Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) est l’agent pathogène responsable de la maladie de Johne qui est aussi connue sous le nom de paratuberculose. Cette maladie affecte principalement les ruminants, mais également d’autres animaux d’élevages et sauvages. Les mécanismes de pathogenèse de la paratuberculose sont toujours peu compris, mais il est connu que MAP est capable de s’évader du système immunitaire de son hôte pendant plusieurs années en utilisant les macrophages comme réservoir principal. L’effet de MAP dans l’infection des macrophages est souvent étudié en utilisant des vaches saines ou encore infectées de façon expérimentale, mais les études sur l’effet à long terme de la paratuberculose en étudiant les macrophages de vaches atteintes sont manquantes. Dans mon projet, le transcriptome de macrophages primaires dérivés des monocytes circulants infectés in vitro par MAP a été analysé par séquençage haut débit de l’ARN (RNA-seq). Des différences importantes dans les interactions hôtes-pathogènes ont été observées dans les signatures d’expression génique des vaches diagnostiquées comme négatives ou positives. Ces modifications mettent en lumière la mise en place de processus durables dans l’établissement de la paratuberculose. Les modifications clés observées lors de mon projet sont un débalancement immunométabolique, un changement dans l’homéostasie du cholestérol et des lipides intracellulaires, ainsi qu’un patron d’expression génique associé à l’établissement d’une tolérance mémoire chez les macrophages. En effet, les résultats obtenus lors de ce projet consolident l’hypothèse selon laquelle MAP pourrait induire un état de type tolérance dans les monocytes sanguins périphériques circulants lorsqu’ils se différencient en macrophages. De ce fait, MAP pourrait promouvoir davantage la persistance de la maladie en influençant le comportement des macrophages à long terme. Cette étude contribue à une meilleure compréhension du contrôle de MAP sur les cellules immunitaires et de ses mécanismes de survie.

Doctor of Philosophy / Department of Biology / Stephen K. Chapes / Silvia Mora Fayos / My work focused on understanding adipocyte function and regulation because of the importance to diabetes. In addition to being a fat storage depot, adipose tissue is an endocrine tissue. Adiponectin and leptin are two adipokines that control insulin sensitivity and energy balance. In spite of their importance, there are still questions about their secretion. I hypothesized that leptin and adiponectin follow different secretory routes. I found adiponectin localized in Golgi and the trans Golgi Network, while leptin mostly localized in ER during basal metabolisms. Common requirements for their secretion were the presence of class III Arf proteins and an intact Golgi apparatus, since BFA treatment inhibited secretion of both adiponectin and leptin. I found that trafficking of adiponectin is dependent on GGA1 coated vesicles. Endosomal inactivation significantly reduced adiponectin, but not leptin, secretion in both 3T3L1 and isolated rat adipocytes. Also, adiponectin, but not leptin, secretion was reduced in cells expressing non- functional form of Rab11 and Rab5 proteins. However, secretion of leptin, but not adiponectin was inhibited in cells expressing mutants of Protein Kinase D1. These results suggest that leptin and adiponectin secretion involve distinct intracellular compartments and pathways. Insulin resistance is associated with macrophage infiltration into adipose tissue and elevated levels of IL-6, TNF-alpha and IL-1beta Therefore, the second part of my dissertation tested the hypothesis that the interaction of macrophages and adipocytes causes insulin resistance. To test this hypothesis, I co-cultured macrophages and adipocytes. I found that mouse elicited peritoneal macrophages significantly decreased insulin-stimulated GLUT4 translocation to the plasma membrane in a contact-independent manner. IL-6 was the most inhibitory cytokine in reducing GLUT4 translocation, GLUT4 expression, Akt phsphorylation and reducing adipocyte differentiation compared to TNF-alpha and IL-1beta. These data suggest that IL-6 is the most effective cytokine secreted by macrophages involved in insulin resistance. Lastly, I tested the impact of adipocytes on macrophage differentiation in vitro and in vivo. I found that C2D macrophages isolated from the peritoneal cavity had increased IL-6 transcript levels after co-culture with 3T3L1 adipocytes in vitro. After i.p. injection, C2D macrophages isolated from WAT increased expression of mature macrophage surface markers and transcript levels of proinflammatory cytokines compared to C2D cells in vitro. However, macrophages isolated from BAT expressed low levels of cytokines and macrophage surface markers.

