Orientador: Vani Xavier de Oliveira Junior. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2011.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Janaina Roriz Hipolito.pdf: 4312682 bytes, checksum: ecb7ef268b16e006660e9770d5f663b4 (MD5) Previous issue date: 2006-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / A malária é um problema de saúde pública na região Amazônica, mais de 200 mil casos dessa doença ocorrem anualmente no Amazonas, sendo 80% deles causados pelo P. vivax, que vem apresentando índices crescentes de morbidade, principalmente associados à diminuição da sensibilidade aos antimaláricos. Dentre as estratégias para combate e controle da doença, a identificação rápida e precisa da espécie é ferramenta indispensável para um tratamento apropriado, diminuição do risco de transmissão e melhor entendimento da epidemiologia desses parasitas. A técnica microscópica da gota espessa é a principal para diagnóstico da malária, entretanto, outros métodos vêm sendo testados, principalmente os moleculares que tem se mostrado mais sensíveis e específicos para detectar e diferenciar as espécies em baixas parasitemias. Avanços desse método, como a PCR em tempo real, permitem que o resultado do teste seja detectado simultaneamente a amplificação, diminuindo o tempo gasto para a realização do diagnóstico. Com o intuito de detectar molecularmente a malária, verificando a presença de plasmódios, o diagnóstico molecular foi realizado através das técnicas de PCR em tempo real e nested-PCR, para se fazer uma comparação desses dois métodos com o diagnóstico microscópico da gota espessa em 300 amostras criopreservadas, 200 coletadas no dia inicial do tratamento (D0), das quais 88% (176/200) eram provenientes de pacientes de Manaus, as 24 amostras restantes (12%) eram provenientes de localidades do interior do Amazonas: São Gabriel da Cachoeira (09), Tefé (08), Humaitá (04) e Careiro (03). Apenas 9% dessas amostras tinham diagnóstico microscópico de monoinfecção por P. falciparum e 91% (182/200) por P. vivax, não havia nenhuma amostra mista pelo diagnóstico microscópico. O diagnóstico molecular por nested-PCR confirmou a presença de DNA de plasmódio em 100% das amostras monoinfectadas. Adicionalmente, foram observadas infecções mistas, co-infecção de P. falciparum e P. vivax, em 19% (38/200) destas amostras. O diagnóstico molecular por PCR em tempo real (Lightcycler, Roche®) foi realizado em apenas 17% (34/200) dessas amostras. A co-positividade (sensibilidade) dos testes para P. vivax foi em média 71% e a co-negatividade (especificidade) 92%, para P. falciparum a co-positividade foi 91% e a conegatividade 79%. A concordância entre os testes foi regular. As 100 amostras restantes haviam sido coletadas no sétimo dia (D7) de tratamento e eram negativas pela microscopia. O diagnóstico molecular demonstrou 21% de positividade. Este estudo mostrou que muitas infecções mistas vêm sendo subestimadas para fins de avaliação epidemiológica, demonstrando que a sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular são superiores a do teste microscópico. O diagnóstico molecular seria então mais indicado como teste complementar no diagnóstico de pacientes com baixas parasitemias, na análise da quantidade de portadores assintomáticos, em estudo de infecções criptônicas e na avaliação da negativação da parasitemia para monitoramento terapêutico, e em estudos que visem a diminuição da transmissão pela existência de prováveis gametócitos persistentes após o tratamento. Entretanto, esse método não é indicado para rotina de diagnóstico de malária, uma vez que os resultados positivos por essa técnica não significam necessariamente que o paciente desenvolva a doença.

A caracterização fenotípica de Plasmodium falciparum permite conhecer o padrão de sensibilidade do parasito às drogas antimaláricas utilizadas em países endêmicos. No presente estudo avaliamos fenotipicamente isolados clínicos de P. falciparum provenientes do Continente Africano e do Caribe. A sensibilidade à dihidroartemisinina (DHA: 4 - 1.000 nM), artesunato (AS: 0,1 - 100 nM), lumefantrina (LMF: 3,1 - 200 nM) e mefloquina (MFQ: 0,2 - 1.000 nM) foi investigada por meio de quatro técnicas: (a) ensaio de sensibilidade ex-vivo e in vitro, (b) ensaio de dormência, (c) ensaio de citometria de fluxo e (d) ensaio de sobrevivência do trofozoíto jovem (Ring Stage Survival Assay - RSA). Nos experimentos ex-vivo e in vitro, os IC50 estabelecidos foram 0,4 - 66,6 nM para DHA; 3,8 - 48,8 nM para LMF; 0,3 - 25,9 nM para AS e 2 - 439 nM para MFQ. No ensaio de dormência, esquizontes foram observados na amostra de referência NF54 de P. falciparum e na amostra clínica S-01/15 após pressão com 62,5 nM, 250 nM e 1.000 nM de DHA. O período de recuperação variou de 4 a 40 dias. Para LMF, houve maturação para o estágio de esquizonte no isolado de referência no sétimo e décimo segundo dia após a exposição a 66,6 nM e 200 nM da droga, respectivamente. Esquizontes foram visualizados no isolado clínico FS-08/15 de P. falciparum depois da pressão com 100 nM de AS, com recuperação de 0 a 28 dias, portanto sem apresentar dormência. Na