With more than 12 million people affected worldwide, 2 million new cases occurring per year, and the rapid emergence of drug resistance and treatment failure, leishmaniasis is an infectious disease for which research on drug and vaccine development, hostpathogen, and vector-parasite interactions are current international priorities. Polyamines are important regulators of growth and differentiation in a variety of cells, including parasitic protozoa. The inhibition of parasitic biosynthesis by polyamines has been an interesting chemotherapeutic approach in the design of novel antiparasitic drugs against mainly leishmaniasis. In this work we evaluate the in vitro effect of N-dodecyl- 1,2-ethanediamine (GUT) on morphology and replication of Leishmania. A concentration of 0.31 μg/ml of this compound was highly effective against Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi and no toxicity against mammalian cell lines as well HFF, THP-1, J774.G8 or murine peritoneal cells was observed. So, there was inhibition of multiplication of the L. amazonensis, L. braziliensis and L. chagasi amastigotes into inflammatory peritoneal cells in presence of 1 μg/ml and 0.5 μg/ml of this compound. Promastigotes form of L. amazoneneis it was with intracellular disorganization by transmission electron microscope observation following 1 to 24 h of treatment with GUT. Thus, N-dodecyl-1,2-ethanediamine shown be a promising drug against Leishmania. / Leishmaniose é uma doença infecciosa que afeta mais de 12 milhões de pessoas em todo mundo. Com mais de 2 milhões de novos casos por ano e falhas no tratamento há o surgimento de resistência às drogas. Como prioridades são realizadas pesquisas relacionadas ao ciclo de vida do parasito, interação com o hospedeiro, desenvolvimento de vacinas e novas drogas. A inibição da biossíntese do parasito por poliaminas tem sido uma importante abordagem quimioterápica no desenvolvimento de novas drogas contra leishmaniose. As poliaminas são importantes reguladores do crescimento e diferenciação em vários tipos celulares incluindo protozoários. Nesse trabalho avaliamos in vitro o efeito do composto N-dodecil-1,2- etanodiamina (GUT) na susceptibilidade de diferentes espécies de Leishmania sp. A concentração de 0,31 μg/ml foi altamente eficiente contra Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis e Leishmania chagasi, entretanto em diferentes células de mamíferos (THP-1, HFF, macrófagos murinos J774.G8 e macrófagos peritoneais de camundongos) a mesma citoxicidade não foi observada. A inibição nos índices de multiplicação e infecção de amastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis e L. chagasi em macrófagos peritoneais foi observada na presença das concentrações de 1Ug/ml e 0,5Ug/ml de (GUT). Formas promastigotas de L. amazonensis mostraram diversas alterações ultraestruturais por microscopia eletrônica de transmissão causada pelo tratamento com o composto Ndodecil- 1,2- etanodiamina. O composto N-dodecil-1,2- etanodiamina mostrou ser um novo composto promissor contra a leishmaniose. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Orientador: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Flavia de Rezende Eugênio / Banca: Alexandre Pinto Ribeiro / Resumo: A leishmaniose visceral (LV) canina caracteriza-se por uma enorme variabilidade de manifestações clínicas, dentre elas, lesões dermatológicas e oculares. Poucos são os estudos com as alterações do segmento posterior de olhos de cães acometidos pela doença, devido, principalmente, à opacidade do segmento anterior. O objetivo do trabalho foi avaliar e descrever as principais alterações fundoscópicas e eletrorretinográficas observadas em cães naturalmente acometidos por LV, antes e após o tratamento com a miltefosina. Foram selecionados oito cães, que não apresentavam outras doenças infecciosas ou vasculares, e apresentassem meios oculares transparentes. Utilizaram-se registros fotográficos do segmento posterior e a avaliação da funcionalidade da retina através da eletrorretinografia (ERG). Os achados de fundoscopia incluíram atenuação vascular, hiperrefletividade, pigmentação retiniana, embainhamento vascular, hiperpigmentação peripapilar, hemorragia sub-retiniana, turbidez vítrea, papiledema e tortuosidade vascular. Todos os animais se beneficiaram clinicamente da terapêutica medicamentosa, não sendo mais encontradas hemorragia sub-retiniana e turbidez vítrea após tratamento, e somente um animal permanecia com a lesão de embainhamento vascular. A avaliação dos registros de ERG mostrou diminuição da amplitude de onda "b" nas respostas de bastonetes e máxima resposta entre os momentos. Conclui-se que a LV promove alterações no fundo de olhos de cães antes mesmo da ocorrência de ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) canine is characterized by a huge variability of clinical manifestations, among them skin and eye damage. Few studies of the changes of the posterior segment of an eye of dogs affected by the disease, mainly due to the opacity of the anterior segment. The objective was to assess and describe the main fundus and ERG changes observed in dogs naturally affected by LV before and after treatment with miltefosine. Eight dogs were selected which showed no vascular or other infectious diseases, and to produce clear ocular media. They used photographic records of the posterior segment and evaluation of retinal function by electroretinography. The findings included fundus vascular attenuation, increased reflective, retinal pigmentation, vascular sheathing, peripapillary hyperpigmentation, subretinal hemorrhage, atrophy of the optic disk, vitreous turbidity, papilledema, vascular tortuosity. All animals were clinically benefit of drug treatment, no longer found bleeding subretinal and vitreous turbidity after treatment, only one animal was to vascular sheathing. The evaluation of the ERG records showed decreased amplitude wave "b" in the responses of rods and maximum response between times. It concludes that the LV promotes changes in the dog's eyes background even before the occurrence of visual loss and miltefosine is effective in treating the disease, but provided few changes of fundus findings and ERG. / Mestre