Notre équipe étudie les HSP, et notamment HSP110. Les HSP sont des chaperons impliqués dans le repliement des protéines nouvellement synthétisées et dénaturées. Les HSP sont surexprimées lors des stress et participent à la survie des cellules par leurs propriétés anti-apoptotiques et anti-agrégations. HSP110 est surexprimée dans le cancer colorectal et est associée à un mauvais pronostic. L’expression d’un mutant d’HSP110, nommé HSP110DE9, a été mise en évidence dans les cancers colorectaux de type MSI. Celui-ci y agit comme un dominant négatif, en se liant à HSP110 et en inhibant ses fonctions. Son expression sensibilise les cellules cancéreuses à la chimiothérapie et est associée à un bon pronostic chez les patients.Je me suis tout d’abord intéressé au rôle d’HSP110 dans la régulation de la voie oncogénique STAT3. Son activation est en effet associée à un mauvais pronostic, par l’induction de gènes impliqués dans la prolifération et la survie. La protéine HSP110 favorise la prolifération des cellules colorectales cancéreuses à travers cette voie. HSP110DE9 en revanche l’inhibe. Je me suis ensuite intéressé au rôle d’HSP110 sur la polarisation des macrophages dans le cancer colorectal. Celle-ci peut être sécrétée par les cellules cancéreuses et induit une polarisation pro-tumorale des macrophages. HSP110DE9, en bloquant la sécrétion d’HSP110, conduit en revanche à une polarisation pro-inflammatoire. L’effet d’HSP110 sur la polarisation implique le récepteur TLR4.L’ensemble de ces résultats montrent le rôle d’HSP110 dans la progression tumorale. HSP110 apparaît comme une cible thérapeutique dans le traitement du cancer colorectal. / Our team studies HSPs, including HSP110. HSPs are chaperones involved in the folding of newly synthesized and denatured proteins. HSPs are overexpressed under stress conditions and are involved in cell survival thanks to their anti-apoptotic and anti-aggregation functions. HSP110 is overexpressed in colorectal cancer and is associated with a poor prognosis. The expression of a mutant HSP110, named HSP110DE9, has been shown in MSI colorectal cancer. This one was shown to act there as a dominant negative, by binding HSP110 and inhibiting its functions. Its expression sensitizes cancer cells to chemotherapy and is associated with a better prognosis for patients.I was first interested in HSP110 role in regulating the oncogenic STAT3 pathway. Its activation is associated with a poor prognosis, as it induces the transcription of genes involved in proliferation and survival. HSP110 favors colorectal cancer cell proliferation through this pathway. Conversely, HSP110DE9 inhibited it.I then focused on the role of HSP110 on macrophage polarization in colorectal cancer. HSP110 can be secreted by cancer cells and induces a pro-tumoral macrophage polarization. In contrast, HSP110DE9, by inhibiting HSP110 release, leads to a pro-inflammatory polarization. HSP110 effect on macrophage polarization involve the TLR4 receptor.All these results show HSP110 role in tumor progression. HSP110 appear as a therapeutic target in the treatment of colorectal cancer.

