A malária é responsável por cerca de 207 milhões de casos e 627 mil óbitos em todo o mundo. No Brasil, em 2013, foram registrados mais de 167 mil casos. Um dos grandes desafios para o controle da doença é o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos. Dentre as cinco espécies que podem causar malária em seres humanos, Plasmodium falciparum é a que apresenta maior habilidade de desenvolver resistência a quase todas as classes de medicamentos utilizados no tratamento. Estudos com marcadores moleculares têm associado mutações em diversos genes à resistência aos antimaláricos. A mutação K76T no gene pfcrt é relacionada à resistência à cloroquina. Mutações em pfmdr1 e aumento de seu número de cópias foram associados à resistência a diversos antimaláricos, como quinino, mefloquina e derivados de artemisinina. A resistência aos antifolatos é associada a mutações nos genes pfdhfr e pfdhps. Mutações nos genes pfATPase6 e pfAP2-u têm sido relacionadas à diminuição de sensibilidade à artemisinina. O monitoramento dessas mutações e suas associações às respostas in vivo e in vitro aos antimaláricos pode contribuir para a escolha de terapêutica para o controle da doença. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil genético relacionado à resistência em P. falciparum ao longo de 27 anos. Foram analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período entre 1984 e 2011, de pacientes atendidos em serviços de saúde nos estados do Pará e São Paulo, com infecções provenientes principalmente de países da América do Sul e África. A análise do gene pfcrt mostrou frequência de 100% da mutação K76T nas amostras de países da América do Sul ao longo das décadas analisadas. Este resultado é concordante com o fenótipo de resistência à cloroquina observado em 100% das amostras testadas in vitro para sensibilidade a este antimalárico. Amostras de países africanos apresentaram o genótipo selvagem em infecções únicas ou mistas. Com relação ao gene pfmdr1, a análise do códon 86 mostrou surgimento do mutante 86Y na última década em amostras da América do Sul e ocorrência de alelos selvagens e mutantes em amostras da África. Na análise do códon 1246 foi observada predominância do mutante 1246Y nas amostras sul-americanas e do selvagem D1246 nas africanas. Com relação ao gene pfdhfr, as amostras brasileiras apresentaram frequência de 100% dos mutantes 51I e 108N. O mutante 59R não foi observado no período 1980-1990, mas estava presente em 22,6% das amostras de 2000-2010. A análise do gene pfdhps das amostras brasileiras mostrou frequência de 100% do mutante 437G em todas as décadas e diminuição da frequência de 540E no período 2000-2010 em relação aos anteriores. O sequenciamento do gene pfATPase6 revelou a ocorrência de mutações que já haviam sido relatadas anteriormente, porém seu papel na resistência aos derivados de artemisinina ainda não foi elucidado. Na análise do gene pfAP2-? foram observadas duas novas mutações. Não foram observadas associações entre as mutações estudadas e a resposta in vivo e in vitro à mefloquina, quinino e derivados de artemisinina. Este estudo permitiu a avaliação do perfil genético de P. falciparum, com análise de marcadores moleculares relacionados à resistência a diversos antimaláricos, em amostras coletadas ao longo de 27 anos em que o parasito foi submetido à pressão de diferentes esquemas terapêuticos adotados no Brasil / Malaria is responsible for 207 million cases and 627 thousand deaths worldwide. In Brazil, in 2013, more than 167 thousand cases were reported. The major challenge for malaria control is the emergence and spread of resistance to antimalarials. Among the five species able to cause malaria in humans, Plasmodium falciparum presents ability to develop resistance to almost all classes of drugs for malaria treatment. Studies with molecular markers have associated mutations in several genes to antimalarial resistance. The mutation K76T in pfcrt is related to chloroquine resistance. Polymorphisms in pfmdr1 and increased copy number were associated to several antimalarials resistance, such as quinine, mefloquine and artemisinin derivatives. Resistance to antifolates is associated to mutations in pfdhfr and pfdhps genes. Mutations in pfATPase6 and pfAP2-u were linked to decreased sensibility to artemisinins. The monitoring of these mutations and their association with in vivo and in vitro responses may contribute to the choice of therapeutics for malaria control. The aim of the present study was to analyze the genetic profile related to resistance in P. falciparum over twenty-seven years. Samples collected from 1984 to 2011 from patients enrolled at health facilities in Para and Sao Paulo States were assessed. The origin of infections was mainly from South America and Africa countries. Pfcrt analysis showed that all samples from South America countries harbored the K76T mutation over the four decades, in agreement with the resistant phenotypic response of samples tested in vitro for chloroquine. African samples presented the wild type in mixed or single infections. Regarding to the pfmdr1 gene, the emergence of the mutant 86Y was observed in the last decade in South American samples and