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:02:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:38:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-26T13:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-09-18 / Leishmaniasis are a group of endemic diseases in 98 countries, with an estimated incidence up to 1.6 million cases per year (0.7-1.2 million of cutaneous leishmaniasis and 0.2 to 0.4 million visceral leishmaniasis). The criteria for the cure of american tegumentary leishmaniasis adopted nowadays is the complete healing of the lesion. IgG3 subclass anti-leishmania antibodies decrease faster than the total IgG antibodies in cured patients. This study was aimed to identify differences in the recognition pattern of L. (V.) braziliensis protein by total IgG or IgG3 antibodies obtained from cutaneous leishmaniasis infected patients’ serum before and after treatment. Sera of 15 patients infected with L. braziliensis attended at the Tropical Diseases Hospital Anuar Auadi were tested by ELISA against crude extracts of L. braziliensis. When all patients were analyzed, it was observed that anti-leishmania IgG3 absorbance levels measured by ELISA were similar to the controls levels at 6 month. The absorbance levels of total antibodies in control and infected patients reached similarity only at 12/18 months. After split patients into group A: healing of the lesion before one month and B: healing of the lesion after one month, it was observed that absorbance levels in ELISA for IgG3 in group A was similar to the controls levels at the time of diagnosis. It was also observed, by Western Blotting, that the IgG3 reactivity of IgG3 to 49 kDa protein waspresent mainly for group B patients. The 28 kDa protein showed IgG3 reactivity mainly in group B the healing os lesions and the 14 kDa protein showed IgG3 reactivity in some controls our data suggest that the use of 49 kDa protein in ELISA may be useful for diagnosis and following up of patients and the 14kDa protein may be important in false-positive results. / As leishmanioses constituem um grupo de doenças endêmicas em 98 países, com uma incidência estimada de até 1,6 milhões de casos por ano (0,7-1,2 milhão de leishmaniose tegumentar e 0,2 a0,4 milhão de leishmaniose visceral). O critério de cura da leishmaniose tegumentar americana adotado hoje é a cura completa da lesão. Anticorpos anti-Leishmania da subclasse IgG3 decaem mais rapidamente que os anticorpos IgG totais em pacientes curados. O presente trabalho tem objetivo de identificar diferenças no reconhecimento de proteínas de L. (V.) braziliensis por anticorpos IgG totais ou IgG3 obtidos de soro de pacientes com leishmaniose tegumentar americana antes e após o tratamento. Soros de 15 pacientes infectados com L. braziliensis atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad foram testados por ELISA contra extratos brutos de L. braziliensis. Quando analisados todos os pacientes, foi possível observar que as absorbâncias no ELISA para a subclasse IgG3 anti-Leishmania ficou semelhante aos controles com 6 meses, o que só aconteceu para anticorpos totais com 12/18 meses. Com a separação dos pacientes em A: pacientes com cura clínica antes de um mês e grupo B: pacientes com cura clínica após um mês, observou-se que as absorbâncias no ELISA para IgG3 no grupo A era semelhante à dos controles no momento do diagnóstico. Identificamos, pelo Western Blotting, que a reatividade à proteína de 49 kDa pela IgG3 de pacientes era presente principalmente no grupo B. A proteína de 28 kDa reagiu com IgG3 de pacientes do grupo B antes da cura clínica e a proteína de 14 kDa reagiu com IgG3 de três soros controles. Nossos dados sugerem que a proteína de 49 kDa pode ser usada em ELISA para o diagnóstico e acompanhamento dos pacientes portadores de LTA e que a proteína de 14kDa pode ser responsável por reações falso positivas.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-28T13:21:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_Amanda Aliança_digital.pdf: 2689265 bytes, checksum: 0b25cf703fd666da539c3034a8c40823 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T13:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_Amanda Aliança_digital.pdf: 2689265 bytes, checksum: 0b25cf703fd666da539c3034a8c40823 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / CAPEs / A leishmaniose é uma doença infecciosa, não contagiosa de caráter zoonótico, causada por vários tipos de protozoários do gênero Leishmania. Em humanos, a doença apresenta três principais formas clínicas, dependendo das espécies envolvidas de Leishmania: a cutânea, mucocutânea e visceral (LV), sendo esta última a forma mais grave que quando não tratada pode evoluir para óbito em mais de 90% dos casos. O agente etiológico da LV compreende Leishmania donovani na Índia e leste da África; Leishmania infantum na China, Ásia central, Europa, África, América do Sul e Central. Calcula-se que a prevalência mundial de leishmaniose esteja em torno de 12 milhões de pessoas, acometendo 80 países e com uma estimativa de 400.000 novos casos da doença por ano. O tratamento atual para a leishmaniose é baseado na utilização de antimoniais pentavalentes como o estibogluconato de sódio (Pentostan®) e o antimoniato de meglumina (Glucantime®), este apresenta várias dificuldades como toxicidade, via de administração intravenosa e tempo prolongado de tratamento, que levam a sua descontinuação. Diante deste cenário, os compostos sintéticos são de grande importância na terapêutica por representarem 85% dos fármacos disponíveis. As ftalimidas e os tiazóis são importantes classes de compostos sintéticos e apresentam amplo espectro de atividades biológicas, como ansiolítica, anti-Parkinson, anti-Alzheimer, analgésica, anti-inflamatória, imunomoduladora e antibacteriana. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade in vitro frente a L. infantum e a células de mamíferos de uma série de 15 derivados ftalimido-tiazóis. Os compostos foram avaliados frente a formas promastigotas e amastigotas de L. infantum, quanto à citotoxicidade frente a células vero, macrófagos J774 e macrófagos peritoneais, a produção de óxido nítrico e alterações sobre alvos intracelulares do parasito. Os resultados mostram que os compostos oriundos da hibridação da ftalimida com 1,3 tiazol apresentaram atividade leishmanicida contra formas promastigota de L. infantum, baixa citotoxicidade às células de mamíferos testadas e aumentaram a produção de ON em relação às células controles nos macrófagos não infectados. Os compostos 2j e 2m se mostraram como os mais potentes contra as formas promastigotas da série testada, estes foram testados frente as formas amastigotas, os compostos reduziram a sobrevivência de amastigotas intracelulares e apresentaram baixa citotoxicidade para os macrófagos peritoneais. Formas promastigotas tratadas com esses compostos apresentaram alterações ultraestruturais como: encolhimento do corpo celular, perda da integridade da membrana celular, vacuolização do citoplasma, perfis de membranas circundando organelas e inchaço da mitocôndria. Quando avaliada a marcação pelo iodeto de propídio e pela rodamina 123, formas promastigotas tratadas com os compostos 2j e 2m apresentaram aumento no número de células marcadas com o iodeto de propídio e induziram alterações significativas no potencial de membrana mitocondrial. Dessa maneira, os compostos ftalimido-tiazóis apresentam atividades leishmanicida e devem formar a base para futuros estudos experimentais. / Leishmaniasis is an infectious disease, non-contagious with zoonotic characteristic, caused by several types of protozoa of the genus Leishmania. In humans, the disease has three main clinical forms, depending on the species of Leishmania involved: cutaneous, mucocutaneous and visceral, the latter being the more severe if left untreated can lead to death in more than 90% of cases. The etiologic agent of LV comprises Leishmania donovani in India and East Africa; Leishmania infantum in China, Central Asia, Europe, Africa, South and Central America. It is estimated that the worldwide prevalence of leishmaniasis is around 12 million people in 80 countries and 400,000 new cases per year. The current treatment for leishmaniasis is based on the use of pentavalent antimonials such as stibogluconate sodium (Pentostan®) and meglumine antimonate (Glucantime®), this presents several problems such as difficulties such as toxicity, intravenous route of administration and prolonged treatment, which leads to its discontinuation of the treatment. The phthalimides and thiazoles are important classes of synthetic compounds and have a broad spectrum of biological activities such as anxiolytic, anti-Parkinsons, anti-Alzheimer, analgesic, antiinflammatory, immunomodulating and antibacterial. This study aimed to evaluate the in vitro activity against L. infantum and mammalian cells in a series of 15-phthalimido thiazoles derivatives. The present work report the in vitro activity of a phthalimido-thiazoles derivatives series. The activities were evaluated against promastigotes and amastigotes of Leishmania infantum, front of cytotoxicity to vero cells, J774 macrophages and peritoneal macrophages, the effect on production of nitric oxide (NO) and changes of intracellular targets on the parasite. The results show that the compounds arising from the hybridization of phthalimido 1, 3 thiazole showed leishmanicidal activity against promastigotes forms of L. infantum, low cytotoxicity to mammalian cells and increased the NO production compared to control cells in uninfected macrophages. The compounds 2j and 2m are shown as the most potent against promastigotes of the test series, these were tested against amastigote forms, the compounds reduced the survival of intracellular amastigotes and showed low cytotoxicity peritoneal macrophages. The promastigotes treated with these compounds exhibited ultrastructural changes such as cell body shrinkage, loss of cell membrane integrity, vacuolization of the cytoplasm membranes surrounding organelles profiles and swelling of mitochondria. The compounds 2j and 2m were the most potent of the series tested and the parasites treated with these compounds showed ultrastructural changes such as cell body shrinkage, loss of cellular membrane integrity, vacuolization of cytoplasm, membrane profiles surrounding organelles and swelling of mitochondria. When assessed by propidium iodide tag and the rhodamine 123 promastigotes treated with the compounds 2j and 2m showed an increase in the number of cells stained with propidium iodide and induced significant changes in mitochondrial membrane potential. Thus, the phthalimido-thiazoles compounds have leishmanicide activities and should form the basis for future experimental studies.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-05T15:35:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiane V. Soares.pdf: 2842986 bytes, checksum: f65acb16091242753d91f534b2d8d8f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-05T15:35:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiane V. Soares.pdf: 2842986 bytes, checksum: f65acb16091242753d91f534b2d8d8f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-05T15:36:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiane V. Soares.pdf: 2842986 bytes, checksum: f65acb16091242753d91f534b2d8d8f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-05T15:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiane V. Soares.pdf: 2842986 bytes, checksum: f65acb16091242753d91f534b2d8d8f4 (MD5) Previous issue date: 2012-04-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) is a public health problem worldwide. It is widely distributed in Brazil and the Amazonas population is among the states most affected by the disease in the country. This study aimed to investigate the epidemiological and entomological leishmaniasis in the municipality of Tabatinga, Amazonas state. The city is situated on the left margin of the Solimões River, the border region to Colombia and Peru. We conducted a retrospective study (seven years), human cases of cutaneous leishmaniasis reported in the city, from data