/dtmax e no duplo produto (~85-94%) em todos os períodos isquêmicos, e um aumento na PVD e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas aos 20 min isquemia. O captopril reverteu parcialmente ou totalmente os efeitos da angiotensina-I sobre a recuperação funcional, somente nos períodos 20 e 25 min de isquemia. Esses dados sugerem que a transição de dano pós-isquêmico leve/moderado para severo ocorre após 20 min de isquemia. Dessa forma, 20 min de isquemia é o melhor período de tempo para se estudar os efeitos de abordagens farmacológicas sobre a recuperação funcional. No estudo 2 investigamos os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. Os corações foram submetidos a um período de isquemia global (20 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: KH (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio), KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC), KH + insulina (grupo Insulina), KH + insulina + angiotensina-I (grupo IA) e KH + insulina + angiotensina-I + captopril (grupo IAC). Durante a recuperação, o grupo Angio apresentou uma redução de ~24% na pressão ventricular desenvolvida (PVDes) e de ~29% no dP/dtmáx vs período basal, e apresentou um aumento de ~2,7 vezes na PVD vs período basal, estes efeitos foram revertidos parcialmente ou totalmente pelos tratamentos AC, IA e IAC. O grupo Angio apresentou uma redução de ~24% no duplo produto vs período basal, este efeito foi revertido pelo tratamento IA, que também foi maior vs grupos KH e AC. Os grupos Angio e IA apresentaram um aumento de ~20% na PP vs período basal, e todos os grupos (exceto o insulina) foram maiores vs grupo KH; os grupos AC e IAC não diferiram dos grupos Angio e insulina. A Akt fosforilada foi maior nos grupos insulina e IA vs grupos KH (~47% e ~42%, respectivamente) e Angio (~60% e ~55%, respectivamente), os grupos AC e IAC não diferem dos demais. A AMPK fosforilada foi ~31% maior nos grupos insulina, IA e IAC vs grupos KH, Angio e AC. Os níveis de TBA-RS no grupo KH foram ~73% maior vs outros grupos; a quimiluminescência também foi maior (~2,2 vezes) no grupo KH vs outros grupos, e o grupo IA foi ~35% menor vs grupo Angio. A atividade da SOD não foi alterada pelos tratamentos, mas a atividade da catalase foi ~28% maior no grupo KH vs outros grupos (exceto o IA, P = 0,058) e a atividade da GST foi menor no grupo insulina vs grupos Angio e AC (~45% e ~50%, respectivamente). Os grupos Angio, AC e IAC apresentaram uma menor concentração da Cu/ZnSOD vs grupo KH (~40%, ~43% e ~27%, respectivamente), os grupos insulina e IA não diferem do grupo KH. Nenhum dos tratamentos alterou a concentração das enzimas GST e eNOS, os níveis de NOX ou a translocação do GLUT-4. Assim, a insulina ativa a via PI3k-Akt e parece exercer uma melhor regulação do estado redox celular, podendo ainda ativar a AMPK e ambas atuarem sinergicamente para um melhor perfil metabólico do miocárdio. Desse modo, a insulina administrada no inicio da reperfusão opõe-se aos efeitos deletérios da angiotensina-II e exerce um efeito cardioprotetor.