occurrence of both, mutant and wild type, in African ones. The analysis of 1246 showed only the mutant 1246Y in South American samples and the wild type D1246 in samples from Africa. Regarding to pfdhfr gene, the frequency of mutants 51I and 108N was 100% in Brazilian samples. The mutant 59R was not observed in the period 1980-1990 and it was present in 22.6% in samples from 2000-2010. The mutant 437G of pfdhps gene was observed in 100% of Brazilian samples in all decades and the frequency of mutant 540E decreased in the period 2000-2010 when compared to 1980-1990. The sequence analysis of pfATPase6 gene showed mutations previous described, but their role in artemisinin resistance is not well defined. Two novel mutations were observed in pfAP2-? gene. No association between the polymorphisms studied and in vivo or in vitro responses to mefloquine, quinine and artemisinin derivatives was observed. This study enabled the knowledge of P. falciparum genetic profile regarding to mutations related to resistance in samples collected over twenty-seven years, when the parasite was exposed to selective pressure of several therapeutic schemes adopted in Brazil

Uma família multigênica, polimórfica, ainda pouco conhecida de P. falciparum é a família SURFIN, codificada por dez genes denominados surf. Para abordar o modo de transcrição desses genes e observar se ocorre switching transcricional, monitoramos a quantidade de transcritos analisando amostras por RT-qPCR ao longo de 40 reinvasões. O gene surf 4 foi claramente detectado em nossos ensaios, apresentando quantidade significativa de transcritos na fase esquizonte. Para analisar a localização e função de SURFIN 4, construímos linhagens transgênicas (por fusão à GFP) e por fusão de um domínio desestabilizador (DD24) que permite de forma controlada, desestabilizar a proteína e analisar a sua importânica. Não houve alteração na viabilidade dos parasitas com SURFIN 4 desestabilizado, no entanto detectamos um aumento significativo de transcritos quando SURFIN 4 foi diminuída. Estes achados apontam para um novo mecanismo de regulação gênica, ao menos para o gene surf 4 onde a proteína SURFIN 4 parece ser capaz de modular a quantidade do seu respectivo transcrito. / One smaller family of antigen variant of P. falciparum whose function is still unknown is surf genes. Some members appear in asexual blood stage forms and may be associated also to virulence associated processes. We accessed the transcription of the members of the surf gene family along multiple invasions by real time PCR. Based on the observation of constitutive expression of one surf gene, surf4.1, we created a parasite line which expresses a GFP, conditionally destabilized SURFIN4.1 protein. Upon destabilization of the protein, no differential growth rates were observed. However, when we monitored the transcription of SURFIN4.1 knocked-down parasites compared to their stabilized counterparts, we observed a strong increase in the transcript quantities of surf4.1 and also three other surf genes, pointing to a feedback of the SURFIN protein quantity to either the stability of surf transcripts or the transcriptional activity of surf loci. This type of potential regulation is yet unheard in Plasmodium biology.

A busca de adjuvantes que estimulem de forma eficiente à resposta imune celular representa uma importante contribuição para a pesquisa de vacinas. O principal objetivo deste trabalho foi a avaliação do efeito imunoestimulador de flagelinas expressas por linhagens de Salmonella sp., particularmente na ativação de respostas mediadas por células T CD8+, ao antígeno modelo ovalbumina. Em uma segunda etapa, foram investigados os efeitos adjuvantes da flagelina FliCd frente a um epítopo T CD8+, específico da proteína CS de P. yoelli. Animais foram imunizados com linhagens atenuadas de S. Dublin que expressam flagelinas geneticamente fusionadas ao epítopo CS ou com flagelina purificada co-administrada ou geneticamente fusionada ao antígeno alvo. A ativação de células T CD8+, foi monitorada por ELISPOT após estimulação com peptídeos específicos. Os resultados obtidos demonstram que a FliCd é capaz de modular o sistema imune, atuando particularmente na ativação de respostas mediadas por células T CD8+, sugerindo seu potencial para a composição de vacinas terapêuticas. / The search for adjuvants stimulating efficient cellular immune responses represents an important contribution in vaccine research. In the present work, we evaluated immunostimulatory effect of flagellins expressed by Salmonella sp. strains, particularly on activation of CD8+, T cells using ovalbumin as a model antigen. Secondly, we explored the adjuvant effect of the FliCd flagellin using an epitope from the CS protein of P. yoelli. Mice were immunized with S. Dublin strains that express flagellin genetically fused to CS epitope or purified flagellin co-administrated or genetically fused to the target antigen. The CD8+, T cells activation was monitored by ELISPOT after stimulation with specific peptides. Our results show that FliCd flagellin modulates the immune system, increasing CD8+, T cell activation, unveiling its potencial use in therapeutic vaccine approaches.