supplied by the Municipal Health Tabatinga and fauna survey of sand flies in August 2010 and 2011. Sandfly collections were carried out on the road from the National Institute of Colonization and Agrarian Reform - INCRA, Geodesy II, between km 4 and 8, using light traps (CDC) and aspiration in base tree with modified CDC. For statistical analysis we used the abundance index of species (ISA), standardized index of abundance of species (SISA), Index of Shannon-Wiener diversity (H ') and evenness index (J'). Have been reported 41 autochthonous cases of ACL in Tabatinga, where 61.7% were male, aged 30-39 years (24.4%) and farmers (21.9%). The predominant clinical form was cutaneous. We collected 5741 specimens representing 35 species of the genus Lutzomyia, both captured in the sylvatic and peridomiliciar environment. The most abundant species was L. umbratilis (SISA = 1.000). Of this total, 13 species are considered vectors or potential vectors of Leishmania and/or other trypanosomatids. Of the 44 positive samples, 10 were isolated / maintained in culture, eight from L. umbratilis and two L. dendrophyla. Isozyme analysis of these isolates showed similar profiles to Leishmania colombiensis and Endotrypanum sp., however, the profile of MDH locus showed greater similarity to the genus Endotrypanum. It made the report of the occurrence of two new species of sand flies in the Amazonas State (Lutzomyia howardi) and Brazil (Lutzomyia witoto). These are the first information on the phlebotomine fauna in the municipality of Tabatinga and expanding knowledge of the distribution, diversity and natural infection of trypanosomatids in the state of Amazonas / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é um problema de Saúde Pública mundial. É amplamente distribuída no Brasil e a população amazonense encontra-se entre os estados mais acometidos pela doença no país. Este estudo teve como objetivo averiguar os aspectos epidemiológicos e entomológicos da LTA no município de Tabatinga, Estado do Amazonas. O município está situado à margem esquerda do rio Solimões, região fronteiriça à Colômbia e ao Peru. Foi realizado um estudo retrospectivo (últimos sete anos) dos casos humanos de leishmaniose cutânea notificados no município, a partir dos dados fornecidos pela Secretaria Municipal de Saúde de Tabatinga e o levantamento da fauna de flebotomíneos em agosto de 2010 e 2011. As coletas de flebotomíneos foram realizadas na Estrada do Instituto Nacional de Colonização e Reforma Agrária - INCRA, Geodésica II, entre os km 4 e 8, utilizando-se armadilhas luminosas (CDC) e aspiração em base de árvore com CDC modificada. Para análise estatística foram utilizados o Índíce de Abundância de Espécies (IAE), Índíce Padronizado de Abundância de Espécies (IPAE), Índice de Diversidade Shannon-Wiener (H’) e Índice de eqüitabilidade (J’). Foram notificados 41 casos autóctones de LTA em Tabatinga, onde 61,7% eram do sexo masculino, com faixa etária de 30 a 39 anos (24,4%) e agricultores (21,9%). A forma clínica predominantemente foi cutânea. Foram coletados 5.741 espécimens, correspondente a 35 espécies do gênero Lutzomyia, capturados tanto em ambiente silvestre quanto peridomiliciar. A espécie mais abundante foi L. umbratilis (IPAE= 1.000). Deste total, 13 espécies são consideradas transmissoras ou vetores potenciais de Leishmania e/ou outros tripanosomatídeos. Das 44 amostras positivas, 10 foram isoladas/mantidas em cultivo, sendo oito de L. umbratilis e duas de L. dendrophyla. Análise isoenzimática desses isolados, demonstrou perfis similares a Leishmania colombiensis e Endotrypanum sp., no entanto, o perfil do locus MDH demonstrou maior similaridade para o gênero Endotrypanum. Foi feito o relato da ocorrência de duas novas espécies de flebótomos no Amazonas (Lutzomyia howardi) e no Brasil (Lutzomyia witoto). Os resultados deste trabalho referem-se à primeira informação sobre a fauna de flebotomíneos no município de Tabatinga, ampliando o conhecimento da distribuição, diversidade e infecção natural por tripanosomatídeos no Estado do Amazonas.

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada, no Brasil, pelo protozoário Leishmania infantum. A resistência à LV é relacionada ao desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente. Para isso, células dendríticas (DCs) reconhecem produtos antigênicos do parasito, através dos Toll-like Receptors (TLRs), e, após ativação, produzem fatores, que irão orquestrar o recrutamento celular e desenvolvimento da resposta imune protetora. Dentre os vários TLRs, tem sido demonstrado que o TLR9 está relacionado com a resistência à infecção em modelo de leishmaniose cutânea. No presente estudo, nosso objetivo foi determinar o papel do TLR9 durante a infecção por L. infantum. Nossos resultados demonstram que a expressão de TLR9 é modulada positivamente durante a infecção in vivo e in vitro pela L. infantum. O TLR9 é essencial para o controle da infecção contra L. infantum, uma vez que camundongos TLR9-/- são mais susceptíveis à infecção, apresentando maior número de parasitos no baço e fígado na 4ª e 6ª semana pós-infecção. A fenotipagem de leucócitos presente no baço demonstrou que camundongos TLR9-/- possuem menor número de neutrófilos. De maneira semelhante, a análise imuno-histoquímica mostrou uma reduzida marcação de células 7/4+ (específica para neutrófilos) no fígado de animais TLR9-/-. A falha na migração de neutrófilos observada em animais TLR9-/- não está associada a uma incapacidade de ativação dos polimorfonucleares, mas sim a deficiências na produção de fatores quimiotáticos, como CXCL1 (KC) e CXCL2 (MIP-2) nos órgãos-alvo. Investigando o mecanismo de ação, as células dendríticas oriundas de animais TLR9-/- falham em seu processo de ativação frente à infecção in vitro e in vivo com L. infantum, apresentando um fenótipo semi-maduro, com redução de expressão de MHC-II e moléculas coestimuladoras. Interessante que essas células apresentaram deficiência na produção de mediadores quimiotáticos de neutrófilos como KC e MIP-2, e consequentemente, induzindo o menor recrutamento de neutrófilos in vitro. Em conjunto, nossos