Made available in DSpace on 2014-10-09T12:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

No diabete melito tipo (DM) 2, a glicoxidação da LDL favorece o acúmulo de colesterol nos macrófagos da parede arterial, enquanto que as modificações da HDL alteram o transporte reverso do colesterol e reduzem sua capacidade ateroprotetora. O objetivo deste estudo foi avaliar a concentração de colesterol livre (CL) e esterificado (CE) em macrófagos, resultante da incubação conjunta de LDL e HDL isoladas de indivíduos portadores de DM 2 (D) com controle glicêmico inadequado, ou de indivíduos controles não diabéticos (C). LDL e HDL isoladas do plasma por ultracentrifugação por gradiente descontínuo de densidade foram incubadas simultaneamente (100g proteína/mL de meio) em macrófagos de peritônio de camundongos, durante 48 h, a 37°C, de acordo com os seguintes esquemas: LDL(C); LDL(C)+HDL(C); LDL(C)+HDL(C) pool; LDL(D); LDL(D)+HDL(D) ou LDL(D)+ HDL(C) pool. O conteúdo celular de CL e CE (linoleato, oleato e palmitato) foi analisado por HPLC (g/mg de proteína celular). A idade, IMC e triglicérides plasmáticos, assim como a glicemia de jejum e HbA1c, eram maiores no grupo DM, em comparação com o grupo C. Nas incubações com LDL(D) + HDL(D), observou-se maior conteúdo celular de colesterol total (607 ± 99; p = 0,033) e esterificado (430 ± 86; p = 0,023) em comparação com LDL(D) (356 ± 73; 209 ± 51, respectivamente), e somente do colesterol esterificado comparado com LDL(D) + HDL(C) pool (208 ± 70; p = 0,023). Os macrófagos com LDL(D) + HDL(D) apresentaram maior conteúdo de colesterol total (607 ± 99; p = 0,01), CL (177 ± 21; p = 0,03) e CE (430 ± 86; p = 0,02) em comparação com LDL(C) + HDL(C) pool (266 ± 66, 89 ± 16 e 176 ± 53, respectivamente). O acúmulo de colesterol esterificado nos macrófagos foi decorrente da maior formação de colesterol linoleato e oleato. A análise da composição das HDL(D) mostrou menor conteúdo de apo A-I em relação aos lípides, comparada com HDL(C). Em conclusão, a incubação simultânea de LDL(D) + HDL(D) provocou maior acúmulo de colesterol em macrófagos, em comparação à incubação de LDL(D) isoladamente ou de LDL(C) + HDL(C) pool. Estes resultados sugerem que a HDL de portadores de DM 2 mal compensados favorece o maior acúmulo de colesterol em macrófagos. / The development of atherosclerosis in type 2 diabetes mellitus (DM2) is associated with lipoprotein (LP) modifications. Glycoxidized LDL increases macrophage cholesterol accumulation whereas HDL modifications impair the reverse cholesterol transport and atheroprotective properties. The objective of this study was to evaluate the cholesterol content of mouse peritoneal macrophage (MPM) after their simultaneous incubation with LDL+HDL or LDL alone from poorly controlled DM2 (D, n=11), and from non-diabetic control individuals (C, n=11). LP were isolated by discontinuous density gradient ultracentrifugation and incubated (100g protein/mL) with MPM (48h), according to the following protocol: LDL(C); LDL(C)+HDL(C); LDL(C)+HDL(C) pool; LDL(D); LDL(D)+HDL(D) or LDL(D)+ HDL(C) pool. The cellular contents of free (FC) and of esterified cholesterol (EC: linoleate, oleate and palmitate) were measured by HPLC (g/mg of cell protein). Age, BMI, fasting plasma glucose, HbA1c and triglycerides were higher in D as compared to C. The incubation with LDL(D)+HDL(D) increased MCM TC (mean ± SEM) (607 ± 99; p = 0,033) and EC (430 ± 86; p = 0,023) contents compared to LDL(D) alone (356 ± 73; 209 ± 51, respectively). Also, MPM EC content was higher compared to LDL(D)+HDL(C)pool (208 ± 70; p = 0,023). MPM incubated with LDL(D)+HDL(D) presented greater contents of TC (607 ± 99; p = 0,01), FC (177 ± 21; p = 0,03) and of EC (430 ± 86; p = 0,02) compared to the LDL(C)+HDL(C)pool (266 ± 66, 89 ± 16 e 176 ± 53, respectively). The cellular EC content was ascribed to accumulations of linoleate and oleate. Analysis of the HDL composition showed higher lipid/apo A-I ratio in HDL(D) compared to HDL(C). In conclusion, the simultaneous incubation of LDL(D)+HDL(D) induces greater cholesterol accumulation in macrophage compared to LDL(D) and LDL(C)+HDL(C)pool. These results suggest that uncontrolled DM2 HDL favours the cellular cholesterol accumulation.

