A demanda por frutas e hortaliças frescas, associada à necessidade de maior praticidade da vida atual, está causando um aumento no interesse, por parte dos consumidores, nos produtos minimamente processados (MP). Processamento mínimo inclui as operações de lavagem, corte, descascamento e embalagem do produto. Entre os microrganismos patogênicos que, potencialmente, podem ser transmitidos por vegetais MP citam-se: Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 e Salmonella sp. A pesquisa destes microrganismos é usualmente demorada mas, a cada dia, novos métodos para detecção rápida de patógenos em alimentos são lançados no mercado. Dentre estes métodos, aqueles que empregam ferramentas moleculares têm se tornado mais populares, cabendo destacar os que empregam a reação de polimerização em cadeia (PCR). Para a pesquisa de Listeria monocytogenes existe no mercado o sistema automatizado BAX®System que permite a detecção de L. monocytogenes em, no máximo, 54 h. Neste estudo, buscou-se avaliar a microbiota de vegetais folhosos MP além do emprego do sistema BAX® para a detecção de L. monocytogenes nestes produtos. Foram examinadas, no período de março a julho de 2003, 181 amostras de saladas MP coletadas em diferentes estabelecimentos comerciais no município de São Paulo, SP. Em 133 amostras foram feitas determinações das populações de coliformes totais e fecais, Enterobacteriaceae, microrganismos psicrotróficos aeróbios e pesquisa de Salmonella sp. L. monocytogenes foi pesquisada nas 181 amostras empregando-se o sistema BAX® e, paralelamente, a semeadura do caldo de enriquecimento em placas contendo ágar Palcam e Oxford, com a identificação das colônias suspeitas através de testes bioquímicos tradicionais. Das 133 amostras, 51% apresentaram populações de microrganismos psicrotróficos aeróbios > 106 UFC/g e 42% apresentaram populações de Enterobacteriaceae entre 105 – 106 UFC/g. Coliformes fecais estiveram presente em populações superiores a 102 UFC/g em 97 amostras (73%) e Salmonella foi detectada em 4 amostras (3%). L. monocytogenes estava presente em 1 (0.6%) amostra de espinafre das 181 amostras examinadas, tendo sido detectada, simultaneamente, por ambos os métodos empregados. As outras espécies de Listeria encontradas, empregando-se a semeadura em placa foram: L. welshimeri (1 amostra de alface mimosa) e L. innocua (2 amostras de agrião). Os resultados indicam que grande parte dos vegetais MP examinados, apresentaram qualidade microbiológica deficiente e podem ser veículos de patógenos como a Salmonella. O BAX®System é de grande utilidade para as análises de vegetais MP, que permite a obtenção de resultados mais rapidamente que o método tradicional, sem perda na sensibilidade e na especificidade. / The increasing demand for fresh fruits and vegetables, associated with the desire of convenient goodies, is causing an expansion on the market share of minimally processed products (MP). Minimal processing includes operations such as washing, cutting, peeling and packaging of the product. Amongst pathogenic microorganisms that can be transmitted by MP vegetables are: Listeria monocytogenes (Lm), Escherichia coli O157:H7 and Salmonella sp. Searching for these microorganisms is labor intense and time-consuming, however new methods for fast detection of pathogens are commercially available. Methods employing molecular technology are becoming more popular and the polymerase chain reaction (PCR) is now a good choice. There is an automatized PCR system (BAX®System) that can be used for Lm detection in up to 54 h. The aims of this study was to evaluate the microflora of MP vegetables and to evaluate the effectiveness of the BAX®System for screening Lm on those products. From March to July 2003, 181 samples of MP salads were collected at retail level in the city of São Paulo, SP. Total and faecal coliforms, Enterobacteriaceae, psychrotrophic microorganisms enumeration and Salmonella evaluation were conducted in 133 samples. L. monocytogenes was assessed in 181 samples using the BAX®System and also by plating the enrichment broth onto palcam and Oxford agars. Suspected colonies of Listeria were submited to classical biochemical tests. Population of psychrotrophic microorganisms >106 CFU/g was observed in 51% of the 133 samples and Enterobacteriaceae population between 105 - 106 CFU/g was in 42%. 97 samples (73%) showed population of faecal coliforms >102 CFU/g (Brazilian standard) and Salmonella was detected in 4 samples (3%). L. monocytogenes was detected in 1 spinach sample (0,6%) out of the 181 examined MP vegetables. This positive sample was simultaneously detected by both methods. The other Listeria species identified by plating were L. welshimeri (1 sample of curly lettuce) and L. innocua (2 watercress samples). The results indicate that the MP vegetables had poor microbiological quality and could be vehicle of pathogens such as Salmonella. BAX®System showed good specificity and sensitivity when used for vegetable analysis and was easier to perform and faster than the classical method.