Resumo não disponível

A isquemia cerebral é a terceira maior causa de morte em países industrializados, sendo a maior causa de morbidade e mortalidade em indivíduos de meia idade e idosos. A redução do suprimento de glicose e oxigênio ao cérebro, o que ocorre na isquemia, leva a uma complexa cascata de eventos celulares, resultando em degeneração neuronal e, conseqüentemente, na perda das funções cerebrais. Altas concentrações extracelulares de glutamato ocorrem em decorrência a um episódio isquêmico devido ao bloqueio da captação de glutamato, assim como ao aumento na sua liberação e a uma reversão de seus transportadores. A manutenção de seus níveis abaixo dos neurotóxicos é realizada por transportadores de alta afinidade dependentes de sódio, principalmente nos astrócitos. Modelos de isquemia in vitro e in vivo foram utilizados nos trabalhos que compõem esta tese. No primeiro capítulo, usamos um modelo de privação de oxigênio e glicose (POG) em fatias de hipocampo de ratos jovens e adultos. A POG diminuiu a captação de glutamato em todos os tempos de reperfusão estudados em ambas as idades, sendo essa diminuição menos pronunciada em animais jovens. Fatias de hipocampo de animais adultos parecem ser mais resistentes ao insulto que as provenientes de animais jovens, visto que o dano celular se dá primeiramente nestes. A guanosina (GUO) foi capaz de evitar a queda da captação somente em animais jovens 3hs após a POG e também foi capaz de reduzir o dano celular em ambas as idades. A padronização da metodologia da captação de glutamato em cultura organotípica de fatias de hipocampo foi montada a fim de estudar alterações neste parâmetro após a POG. Nesse modelo, há um aumento da captação após 1h de reperfusão e uma queda após 24hs. A morte celular medida, pela incorporação de iodeto de propídio, foi significativa a partir das 13hs e há uma queda nos níveis de GLT-1 24hs pós-POG. A GUO protegeu parcialmente a morte induzida pela POG, mas não foi capaz de reverter a queda da captação de glutamato 24hs pós-insulto. O modelo in vivo de isquemia utilizado foi a hipóxia-isquemia (HI) neonatal. Houve um aumento da captação de glutamato 24hs pós-insulto no hemisfério ipsilateral e uma queda significativa 72hs após nos dois hemisférios. Alterações de GFAP e S100B foram analisadas. Houve um aumento dos níveis de GFAP dependente de idade nos três tempos estudados e nas duas estruturas. Nos animais submetidos à HI, o aumento de GFAP foi significativamente maior no hemisfério ipsilateral e esse foi diferente de seu respectivo controle 48 e 72hs após o insulto. Houve um aumento nos níveis de S100B dependente de idade no córtex, sem diferença entre o grupo controle e o HI. No hipocampo ipsilateral, observamos um aumento de S100B dependente de tempo no grupo HI e HI-GUO, mas somente o grupo HI-GUO foi diferente de seu controle 48 e 72hs após o insulto. A GUO não teve nenhum efeito sobre a captação de glutamato em córtex, sobre os níveis de GFAP em ambas as estruturas e sobre a S100B em córtex. O APDC, um potente agonista de receptor metabotrópico de grupo II, foi testado no modelo in vitro de POG com fatias de hipocampo. Ele foi capaz de evitar, parcialmente, a queda da captação de glutamato e esse efeito foi inibido por APICA, um antagonista de grupo II. Esses dados são preliminares e necessitam de maiores estudos. Podemos concluir que quando se usam diferentes modelos experimentais, tanto in vitro quanto in vivo, estes podem nos fornecer dados distintos sobre um mesmo parâmetro ou uma mesma droga em estudo e, mesmo assim, são importantes, pois cada modelo pode representar uma situação completamente diferente da outra. / Cerebral ischemia is the third leading cause of death in the industrialized countries being the major cause of morbidity and mortality in middle and later life. The reduction in the supply of glucose and oxygen to the brain that occurs in cerebral ischemia leads to a complex cascade of cellular events, resulting in neuronal degeneration and, consequently, in loss of brain functions. It has been shown that stroke and ischemia increase the extracellular glutamate levels due to impairment of glutamate uptake, as well as an increase in glutamate release and reversal of glutamate transporters. The maintenance of extracellular glutamate below neurotoxic levels is an essential role for glial cells and this is achieved through high affinity sodium-dependent glutamate transporters present mainly