INTRODUÇÃO:. A dislipidemia diabética é um dos principais fatores de risco para doença arterial coronária (DAC) O uso de uma nanoemulsão LDL-símile para avaliar clearance do éster de colesterol(EC) e colesterol livre(CL) do intravascular mostrou uma remoção acentuada do CL e um maior depósito em vasos sanguíneos de indivíduos com DAC avançada. OBJETIVOS: Identificar em DM2 a cinética plasmática do CL e EC; se há diferença na cinética de CL e EC em DM2 assintomáticos para DAC com e sem aterosclerose subclínica. MÉTODOS: Estudou-se 12 DM2 e 09 controles pareados para idade e sexo. A aterosclerose subclínca foi avaliada pela presença de Calcificação na artéria coronária (CAC). A Nanoemulsão artificial LDLsímile com dupla marcação radioativa 14C-EC, 3H-CL foi utilizada para o estudo cinético do colesterol, sendo injetada nos participantes e amostras de sangue foram coletadas durante 24 horas para mensuração da radioatividade. Remoção dos lípides da circulação foi calculada por análise compartimental. Mediu-se a taxa de esterificação do 3H-CL no plasma e avaliou-se a capacidade in vitro da HDL de receber lípides a partir das LDL-símile. RESULTADOS: Os diabéticos tiveram IMC, CA e CA/CQ maior que os controles, respectivamente: 31,9 ± 4,6 vs. 27,1± 2,4, p<0,05; 104,9 ± 9,8 vs. 94,2 ± 7,3, p<0,05; 0,98 ± 0,09 vs.0,89 ± 0,06, p<0,01. A glicemia de jejum (171 ± 96 vs. 83 ± 7,5 mg/dl, p <0,05) e hemoglobina glicada (8,9 ± 2,1 vs. 5,6 ± 0,4%, p<0,05) também foram maiores no DM2. A concentração de colesterol total, LDL, HDL, Triglicérides e apolipoproteínas A1,B e E não diferiu entre os grupos. A Taxa fracional de remoção (TFR)14C-EC foi 22% maior DM2 que nos controles (0,07 ± 0,02 vs. 0,05 ± 0,01 h-1, p<0.01). A TFR3H- CL foi semelhante entre os dois grupos, bem como a esterificação. A presença de CAC no grupo DM2 não alterou a remoção de EC e CL nesses pacientes. In vitro a capacidade da HDL em receber EC (4,2 ± 0,8vs. 3,5 ± 0,6 %, p=0,03) e TG (6,8 ± 1,6 vs. 5,0 ± 1,1, p=0.03) foi maior nos DM2. CONCLUSÕES: A remoção acelerada do 14C-EC na população DM2 e a remoção semelhante do 3H-CL quando comparado com grupo controle, pode sinalizar alterações na gênese da dislipidemia diabética. O fato dos DM2 com CAC assintomática não apresentam alterações na remoção de colesterol livre sinaliza uma provável relação do CL com a instabilidade da placa aterosclerótica. / INTRODUTION: The diabetic dyslipidemia is one of the most important risk factor in the development of coronary artery disease (CAD). The LDL-like nanoemulsion is being used to study the clearance of cholesteryl ester(CE) and free cholesterol(FC) from intravascular in patients with advanced CAD and it was shown a higher removal of FC and higher deposit in vases. OBJECTIVE: The aim of this study is to analyze the plasma kinetics of FC and CE in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM); and identify if there are any differences in the removal of FC in the presence of subclinical atherosclerosis in asymptomatic patients with T2DM. METHODS: It was studied 12 T2DM and 09 controls paired by age and gender. The LDL-like nanoemulsion labeled with radioactive: 14C- cholesterol ester (CE), 3H-cholesterol free (CF) was used on plasma kinetics. The nanoemulsion was injected intravenously in all participants and blood sample was collected over 24 hours for radioactivity measurement. The intravascular lipid removal was calculated through compartmental analysis. The intravascular esterification of FC contained in the nanoemulsion was calculated. The ability of HDL to received lipids from LDL-simile were observed in vitro essays. Coronary Calcium Score was detected to identify subclinical atherosclerosis. RESULTS: T2DM patients had a bigger BMI, waist and waist/hip than control, respectively 31.9 ± 4.6 vs. 27.1± 2.4, p<0.05; 104.9 ± 9.8 vs. 94.2±7.3, p<0.05; 0.98± 0.09 vs. 0.89 ± 0.06,p<0.01. Fasting glycemia (171 ± 96 vs. 83 ± 7.5 mg/dl, p <0.05) and glycated hemoglobin( 8.9 ± 2.1 vs. 5.6 ± 0.4%,p<0.05) was higher in T2DM, and there was no differences in the concentration of Total cholesterol, HDL, LDL, Triglycerides and apolipoproteins A1, B and E concentrations. The Fractional Clearance rate (FCR) 14C CE in T2DM was 22% bigger than control ( 0.07 ± 0.02 vs. 0.05± 0.01 h-1, p<0.01). FCR 3H-CF was similar between the groups. The CAC in T2DM did not show differents TFR in CE and FC in these group. In Both groups there was no statistical difference in FC esterification rate. The HDL ability to received CE (4.2 ± 0,8vs. 3.5 ± 0,6 %, p=0,03) and TG (6.8 ± 1.6 vs. 5.0 ± 1.1, p=0.03) from LDL-like nanoemulsion was higher in T2DM. CONCLUSIONS: The higher removal of 14C-CE and similar removal of FC in T2DM can be related to the genese of the diabetic dyslipidemia. The similar removal of FC between the control group and T2DM asymptomatic CAD, with and without subclinical atherosclerosis, could possibly signalize to the relation of FC and the atherosclerotic plaque stability.