Os ramnolipídeos (RL) são biossurfatantes que apresentam características de grande interesse para a indústria de alimentos, tais como alta biodegradabilidade, baixa toxicidade e propriedades emulsionantes. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do ramnolipídeo comercial (RL-Com - Jeneil Co.) e do ramnolipídeo produzido e purificado no Laboratório de Biotecnologia Microbiana (RL-LBM) sobre culturas de Listeria monocytogenes, através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) utilizando o método de microdiluição em caldo. Os valores de CIM dos RLs variaram entre 78,1 μg mL-1 e 2500 μg mL-1 sendo que a CIM predominante foi de 2500 μg mL-1. Dentre as 32 L. monocytogenes testadas 68,7% foram sensíveis ao RL-LBM e 90,6% sensíveis ao RL-Com. O efeito do ramnolipídeo sobre L. monocytogenes mostrou-se predominantemente bacteriostático. O RL aumentou a permeabilidade celular de L. monocytogenes, contudo este efeito não foi relacionado à sua atividade antimicrobiana. A interação entre os antimicrobianos RL-Com e nisina foi avaliada sobre dois isolados de L. monocytogenes com sensibilidades diferentes ao RL, o L17 menos sensível, com CIM de 2500 μg mL-1, e o L12 mais sensível, com CIM de 156,2 μg mL-1. O índice CIF obtido para os isolados foi de 0,078 e 0,18 , para L17 e L12 respectivamente, caracterizando o efeito sinérgico da combinação entre RL e nisina. As curvas de sobrevivência dos isolados L12 e L17 mostraram que a interação entre a nisina e o RL foi bactericida em concentrações menores que as obtidas individualmente para cada antimicrobiano. Para a L12 a combinação de 78,1 μg mL-1 de RL e 160 UI mL-1 de nisina reduziu completamente a população em 30 min de tratamento, e para a L17 a combinação de 156,2 μg mL-1 de RL e 320 UI mL-1 de nisina foi bactericida após 2 h. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o ramnolipídeo possui potencial como agente de controle de L. monocytogenes assim como efeito sinérgico quando combinado à nisina. / The rhamnolipids (RL) are biodegradable biosurfactants which have low toxicity and surface activity properties that can be useful for food processing industries. The objective of this study was to evaluate the susceptibility of Listeria monocytogenes with two rhamnolipids products: the rhamnolipid from P. aeruginosa LBI that was produced and purified in the Microbial Biotechnology Laboratory (RLMBL) and a commercial product (RL-Com - Jeneil Co.). Susceptibility tests were performed by the minimal inhibitory concentration (MIC) using the micro-broth dilution technique. The MIC values varied from 78.1 μg mL-1 to 2500 μg mL-1 and the 2500 μg mL-1 concentration was the predominant value . Among the 32 tested cultures, 68.7% were susceptible to RL-MBL and 90.6% to RL-Com. Results showed that the rhamnolipid activity was primarily bacteriostatic. The RL increases the membrane permeability of L. monocytogenes, however this effect was not directly related to its antimicrobial activity. The combined effect of nisin and RL-Com was evaluated against two wild-type isolates of L. monocytogenes, L12 more sensitive (MIC 156.2 μg mL-1) and L17 less sensitive (2500 μg mL-1). The FIC index for the isolates were 0.18 and 0.078 for L12 and L17 respectively, indicating a particular synergistic effect. The survival curve of isolates L12 and L17 showed that the combination between nisin and RL was bactericidal at lower concentration than for the individual antimicrobials. For L12 isolate 78.1 μg mL-1 of RL and 160 UI mL-1 of nisin eliminated the population after 30 min of incubation. The combination of 156.2 μg mL-1 of RL and 320 UI mL-1 of nisin reduced completely L17 population after 2 h of incubation. This work demonstrated the potential antimicrobial activity of rhamnolipids against L. monocytogenes, as well as the synergistic effect of this biosurfactant with nisin.

A formação de biofilme representa preocupação à indústria de alimentos pois é uma fonte crônica de contaminação. Encontrar estratégias eficientes para controlar o crescimento de microrganismos continua a ser um importante desafio. Uma delas é o uso dos ramnolipídeos (RLs), um biossurfatante produzido tipicamente por P. aeruginosa que apresenta potencial como agente antimicrobiano, anti-adesivo e dispersivo. Sua baixa toxicidade, biodegradabilidade, eficiência e especificidade em comparação aos surfatantes sintéticos podem torná-los promissores agentes de biocontrole. O presente estudo teve como objetivo estudar o potencial de uso de ramnolipídeos, em diferentes condições de concentração e temperatura, no controle e remoção de biofilmes de patógenos alimentares formados em meio de cultura e leite. Foram utilizadas Escherichia coli ATCC 43895, Listeria monocytogenes ATCC 19112, Staphylococcus aureus ATCC 8095, reconhecidos patógenos alimentares. Os biofilmes foram formados em placas de microtitulação de poliestireno nos meios de cultivo: caldo nutriente (CN), extrato de levedura com triptona de soja (TSYE) e matriz alimentar (leite) à 37 °C, por 24 h (E. coli) e 48 h (S. aureus e L. monocytogenes). Os biofilmes foram avaliados pela quantificação da biomassa, viabilidade celular, hidrofobicidade de superfície e análises qualitativa (microscopia eletrônica de varredura e de fluorescência) e quantitativa (caracterização da matriz polimérica). O ramnolipídeo foi submetido à análise físico-química de espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados obtidos para E. coli mostraram que a concentração de RL que mais removeu o biofilme foi 2 ‰, porém em temperaturas diferentes, para o CN à 25 °C e para o leite à 37 °C, com 33 ‰ e 80 ‰ de remoção, respectivamente. Para o biofilme de S. aureus em caldo nutriente os resultados mais eficientes foram à 25 °C, na concentração de 0,1 ‰ de RL e em leite 4 °C, na concentração de 0,05 ‰ de RL, com remoção de 35 ‰ e 89 ‰, respectivamente. O biofilme de L. monocytogenes em TSYE mostrou-se mais sensível à 37 °C, na concentração 0,5 ‰ de RL, o qual foi possível remover 35,3 ‰ da biomassa. Enquanto que em leite a 4 °C e 0,5 ‰ de RL, com remoção de 63,6 ‰ .Quanto à redução das células viáveis foi observado que para as bactérias Gram-positivas o tratamento mais efetivo foi à 4 °C com 0,05 ‰ de RL, nos meios CN e TSYEe 1 ‰ em leite. Para os biofilmes de E. coli a maior redução da viabilidade ocorreu em leite, após tratamento com RL 0,05 ‰ à 37 °C. As imagens de microscopia mostraram uma morfologia heterogênea na presença dos diferentes meios de cultivos, com destaque para os biofilmes de S. aureus (leite) e L. monocytogenes (TSYE), nos quais houve grande produção de matriz polimérica extracelular (MPE), e também apresentaram as maiores quantidades de carboidratos e proteínas. O tratamento com o ramnolipídeo reduziu a hidrofobicidade dos biofilmes. As análises de DLS e SAXS mostraram uma predominância em número de micelas com diâmetro entre 1-10 nm, independente das concentrações e temperaturas analisadas. De modo geral, a aplicação de ramnolipídeo promoveu remoção da biomassa celular como também redução de células viáveis presentes no biofilme. As evidências obtidas aqui, podem ser importantes subsídios para futuras investigações sobre as interações físico-químicas entre ramnolipídeos e a camada de biofilme visando aplicação como agentes sanitizantes em indústria de alimentos. / Biofilm formation is a concern to the food industry because it is a chronic source of contamination. Finding effective strategies to control the growth of microorganisms remains a major challenge. One strategy is the use of rhamnolipids (RLs), a biosurfactant typically produced by P. aeruginosa that has potential as antimicrobial, anti-adhesive and biofilm disrupting agent. RLs low toxicity, biodegradability, efficiency and specificity comparatively to synthetic surfactants, makes them promising biocontrol agents. This work aimed to study the potential use of rhamnolipid at different conditions of concentration and temperature, to control and removal of biofilms of food pathogens established in culture medium and milk. The bacterial strain utilized Escherichia coli ATCC 43895, Listeria monocytogenes ATCC 19112, Staphylococcus aureus ATCC 8095, are well-recognized food pathogens. The biofilms were formed in polystyrene microtiter plates in culture media: nutrient broth (NB), yeast extract and tryptone soya (TSYE) and in food matrix (milk) at 37 °C for 24 h (E. coli) and 48 h (S. aureus and L. monocytogenes). Biofilms were assessed by biomass quantification, cell viability, surface hydrophobicity, qualitative (scanning electron microscopy and fluorescence) and quantitative (characterization of polymer matrix) analysis. The rhamnolipid was subjected to physical and chemical analysis of dynamic light scattering (DLS) and X-ray small angle scattering (SAXS). E. coli biofilms were removed more efficiently using 2 ‰ RL, but at different temperatures for NB (25 °C) and milk (37 °C) showing 33 ‰ and 80 ‰ respectively. For the biofilm of S. aureus in NB the best results was obtained at 25 °C and 0.1 ‰ RL and in milk medium at 4 °C with 0.05 ‰ RL showing 35 ‰ and 89 ‰ of biofilm disruption, respectively. The biofilm of L. monocytogenes in TSYE was more sensitive to the treatment at 37 °C with 0.5 ‰ RL, removing 35.3 ‰ of the biofilm; while in milk at 4 °C and 0.5 ‰ RL, biofilm removal reached 63.6 ‰. Reduction on cell viability was more effective for Gram-positive bacteria at 4 °C with 0.05 ‰ RL, for NB and TSYE and at 1 ‰ in milk. For E. coli biofilms the largest reduction of viability occurred in milk after treatment with 0.05 ‰ RL at 37 °C. The microscopy images showed a heterogeneous morphology in the presence of different media, especially biofilms of S. aureus (milk) and L. monocytogenes (TSYE), in which there was a great production of extracellular polymeric matrix (EPM), and also the highest amounts of carbohydrates and protein. The treatment with RL reduced the hydrophobicity of biofilms. The DLS and SAXS analysis of RL showed a predominance of micelles with diameters between 1-10 nm, independent of the concentrations and temperatures utilized. In general, the application of rhamnolipid promoted a reduction in biofilm mass as well in cell viability. The evidences obtained can provide a basis for future research on the physical and chemical interactions between rhamnolipid and biofilm layer aiming their application as sanitizers in food industry.