Schistosoma mansoni est un parasite helminthe responsable de la schistosomiase intestinale, qui affecte 200 millions de personnes dans les zones tropicales et subtropicales, et l’on estime que 600 millions de personnes sont exposées au risque de cette infection. Le cycle de vie du parasite est complexe et il requière, un hôte définitif, l’homme et un hôte intermédiaire, un mollusque d’eau douce appelé Biomphalaria glabrata. C’est chez le mollusque où le parasite se multiplie de forme massive de là l’importance du mollusque dans la transmission du parasite à l’homme. Lors de l’infection le mollusque met en place une réponse cellulaire et humorale très marquées pouvant dans certains cas tuer le parasite. Malgré l’importance du mollusque, les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces réponses sont largement inconnus et donc l’étude de l’immunité du mollusque est une priorité en recherche médicale. Nous avons identifié deux orthologues de la cytokine de mammifère MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor ) BgMIF1 et BgMIF2. En utilisant des approches biochimiques et moléculaires en combinaison avec la technique de RNAi in vitro et in vivo nous avons démontré le rôle de BgMIF 1 et BgMIF2 comme régulateurs centrales de l’immunité innée du mollusque. En particulaire BgMIF1 régule l’activation des hémocytes et la réponse d’encapsulation lors de l’infection. D’un autre côté BgMIF2 régule dans la réponse antibactérienne. Nos résultats montrent que chez B. glabrata il y une régulation fine de la réponse immune innée et une capacité pour répondre de façon différente lors d’un challenge immunitaire. De plus une régulation par une cytokine de type vertébré dans un invertébré n’avait jusqu’à présent jamais été décrite. Nos travaux établissent les bases pour mieux comprendre les relations hôte-parasite dans une maladie comme la schistosomiase, et aussi constituent une avancée importante du point de vue de l’évolution de l’immunité innée en général.l / We have identified and characterized a Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) family member in the Lophotrochozoan invertebrate, Biomphalaria glabrata, the snail intermediate host of the human blood fluke Schistosoma mansoni. In mammals, MIF is a widely expressed pleiotropic cytokine with potent pro-inflammatory properties that controls cell functions such as gene expression, proliferation or apoptosis. Here we show that the MIF protein from B. glabrata (BgMIF) is expressed in circulating immune defense cells (hemocytes) of the snail as well as in the B. glabrata embryonic (Bge) cell line that has hemocyte-like features. Recombinant BgMIF (rBgMIF) induced cell proliferation and inhibited NO-dependent p53-mediated apoptosis in Bge cells. Moreover, knock-down of BgMIF expression in Bge cells interfered with the in vitro encapsulation of S. mansoni sporocysts. Finally, the in vivo knock-down of BgMIF prevented the changes in circulating hemocyte populations that occur in response to an infection by S. mansoni miracidia. These results provide the first functional evidence that a MIF ortholog is involved in an invertebrate immune response towards a parasitic infection and highlight the importance of cytokines in invertebrate-parasite interactions.

Macrophages are professional phagocytes that efficiently clear microbes, dying cells, and debris. Nonetheless, some pathogenic bacteria and parasites can subvert the macrophage phagosome into a vacuolar replicative niche. Exogenous macrophage activation by the cytokine interferon gamma (IFNγ) tips the equilibrium toward pathogen restriction, host survival, and subsequent adaptive immune responses. The relevance of IFNγ-induced immunity to human health has been demonstrated in patients with genetic defects in IFNγ signaling, who are profoundly susceptible to vacuolar pathogens such as Mycobacterium tuberculosis. Still, much remains to be discovered about IFNγ effector functions, and about their co-regulation by signaling downstream of the many innate immune sensors in macrophages. First, we asked whether IFNγ-induced vesicle trafficking mechanisms affect the maturation of phagosomes containing the bacterium Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaire's disease. We used functional genetic screening to discover candidate genes involved. From 380 genes in a curated vesicle trafficking-related set, 15 were selected as candidate IFNγ pathway members by RNAi screening in cell line and primary mouse macrophages. Functional validation of top candidates was inconclusive, but revealed potential roles for membrane tetraspanins and the AP3 complex in IFNγ-induced microbial restriction. Our second goal was to determine whether innate immune sensing affects IFNγ-induced bacterial restriction. Using macrophages from mice deficient in key elements of innate immune sensing pathways, we discovered that the antiviral transcription factor IRF3, which functions downstream of many nucleic acid sensing pathways, suppresses IFNγ-induced restriction of L. pneumophila and the protozoan parasite Trypanosoma cruzi. While activated IRF3 localizes to the nuclei in resting macrophages infected with L. pneumophila, it is mostly excluded from nuclei in macrophages activated with IFNγ prior to infection. This suggests a cascade of suppression in which IFNγ responses inhibit IRF3 activation, but residual IRF3 activity antagonizes IFNγ effectors. IRF3-mediated inhibition of IFNγ-inducible nitric oxide synthase was partially, but incompletely responsible for the phenotype observed; further candidate effectors were identified by gene expression profiling. We speculate that antagonism between IFNγ and IRF3-mediated mechanisms may facilitate a balance of vacuolar pathogen immunity with viral defense, or with protection of tissue damage by nitric oxide and other IFNγ-dependent responses.