A malária é uma infecção causada por plasmódios, cujo controle depende do baço, o responsável pelo clareamento dos eritrócitos parasitos. O aumento da parasitemia induz uma ampliação do baço para resolver a infecção, onde participam células precursoras que apresentam CCD34+ na sua superfície. Estudamos a distribuição e a quantidade de células CD34+ em baços de roedores durante malárias de roedores, para compreender sua participação na ampliação do baço e no controle da infecção. Camundongos C57Bl/6j infectados com as cepas AJ e CR de Plasmodium chabaudi, e com a cepa ANKA de Plasmodium berghei, tiveram seus baços removidos e encaminhados para histologia e citometria de fluxo. A distribuição das células CD34+ mostrou-se mais intensa no 4º dia p.i. e menos intensa no 8º dia p.i.. As células CD34+ livres, por citometria de fluxo, surgem com uma onda no 4º dia p.i.. Sua quantidade é similar entre os modelos de P. chabaudi, mas diferente no P. berghei. Neste trabalho, o influxo de células CD34+ no baço não se relaciona com o controle da infecção. / Malaria is caused by Plasmodium sp., which control depends on the spleen, responsible for parasite clearing. The increase of parasitemia implies in spleen amplification to control the infection, with participation of CD34+ cells. We studied the distribution and amount of CD34+ cells in spleen during rodent malaria, to define the role of those cells in spleen amplification and infection control. C57Bl/6j mice were infected with strains CR and AJ of Plasmodium chabaudi, and ANKA strain of Plasmodium berghei. The spleen was removed and processed for histology and flow cytometry. Spleen CD34+ cells was increased in 4th day, p.i., and decreases in 8th day p.i. in all models. By flow cytometry, free CD34+ cells appears as a wave in the 4th day p.i.. P. chabaudi models presented the same level of those cells, which was larger in the P. berghei mice. In this work, increase of spleen CD34+ cells do not correlate with infection control.

Infecções por Plasmodium sp. podem levar a um quadro respiratório grave, com complicações pulmonares denominadas lesão pulmonar aguda e síndrome do desconforto respiratório agudo (LPA/SDRA). Inflamação aguda, lesão do endotélio alveolar e do parênquima pulmonar, disfunção e aumento da permeabilidade da barreira alvéolo-capilar e, consequente, formação de edema, caracterizam esta síndrome. O modelo experimental, que utiliza o parasita murino Plasmodium berghei ANKA e camundongos da linhagem DBA/2, é empregado no estudo de mediadores imunológicos e fatores que propiciam o estabelecimento das lesões pulmonares associados à LPA/SDRA. Diversos estímulos podem atuar diretamente no aumento da permeabilidade endotelial por meio da desestabilização dos microtúbulos, rearranjo dos microfilamentos de actina e contração das células endoteliais, via sinalização de Rho-GTPases, causando disfunção da barreira endotelial. Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar as alterações do citoesqueleto em células endoteliais primárias pulmonares de camundongos DBA/2 (CEPP-DBA/2), as vias de sinalização das principais Rho-GTPases e o estresse oxidativo, causados pela presença de eritrócitos parasitados com esquizontes de P. berghei ANKA (EP-PbA). As CEPP-DBA/2 foram estimuladas com TNF, VEGF ou IFNγ, em diferentes tempos de exposição, seguido da incubação com EP-PbA. Assim, foram realizados ensaios de imunofluorescência para análise do rearranjo de microfilamentos de actina e da desestabilização de microtúbulos. As vias de sinalização das Rho-GTPases foram avaliadas por Western blot, para as expressões proteicas de RhoA, Cdc42 e MLC. Além disso, ensaio fluorométrico foi realizado para detectar a produção de espécies reativas de oxigênio, resultantes do estímulo com