Listeria monocytogenes é um microrganismo patogênico psicrotrófico e consequentemente de grande importância para alimentos conservados em refrigeração. Vários estudos têm demonstrado que é possível utilizar antimicrobianos naturais, como bacteriocinas e compostos fenólicos, para retardar a multiplicação desse patógeno em produtos cárneos refrigerados. Entretanto, sabe-se que a atividade antimicrobiana desses compostos pode ser influenciada pelos componentes da matriz alimentar. Esse trabalho de mestrado pretendeu avaliar a influência dos ingredientes de lingüiça frescal de suíno na ação inibitória de óleo essencial de orégano (OEO) e nisina sobre Listeria monocytogenes. Foram realizados testes com diferentes modelos alimentares preparados com carne suína moída adicionada de cada um dos ingredientes utilizados na fabricação de lingüiça frescal (sais de cura, açúcar, antioxidante, emulsificante, condimentos e NaCl) separadamente, comparando-se os resultados com os obtidos no modelo contendo todos os ingredientes simultaneamente. Pretendeu-se também avaliar a interferência do tempo de contato da nisina e óleo essencial de orégano com os diferentes modelos alimentares na ação antimicrobiana sobre L. monocytogenes. Os resultados indicaram que os antimicrobianos foram capazes de inibir a multiplicação de L. monocytogenes em todos os modelos analisados armazenados à 5ºC por até 72h. Comparando-se todos os modelos compostos por carne adicionada de apenas um dos ingredientes, a maior atividade antilisterial foi observada no modelo composto de carne com antioxidante. Entretanto, essa atividade inibitória foi menor do que a obtida no modelo contendo todos os ingredientes em conjunto. Quanto à influência do tempo prévio de contato entre os antimicrobianos e os modelos estudados na ação antilisterial, observou-se que na formulação com todos os ingredientes a ação foi mais intensa quando o contato foi de 2h. Entretanto, neste modelo o efeito mais duradouro foi obtido com 12h de contato prévio. Nos demais modelos, o maior efeito foi obtido no tempo zero. Os resultados permitem concluir que cada um dos ingredientes da formulação da lingüiça contribui com uma parcela na ação antilisterial do OEO e nisina nesse produto, e que essa ação é influenciada pelo tempo de contato prévio entre os modelos e os agentes antimicrobianos. / Listeria monocytogenes is psychrotrophic pathogen and, consequently, very important for cold-preserved foods. Many studies have demonstrated that natural antimicrobials such as bacteriocins and phenolic compounds can be used to inhibit the growth of this pathogen in refrigerated meat products. However, it is known that the antimicrobial activity of these antimicrobials may be influenced by components of the food matrix. The aim of the present study was to evaluate the influence of the ingredients of \"lingüiça\" in the inhibitory activity of O.E.O. and nisin against L. monocytogenes. The study was carried out with different food models prepared with minced raw pork meat added separately of each ingredient used for manufacturing \"lingüiça\" (curing salts, sugar, antioxidants, emulsifiers, condiments and NaCl), and results were compared to those obtained in a model containing all ingredients simultaneously. The study also aimed to evaluate the interference of the contact time between the food models and the antimicrobials on the effect against L. monocytogenes. Results indicated that the antimicrobials added to the models were able to inhibit the growth of the pathogen at 5ºC up to 72h. Comparing the models, the highest antilisterial activity was observed in the model containing pork meat and antioxidants. However, this inhibitory activity was lower than that observed in the model with all ingredients. What concerns the influence of contact time in antilisterial activity, we observed that in the model containing all ingredients the antilisterial activity was more intense after 2h of contact, but the more lasting effect was observed after 12h of contact. In the other models, the most intense effect was noted in time zero. The conclusions of the study are that each ingredient used in manufacture of \"lingüiça\" has its share in the antilisterial activity of nisin and OEO in this product and that this activity is influenced by the contact time between the food matrix and the antimicrobials.

A aplicação das bacteriocinas de bactérias láticas como agentes de bioconservação de alimentos é dependente de vários fatores, com destaque para composição química do alimento que pode interferir na eficácia da atividade antimicrobiana. Esse estudo objetivou avaliar a influência de ingredientes da matriz alimentar na multiplicação e produção das bacteriocinas por Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a e na atividade das bacteriocinas produzidas, trabalhando-se com um modelo composto de extrato de carne, extrato de levedura, proteose peptona e amido, adicionado de 4% de NaCl e/ou 0,5% de glicose e mantido em refrigeração (4° C) por até 10 dias. O estudo foi realizado com os seguintes materiais contendo as bacteriocinas: 1. sobrenadante concentrado livre de células obtido a partir da cultura de L. sakei 2a em caldo MRS; 2. extrato ácido neutralizado obtido do sedimento da cultura em caldo MRS e 3. extrato ácido neutralizado e semi-purificado por cromatografia líquida. Listeria monocytogenes Scott A foi empregada como microrganismo indicador da atividade antimicrobiana e Lactobacillus sakei ATCC 15521 como controle não produtor de bacteriocinas. Os resultados indicaram que nenhum dos ingredientes do modelo avaliado teve papel importante na multiplicação de L. sakei 2a e na bacteriocinogênese. No entanto, 4% de NaCl interferiu negativamente na produção das bacteriocinas, enquanto 0,5% de glicose auxiliou a produção, mesmo na presença de 4% de NaCl. Em relação à atividade das bacteriocinas, verificou-se que nem os ingredientes do modelo, nem 4% de NaCl e nem 0,5% de glicose apresentaram interferência marcante ao longo dos dez dias estudados, independentemente do material contendo as bacteriocinas testado. / The application of bacteriocins produced by lactic acid bacteria as biopreservatives in foods depends of several factors, such as the chemical composition of the food, which can interfere with the antimicrobial activity. This study aimed to evaluate the influence of food ingredients on the growth and production of bacteriocins by Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a, and on the activity of the bacteriocins produced, by means of a food model prepared with meat extract, yeast extract, proteose-peptone and starch, added of 4% 4% de NaCl and/or glucose, maintained under refrigeration (4° C) for up to 10 days. The study was carried out with the following bacteriocins-containing materials: 1. the concentrated cell-free supernatant from an overnight culture of L.sakei 2a in MRS broth; 2. acid extract obtained from the sediment of the overnight culture of L. sakei 2a in MRS broth and 3. acid extract submitted to a semi-purification by HPLC. Listeria monocytogenes Scott A was used as the antimicrobial activity indicator microorganism and Lactobacillus sakei ATCC15521 as the non-bacteriocinogenic negative control. Results indicated that none of the ingredients presented a significant role in the growth of L.sakei 2a, and in the production and activity of the bacteriocins. However, 4% of NaCl caused a reduction on the production of bacteriocins, while 0,5% of glucose stimulated their production, even in the presence of 4% of NaCl. The interference of the ingredients of the model, 4% of NaCl and/or 0,5% of glucose on the activity of the bacteriocins was not marked, regardless the materials used in the tests.