O papel do exercício físico na prevenção da doença macrovascular aterosclerótica é atribuído em parte à melhoria no metabolismo de lípides, com evidências para regressão e prevenção no desenvolvimento de aterosclerose. Neste estudo, avaliamos o efeito de 6 semanas de treinamento físico aeróbio (protocolo diário em esteira 15 m/min, 30 min, 5 vezes na semana) sobre o transporte reverso de colesterol (TRC) em camundongos C57BL/6 selvagens e transgênicos para CETP humana (CETP-tg). Estes últimos constituem modelo experimental de TRC que se assemelha aos humanos, pela presença da CETP. O TRC é um sistema antiaterogênico, por meio do qual o colesterol é removido de células periféricas e transportado ao fígado para eliminação na bile e excreção fecal. A metodologia utilizada consistiu na injeção intraperitoneal de macrófagos J774 enriquecidos em LDL-acetilada e 3H-colesterol em animais selvagens e CETP-tg sedentários e treinados, após as 6 semanas de estudo. O perfil lipídico não foi modificado após o treinamento físico, no entanto, apenas no grupo CETP-tg treinado houve aumento na concentração de HDL colesterol ao final do estudo. O treinamento físico aeróbio acelerou o TRC em camundongos selvagens, refletido pela maior recuperação de 3H-colesterol no plasma (após 24 h e 48 h da injeção intraperitoneal) e no fígado (após 48 h), em comparação aos animais selvagens sedentários. Este evento associou-se ao aumento de 60% na expressão dos receptores hepáticos SR-BI, em relação ao grupo sedentário. Nos animais CETP-tg, o treinamento físico aumentou o TRC, com maior recuperação de 3H-colesterol - advindo dos macrófagos - no plasma, fígado e também nas fezes (após 24 h e 48 h), em comparação aos animais transgênicos sedentários. Embora a expressão de SR-BI não tenha sido alterada pelo treinamento físico nos animais CETPtg, observou-se nestes animais aumento na expressão hepática do receptor B-E, contribuindo para a maior remoção de colesterol pelo fígado. Os achados apontam para importante papel do exercício físico aeróbio regular sobre o transporte reverso de colesterol de macrófagos, contribuindo para a prevenção contra a gênese e progressão da aterosclerose. / Regular exercise prevents the development of atherosclerosis. We analyzed the role of a six-week aerobic exercise training program in the macrophage reverse cholesterol transport in wild-type (WT) and in human CETP transgenic (CETP-tg) mice. Animals were randomly assigned to sedentary and trained groups (treadmill 15 m/min, 30-min sessions, 5 sessions per week). Plasma lipids were not modified after training, although HDL-cholesterol concentrations levels increased in trained CETP-tg mice only. Plasma CETP activity was not modified after training. A greater recovery of 3H-cholesterol from J774 macrophages injected into peritoneal cavities of mice was found in plasma and in the liver from exercised WT and CETP animals in comparison to sedentary groups. Exercise training induced a greater excretion of 3H-cholesterol in feces only in the CETP-tg mice. The SR-BI expression in the liver was increased and unchanged in trained WT and CETP-tg mice, respectively. The liver expression of LDL receptor was higher in both groups after training. Alternatively, liver X receptor (LXR) increased only in trained WT mice. Aerobic exercise training improves the macrophage RCT in mice, thereby contributing to the prevention and regression of atherosclerosis. The benefit of exercise on the cholesterol excretion in feces in mice was attained only in the presence of CETP, which elucidates the importance of exercise in the prevention of atherosclerosis in humans.