eritrócitos parasitados. CEPP-DBA/2 estimuladas por EP-PbA, VEGF, TNF ou IFNγ, em associação ou não, apresentaram alterações morfológicas nos microfilamentos de actina e aumento dos espaços interendoteliais. Imagens de imunofluorescência também mostram desestabilização de microtúbulos e desfosforilação de FAK, causadas por EP-PbA. Os ensaios de permeabilidade validam que os eritrócitos parasitados com formas maduras de P. berghei induziram aumento da permeabilidade microvascular nas CEPP-DBA/2. Além disso, estas células, estimuladas com EP-PbA, demonstraram elevada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que pode estar contribuindo com o desenvolvimento de estresse oxidativo e com a injúria endotelial, assim como, com o aumento da permeabilidade vascular. O mais interessante é que estas alterações endoteliais podem estar relacionadas ao aumento da razão RhoA/Cdc42, da expressão proteica de MLC fosforilada e do sinal de ativação de RhoA. Em conjunto, estes resultados mostram envolvimento dos eritrócitos parasitados com esquizontes de Plasmodium berghei ANKA na desorganização do citoesqueleto e na disfunção da barreira alvéolo-capilar, via RhoA/Rho-kinase, o que pode estar contribuindo com a patogênese da LPA/SDRA associada à malária. / Infections by Plasmodium sp. can lead to a serious respiratory condition with pulmonary complications, named acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS). Acute inflammation, alveolar endothelium and lung parenchyma injuries, dysfunction and increased permeability of the pulmonary alveolar-capillary barrier and consequent formation of edema characterize this syndrome. Several stimuli can directly increase endothelial permeability through actin microfilaments rearrangement, via Rho- GTPases signaling, leading to endothelial barrier dysfunction. DBA/2 mice infected with Plasmodium berghei ANKA develop ALI/ARDS similar to that observed in humans. The purpose of this research was to assess cytoskeletal changes in DBA/2 mice primary microvascular lung endothelial cells (PMLEC), verify the signaling pathways of the Rho- GTPases and analyze the oxidative stress on these cells in the presence of P. berghei ANKA-infected red blood cells (PbA-iRBC). PMLEC were stimulated by TNF, VEGF or IFNγ followed by incubation with PbA-iRBC. Immunofluorescence assays were performed to analyze actin microfilaments rearrangement and microtubules destabilization. Western blot for RhoA, Cdc42 and MLC proteins were conducted to assess alterations in signaling pathways of Rho-GTPases. In addition, a fluorimetric assay was performed to detect the production of reactive oxygen species resulting from PbA-iRBC stimulus. P. berghei ANKA, VEGF, TNF and IFNγ stimuli, in association or not, caused morphological disturbances in actin microfilaments of PMLEC and an increase of intercellular spaces. Moreover, immunofluorescence images showed microtubules destabilization and FAK dephosphorylation in these cells, caused by PbA-iRBC. The permeability assay showed that PbA-iRBC induced an increase of microvascular permeability in PMLEC. In addition, PMLEC stimulated by PbA-iRBC, showed elevated production of ROS, which may be contributing to oxidative stress and increasing the damage of endothelial cells, as well as an increase of vascular permeability. Interestingly, these endothelial changes may be related to the increased RhoA/Cdc42 protein expressions ratio, augmented protein expression of phosphorylated MLC and RhoA activation signal. Taken together, these data demonstrate the involvement of P. berghei ANKA-infected red blood cells in cytoskeleton disorganization and alveolar-capillary barrier dysfunction, through of RhoA / Rho-kinase signaling pathway, which may contribute to ALI/ARDS pathogenesis.