in astrocytes. Ischemic models in vitro and in vivo were used in this work. In the first chapter, we used a model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in hippocampal slices of young and adult rats. OGD decreased glutamate uptake in all reperfusion times and in both ages studied, being this decrease less pronounced in young rats. Hippocampal slices of adult animals seemed to be more resistant to OGD than youngs, since cell damage was first seen in young. Guanosine (GUO) was able to avoid the decrease in glutamate uptake only in young animals 3h after OGD e also to reduce cell damage in both ages. To study glutamate uptake alterations after OGD in organotypic culture of hippocampal slices, we first standardized this method. There is an increase in glutamate uptake after 1h of reperfusion and a decrease 24h later. Cell death was measured by propidium iodide incorporation and it was significative increased from 13h. There is a decrease in GLT1 levels 24h after OGD. GUO was able in partially protect cells from death, but not able in recovering glutamate uptake decrease 24h after the insult. Neonatal hypoxia-ischemia (HI) was the in vivo model used here. There was an increase in glutamate uptake 24h after the insult in the ipsilateral hemisphere and a decrease 72h later in both hemispheres. GFAP and S100B alterations were also analyzed. There was an increase in GFAP levels dependent of age in all times studied and in both structures. In the HI group, the increase of GFAP was significatively higher in the ipsilateral hemisphere and this was different from its control 48 and 72h after the insult. There was an increase in S100B levels dependent of age in cortex, without difference between control and HI group. In the ipsilateral hippocampus, there was an increase of S100B dependent of time in HI and HI-GUO group, but only HI-GUO was different from its control 48 and 72h after the insult. GUO had no effect over glutamate uptake in cortex, GFAP levels in both structures, and S100B in córtex. APDC, a potent agonist of methabotropic receptors of grup II, was tested in the same OGD model used in the first chapter. APDC was able in partially avoid glutamate decrease induced by OGD in hippocampal slices, and this effect was abolished by APICA, a group II antagonist. These results are preliminary and deserve more study. We could conclude that when different experimental models are used, as in vitro or in vivo, these could give us distinct date about the same parameter or about the same drug in study, and even that happens, they are very important since each model might represent a complete different situation.

Nanopartículas de polímeros biodegradáveis têm atraído um intenso interesse nos últimos anos, pois esses sistemas podem prover vetorização de forma sustentada, controlada e atuar como carreadores de fármacos aumentando a eficácia terapêutica e diminuindo os efeitos adversos. Doenças degenerativas do sistema nervoso central têm sido vistas como um problema pela complexa patogênese e pela dificuldade na vetorização de fármacos. Dentre essas, estão os gliomas e os insultos isquêmicos, os quais são pobremente responsivos às intervenções terapêuticas. Atualmente, o tratamento com indometacina em doenças inflamatórias tem sido relacionado com diversos efeitos adversos gastrointestinais. Neste contexto, o presente estudo avaliou os efeitos do tratamento com indometacina em nanocápsulas em modelos experimentais de gliomas, isquemia cerebral, inflamações aguda e crônica em ratos. O tratamento com indometacina em nanocápsulas foi mais potente do que indometacina em solução em diminuir a viabilidade e a proliferação celular de linhagens de gliomas. Esse efeito citotóxico foi seletivo para as células tumorais. Adicionalmente, nós observamos em um modelo in vivo de gliomas que nanocápsulas poliméricas foram capazes de vetorizar a indometacina ao cérebro. Essa vetorização reduziu o crescimento de glioblastoma e aumentou a sobrevida dos animais. Estes efeitos foram mediados, pelo menos em parte, por mecanismos antiproliferativos e anti-angiogêncos. Além disso, o tratamento com indometacina em nanocápsulas apresentou efeitos neuroprotetores em culturas organotípicas de hipocampo expostas à privação de oxigênio e glicose. Esses efeitos foram mediados pela redução dos níveis de fosforilação de ERK1/2 e JNK, redução na iNOS e na ativação glial. Adicionalmente, a indometacina em nanocápsulas reduziu os