O controle de Listeria monocytogenes (Lm) nas plantas processadoras de alimentos é uma tarefa difícil, devido à sua capacidade em formar biofilmes e se adaptar às condições adversas do ambiente. A sobrevivência a altas concentrações de cloreto de sódio, além da multiplicação em temperaturas de refrigeração são outras duas importantes características de isolados de Lm, incluindo os dois sorotipos mais prevalentes da espécie (4b e 1/2a). Os objetivos deste estudo foram avaliar o comportamento de multiplicação, da expressão gênica global e da virulência dos dois principais sorotipos de Lm em ambientes de estresse encontrados por esses micro-organismos na indústria de alimentos. Para tanto, 22 cepas de Lm - 12 isoladas de casos clínicos (seis cepas sorotipo 4b e seis sorotipo 1/2a) e 10 isoladas de alimentos (seis sorotipo 4b e quatro sorotipo 1/2a) - além de uma cepa de Listeria monocytogenes Scott A e outra de Listeria innocua, foram inoculadas em caldo BHI com atividade de água (aw) 0,94 (11% NaCl) e incubadas a 4°C, 10°C e 25°C durante 73, 42 e 15 dias, respectivamente. A 4°C, a maior parte das cepas, tanto clínicas como de origem alimentar, conseguiu se manter viável ou ainda se multiplicar e aumentar até 2 log UFC/ml a partir da população inicial. Já a 10°C, a maioria das cepas conseguiu se multiplicar, porém diferenças significativas (p < 0,05) na duração da fase lag entre as cepas dos sorotipos 1/2a e 4b, independentemente da origem das mesmas, foram observadas (lag1/2a > lag4b). Diferenças estatísticas também foram observadas no que diz respeito às cepas de Lm sorotipo 4b, quando incubadas a 25°C em meio de cultura BHI com aw 0,94, apresentando maiores taxa de multiplicação e concentração populacional máxima (p < 0,05) em comparação às cepas de Lm sorotipo 1/2a submetidas às mesmas condições. Já com relação ao potencial de virulência das cepas, não foram detectadas diferenças estatísticas entre os sorotipos com relação a sua capacidade hemolítica, entretanto, a capacidade de invasão das cepas sorotipo 4b em células Caco-2 foi maior (p < 0,05) em comparação ao sorotipo 1/2a. Além disso, análises comparativas pré e pós-estresse osmótico confirmaram o aumento no potencial de invasão (p < 0,05) tanto das cepas sorotipo 1/2a, quanto 4b após o contato com elevadas concentrações de sal. O papel dos reguladores de transcrição Sigma B e PrfA na sobrevivência de Listeria monocytogenes, sob condição de estresse osmótico, também foi avaliado. Ensaios de microarray com cepas das linhagens I e II demonstraram maiores níveis de transcrição para 173 e 68 genes, respectivamente, na cepa selvagem quando comparada à cepa mutante &#916sigB, incluindo genes relacionados à virulência (internalinas), sobrevivência a condições de estresse e metabolismo. Os resultados obtidos confirmam a habilidade de cepas de Lm se manterem viáveis ou mesmo se multiplicarem em baixas temperaturas, bem como em ambientes com elevada pressão osmótica, independentemente do sorotipo ou origem, enfatizando a necessidade de tomada de medidas efetivas de controle desse patógeno pela indústria de alimentos uma vez que cepas de Lm podem, além de sobreviver às condições adversas, ter seu potencial de virulência aumentado. Os dados obtidos também indicam a necessidade de mais estudos de avaliação comportamental e viabilidade de Lm em ambientes com concentração de sal modificada, uma vez que a discussão sobre a diminuição nos teores de sal em alimentos vem ganhando importância mundialmente. / The control of Listeria monocytogenes (Lm) in food processing plants is difficult due to its ability to form biofilms and adapt to adverse environmental conditions. The survival at high concentrations of sodium chloride and growing at low temperatures are two other important features of Lm isolates, including the two most prevalent serotypes (1/2a and 4b). The objectives of this study were to evaluate the growing behavior, global gene expression profile and virulence potential of the two main serotypes of Lm under osmotic stress environments encountered by these microorganisms in the food industry. 