resultados demonstram que o TLR9 é essencial para o controle da infecção por L. infantum, através de um mecanismo dependente do recrutamento de neutrófilos para o sítio inflamatório mediado pela ativação apropriada de fatores quimiotáticos de neutrófilos pelas DCs. / Visceral leishmaniasis (VL) is a chronic and potentially fatal disease caused by protozoan Leishmania infantum, in Brazil. The resistance against VL is related to the development of cellular immune response. During infection, the dendritic cells (DCs) recognize antigenic products through Toll-like Receptors (TLRs) and then orchestrate the cellular recruitment and immune response development. Among several TLRs, it has been showed that TLR9 is related to resistance to cutaneous leishmaniasis. In the present study, our aim was to determinate the role of TLR9 during L. infantum infection. Our results demonstrated that TLR9 is up regulated during in vitro and in vivo L. infantum infection. TLR9 is critical for protective immunity against L. infantum, since TLR9-/- mice infected were more susceptible to infection, displaying high amounts of parasites in spleen and liver, at 4th and 6th weeks post-infection. Phenotyping the leukocytes into the spleen, TLR9-/- mice presented reduced neutrophils when compared to WT. Likewise, imunohistochemistry analyses showed the reduced of 7/4+ cells (specific to neutrophils) staining into the TLR-9-/- liver. The failure of neutrophil migration is not associated to their stage of activation impaired, but due the reduced levels of CXCL1 (KC) and CXCL2 (MIP-2) (neutrophil chemoatracttant) produced into into the spleen cells culture from infected TLR9-/-. Furthermore, DCs from TLR9-/- presented a semi-mature stage during in vitro and in vivo L. infantum infection, showing reduced expression of MHC-II and co-stimulatory molecule. Interestingly, the ability of DC to produce the neutrophil chemotact mediators (KC and MIP-2) was completely reduced by that derived from TLR9-/- mice, affecting neutrophil migration into Boyden chamber. Altogether, we demonstrated that TLR9 presents a critical role in the protective response against L.infantu through the mechanism dependent of crosstalk between neutrophil recruitment and DC activation.

Orientador: Ingrid Menz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:49:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cutolo_AndreAntonio_D.pdf: 3489196 bytes, checksum: ba6ee219dca9c92ee1ef9d6f194ee0b4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A incidência das leishmanioses tegumentar (LTA) e visceral americanas (LVA) em hospedeiros caninos e humanos encontra-se em crescente expansão no Brasil. Para a vigilância epidemiológica dessas endemias, é fundamental o conhecimento da distribuição das diferentes espécies vetoras de flebotomíneos e, para a LVA, o conhecimento de parâmetros epidemiológicos como a prevalência, incidência, período de incubação e potencial de transmissibilidade de Leishmania infantum chagasi no cão, seu principal reservatório. Objetivou-se assim esclarecer alguns aspectos epidemiológicos das infecções caninas, incluindo-se levantamento entomológico no município de Monte Mor, situado na região centro-leste do estado de São Paulo, além da obtenção de parâmetros epidemiológicos da LVA por estudo longitudinal de 105 cães em área endêmica para a doença em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, por dois anos. Em Monte Mor, 319 amostras de soro canino foram avaliadas por ELISA e RIFI, sendo todas negativas para anticorpos anti-Leishmania, identificou-se sete espécies de flebotomíneos, com predomínio de Nyssomyia neivai (48,84%) considerada a principal transmissora do agente causador da LTA no interior paulista, além do diagnóstico de dois casos caninos de LTA, com sorologia reagente para ELISA FML e infecção por L. (Viannia) braziliensis. No estudo longitudinal dos 105 cães acompanhados por meio de avaliações clínicas, exames sorológicos (ELISA L. major-like, FML e S7) e parasitológicos diretos (esfregaços e PCR de aspirados de medula óssea e linfonodo e imunoistoquímica de pele) obteve-se prevalência sorológica inicial de 30,40% (145/477) no ELISA L. major-like e 26,28% (97/369) no ELISA FML. A prevalência da doença clínica (sintomáticos) foi de 7,13% (62/870), sendo que 24,53% (117/477) foram soropositivos no ELISA L. major-like, mas sem sintomas de leishmaniose visceral canina (LVC), demonstrando quantidade elevada de cães infectados assintomáticos na área. Ao final de 24 meses não se observou associação estatística significativa nas variáveis ambientais avaliadas no início do estudo e a ocorrência de casos de LVC, como a ocorrência prévia de LVA e/ou LVC no entorno ou na casa do proprietário, a existência de outras espécies animais na casa, o hábito intra ou peridomiciliar, o temperamento, a idade e o sexo do cão. A incidência de novas infecções variou de 11,76% (8/68), 11,76% (8/68) e 18,18% (12/66) respectivamente entre o Dia -30 e Zero, Dia Zero e Mês 12 por sorologia e Dia Zero e Mês 12 para os métodos diretos. A mortalidade natural e induzida via eutanásia de animais doentes e/ou infectados foi de 28,57% (30/105). O período de incubação médio foi de 6,46 meses. Alguns animais infectados com resultados positivos em prova diagnóstica de PCR e/ou prova de sorologia no início do estudo não apresentaram novos resultados positivos após 12 meses, indicando possível cura ou não estabelecimento da infecção. Observaram-se alguns animais com provas diretas positivas mostrando infecção assintomática por período de 24 meses. Obteve-se baixa prevalência de amastigotas em pele saudável, presente apenas em animais sintomáticos, enquanto que a ausência de amastigotas observada em cães portadores assintomáticos indica que os mesmos podem não ter papel importante na transmissão de parasitas ao flebotomíneo vetor / Abstract: Cutaneous (ACL) and visceral american leishmaniasis (AVL) incidences in human and canine hosts are increasing and expanding in Brazil. In order to perform an adequate vigilance of these diseases, the knowledge regarding distribution of different sandfly