Le diabète non insulino-dépendant de type 2 demeure un problème majeur de santé publique. Cette pathologie associée au vieillissement, à la sédentarisation et à l'obésité induit un taux élevé de complications. Parmi celles-ci, le défaut de cicatrisation et plus particulièrement le syndrome du " pied diabétique " est une des causes majeures de morbidité et de mortalité chez les patients diabétiques. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. C'est dans ce contexte que ce travail de thèse a été réalisé. La cicatrisation des plaies est un processus physiopathologique complexe, multifactoriel et dynamique visant à rétablir l'intégrité et la fonctionnalité des tissus lésés. Cette réponse biologique nécessite une orchestration et une communication précise entre les cellules inflammatoires infiltrées et les différentes populations cellulaires des tissus. De manière conventionnelle, on distingue 4 principales phases qui peuvent se chevaucher : une première étape d'hémostase généralement couplée à une phase inflammatoire précoce et arrêtée par une phase de résolution de l'inflammation. Une période de prolifération/ régénération permet la génération du nouveau tissu, et enfin, la phase de remodelage tissulaire permet au tissu de retrouver des caractéristiques d'élasticité et de souplesse proche du tissu original. Les données de la littérature suggèrent que le retard de cicatrisation des personnes diabétiques résulterait de la chronicité de la phase inflammatoire. Notre hypothèse de travail a été de démontrer que cette dérégulation était la conséquence d'un défaut majeur de la phase de résolution de l'inflammation. Notre objectif final a été d'agir sur cette phase pour accélérer le processus cicatriciel. La première étape de ce travail de thèse a consisté à mettre en place un modèle de lésions cutanées par excision chez des souris diabétiques de type 2 (en régime hyper lipidique ou déficientes pour le récepteur de la leptine, db/db). Ce modèle expérimental, combiné à la mise au point d'un dispositif médical innovant nous a permis (i) de recueillir stérilement les cellules et l'exsudat produit au niveau de la lésion cutanée, (ii) d'évaluer les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules de l'exsudat et (iii) d'évaluer le taux des médiateurs pro- et anti-inflammatoires au cours du temps. L'ensemble de ce travail a pu être réalisé en préservant l'environnement du tissu cicatriciel. Cette première étape a débouché sur le dépôt de 2 brevets en décembre 2011 (FR 2984719 - FR 2984722) suivi de leur extension Européenne l'année suivante. Cette approche expérimentale nous a permis de démontrer que la dérégulation du processus cicatriciel de souris diabétiques de type II était due, à une forte infiltration au niveau de la lésion de polynucléaires neutrophiles, de macrophages inflammatoires M1 et à un défaut d'afflux de macrophages anti-inflammatoires M2. Tout cela était associé à un défaut d'apoptose des cellules inflammatoires et de leur efférocytose. Ces dérégulations signent un défaut de résolution de l'inflammation que nous avons pu valider par la mise en évidence au niveau de l'exsudat inflammatoire et du tissu cicatriciel d'un excès de leucotriène B4 (LTB4) (métabolite de l'acide arachidonique pro-inflammatoire provenant de la voie de la 5-lipoxygénase) au dépend de la lipoxine A4 (LXA4) (métabolite de l'acide arachidonique anti-inflammatoire produit par les voies des 5-LOX et 12/15-LOX). Ces résultats acquis, nous nous sommes attachés à cibler, par une approche pharmacologique originale, la phase de résolution de l'inflammation pour favoriser la fermeture des plaies des souris diabétiques. / Non-insulin dependent type 2 diabetes is a major public health problem due to its prevalence and the high rate of its degenerative complications. Among these problems, healing disorders and more particularly "diabetic foot" ulcers are one of the leading cause of morbidity and mortality of diabetic patients. The understanding of the deregulation of cellular and molecular mechanisms of the wound healing process in diabetic patients is a key issue for the development of new therapeutic strategies. This work was carried out in this context. Wound healing is a physiological multifactorial and dynamic process aiming to the restoration of the integrity and functionality of injured tissue. This complex biological response requires an orchestration and a precise communication between immuno-inflammatory cells and resident cells in the wound tissue. This process can be divided into four distinct but overlapping phases: an inflammatory phase involving the initial stage of hemostasis arrested by a resolution phase of inflammation; a proliferative/regeneration stage and finally a tissue remodeling