22 Lm strains - 12 isolated from clinical cases (six strains serotype 4b and six serotype 1/2a) and 10 isolated from food (six serotype 4b and four serotype 1/2a) - plus one L. monocytogenes Scott A and one Listeria innocua were inoculated into BHI broth with water activity (aw) 0.94 (11% NaCl) and were incubated at 4°C, 10°C and 25°C during 73, 42 and 15 days respectively. At 4°C, the majority of strains both clinical and food were able to remain viable and to grow (up to 2 log CFU/ml). At 10°C, most strains could grow but significant differences (p < 0.05) on the lag phase duration between the serotypes 1/2a and 4b strains, regardless their origin, were observed (lag1/2a > lag4b). Statistical differences were also observed related to Lm serotype 4b strains when grown in BHI with aw 0.94 at 25°C, that showed higher maximum growth rate and final density (p < 0.05) compared to Lm serotype 1/2a strains. Regarding the virulence potential, there were no statistical differences among serotypes with respect to its hemolytic activity, however, the invasiveness of serotype 4b strains in Caco-2 cells was higher (p <0.05) than serotype 1/2a. Furthermore, comparative analyzes before and after osmotic stress confirmed the increased potential for invasion (p < 0.05) in both serotypes (1/2a and 4b) after being submitted to high salt concentrations. The role of transcription regulators sigma B and PrfA in L. monocytogenes survival under osmotic stress condition was also evaluated. Microarray assay using lineage I and II strains showed increased transcription levels in 173 and 68 genes, respectively, when comparing the wild type strains to the mutant &#916sigB strain. This included genes related to virulence (internalina), survival under stress conditions and metabolic genes. The results confirm the ability of Lm strains in remain viable or even grow at low temperatures and in high osmotic pressure environments, regardless of serotype or origin. They also emphasize the need for effective measures to control this pathogen by food industry since it is possible that Lm strains survive under adverse conditions and also increase its virulence potential. The data also indicate the need for additional studies regarding the behavior of Lm in environments with modified sodium chloride concentration since the discussion about salt levels in foods is increasing worldwide.

Leite integral de búfala foi experimentalmente contaminado com Mycobacterium fortuitum e Listeria monocytogenes. Foi feita a análise quantitativa dos agentes imediatamente antes e depois de dois tratamentos térmicos: pasteurização (do leite) e filagem (da Mozzarella). Na análise da Listeria, foi empregada metodologia adaptada para a obtenção do NMP, usando os meios UVM, Fraser e Palcam como pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento, respectivamente. O Mycobacterium foi semeado em placas com meio Löwenstein-Jensen modificado. Os resultados mostraram que a pasteurização do leite reduziu em média 6,0 log NMP/mL de Listeria sp e 4,0 log UFC/mL de Mycobacterium sp. A filagem da coalhada reduziu em média 8,37 log NMP/g de Listeria sp e 6,3 log UFC/g de Mycobacterium sp. Concluiu-se que a filagem da Mozzarella foi mais eficiente que a pasteurização do leite na redução do inóculo de Listeria monocytogenes e Mycobacterium fortuitum em cerca de 2 logaritmos de cada agente. / Whole buffalo milk was experimentally contaminated with Mycobacterium fortuitum and Listeria monocytogenes. The quantitative analysis of the agents was made immediately before and after two thermal treatments: pasteurization (of milk) and stretching (of Mozzarella). In the analysis of the Listeria, methodology adapted for the attainment of the MPN was used, employing UVM, Fraser and Palcam as not selective enrichment, selective enrichment and isolation, respectively. The Mycobacterium was plated onto modified Löwenstein-Jensen. The results had shown that the pasteurization of milk reduced 6,0 log MPN/mL Listeria sp on average, and 4,0 log CFU/mL de Mycobacterium sp. The stretching of the curd reduced 8,37 log MPN/g de Listeria sp on average, and 6,3 log CFU/g de Mycobacterium sp. It has been concluded that the stretching of Mozzarella was more efficient than the pasteurization of milk in the reduction of Listeria monocytogenes inoculum and Mycobacterium fortuitum in about 2 logarithms of each agent.