vector species is mandatory, besides of precising epidemiological parameters like prevalence, incidence, incubation period and potential of transmissibility in the dog, the main reservoir for the AVL etiologic agent. This way, the objectives of this study were to clarify some epidemiological aspects of canine leishmaniases, including entomological surveillance in the county of Monte Mor, central east region of São Paulo state and performance of a longitudinal study in an AVL endemic area located in Campo Grande, Mato Grosso do Sul state, including 105 dogs in order to evaluate epidemiological data during two years. In Monte Mor county, 319 sera samples were analysed through in house developed ELISA and IFA methods. No seropositive result was found, seven different sandfly species were identified, prevailing Nyssomyia neivai (48.84%) considered the main vector for the ACL etiologic agent in São Paulo state countryside, and two dogs were diagnosed with ACL symptoms, presenting seropositivity through ELISA FML and positive identification of L. (Viannia) braziliensis infection using PCR. The longitudinal study was performed using clinical examination, serology (ELISA L. major-like, FML and S7) and direct diagnostic techniques (bone marrow and lymph node smears and PCR and immunohistochemistry in skin tissues) on dogs. A seroprevalence of 30.40% (145/477) at ELISA L. major-like and 26.28% (97/369) at ELISA FML was obtained at the pre-initial phase. Clinical disease prevalence was 7.13% (62/870), and 24.53% (117/477) dogs were seropositive at ELISA L. major-like, but asymptomatic, showing the high amount of infected healthy carriers. At the end of the 24 months period no significant association was found between visceral leishmaniasis (VL) canine cases with environmental variables evaluated at Day Zero like previous registration of human or canine VL on the study house or neighborhood, other domestic animal species at the backyard, intra or peridomiciliar, aggressive behavior, age or sex of the study dog. Incidence of infections varied from 11.76% (8/68), 11.76% (8/68) e 18.18% (12/66) respectively between Day -30 and Zero, Day Zero and Month 12 using serology and Day Zero and Month 12 for direct diagnostic methods. Natural and induced mortality through euthanasia of sick/infected dogs was 28.57% (30/105). The mean disease incubation period was 6.46 months. Some of the infected animals with positive diagnosis at the beggining of the study had no other positive results after 12 months, indicating a possible cure or an absence of infection establishment, while others had positive diagnosis at the beginning and at month 12 with asymptomatic condition for more than 24 months. A low Leishmania amastigotes prevalence at healthy skin was obtained and positive results were observed only in symptomatic animals. Absence of parasites in skin of asymptomatic carriers may indicate they have no important role on the transmission of Leishmania to competent vectors / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

Orientador: Carlos Lenz Cesar / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pozzo_LilianadeYsasa_M.pdf: 4076293 bytes, checksum: 5197fda41d6fa440de56b82b104a4bcd (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Microorganismos unicelulares, como os demais seres vivos, necessitam interagir com o ambiente e procurar ativamente por alimentos. Seus orgãos sensoriais, entretanto, se limitam a sensores hidrodinâmicos e receptores bioquímicos de membrana. A quimiotaxia estuda a resposta de organismos unicelulares frente a gradientes de concentração de substâncias atratoras ou repulsoras. Essa resposta é parte essencial do processo de infecção por parasitas no direcionamento e reconhecimento das células a serem infectadas. Dessa forma, um estudo quantitativo da quimiotaxia de parasitas requer o monitoramento tanto dos movimentos do parasita quanto das intensidades, direção e sentido das forças que exerce na presença de gradientes de concentração das substâncias atratoras e repulsoras. Forças de microorganismos com dimensões da ordem de 10 µm são da ordem de pico-Newtons. A pinça óptica é a microferramenta ideal para esse tipo de estudo pelas seguintes razões: (1) tem sensibilidade para medir forças desde 20 femto-Newtons até 200 pico-Newtons, da mesma ordem de grandezas das forças geradas pelos parasitas; (2) é uma técnica remota, sem necessidade de contacto e (3) não destrutiva, pois os lasers no infravermelho não geram calor suficiente para causar danos térmicos. Nesse trabalho mostramos como se pode utilizar o deslocamento da posição de equilíbrio de uma microesfera como transdutor de forças vetoriais, determinando quantitativamente intensidade, direção e sentido das forças na microesfera. Um detector de quadrante da luz do próprio laser da pinça óptica fornece o deslocamento da mesma em duas dimensões. Dessa forma foi possível monitorar a força exercida pelo parasita em tempo real em diferentes gradientes de concentração de várias substâncias. Também desenvolvemos uma câmera de gradiente que garantiu um gradiente unidimensional estacionário na qual se pode aprisionar os parasitas e realizar a medida vetorial da força em função do tempo. Demonstramos a capacidade do nosso sistema de realização de medidas de quimiotaxia utilizando o protozoário Leishmania amazonensis, responsável pela doença leishmaniose, na forma promastigota, na presença de gradientes de glucose. Nossos resultados mostram que além das forças serem fortemente direcionadas na direção do gradiente, que a intensidade das mesmas diminui nas direções contrária ou perpendicular ao gradiente. Com esse trabalho mostramos a construção de um sistema de medidas quantitativa capaz de estudar quantitativamente a quimiotaxia de qualquer parasita frente a qualquer gradiente de concentração de diferentes substâncias / Abstract: Unicellular microorganisms, like others live beings, need to interact with environment to find nourishment. They have only hydrodynamics sensors and biochemical receptors on membrane to accomplish this task. The response of the microorganism to concentration