A malária é a doença infecciosa mais prevalente em regiões tropicais e subtropicais e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com primers do 18S rRNA (4-8 cópias/parasito) no formato semi-nested ou nested-PCR são empregadas como referência. O genoma mitocondrial dos plasmódios é pequeno (6 kb) contendo três genes que codificam a enzima citocromo c oxidase I (cox I), a citocromo c oxidase III (cox III) e a citocromo b (cyt b), com número de cópias variando de 20-150/parasito. Esta pesquisa desenvolveu uma multiplex-PCR baseada na amplificação de cox I, cox III e cytb para a detecção simultânea de Plasmodium das espécies falciparum, vivax e malariae. A utilização de três pares de primers espécie-específicos, em uma única etapa de amplificação em lugar de uma nested-PCR (18S rRNA) poderia minimizar a ocorrência de contaminações (carry-over), reduzindo o custo das reações e o tempo para a liberação de resultados. A seleção dos primers empregou a estratégia ASO (Allele Specific Oligonucleotide), os amplificados das três espécies foram clonados e os plasmídeos contendo os insertos (controles positivos) foram usados em diluições seriadas determinar o limite de detecção que foi de 22,5 cópias para P. falciparum, 28,7 cópias para P. vivax e 32 cópias para P. malariae. Como cada parasito possui entre 20-150 cópias dos genes mitocondriais, a multiplex-PCR detectou 1 parasito das três espécies. Na etapa de validação, amostras antigas e recentes provenientes de regiões endêmicas foram testadas, todas com diagnóstico de gênero e espécie de Plasmodium. A multiplex-PCR foi mais sensível que a microscopia (gota espessa) quando 104 amostras foram testadas, e tão sensível quanto a semi-nested (n=60), a nested-PCR (n=6) e a PCR em Tempo Real (n=38). No entanto, na análise das espécies de Plasmodium, houve discordâncias da multiplex-PCR tanto em relação a gota espessa, quanto com a semi-nested-PCR principalmente na detecção de infecções mistas, havendo mais espécies detectadas pela semi-nested-PCR. Não houve discordâncias com a nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Testes de especificidade da multiplex-PCR utilizando DNA de outros microrganismos e de doadores de banco de sangue não encontraram reações cruzadas (100% de especificidade). O estudo concluiu que a multiplex-PCR foi desenvolvida com sucesso, com especificidade de 100%, apresentando sensibilidade superior à gota espessa e equivalente à semi-nested-PCR, nested-PCR e PCR em Tempo Real, no entanto com discordâncias na identificação de espécies. Estudos prospectivos com amostras apresentando resultados discordantes nos testes moleculares de referência deverão ser testadas para avaliar se a nova ferramenta molecular possui sensibilidade superior. / Malaria is the most prevalent infectious disease in tropical and subtropical regions and the Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the 18S rRNA sequence (4-8 copies/parasite) in semi-nested and nested-PCR formats are the reference tests. Plasmodium mitochondrial genome is small (6 kb) containing three genes encoding cytochrome c oxidase I (cox I), cytochrome c oxidase III (cox III) and cytochrome b (cyt b), with number of copies varying from 20-150/parasite. This research developed a multiplex-PCR based on the amplification of cox I, cox III and cytb for the simultaneous detection of Plasmodium falciparum, vivax and malariae. The use of three pairs of species-specific primers in a single amplification step rather than a nested-PCR (18S rRNA) could minimize the occurrence of carry-over, reducing the cost of reactions and the time to release of results. The selection of primers employed the ASO (Allele Specific Oligonucleotide) strategy. Amplification products of the three species were cloned and the plasmids containing the inserts (positive controls) were used in serial dilutions to determine the limit of detection (LoD) of 22.5 copies for P. falciparum, 28.7 copies for P. vivax and 32 copies for P. malariae. As each parasite has between 20-150 copies of the mitochondrial genes, the multiplex-PCR was able to detect 1 parasite of the three species. In the validation stage, old and recent samples from endemic regions were tested, all with diagnosis of genus and Plasmodium species. The multiplex-PCR was more sensitive than the thick blood smear when 104 samples were tested, and was as sensitive as the semi-nested (n=60), the nested-PCR (n=6) and the Real-Time PCR (n=38). However, in relation to Plasmodium species, there were disagreements of the multiplex-PCR with respect to both, the thick blood smear and the semi-nested PCR, mainly in the detection of mixed infections, with more species detected by the semi-nested-PCR. There were no disagreements with the nested-PCR and the Real-Time PCR. Multiplex-PCR specificity tests using DNA from other microorganisms and from blood bank donors found no cross-reactivity (100% specificity). The study concluded that the multiplex-PCR was successfully developed with specificity of 100%, presenting higher sensitivity than the thick blood smear and equivalent sensitivity to the semi-nested-PCR, the nested-PCR and the real-time PCR, however with disagreements in the identification of species. Prospective studies are needed to test the multiplex-PCR on samples with discordant results in reference molecular tests to assess whether the new molecular tool has superior sensitivity.