A disfunção endotelial é um dos componentes básicos tanto da origem como das complicações de algumas doenças cardiovasculares, principalmente aquelas devidas a aterosclerose. Fatores de risco que compõe a Síndrome Metabólica (SMet) interferem na integridade endotelial por causarem marcante estresse oxidativo e conseqüente disfunção endotelial. Os benefícios de um treinamento físico de longa duração sobre o endotélio e sobre a concentração das lipoproteínas já são conhecidos. Entretanto, ainda restam lacunas de conhecimento dos efeitos que um treinamento de curta duração produziria em pacientes portadores de Síndrome Metabólica. Para elucidarmos este assunto, estudamos 40 indivíduos sedentários sendo 30 portadores de SMet e 10 normais para controle. Vinte dos pacientes com SMet (10 mulheres e 10 homens) realizaram treinamento físico (TF) aeróbio de moderada intensidade, em bicicleta ergométrica, por um período de 3 meses. A reatividade vascular e testes funcionais in vitro das lipoproteínas HDL e LDL foram realizados antes e depois do TF. Os resultados indicam melhora na unção endotelial, porém sem mudanças do índice de massa corpórea e dos níveis lipídicos. Houve redução da circunferência abdominal e dos níveis de Triglicérides. Os testes funcionais revelaram que, apesar de não terem ocorrido alterações na concentração, houve melhora funcional das lipoproteínas. Portanto, exercício de curta duração melhora a funcionabilidade endotelial e das lipoproteínas. / Endothelial dysfunction is one of the basic components of origin and complications of some cardiovascular diseases, especially those consequent to atherosclerosis. Risk factors that compose the Metabolic Syndrome (MetS) modify the endothelial integrity causing significant oxidative stress and consequent endothelial dysfunction. The long-term exercise training benefits in lipoproteins concentration and endothelium are already known. However, the effects of short-term training in endothelial function and in LDL, HDL quantitative and functional profile are still doubtful, especially in patients with MetS. To address this issue, we studied 40 sedentary persons, 30 with MetS and 10 controls. Twenty of those with MetS (10 women and 10 men) were subjected to a 3 times/week moderate intensity controlled training load for 3 months on a bicycle ergometer. Vascular reactivity and in vitro HDL, LDL functional laboratorial tests were analyzed before and after the training. The results revealed that exercise training improved the endothelial function. There was no significant change in body mass index, but some reduction in the abdominal circumference was observed. Total cholesterol and lipoprotein concentrations were not affected by exercise, but triglyceride levels were reduced and lipoprotein subfractions functional tests significantly improved. Therefore, short-term exercise improves endothelium and lipoprotein functionability.

Introdução São escassas as evidências do impacto dos padrões de atividade física (AF) e local de residência (rural e urbano) para a dislipidemia e ao perfil lipídio. Objetivos Avaliar a associação dos padrões de atividade física e local de residência (urbano e rural) com dislipidemia. Associar a correlação do gasto energético estimado em Mets e valores e frações de colesterol e triglicérides. Metodologia Estudo Transversal em coorte prospectiva, com 4551 indivíduos com idade entre 35 e 70 anos de áreas urbana e rural. A AF foi avaliada utilizando o Questionário Internacional de Atividade Física (IPAQ). Foi realizada regressão múltipla para a associação de AF e local de residência com o tipo de dislipidemia. A regressão linear foi realizada para avaliar o efeito da AF e local de residência nos valores e frações de colesterol e triglicérides. Resultados A prevalência de baixa AF no rural foi de 5,1 por cento (mulheres 4,3 por cento e homens 6,0 por cento ), urbano 11,2 por cento (7,9 por cento mulheres e 5,5 por cento homens), p<0,001. A dislipidemia ocorreu em 75,3 por cento do rural e 68 por cento do urbano (p<0,001). Em mulheres 80,6 por cento do rural e 65,7 por cento do urbano (p<0,001), homens 69,1 por cento do rural e 71 por cento do urbano (p=0,369). O perfil lipídico das mulheres em mediana foi: colesterol total (CT) rural 194,51 mg/dl, e urbano 201,5 mg/dl (p<0,001), HDL rural 44,5 mg/dl e urbano 50,1 mg/dl (p<0,001) LDL rural 120,3 mg/dl e urbano 122,6 mg/dl (p=0,35), triglicérides rural 127,1 mg/dl e urbano 117,8 (p<0,001). Em homens as medianas foram: CT rural 189,5 mg/dl e urbano 196,1 mg/dl (p=0,002), HDL rural 40,2 mg/dl e urbano 41,8 mg/dl (p<0,001), LDL rural 118,3 mg/dl e urbano 121,4 mg/dl (p=0,5), triglicérides rural 131,1 mg/dl l e urbano 147,0 mg/dl (p=0,001). A dislipidemia por HDL baixo foi a mais frequente. AF domiciliar, transporte e trabalho estão associados com a redução do risco de dislipidemia. Em mulheres, o efeito no HDL da AF domiciliar foi no rural 1,001 mg/dl (p=0,021) e no urbano 1,114 mg/dl (p<0,001). Em homens do grupo urbano, o efeito de AF de transporte foi -1,42 mg/dl (p<0,001) no LDL. O efeito da AF de trabalho no HDL foi no rural 1,002 mg/dl (p<0,001) e urbano 0,042 mg/dl (p=0,04) Conclusão Existem fortes indícios da interação da atividade física e local de residência com as dislipidemias e perfil lipídico. As associações encontradas entre as atividades físicas domiciliar, transporte e trabalho e dislipidemias sugerem caminhos complementares nas estratégias de prevenção de doenças cardiovasculares na população brasileira. / Introduction There is scarce evidence about the