gradients of attractive or repulsive chemical substances is called chemotaxis. The investigation of chemotaxis is essential to understand infection processes and how parasites recognizes and directs itself to the cells to be infected. This way a quantitative study of parasites chemotaxis requires the observation of not only its movements, but also the strength, direction and sense of forces exerted in the presence of concentration gradient of attractive or repellent chemical substances. Microorganism¿s forces with dimensions of around 10µm are the order of pico-Newton. Optical tweezers are a suitable tool for this kind of investigation, we can justify this affirmation by the following reasons: (1) it has high sensibility to measure forces from 20 femto-Newton until 200 pico-Newton. These forces are in same order of the forces exerted by the parasites. (2) This technique does not need contact, therefore it is a remote technique; and (3) this tool does not destroy the parasites, because lasers on infrared band do not generate enough heat to cause thermal damage on them. In this work we used the displacements of a microsphere trapped in an Optical Tweezers as the force transducer to measure the direction and the strength of the propulsion forces of flagellum of the microorganism under several gradient conditions. A quadrant detector was utilized to sense the displacement of optical tweeter¿s laser in two dimensions. So we monitor the force exerted by the parasites in real time in several concentrations gradients of different substances. We also developed a system enable to create concentration gradient. This system guaranteed a stationary one-dimensional gradient, which the parasites were arrested and the vectorial measurements of force in time function were realized. In this study, we used the protozoa Leishmania amazonensis in its promastigote form. It is responsible by the disease called leishmaniose and it represents a serious problem of public health. We demonstrated that our system is able to perform chemotaxis measurements in gradients of glucose. Our results suggest that the direction and strength of force can be used to identify the movement of the parasite. We also notice differences in strength forces for both direction x and y for different glucose in several concentrations. Using that system we can investigate quantitatively taxias of any parasites in any concentration gradient with different chemical substance, temperature or other variables / Mestrado / Física / Mestre em Física

Orientador: Raimundo Souza Lopes / Resumo: A Leishmaniose Visceral é uma doença infecciosa, de caráter zoonótico, emergente e de notificação obrigatória. No Brasil tem como agente o protozoário Leishmania infantum chagasi, e o principal reservatório é o cão (Canis familiaris). A transfusão sanguínea é muito utilizada na rotina da clínica, entretanto está associada a transmissão de doenças infecciosas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com a luz visível associada a ftalocianina de cloro-alumínio na inativação da Leishmania infantum chagasi em sangue canino, quando inoculados em hamsters (Mesocricetus auratus). Foram preparados 3 grupos experimentais compostos por 6 hamsters cada. O grupo controle recebeu sangue negativo para Leishmania, o grupo doença foi inoculado com sangue parasitado com Leishmania infantum chagasi e o grupo tratamento recebeu sangue parasitado tratado com luz visível associada a ftalocianina de cloro-alumínio. Os animais foram monitorados por 180 dias e então submetidos a avaliação clínica. Em seguida os animais foram anestesiados para a coleta de sangue por meio de punção intracardíaca e procedendo-se assim a eutanásia. O sangue foi colocado em microtubos e o soro separado por centrifugação e acondicionado a -30ºC, até a realização do teste de aglutinação direta. Após procedeu-se a coleta do fígado e baço para a realização da histopatologia. Outra parte destes órgãos e a medula óssea foram acondicionados em tubos livres de DNAse e RNAse, congelados a -30ºC até a realizaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral Leishmaniasis is an emerging zoonotic infectious disease that requires mandatory reporting. In Brazil, it is caused by the protozoan Leishmania infantum chagasi, with dogs as main reservoir (Canis familiaris). Blood transfusion is frequently used in clinical routine, however it is associated with the transmission of infectious diseases. The aim of this study was to evaluate the effects of treatment with visible light associated with chloro-aluminium phthalocyanine on the inactivation of Leishmania infantum chagasi in canine blood, when inoculated in hamsters (Mesocricetus auratus). Three experimental groups consisted of six hamsters each. The control group received blood negative for L. infantum chagasi, the diseased group was inoculated with blood infected with L. infantum chagasi, and the treatment group received infected blood previously subjected to therapy with visible light associated with chloroaluminium phthalocyanine. The animals were observed for 180 days and then subjected to clinical evaluation. Then the animals were anesthetized for blood collection through intracardiac puncture and were euthanized. The blood was placed into microtubes and the serum was separated by centrifugation and stored at -30 ° C until the direct agglutination test was performed. After, liver and spleen collection was performed to histopathological examination. Another part of these organs and bone marrow were placed in tubes DNase and RNase free, and frozen at -30°C until the PCR ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A leishmaniose é uma doença negligenciada causada por protozoários parasitos do gênero Leishmania sp. e transmitida por vetores. Esta doença pode apresentar formas clínicas que variam de lesões cutâneas simples que podem desaparecer espontaneamente até a forma visceral, a qual acomete órgãos como baço, fígado, medula óssea e linfonodos, e pode levar a morte se não tratada corretamente. Além disso, de acordo com a Organização Mundial da Saúde as leishmanioses são endêmicas em 98 