Estima-se que a malária seja responsável por um milhão de mortes anuais, atingindo principalmente crianças. O sistema imune participa tanto na proteção contra a infecção pelo plasmódio, como no desenvolvimento das síndromes associadas à malária (anemia, malária cerebral, acidose metabólica e choque sistêmico). Recentemente, tem sido mostrado que a imunidade inata é capaz de detectar sinais liberados por células ou tecidos danificados como o ATP e o ácido úrico. Esses sinais de perigo parecem ser importantes para promover a regulação da inflamação após o trauma ou injúrias ocasionadas pelos patógenos. Porém, a relevância fisiológica desses sinais na resposta imune e seu mecanismo de ação ainda não estão claros. Na malária, é provável que o ATP seja liberado no momento da ruptura dos eritrócitos, a partir de células danificadas do endotélio vascular ou de células do sistema imune mortas por ativação. Assim, neste estudo nós avaliamos o papel do ATP na ativação do sistema imune e no desenvolvimento da doença durante a infecção com P. chabaudi. Nossos resultados sugerem que, a concentração de ATP no soro e permeabilização de linfócitos do sangue é maior após a ruptura dos eritrócitos. Durante a infecção, as células T e as células dendríticas possuem uma capacidade exacerbada de resposta ao ATP, que pelo menos em parte depende do P2X7R. Além disso, a presença funcional de receptores purinérgicos parece ser importante para a fase inicial da resposta imune ao P. chabaudi. A inibição farmacológica do receptor reduziu o número de células, produção de IFN-<font face=\"Symbol\">g e injúria hepática. Desta forma a utilização do antagonistas do P2X7R poderia ser benéfico na resolução de problemas ocasionados pelo aumento acentuado do sistema imune. / It is estimated that malaria accounts for one million deaths annually, affecting mainly children. The immune system participates in both the protection against infection by the plasmodium, as in the development of the syndromes associated with malaria (anemia, cerebral malaria, metabolic acidosis and systemic shock). Recently, it has been shown that innate immune is able to detect signals released by damaged cells or tissues as ATP and uric acid. These danger signals appear to be important to promote the regulation of inflammation after trauma or injuries caused by pathogens. However, the physiological relevance of these signals in the immune response and its mechanism of action remain unclear. In malaria, it is likely that ATP is released upon rupture of erythrocytes, vascular endothelial cells damaged or dead cells of the immune system activation. In this study we evaluated the role of ATP in the activation of the immune system and the development of disease during infection with P. chabaudi. Our results suggest that ATP concentration serum and permeabilization of blood lymphocytes is higher after the rupture of erythrocytes. During infection T cells and dendritic cells have a heightened ability to respond to ATP which is partly dependent on P2X7R. Moreover, the presence of functional purinergic receptors appears to be important for the initial phase of the immune response to P. chabaudi. The pharmacological inhibition of the receptor reduced the number of cells, liver damage and IFN-<font face=\"Symbol\">g, thus the use of the P2X7 receptor antagonists could be beneficial in solving problems caused by the sharp increase in the immune system.

Nesta tese estudamos os repertórios das famílias multigênicas var (domínio DBLa), rif e stevor, importantes fatores de virulência, de Plasmodium falciparum em isolados brasileiros. Mostramos que estas famílias multigênicas podem ser conservadas entre diferentes isolados no Brasil, sugerindo que o repertório de genes variantes pode ser limitado em algumas localidades. Identificamos menos polimorfismos nos genes stevor que os genes var ou rif. Constatamos que genes var podem ser conservados ao longo do tempo em isolados brasileiros. Identificamos também os domínios DBLa e DBLb de genes var associados a citoaderência a CHOICAM1 em isolados de Rondônia. Mediante ensaios de ELISA, mostramos que domínios DBLbICAM foram reconhecidos de modo heterogêneo. Por citometria de fluxo, demonstramos que o parasita aderente em ICAM1 foi reconhecido majoritariamente pelo plasma de pacientes com infecção sintomática e menos de infecção assintomática. Além disso, identificamos por PCR em tempo real os genes var transcritos no clone 3D7 aderente em diferentes linhagens de células CHO. / Herein, we studied the repertoire of multigenic families of var (DBLa domain), rif and stevor from brazilian isolates of Plasmodium falciparum. We showed that these multigenic families could be conserved among different isolates from Brazil, suggesting that the repertoire of variant genes can be limited in certain areas. We identified less polymorphism in stevor genes than in var or rif genes. We also demonstrated that var genes can be conserved over time in Brazilian isolates and identified the DBLa and DBLb domains from var genes associated with cytoadherence to CHOICAM1 in Rondonian isolates. ELISA assays showed that these DBLbICAM domains were recognized in a heterogeneous fashion. By flow cytometry, we demonstrated that ICAM1-adherent parasites were stronger recognized by plasma from symptomatic infections than from non-symptomatic infections. Finally, we profiled the var gene transcripts in 3D7 parasites adherent to different CHO cells by real time PCR.