phase. Data from the literature suggest that the delayed healing in diabetic patient is principally due to chronic inflammation. Our hypothesis was to demonstrate that deregulation was the result of a major impairment of the resolution phase of inflammation. Our ultimate aim was to influence this phase to accelerate the healing process in diabetic mice. The first step of this study was to develop a new cutaneous excisional wound model in type 2 diabetic mice (in High Fat Diet or leptin receptor deficiency mice db/db). Associated with the development of an innovative device, this model allowed us (i) to treat the wound and follow the wound healing evolution (ii), to collect in aseptically condition and over time the secreted exudate, (ii) to evaluate the phenotypic and functional characteristics of exudate cells and to measure the amount of pro-and anti -inflammatory mediators. This first step leads to the publication of two patent applications (filed in December 2011 and published under the references FR 2984719 and FR 2984722). Our experimental approach demonstrate that the impaired wound healing process in type 2 diabetic mice was due to a strong neutrophil and inflammatory macrophage M1 infiltration, and a lack of influx of anti-inflammatory macrophages M2. All this is associated with a failure in the inflammatory cells apoptosis and efferocytosis. These dysregulations sign a default of resolution of inflammation that we have quantified by the measure of excessive leukotriene (LT) B4, (a proinflammatory arachidonic acid (AA) metabolite from the 5-lipoxygenase pathway) in both exudate and scar tissue, at the expense of the lipoxin (LX) A4 (an anti-inflammatory AA metabolite formed from LTA4 by 12/15-LOX). With an original pharmacological approach, we target the resolution of the inflammatory phase to promote wound closure in diabetic mice. For this we have decided to use topical application of acetylsalicylic acid on the wound (AAS-aspirin), 3 days after the establishment of the skin lesion. We demonstrate that aspirin accelerates wound closure in diabetic mice.

L’obésité est devenue une véritable épidémie mondiale qui résulte principalement de la surnutrition mais peut également avoir une origine iatrogène, par la prise au long cours de glucocorticoïdes (GC). Le but de ce travail a été d’identifier les mécanismes impliqués dans la survenue et dans le développement de l’obésité nutritionnelle et induite par les GC. Le modèle d’obésité induite par un régime hyperlipidique a permis de caractériser des perturbations intestinales associées: une capacité d’absorption des acides aminés élevée, un temps de transit ralenti et une perméabilité intestinale augmentée ainsi qu’une flore intestinale altérée qui pourraient concourir à moduler la balance azotée et énergétique.Parallèlement, le second modèle de diabète et d’obésité cortico-induits a révélé des effets différentiels des GCs selon les dépôts adipeux : une hyperplasie adipocytaire et une invasion précoce des macrophages spécifiquement au niveau viscéral ainsi qu’une polarisation macrophagique distincte entre les dépôts viscéraux et sous-cutanés. L’accumulation des macrophages viscéraux est responsable tout au moins partiellement de l’insulino-résistance induite par les GC. D’autre part, en terme d’homéostasie glucidique, le traitement par GC provoque des réponses différentes sur deux fonds génétiques distincts ce qui s’explique par une adaptation pancréatique souche-dépendante. L’ensemble de ce travail met en exergue différents mécanismes d’adaptation des organes périphériques à l’obésité. / Obesity becomes a worldwide epidemic due to over-nutrition, but also to drug treatments, particularly glucocorticoids (GCs). The aim of this work was to identify the mechanisms involved in obesity induced by high-fat diet or by GCs. High-fat diet-induced obesity model was used to characterize intestinal disturbances: an elevated amino acids absorption capacity, a delayed transit time and an increased intestinal permeability and an altered gut microbiota, which can further modulate nitrogen and energy balance. Meanwhile, GC-induced obesity model revealed differential effects of GCs on fat depots. Adipogenesis and an early increased macrophage infiltration were restricted to visceral adipose tissue with a differential macrophage polarization between visceral and subcutaneous fat pads. Visceral macrophage infiltration was responsible for GC-induced insulin resistance. Moreover, GC exposure resulted in opposite phenotypes of glucose metabolism in two distinct genetic murine backgrounds that could be explained by a strain-dependent pancreatic adaptation. Taken together, our work highlights adaptive mechanisms of peripheral organs during obesity.