impact of physical activity (PA) and residence area (rural and urban) on dyslipidemia and lipid profile. Objectives To assess the association between patterns of physical activity, residence area (rural or urban) and dyslipidemia. To assess the correlation between energy expenditure in estimated Mets and total cholesterol, HDL, LDL and l triglycerides levels. Methodology A cross sectional evaluation in a prospective cohort with 4551 individuals aged between 35 and 70 years from rural and urban areas. The PA was assessed using the International Physical Activity Questionnaire (IPAQ). Multiple logistic regression was performed to determine the association between PA and residence area and the type of dyslipidemia. Linear regression was used to determine the effect of PA on the cholesterol, HDL, LDL and triglycerides levels. Results The prevalence of low PA in rural individuals was 5.1 per cent (4.3 per cent women and 6.0 per cent men), urban 11.2 per cent (7.9 per cent women and 5.5 per cent men), p<0,001. Dyslipidemia was present in 75.3 per cent of rural and 68 per cent of urban individuals (p<0.001). In rural women 80.6 per cent and urban women 65.7 per cent (p <0.001), rural men 69.1 per cent and urban men 71 per cent (p=0.369). The medians of lipid levels among women were: total cholesterol (CT) 164,5 mg/dl rural and 201,5 mg/dl urban (p<0,001), HDL 44,5 mg/dl rural and 50,1mg/dl (p<0,001), LDL 120,3 mg/dl rural e 122,6 mg/dl urban (p=0,35), triglycerides 127,1 mg/dl rural e 117,8 urban (p<0,001). Among men the medians of lipid levels were CT 189,5 mg/dl rural e 196,1 mg/dl urban (p=0,002), HDL 40,2 mg/dl rural e 41,8 mg/dl urban (p<0,001), LDL 118,3 mg/dl rural e 121,4 mg/dl urban (p=0,5), triglycerides 131,1 mg/dl rural e 147,0 mg/dl urban (p=0,001). Low HDL level was the most frequent. Household, transportation and occupational PA are associated with reduced risk of dyslipidemia. The effect of household PA on HDL level was 1,001 mg/dl among rural women (p=0.021) and 1,114 mg/dl (p<0.001) among urban women. In urban men, the effect of transportation PA on LDL level was -1.42 mg/dl (p<0.001). The effects of occupational PA on HDL level was 1.002 mg/dl among rural men (p<0.001) and 0.042 mg/dl among urban men (p=0.04). Conclusion There are strong indications about the interaction of physical activity and residence area with dyslipidemia and lipid profile. The observed associations between household, transportation, occupational physical activities and dyslipidemia suggest complementary ways in strategies for cardiovascular disease prevention in the Brazilian population.

Orientadores: Celso Eduardo Benedetti, Thelma Aguiar Pertinhez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanini_MarinaMarquesTeixeira_D.pdf: 4190459 bytes, checksum: 7f5524ada199418936817a26a2c2aadb (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Dentro do programa Smolbnet (Structural Molecular Biology Network) da Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), a orf (open reading frame) XAC1516 da bactéria causadora do cancro cítrico, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), foi selecionada para estudos de estrutura e função. XAC1516 codifica uma lipoproteína de membrana externa semelhante a membros da família OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) de pequenas lipoproteínas, amplamente distribuída entre as Proteobacteria 'beta¿ e 'gama¿. Apesar de se conhecer o papel de muitas lipoproteínas, nenhum membro OmlA/SmpA tem estrutura 3D (tridimensional) determinada e pouco se sabe sobre esta família do ponto de vista funcional, sendo sugerido um possível papel na manutenção da integridade do envelope celular. Curiosamente, no genoma de diversas bactérias o gene omlA apresenta localização adjacente ao gene fur (ferric uptake regulator), que codifica o principal regulador transcricional dos níveis intracelulares de ferro em bactérias Gram-negativas. O curto espaço intergênico entre omlA e fur sugere que os seus promotores são sobrepostos e que suas funções e/ou regulação podem estar associadas. Este trabalho procurou investigar a função da proteína OmlA de Xac, primordialmente através da determinação da sua estrutura 3D e análise das suas propriedades dinâmicas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Também se buscou estudar a possibilidade de associação regulatória e/ou funcional entre omlA e fur, e o envolvimento do lócus no metabolismo de ferro ou na resposta ao estresse celular. Nós observamos que durante a infecção em folhas de citrus OmlA tem sua expressão aumentada em Xac e que neste processo os genes omlA e fur são co-ativados, sugerindo seu envolvimento na interação planta-patógeno. No entanto, o lócus não foi ativado em condições associadas ao metabolismo de ferro e à regulação por Fur observada em outros organismos. Ensaios de mono-híbrido foram realizados para tentar detectar possíveis fatores de ligação ao promotor do lócus omlA e fornecer informações sobre a sua regulação, mas sem sucesso. Pela primeira vez, as propriedades conformacionais e dinâmicas foram determinadas por RMN para um membro da família OmlA, e a estrutura 3D da proteína OmlA de Xac não revelou sua associação direta com processos de captação de ferro. A proteína possui extremidades desenvoveladas e uma porção central estruturada intercalada por loops flexíveis e composta de três fitas 'beta¿ e duas pequenas 'alfa¿ hélices que se empacotam num arquitetura do tipo bicamada 'alfa¿/¿beta¿. Curiosamente, este enovelamento se assemelha aos domínios da proteína BLIP (ß-lactamase inhibitory