O Brasil tem uma grande produção leiteira, e, embora seu comércio seja ilegal, o leite cru é consumido por uma parcela da população, principalmente na zona rural. Visando avaliar o risco associado ao consumo de leite cru, esse trabalho estudou a ocorrência de Listeria monocytogenes e Salmonella spp. em leite cru produzido em quatro importantes regiões produtoras de leite do Brasil, fazendo uma correlação com os níveis de contaminação com outros microrganismos indicadores de qualidade do produto (bactérias aeróbias mesófilas totais, coliformes totais e Escherichia coli), bem como investigou a presença de substancias químicas empregadas no manejo do gado bovino (sanitizantes, antibióticos e defensivos agrícolas). Foi também avaliada a interferência de alguns fatores na detecção desses dois patógenos em leite cru, incluindo sensibilidade da metodologia analítica, possível ação inibitória dos resíduos químicos e o possível antagonismo microbiano da microbiota autóctone do leite sobre L. monocytogenes ou Salmonella spp. O estudo foi conduzido com amostras de leite cru obtidas em 210 fazendas leiteiras localizadas nos Estados do Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul e Minas Gerais, selecionadas de acordo com as diferentes práticas de ordenha e de equipamentos disponíveis. Os resultados indicaram ausência dos dois patógenos em todas as amostras estudadas, embora grande parte (48,6%) apresentasse contaminação microbiológica acima do especificado pela Instrução Normativa 51, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a vigorar a partir de julho de 2005. A presença de cloro não foi detectada em nenhuma das amostras, mas 11,4% foram positivas para antibióticos. A grande maioria das amostras (93,8%) foi positiva para organofosforados e/ou carbamatos. Quanto à sensibilidade das metodologias analíticas, verificou-se que sua capacidade de detectar os patógenos era dependente da contaminação microbiana presente. Os pesticidas não tiveram nenhuma ação inibitória sobre L. monocytogenes ou Salmonella spp. Das 360 colônias de bactérias isoladas das amostras de leite cru, 25,3% e 9,2% apresentaram antagonismo em relação à L .monocytogenes e Salmonella spp., respectivamente. A maioria dessas bactérias foi identificada como Lactococcus lactis subsp. lactis e Enterococcus faecium. Concluiu-se que L. monocytogenes e Salmonella spp. não devem ser considerados perigos de significância em leite cru produzido nas quatro regiões estudadas, mas resultados negativos devem ser interpretados com cuidado, pois há fatores que podem interferir no isolamento desses patógenos, especialmente em relação à L. monocytogenes, sendo a atividade antimicrobiana na microbiota autóctone o mais importante. / Brazil is a great milk-producing country, and despite illegal its commercialization, raw milk is consumed by certain groups of people, especially in rural areas. Aiming to evaluate the risk associated to consumption of raw milk, this study evaluated the occurrence of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in raw milk produced in four important milk producing regions in Brazil, correlating this result with the levels of hygiene indicator microorganisms (total aerobic counts, fecal coliforms and Escherichia coli) and the presence of chemical substances used in animal rearing (sanitizers, antibiotics and pesticides). The study also evaluated some factors that may interfere in the detection of both pathogens in raw milk, mainly sensitivity of the analytical method, potential inhibitory activity of chemical residues and antagonism of the autoctonous microbiota. The study was conducted with raw milk samples collected in milk farms located in four Brazilian States: Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul and Minas Gerais, selected according to milking procedures and machinery availability. Results indicated that both pathogens were absent in the samples, despite 48.6% of the samples were not in accordance to the standards of the Brazilian Ministry of Agriculture (Instrução Normativa 51), that will be in place next July 2005. Chlorine was not detected, but 11.4% of the samples were positive for antibiotics. The great majority (93.8%) was positive for organophosphorous and/or carbamate pesticides. Results conformed that the sensitivity of the analytical method is dependent on the level of microbial contamination of the samples. The pesticides presented no action over the tested pathogens. Among 360 bacterial colonies isolated from the milk samples, 25.3% and 9.2% were active against L. monocytogenes e Salmonella spp., respectively. Most of them were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis and Enterococcus faecium. It was concluded that L. monocytogenes and Salmonella spp. should not be considered relevant pathogens in raw milk produced in the four tested regions in Brazil, but the negative results should be interpreted with care because there are factors that may interfere in the isolation of the pathogens, mainly L. monocytogenes, being the antagonism of components of the autoctonous microbiota the most important.

Devido à gravidade da manifestação clínica e pelas altas taxas de mortalidade em populações de risco, o controle e a prevenção da listeriose, doença causada pela L. monocytogenes, representa um importante desafio às autoridades sanitárias. A dificuldade de recuperar organismos envolvidos nos surtos, a sub-notificação e a demora na realização de análises convencionais são alguns dos fatores que retardam ou impedem intervenções em situações de surto. Com o advento da biologia molecular,novas técnicas têm sido empregadas para a identificação e tipificação da L. monocytogenes, com o intuito de contribuir com os estudos epidemiológicos e de vigilância sanitária de alimentos. O presente estudo visou confirmar a taxonomia e o perfil genotípico de 31 cepas isoladas de diversos tipos de carne, supostamente identificadas como L. monocytogenes, por intermédio das técnicas de Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR), com o emprego de iniciadores de identificação dos genes 16S rRNA e Internalina A e B, para confirmação da espécie. Os resultados indicaram que apenas 20 (65%) das cepas foram confirmadas como sendo da espécie investigada. Foi realizada ainda a avaliação de similaridade nas 20 cepas confirmadas, através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), que revelou grande diversidade genotípica, caracterizada por 18 diferentes perfis, segundo o coeficiente de similaridade de Pearson. Os resultados demonstraram que as técnicas moleculares são de grande utilidade para a identificação e tipificação de L. monocytogenes, caracterizando-se como importantes ferramentas epidemiológicas. / Due to the seriousness of clinical manifestations and high rates of mortality of the listeriosis disease in populations at risk, control and prevention of this disease, caused by L. monocytogenes, represent an important challenge to sanitation authorities. Difficulties of recovering organisms involved in outbreaks; sub notification; and, the delay in accomplishing conventional analysis are some of the factors that slow-down or even prevent health interventions in outbreak occurrences. With the advent of the molecular biology, new techniques have been employed for identifying and typifying the L. monocytogenes aiming at contributing to studies on epidemiology and sanitary surveillance of foods. The present study aimed at ratifying the taxonomy and the genotypic profile of 31 isolated stocks of varied types of meats supposedly identified as L. monocytogenes by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR) employing identification starters of genes 16 rRNA and A and B Internalin in order to confirm the species. Results indicated that only 20 (65.0%) of the stocks were confirmed as being from the investigated species. Another evaluation of similarity were also carried out along with the 20 stocks ratified through pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which disclosed a great genotypic diversity characterized by 18 different profiles, according to the Pearson’s similarity coefficient. Results demonstrated that the molecular techniques are very helpful for identifying and typifying the L. monocytogenes, characterizing themselves as important epidemiological tools.