países. O tratamento ainda é feita principalmente com dois medicamentos, os antimoniais pentavalentes e anfotericina B, os quais causam uma série de efeitos secundários, além disso, relatos de resistência a esses fármacos têm sido publicados. Além disso, medicamentos alternativos aprovados para uso, como a miltefosina e pentamidina, também possuem sérios efeitos colaterais e nem sempre são efetivos para todas as espécies do parasito e/ou formas clínicas. Estes fatos demonstram que é necessário o desenvolvimento de fármacos alternativos para a quimioterapia das leishmanioses. Nesse sentido, o reposicionamento de fármacos se mostra como uma importante estratégia para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para a leishmaniose, pois fármacos já liberados para o uso em humanos podem ser reutilizados, diminuindo o tempo de desenvolvimento e custos empregados para o desenvolvimento de novos fármacos. Leishmania sp. possui como um dos principais lipídios o ergosterol, cuja rota metabólica é complexa e envolve uma série de enzimas, as quais, se corretamente bloqueadas poderão suprimir a produção do ergosterol e, portanto, a viabilidade de parasitos. Considerando estes aspectos, o presente estudo objetivou investigar a ação leishmanicida de fármacos que possuem ação inibitória em enzimas da via de esteróis como o fármaco anti-hiperlipidêmico rosuvastatina (inibidor da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase) e, os antifúngicos voriconazol, tiaconazol, fenticonazol (inibidores da enzima 14 alfa-metilesterol 14-demetilase), naftifina e tolnaftato (inibidores da enzima esqualeno epoxidase), e por fim a nistatina que age diretamente sobre ergosterol. O potencial contra formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum e L. (V.) braziliensis foram avaliados, e então foram investigadas possíveis alterações ultraestruturais, fisiológicas em promastigotas de L. (L.) amazonensis (formação de poros de membrana, e alteração do potencial de membrana mitocondrial) ou nas células hospedeiras (produção de óxido nítrico, peróxido de hidrogênio, e mudanças no pH intracelular). O fenticonazol, tioconazol, nistatina e o tolnaftato foram capazes de eliminar as formas promastigotas e amastigotas intracelulares, sendo a nistatina, o tolnaftato e o fenticonazol os mais seletivos para amastigotas das três espécies de parasitos estudados. Por outro lado, rosuvastatina, voriconazol e a naftifina não apresentaram ação contra formas amastigotas intracelulares. Além disso, os fármacos com atividade leishmanicida alteraram morfologicamente e fisiologicamente a mitocôndria do parasito. Apesar de não haver estímulo da produção de H2O2 ou NO por parte dos fármacos analisados, o fenticonazol foi capaz de alcalinizar macrófagos hospedeiros infectados. Considerando que estes fármacos foram capazes de inibir o crescimento de multi-espécies do parasito no interior dos macrófagos, esses resultados sugerem que medicamentos antifúngicos podem ser interessantes alvos para reposicionamento da quimioterapia das leishmanioses tegumentar e visceral / Leishmaniosis is a neglected disease caused by parasitic protozoa belonging to the genus Leishmania sp. and transmitted by vectors. This disease presents different clinical forms ranging from single lesion, that can heal spontaneously, to the visceral form, that affects the spleen, liver, bone marrow and lymph nodes, and may lead to death if not properly treated. Additionally, according to the World Health Organization, leishmaniosis is endemic to 98 countries. The treatment is still carried out with two main drugs, antimonials and amphotericin B that induce side effects; in addition, reports about the emergence of parasite resistance have been published. Besides, alternative drugs such as miltefosine and pentamidine still have serious side effects and are not always effective to treat all Leishmania species and/or clinical form. In this regard, drug repurposing has been considered an important strategy to develop new therapeutic alternatives to leishmaniasis chemotherapy, since drugs already approved to human use may be reused, decreasing time and costs needed for the research of new drugs. Leishmania sp. possesses ergosterol as the main membrane lipid, and the metabolic pathway to produce this lipid is complex and involves different enzymes, which if correctly inhibited may suppress ergosterol production and, therefore, parasite viability. Considering these aspects, the aims of this study is to investigate the leishmanicidal potential of drugs who inhibit enzymes of the ergosterol pathway, such as the anti-hyperlipidemic drug rosuvastatin (inhibitor of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase), the antifungals voriconazole, tioconazole, fenticonazole, (inhibitors of the 14 Alpha-methylsterol 14-demethylase), naftifine and tolnaftate (inhibitors of squalene epoxidase), and nystatin, that acts directly on ergosterol. The anti-promastigote and anti-amastigote potentials of drugs against L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum and L. (V.) braziliensis were evaluated; ultrastructural and physiological alterations of L. (L.) amazonensis promastigotes (membrane pore formation and mitochondrion membrane potential alterations) and host macrophages (nitric oxide and hydrogen peroxide productions and changes to intracellular pH) were investigated. Fenticonazole, tioconazole, nystatin and tolnaftate were capable to eliminate promastigote and amastigotes, being the most selective drugs nystatin, tolnaftate and fenticonazole to all studied species amastigotes. Rosuvastatin, voriconazole and naftifine were unable to eliminate amastigote forms. Furthermore, the drugs that possess leishmanicidal effects affected parasite mitochondrion. Although these drugs did not trigger the production of H2O2 or NO, fenticonazole was able to alkalinize host infected macrophages. Considering these drugs were able to inhibit multiple species of the parasite growth in macrophages, these results suggest that antifungal drugs can be interesting targets to be repurposed in the cutaneous and visceral leishmaniasis