protein), um inibidor de 'beta¿-lactamase envolvido em interações proteína-proteína. Testes in vivo de co-expressão das proteínas OmlA e 'beta¿-lactamase não indicaram que OmlA possua atividade de inibição da 'beta¿-lactamase, e que portanto é provável que se associe a outra(s) proteína(s). Possíveis parceiros de interação não foram detectados através de experimentos de pull-down e coimunoprecipitação. Apesar disso, os resultados sugerem que a proteína OmlA pode estar envolvida em algum tipo de interação proteína-proteína associada à infecção na planta e sua co-ativação com fur deve fazer parte de uma resposta global relacionada à ativação de mecanismos de importância para sobrevivência de Xac durante a colonização na planta / Abstract: The XAC1516 gene from the citrus canker pathogen, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), was selected for structural and functional studies in the context of the Fapesp Smolbnet program. XAC1516 codes for an outer membrane lipoprotein similar to members of the OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) family of small lipoproteins widely distributed across the 'beta¿ and 'gama¿ Proteobacteria. Although the role of numerous bacterial lipoproteins is known, the tridimensional (3D) structure of OmlA/SmpA members has never been reported and little is known about its biological function. However, it has been proposed a role of OmlA in the stability of the cellular envelope. Curiously, the omlA gene is located adjacently to the fur (ferric uptake regulator) gene, which codes for the most important transcriptional regulator of iron intracellular levels in Gram-negative bacteria. The tight intergenic spacement between omlA and fur suggests that they have superimposed promoters and that their function or regulation may be associated. In this work, we have investigated the function of the OmlA protein from Xac essentially through its 3D structure determination and dynamic analysis by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We also investigated the possibility of a functional association between omlA and fur and the involvement of this locus in iron metabolism or cellular stress response. We found that in Xac OmlA expression is enhanced during citrus infection and that in this process omlA and fur are co-activated, thus suggesting their involvement in plantpathogen interaction. The locus, though, was not actived upon conditions associated to iron metabolism or Fur regulation already observed in other organisms. One-hybrid assay were performed in order to detect possible transcriptional factors implicated in omlA/fur expression or repression, but without success. Conformational and dynamical properties of OmlA were determined by NMR. The protein has unfolded N and C termini and a structurally well defined core interconnected by flexible loops and composed by three 'beta¿-strands and two small 'alfa¿-helices, which pack against each other forming a two-layer 'alfa¿/¿beta¿ scaffold. Curiously, this fold ressembles the domains of BLIP ('beta¿-lactamase inhibitory protein), a 'beta¿-lactamase inhibitor involved in protein-protein interaction. OmlA and 'beta¿-lactamase co-expression in vivo experiments did not indicate that OmlA has a 'beta¿-lactamase inhibitory activity. It is possible then that OmlA associates with another protein or proteins, but interacting partners were not detected through pulldown and coimmunoprecipitation assays. Nonetheless, the results suggests that OmlA may be implicated in some sort of protein-protein interaction associated to plant infection and its coactivation with fur may take part of a global response related to activation of important mechanisms for Xac surviving during its colonization in plant / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Eliana Cotta de Faria / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T09:53:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_PaollaFernandaCezar_M.pdf: 1545664 bytes, checksum: adb6ff457c3fca3c72980c7c69797900 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A doença cardiovascular (DCV) é a causa mais comum de morte nas sociedades ocidentais, afetando ambos os sexos, sendo a aterosclerose a mais importante patologia subjacente. A aterosclerose é aceita mundialmente como uma doença imune-inflamatória, na qual, a participação do sistema imunológico é crucial para o início da disfunção endotelial, formação da estria gordurosa, progressão da lesão e ruptura da placa. A modificação oxidativa das lipoproteínas de baixa densidade (LDL), é considerada essencial no processo aterosclerótico, gerando LDL oxidadas (LDLox), que possuem propriedades quimiotáticas e imunogênicas, levando à formação de anticorpos (acLDLox). É fundamental o conhecimento das repercussões metabólicas e ateroscleróticas da LDLox e seus anticorpos no plasma de adultos assintomáticos. Os objetivos deste estudo foram determinar a ação aterogênica da LDLox e dos acLDLox e seus determinantes metabólicos e antropométricos. Foram selecionados 107 indivíduos e classificados em tercis de acordo com os níveis de LDLox e acLDLox. As análises bioquímicas foram realizadas por métodos enzimáticos-colorimétricos, nefelométricos e radiométricos (CETP, PLTP, LH e LPL). A LDLox plasmática foi determinada por ELISA (Mercodia) e os acLDLox contra a LDL inteira, utilizou LDL altamente oxidada. A medida da EIM foi realizada através da ultrassonografia Doppler. Verificamos uma redução na atividade da LH no maior tercil de acLDLox, além de uma tendência no aumento da EIM (p ? 