níveis de citocinas pró-inflamatórias, sugerindo que o bloqueio da neuroinflamação está envolvido no efeito neuroprotetor observado. Em modelos de inflamação crônica em ratos (modelo de artrite), o tratamento sistêmico com indometacina em nanocápsulas produziu simultaneamente uma redução nos níveis de citocinas pró-inflamatórias e um aumento da citocina anti-inflamatória IL- 10. A maior eficácia anti-inflamatória foi associada a uma redução da toxicidade gastrointestinal. Juntos, nossos resultados sugerem que a indometacina em nanocápsulas pode ser considerada uma alternativa terapêutica promissora para o tratamento de gliomas, de isquemia cerebral e de inflamação crônica. / Nanoparticles of biodegradable polymers have attracted intensive interest in recent years because these systems can provide a sustained, controlled, and targeted delivery acting as drug carriers thus leading to high therapeutic efficiency and low side effects. Degenerative diseases of the central nervous system have long been viewed as a problem due to the complex pathogenesis of these disorders and the difficulty in drug delivery. Among these diseases, are the gliomas and the ischemic insults, which are poorly responsive to therapeutic interventions. Actually, indomethacin treatments for inflammatory diseases are related with several gastrointestinal side effects. Within this context, the present study was designed to evaluate the effects of indomethacin-loaded nanocapsules treatment in experimental models of gliomas, cerebral ischemia, acute and chronic inflammation in rats. Indomethacin-loaded nanocapsules treatment was more potent that indomethacin in solution in decreasing the viability and the cell proliferation of glioma lines. This cytotoxic effect was selective for tumoral cells. In addition, we have observed in an in vivo model of gliomas that polymeric nanocapsules are able to successfully carry indomethacin into the brain tumor. Local delivery of indomethacin reduced glioblastoma growth and improved the animals' survival. These effects were mediated, at least in part, by antiproliferative and antiangiogenic mechanisms of indomethacin-loaded nanocapsules. Also, indomethacin-loaded nanocapsules treatment presented neuroprotective effects in organotypic hippocampal cultures exposed to oxygen-glucose deprivation. These effects were mediated by the reduction in the levels of ERK1/2 and JNK phosphorylation, reduction in iNOS and glial activation. Additionally, indomethacin-loaded nanocapsules decreased the levels of the pro-inflammatory cytokines, suggesting that the blockage of neuroinflammation is involved in the neuroprotective effect observed. In models of chronic inflammatory in rats (arthritis model), the systemic treatment with indomethacin loaded nanocapsules produced simultaneity a reduction of the levels of pro-inflammatory cytokines and an increased in the levels of anti-inflammatory cytokine IL-10. The antiinflammatory efficacy increase was allied to an improved gastrointestinal safety. Taken together, our results imply that nanocapsule formulations containing indomethacin might be considered as promising alternative therapeutic for gliomas, cerebral ischemia and chronic inflammation treatment.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Educação Física, Programa de Pós-Graduação em Educação Física, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-13T19:52:48Z No. of bitstreams: 1 2017_IanCaetanoQuadrado.pdf: 5414529 bytes, checksum: 54a547817ff161fc1b5d37eec35217da (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-21T18:26:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_IanCaetanoQuadrado.pdf: 5414529 bytes, checksum: 54a547817ff161fc1b5d37eec35217da (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T18:26:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_IanCaetanoQuadrado.pdf: 5414529 bytes, checksum: 54a547817ff161fc1b5d37eec35217da (MD5) Previous issue date: 2018-02-20 / O objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos do pré-condicionamento isquêmico remoto em membro inferior na excitabilidade reflexa de adultos sedentários. O Pré-Condicionamento Isquêmico Remoto nos Membros (PCIR - Remote Limb Ischemic Conditioning) apresenta alguns efeitos benéficos relacionados, principalmente, à melhor recuperação de novos eventos isquêmicos. Recentemente, foi relatada melhora no equilíbrio em adultos saudáveis após PCIR do membro superior, sugerindo a ocorrência de