Macrophage-conditioned medium (MacCM) inhibits the differentiation of rodent and human preadipocytes. Previous studies report that murine J774A.1-MacCM inhibits clonal expansion (early required phase of adipogenesis), including Rb phosphorylation. I hypothesized that MacCM induced alterations in cyclins and/or cyclin-dependent kinases (CDKs) were responsible for impairing Rb phosphorylation. My first objective was to assess the effect of J774A.1-MacCM on CDK4, CDK2, and their regulatory cyclins. Murine 3T3-L1 preadipocytes were differentiated with control medium or J774A.1-MacCM. Expression of cyclin D and A was inhibited by J774A.1-MacCM. Inhibition of cyclin A expression was associated with reduced differentiation-induced CDK2 activity. My second objective was to assess the expression patterns of cell cycle proteins in differentiating human abdominal subcutaneous preadipocytes, which do not undergo clonal expansion in culture. Cyclin E expression increased with differentiation. THP-1-MacCM (a human macrophage cell line) further enhanced this increase. My studies suggest MacCM leads to alterations in cyclin/CDK regulation during adipogenesis in murine and human preadipocyte models.

A degradable/polar/hydrophobic/ionic (D-PHI) polyurethane with properties intended to promote tissue regeneration in a small diameter peripheral artery vascular graft was evaluated for cell biocompatibility and growth. Films were cast in polypropylene 96 well plates for monocyte/endothelial cell (EC) co-culture in vitro studies and porous scaffold discs were implanted in an in vivo subcutaneous mouse model. After 7 days in culture the co-culture demonstrated cell adhesion and growth, low esterase activity (a measure of degradative potential and cell activation), no detectable release of pro-inflammatory cytokine (tumour necrosis factor -α) but measurable anti-inflammatory interleukin (IL)-10. The EC and the co-culture expressed the EC biomarker CD31, whereas the monocyte monoculture did not. Cytokine array analysis of the in vivo characterization of D-PH supported an anti-inflammatory phenotype of cells at the site of the implant. Levels of IL-6 significantly decreased over time while IL-10 was significantly higher at 6 weeks post implant. TNF-α levels did not change significantly from 24 hours onwards, however the trend was towards lesser amounts following the initial time point. Histological analysis of the explanted scaffolds showed excellent tissue ingrowth and vascularization. A live/dead stain showed that the cells infiltrating the scaffolds were viable. Both the in vitro and in vivo results of this thesis indicate that D-PHI is a good candidate material for tissue engineering a peripheral artery vascular graft.

Elevated Thyroid-Stimulating Hormone (TSH) is associated with an increased risk of cardiovascular disease (CVD). We hypothesized that TSH-stimulated FA release from adipocytes contributes to macrophage inflammation. 3T3-L1 and human subcutaneous differentiated adipocytes were treated with TSH for 4 hours under various conditions and lipolysis assessed via glycerol secretion. Optimal conditions were determined and protein expression of ATGL, HSL and perilipin remained stable. TSH-stimulated 3T3-L1 or human adipocyte-conditioned medium (T-ACM) was placed on murine J774 or human THP-1 macrophages, respectively, and macrophage cytokine mRNA levels (IL-1β, IL-6, MCP-1, and TNFα) were measured by real-time RT-PCR. T-ACM did not change cytokine mRNA expression in J774 macrophages or THP-1 macrophages when compared to ACM. Absence of BSA in the medium may have hindered release of FA from differentiated adipocytes into the medium, BSA may be required to permit adequate FA accumulation in the medium to then evaluate the effect of T-ACM on macrophages. Further investigation is required to determine the effect of FA on J774 and THP-1 inflammatory response.