0.068). O maior tercil de LDLox apresentou maiores concentrações de C, LDL-C e apoB100 (p ? 0.001), porém redução na atividade da CETP (p ? 0.029) e maior EIM (p ? 0.003). Observamos correlação significativa (p = 0,041) entre acLDLox e EIM independente de LDLox ou correlação entre LDLox e EIM independente de acLDLox. Correlações similares com EIM entre acLDLox, LDLox, LDLox/apoB100 e LDLox/LDL-C foram encontradas. Os títulos séricos de acLDLox e provavelmente a sua presença na lesão foram independentes das concentrações de LDLox. Nas análises multivariadas, observamos que a apoAI mostrou-se preditora de acLDLox (R2= 3.98), e para LDLox apoB100 (R2=23,49), e CETP (R2= 1,99), e PLTP (R2=1,78). O comportamento menos aterogênico e a explicação destes biomarcadores por componentes do TRC, mostraram-se coerentes com a atenuação da aterosclerose carotídea observada em indivíduos com maiores títulos de anticorpos. Entretanto, sua semelhança com a LDLox quanto à correlação com a EIM e EIM máxima igual, revelam duplo comportamento com relação à aterosclerose. Este trabalho estimula novas investigações para a elucidação dos mecanismos envolvidos na aterogenicidade destes biomarcadores em adultos assintomáticos e em estados patológicos / Abstract: Cardiovascular disease (DCV) is the most common cause of death on western societies, affecting both sexes, with atherosclerosis being the most important underlying pathology. Atherosclerosis is accepted worldwide as an immuneinflammatory disease, in which the participation of the immune system is crucial for the beginning of endothelial dysfunction, fatty streak formation, progression of lesion and plaque rupture. The oxidative modification of low density lipoproteins (LDL) is an essential step on the atherosclerotic process, generating oxidized LDL particles (oxLDL), which have chemotactic, cytotoxic and immunogenic properties, leading to the formation of specific antibodies (aboxLDL). Thus, it is very important to understand the metabolic and atherosclerotic repercussions of plasma oxLDL and their antibodies on asymptomatic adults. The aims of this study were to determine the atherogenic effects of oxLDL and aboxLDL and their metabolic and anthropometric determinants. For this study, 107 adult individuals were selected, who were classified in tertiles according to serum values of oxLDL and aboxLDL. The biochemical parameters were analyzed through enzymatic-colorimetric, nephelometric and radiometric methods (CETP, PLTP, LH e LPL). The plasma oxLDL was determined using ELISA (Mercodia) and aboxLDL against full LDL using highly oxidized LDL. EIM was measured by Doppler ultrasonography. We observed a reduction on LH activity on the higher tertile of aboxLDL and a borderline increase on EIM (p ? 0.068). The higher oxLDL tertile presented higher concentrations of C, LDL and apoB100 (p ? 0.001), but also presented reduction on CETP activity (p ? 0.029) and higher cIMT (p ? 0.003). We observed significant correlation (p = 0.041) between aboxLDL and cIMT independent of oxLDL or correlation between oxLDL and cIMT independent of aboxLDL. Similar correlations with cIMT between aboxLDL, oxLDL, oxLDL/apoB100 and oxLDL/LDL-C were observed. Serum titles of aboxLDL and probably its presence in the lesion were independent of concentrations of oxLDL. Multivariate regression analysis revealed apoAI as a predictor of aboxLDL (R2= 3.98), and for oxLDL, the preditors were apoB100 (R2= 23,49), CETP (R2= 1,99), and PLTP (R2= 1,78). The behavior and less atherogenic explanation of these biomarkers by components of the TRC were consistent with the attenuation of carotid atherosclerosis observed in individuals with higher levels of antibodies. However, its similarity to oxLDL marker regarding the association with cIMT and its maximum value reveal a double behavior of aboxLDL regarding atherosclerosis This study encourages further investigations to elucidate the mechanisms involved in the atherogenicity of these biomarkers in asymptomatic adults and in pathological states / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O presente trabalho tem como objetivo avaliar se o complexo Európio- Clorotetraciclina (EuCTc) ou o corante Tioflavina T (ThT) podem atuar como biossensores precisos e eficientes de colesterol numa fração específica, através de procedimentos simples. Para isso estudaram-se as propriedades ópticas do complexo EuCTc e ThT na presença da Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) em seu estado nativo e em seu estado oxidado. O primeiro estudo realizado verificou a melhor razão molar entre o Európio e a Clorotetraciclina, em seguida verificou-se a influência da diálise da LDL na emissão do complexo EuCTc, para obtenção de um protocolo para quantificação da concentração da LDL. Foram traçadas as curvas de calibração da emissão do complexo EuCTc com várias concentrações da LDL nativa, LDL oxidada com íons de Cobre e LDL oxidada com íons de Ferro. Em seguida obteve-se o tempo de vida do íon Európio no complexo EuCTc na presença de diferentes concentrações de LDL nativa e LDL oxidada por íons de Cobre. Na segunda parte do trabalho estudou-se a emissão do corante Tioflavina T na presença da LDL nativa e LDL oxidada. Na terceira etapa as propriedades ópticas dos biossensores EuCTc e ThT foram investigadas na presença do plasma sanguíneo e foram comparadas às emissões do complexo EuCTc e o corante ThT com a LDL ultracentrifugada, para verificar a possibilidade de quantificar a LDL diretamente no plasma sanguíneo. Na última etapa do trabalho desenvolveu-se uma nova metodologia para oxidar a partícula de LDL a partir da irradiação com laser de pulsos ultracurtos, a fim de produzir uma oxidação branda da partícula de LDL e controlada. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