adaptações no sistema nervoso. Não se sabe definitivamente como o PCIR induz essas adaptações, mas acredita-se que possam ocorrer na medula espinhal. Foi estudada neste projeto a modulação do reflexo-H do músculo sóleo (SO) por meio de parâmetros extraídos da alça ascendente da Curva de Recrutamento (CR) do reflexo H no repouso, e durante contração voluntária isométrica (Curva de Recrutamento Com Contração - CRCC), além de dois mecanismos pré-sinápticos: Inibição Pré-Sináptica (IPS) e Depressão Pós-Ativação (DPA). Os parâmetros fisiológicos associados às CRs e às inibições foram analisados antes e após um protocolo de PCIR. Para confirmação do efeito da melhora no equilíbrio pós-PCIR, foi realizado um experimento para obter a variação do centro de pressão (CP) com os sujeitos em uma condição desafiadora (sobre uma espuma de alta densidade). Na primeira semana de testes foi realizado um PCIR placebo (SHAM). Na segunda semana o PCIR consistiu na intervenção real (INT). No início e no fim de cada semana, os testes para obter CR, CRCC, IPS, DPA e CP foram realizados, além de um encontro na semana seguinte, ao fim do protocolo INT (terceira semana) para realização dos mesmos testes em apenas um dia (“follow-up” - FU). Foram encontradas alterações em um dos parâmetros da CR, associadas às unidades de diâmetro maior, mas não foram detectadas diferenças nos parâmetros associados aos mecanismos pré-sinápticos (IPS e DPA), o que mantém aberta a discussão sobre qual mecanismo neurofisiológico altera o padrão de recrutamento de unidades motoras após o PCIR. Foi verificado que o PCIR na coxa induz melhora no equilíbrio postural, ou seja, houve diminuição nas componentes de alta frequência do CP no sentido médio-lateral. Finalmente, foi constatado que os efeitos psicológicos (placebo) induzem alterações neurofisiológicas que podem estar associadas à melhora no controle da postura, mas apenas os efeitos fisiológicos persistiram por vários dias após o último condicionamento. É possível que mecanismos medulares que medeiam efeitos pós-sinápticos estejam envolvidos nas adaptações neurofisiológicas observadas. / The aim of the present project is to evaluate the effects of remote ischemic preconditioning in the leg on spinal cord excitability of sedentary adults. Remote Limb Ischemic Conditioning (PCIR) shows some beneficial effects, such as improvement of the recovery from new ischemic events. Recently, it has been reported that balance in healthy adults was improved after upper limb PCIR, suggesting the occurrence of neuronal adaptations. However, it is still unknown how PCIR induces these adaptations. We hypothesized that some of these adaptations occur within the spinal cord. In this project, we studied the modulation of reflex pathway of the soleus muscle (SO) by analyzing the ascending phase of the Recruitment Curve (CR) of the H-reflex at rest and voluntary isometric contraction (Recruitment Curve With Contraction - CRCC). In addition, two presynaptic mechanisms: Pre-Synaptic Inhibition (IPS) and Post-Activation Depression (DPA) have been investigated. The electrophysiological parameters obtained from these four procedures were analyzed before and after PCIR. The center of pressure (CP) was measured in a challenging condition to assess whether there was improvement in balance. Fifteen adult subjects without neurological and / or orthopedic lesions were selected. Subjects underwent a placebo PCIR (SHAM) procedure in the first week, and in the second week a real PCIR (INT). At the beginning and end of each week, the CR, CRCC, IPS, DPA and CP tests were performed. In the middle of the following week, after the end of the INT protocol (third week), the same tests were performed. Significant differences were found in one CR parameter (H @ 100), but no difference was detected for the presynaptic parameters (IPS and DPA). These results leave open the question of which mechanisms are influencing the recruitment pattern of the motor units. PCIR in the thigh influence the reflex responses besides improving balance through the mid-lateral variation of CP. Finally, it was found that psychological (placebo) effects leads to a neurophysiological effects that may be associated with improved posture control, but only the physiological effects persisted for several days after the last conditioning. It is possible that spinal mechanisms that mediate post-synaptic effects are involved in the neurophysiological adaptations.