A malária apresenta um alto índice de mortalidade com mais de 500 mil mortes registradas em 2013. Para agravar a situação de saúde pública, foi descrito o surgimento de resistência às drogas usadas na terapêutica da doença. Torna-se necessário a identificação e o estudo de novos alvos antimaláricos. A via MEP se mostra como um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas contra P. falciparum uma vez que está ausente em humanos. Nossos objetivos foram avaliar a função da vitamina E biossintetizada pelo parasita, caracterizar a biossíntese de vitamina K1 e o metabolismo de fitol. Esse estudo determinou que a vitamina E biossintetizada pelo parasita atua no sistema redox do parasita. Por outro lado, mostramos que a biossíntese de vitamina K1 é ativa no parasita e detectamos sua forma reduzida. Por fim, observamos que existe uma via de reaproveitamento de fitol em P. falciparum assim como em plantas. O estudo abre oportunidades para um desenvolvimento racional de novos antimaláricos e aprofunda o conhecimento na biologia do parasita. / Malaria has the highest mortality rate with more than 500 000 deaths in 2013. The public health situation gets worse because it has been described the emergence of resistance to common drugs used in the treatment of disease. It is necessary to identify and study of new antimalarial targets. The MEP pathway is a potential target for drug development against Plasmodium falciparum once it is absent in humans. Our objectives were to evaluate the function of vitamin E biosynthesized by the parasite and characterize the biosynthesis of vitamin K1 and the phytol metabolism. This study determined that vitamin E biosynthesized by the parasite operates in the redox system of the parasite. We show the biosynthesis of vitamin K1 is active on parasite and we detected its reduced form. Finally, we demonstrate that there is a phytol salvage pathway in P. falciparum as well as plants. The study opens opportunities for the rational development of new antimalarials and deepens knowledge on parasite biology.

A malária é uma doença causada pelo parasita do gênero Plasmodium e que foi responsável por cerca de 440.000 mortes em 2015. A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma das principais complicações clínicas da malária. O modelo murino DBA/2 reproduz os sinais clínicos da SDRA observados em humanos, quando infectado com o Plasmodium berghei ANKA. Além disso, altos níveis da enzima heme oxigenase 1 (HO-1) foram observados em casos de malária cerebral e em SDRA em humanos. Os nossos dados indicam que os níveis da HO-1 estão aumentados em camundongos que desenvolvem SDRA associada à malária (SDRA-AM). Adicionalmente, a droga indutora de HO-1 (hemina) aumentou a sobrevivência e preveniu a SDRA-AM. Verificou-se também uma redução na permeabilidade pulmonar e nos níveis de VEGF, além de uma melhoria nos parâmetros respiratórios em animais tratados com hemina. Assim sendo, a indução da HO-1 antes do desenvolvimento da SDRA-AM é protetora e assim, a HO-1 pode ser um alvo de novos fármacos, como forma de prevenir o desenvolvimento da SDRA-AM em humanos. / Malaria is a serious disease, caused by the parasite of the genus Plasmodium, which was responsible to 440,000 deaths in 2015. Acute lung injury/ acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) is one of the main clinical complications in severe malaria. The murine model DBA/2 reproduces the clinical signs of ALI/ARDS observed in humans, when infected with Plasmodium berghei ANKA. Additionally, high levels heme oxygenase 1 (HO-1) were reported in cases of cerebral malaria and in ALI/ARDS in humans. Our data have indicated that the HO-1 levels are increased in mice that develop malaria associated ALI/ARDS (MA-ALI/ARDS). Additionally, a HO-1 inducing drug (hemin) increased the survival rate and prevented mice from developing MA-ALI/ARDS in treated mice. Also, there was a decrease in the lung permeability and in lung VEGF levels, and an amelioration of respiratory parameters. Therefore, the induction of HO-1 before the development of MA-ALI/ARDS is protective, making this enzyme a possible target of new drugs to prevent the development of MA-ALI/ARDS in humans.