A lipoproteína de alta densidade (HDL) tem várias ações protetoras contra o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como remover o excesso de colesterol dos tecidos periféricos. No entanto, outros aspectos do metabolismo da HDL, como o transporte de colesterol das outras classes de lipoproteínas para a HDL devem ser avaliados para verificar a sua ação protetora. Sendo assim, nosso objetivo foi verificar, em hamsters, se a dieta hiperlipídica altera fatores relacionados ao metabolismo da HDL, tais como a composição da fração HDL e a transferência simultânea de lípides para a HDL. Trinta e nove hamsters Golden Syrian adultos machos receberam uma dieta hiperlipídica contendo 0,5% colesterol e 10% de óleo de coco (n=20, grupo dieta hiperlipídica) ou uma ração comercial usual (n=19, grupo controle) por 15 semanas. Os animais foram sacrificados e amostras de sangue foram coletadas para determinação do perfil lipídico, atividade da paroxonase 1 (PON1), da proteína de transferência de éster de colesterol (CETP) e da proteína de transferência de fosfolípides (PLTP), bem como a composição em lipídes da fração HDL. A transferência simultânea de colesterol livre (CL), éster de colesterol (EC), triglicérides (TG) e fosfolípides (FL) é baseada na troca de lípides ocorrida entre uma nanoemulsão lipídica artificial, marcada radioativamente com 14C-CL e 3H-TG ou 14C-FL e 3H-EC, e a HDL. Após precipitação química da nanoemulsão e das demais lipoproteínas, a capacidade da HDL em receber lípides foi quantificada pela medida da radioatividade presente na HDL. Além disso, a aorta e o fígado dos hamsters foram coletados para a determinação da composição em lípides e para análise histológica. Em relação ao perfil lipídico o colesterol total, HDL-C, n-HDL-C, FL, CL e EC foram maiores no grupo dieta hiperlipídica comparado ao grupo controle, já a concentração de TG não diferiu entre os grupos. A concentração de CL e EC da fração HDL foram maior no grupo dieta hiperlipídica. A transferência de 14C-CL, 3H-TG, 14C-FL e 3H-EC, bem como a atividade da CETP e da PLTP foram maiores no grupo dieta hiperlipídica. A atividade da PON1 não diferiu entre os grupos. A composição de CL da aorta foi maior no grupo dieta hiperlipídica comparado ao controle, no entanto o diâmetro interno e externo da aorta não diferiu entre os grupos. No grupo dieta hiperlipídica, a composição de EC, CL, TG e FL do fígado e o diâmetro dos hepatócitos foi maior do que no grupo controle. Dessa forma, a dieta hiperlipídica, i.e., enriquecida com colesterol e gordura saturada, em hamsters, modifica a composição em CL e EC da fração HDL, a sua capacidade em receber lípides, bem como outros aspectos relacionados ao seu metabolismo, o que pode alterar as propriedades antiaterogênicas da HDL. / High density lipoprotein (HDL) is known to protect against cardiovascular disease by removing the excess of cholesterol from peripheral tissues. However, other aspects of the HDL metabolism, as the transport of cholesterol of the other classes of lipoproteínas for the HDL should be sought to evaluate its protective action. Here, we tested the hypothesis whether a hyperlipidemic diet, in hamsters, alters the composition of the HDL fraction and ability of HDL to simultaneously receive lipids. Thirty-nine adult male Golden Syrian hamsters were fed hyperlipidemic diet containing 0.5% cholesterol and 10% coconut oil (n=20, hyperlipidemic diet group) or a regular chow diet (n=19, control group) for 15 wk. Then the animals were sacrificed and blood samples were collected for determination of plasma lipids, paraoxonase 1 (PON1), cholesteryl ester transfer protein (CETP) and phospholipid transfer protein (PLTP) activities, and lipids composition of the HDL fraction. Simultaneous transfer of phospholipids (PL), free cholesterol (FC), cholesteryl esters (CE) and triglycerides (TG) from an artificial lipidic nanoemulsion to HDL was performed in an in vitro assay, in which a nanoemulsion doubled labeled with either 14C-FC and 3H-TG or 14C-PL and 3H-CE was incubated with plasma and the radioactivity was counted in the HDL fraction after chemical precipitation. The aorta and the liver of the hamsters were collected for determination of the lipids composition and histological analysis. Plasma total cholesterol, HDL-C, n-HDL-C, CE, FC and PL were greater in the hyperlipidemic diet group than in the control group. However, TG levels were similar between the groups. Compared with the control group, the hyperlipidemic diet group had higher FC and CE in the HDL plasma fraction. Also, the transfer rates of 14C-FC, 3H-TG, 14C-PL and 3H-CE, CETP and PLTP were greater in the hyperlipidemic diet group compared with control group. PON1 activity was equal in both groups. The content of FC in the aorta tissue was greater in hyperlipidemic diet group, but the internal and external diameters of the aorta were equal in both groups. In hyperlipidemic diet group, the content of CE, FC, PL and TG in the liver and the diameter of the hepatocytes were greater than that measured in control group. The hyperlipidemic diet, i.e., dietary cholesterol and saturated fat, in hamsters, alters the FC and CE composition of the HDL fraction and lead to a disturbance in the ability of HDL to receive lipids. And consequently, may alter the antiatherogenic properties of this lipoprotein.