Este estudo objetivou analisar o potencial de deterioração da microbiota psicrotrófica presente em presunto cozido fatiado comercializado entre Maio e Junho de 2015 e Fevereiro e Março de 2016 no mercado público da cidade de Porto Alegre/RS e avaliar a influência de fatores ambientais na qualidade microbiológica do mesmo. Os presuntos foram coletados em 4 bancas desse local e foram realizadas contagens de bactérias psicrotróficas de 8 amostras e pesquisa de Listeria monocytogenes. Selecionaram-se 134 colônias de psicrotróficos isolados de presunto fatiado, 71 deles apresentaram atividade proteolítica, 58 atividade lipolítica e 12 apresentaram produção de exopolissacarídeo. Selecionaram-se 2 bactérias com a presença dessas atividades para identificação molecular, as quais foram identificadas como Kluyvera sp. e Carnobacterium sp. Além delas, mais 2 Listeria monocytogenes isoladas nesse trabalho foram submetidas ao teste de produção de biofilme, resultando como fracas formadoras e também ao teste de aderência em aço inoxidável, todas apresentando capacidade de adesão. A pesquisa de Listeria monocytogenes nos presuntos fatiados mostrou 100% de presença, sendo que 50% foram identificadas como L. monocytogenes, as quais pertenceram aos sorotipos 1/2a (1), 1/2b (2), 1/2c (2). Realizou-se análise de presunto cozido inteiro, em sua embalagem original, sendo que não foram encontrados micro-organismos Tratou-se o presunto fatiado com extrato de hibisco a 40% e pediocina a 0,5% e 1,0% e realizou-se contagem de mesófilos, psicrotróficos, Listeria spp., S. aureus e E.coli. O extrato de hibisco reduziu a carga desses micro-organismos. Pediocina 0,5% e 1% apresentaram pouca ação frente ao controle de mesófilos, psicrotróficos e E. coli, mas mantiveram a carga de S. aureus controlada e foram eficazes contra Listeria spp. Foram realizadas também contagens para Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesófilos e psicrotróficos em suabes oriundos de fatiador de alimentos, superfície de contato e utensílio utilizados nas bancas do mercado público. Em conclusão grande parte dos psicrotróficos apresentou atividade proteolítica e lipolítica, as quais alteram organolepticamente o alimento. Alguns apresentaram produção de biofilme e capacidade de aderência, fato indesejado, pois sua remoção é mais difícil no ambiente industrial, com isso nota-se que a legislação brasileira apresenta carência na contagem de psicrotróficos em produtos cárneos. / This study aimed to evaluate the microbiota present in sliced cooked ham sold in the public market in Porto Alegre/RS and evaluate the ability of compounds with antimicrobial activity of hibiscus extract and pediocin to control the microbiota found. Ham collected was stored refrigerated until to arrive the laboratory for analysis. Psychrotrophic bacteria counts were performed. Were selected 134 colonies of psychrotrophic microorganisms isolated for sliced ham and 71 of them showed proteolytic activity, 58 lipase activity, 12 showed production of exopolysaccharide. Two of these bacteria were selected for molecular identification which were identified as Kluyvera sp. and Carnobacterium sp. These two bacteria plus two Listeria monocytogenes isolated for sliced ham were subjected to testing of biofilm production (resulting as weak forming of biofilm) and were tested for adhesion in stainless steel and all showed this property. The research of Listeria spp. in sliced cooked ham showed 100% of presence, which 50% were identified as L. monocytogenes to serotypes 1/2a (1) 1/2b (2), 1/2c (2). Analysis was carried out of a whole piece of cooked ham in its original packaging and none microorganisms were found. The sliced ham was treated with hibiscus extract of 40% and pediocin of 0.5% and 1.0% and has been mesophilic, psychrotrophic, Listeria spp., S. aureus and E. coli counts The hibiscus extract reduced the quantity of these microorganisms. Pediocin 0.5% and 1,0% had little action against the control of mesophilic, psychrotrophic and E. coli, but in S. aureus counts were controlled bacteria charge and were effective against Listeria spp.. Also counts of Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesophilic and psychrotrophic bacteria were performed from swabs of slicer food, contact surface and food tool (knife or spatula) used in public market stalls. In conclusion, most of the psychrotrophs presented proteolytic and lipolytic activity, which alter organoleptically the food. Some of them have presented biofilm production and adhesion capacity, undesirable fact because when the biofilm is formed is more difficult to remove it in the industrial environment. With this it is showed that the brazilian legislation presents a lack in the research of psychrotrophs in meat products kept refrigerated.