citometria de fluxo, trofozoítos jovens viáveis de P. falciparum marcados com Rodamina 123 e DAPI foram observados nas máximas concentrações de DHA (1.000 nM) e LMF (200 nM). Finalmente no RSA, a taxa de crescimento (TC) e porcentagem de supervivência (PS) do isolado de referência foi 2,92 e 4,19%, respectivamente, frente a 700 nM de DHA. O mesmo isolado pressionado com 3.500 nM de LMF apresentou 3,6 de TC e 2,25% de PS. A avaliação microscópica dos ensaios de sensibilidade ex-vivo e in vitro subestima a resposta de P. falciparum à terapia combinada com artemisinina (ACT). Nossos resultados sugerem que a dormência, principal mecanismo de tolerância às artemisininas (ART), não aconteceria em todos os isolados clínicos de P. falciparum. A citometria de fluxo avaliou com acurácia a viabilidade parasitária. No presente estudo, pela primeira vez foi reportada a dormência de P. falciparum à LMF / The phenotypic characterization of Plasmodium falciparum is useful for the knowledge of parasite sensitivity against antimalarial used in endemic countries. In this study we evaluated the sensitivity of clinical isolates of P. falciparum from the African continent and the Caribbean. The sensitivity to dihydroartemisinin (DHA: 4 - 1,000nM), artesunate (AS: 0.1 - 100 nM), lumefantrine (LMF: 3.1 to 200 nM), and mefloquine (MFQ: 0.2 to 1,000 nM) was investigated through four techniques: (a) ex vivo and in vitro microtests, (b) dormancy assay, (c) flow cytometry assay and (d) survival assay using young trophozoites (Ring Stage Survival Assay - RSA). In the ex vivo and in vitro experiments, the IC50 was calculated and was 0.4 - 66.6 nM for DHA; 3.8 - 48.8 nM for LMF; 0.3 - 25.9 nM for AS and 2 - 439 nM for MFQ. According to dormancy assays, schizonts were observed in the P. falciparum reference isolate NF54 and in the clinical isolate S-01/15 after pressure with 62.5 nM, 250 nM and 1,000 nM DHA. The recovery period ranged from 4 to 40 days. For LMF was observed the growth to the schizont stage in NF54, in the days 7 e 12 after exposure to 66.6 nM and 200 nM of the drug, respectively. Schizonts were seen in the P. falciparum clinical isolate FS-08/15 after pressure with 100 nM of AS, right after incubation period, with no dormancy of trophozoites. In flow cytometry assays, viable young trophozoites of P. falciparum labeled with DAPI and Rhodamine 123 were observed at the maximum concentrations of DHA (1,000 nM) and LMF (200 nM). Finally in RSA, the growth rate (GR) and percentage of survival (PS) of the reference isolate was 2.92 and 4.19%, respectively, after pressure with 700 nM of DHA. The same isolate pressed with 3,500 nM of LMF presented GR of 3.6% and PS of 2.25%. In conclusion, microscopic evaluation of ex vivo and in vitro sensitivity tests underestimates the P. falciparum response to artemisinin-based combination therapy (ACT). Our results suggest that the dormancy, main mechanism of tolerance to artemisinin (ART), is not presented in all clinical isolates of P. falciparum. Flow cytometry was able to confirm the parasite viability accurately. In this study, for the first time the dormancy of P. falciparum after pressure with LMF was reported

Neste trabalho foi desenvolvido um Dot-ELISA capaz de detectar anticorpos anti-Plasmodium vivax, anti-Plasmodium falciparum, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Treponema pallidum, simultaneamente. O teste foi padronizado e aplicado em amostras de pacientes com malária, doença de Chagas e sífilis e comparado com testes de referência. Foi utilizado no estudo 52 amostras de pacientes com doença de Chagas, 43 pacientes com sífilis, 103 indivíduos com infecção presente (primo-infectado e não primo-infectados) ou passada de malária, indivíduos com anticorpos heterólogos, 30 indivíduos com leishmaniose 100 indivíduos saudáveis. O Dot-ELISA-Multi apresentou 100% de especificidade para todos os antígenos nas amostras de indivíduos saudáveis e com anticorpos heterólogos, com exceção do antígeno TESA que obteve 99%. A sensibilidade obtida foi de 100% em indivíduos chagásicos e 88% em pacientes com sífilis. Em indivíduos com malária a sensibilidade obtida foi de 90% para PvMSP119 (antígeno de P. vivax) e 47% para Pf-Zw (antígeno de P. falciparum). A positividade do teste em indivíduos não parasitados com histórico de malária foi de 92%. Nas amostras de malária observou-se que em indivíduos que tinham tido ultimo episódio de P. vivax, associação negativa foi observada entre o tempo passado desde o último episódio e reatividade de Dot-ELISAMulti PvMSP119, e associação positiva entre o número de episódios de malária e reatividade de Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. Indivíduos cujo o último episódio foi por P. falciparum, o Dot-ELISA-Multi Pf-Zw apresentou associação positiva com o número de episódios ocorridos. O comparado com os testes de referência utilizados apresentou um nível muito bom de concordância para TESA, EAE, PvMSP119 e um nível bom de concordância para Pf-Zw / In the present study, a Dot-ELISA was assembled to test antibodies against Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi and Treponema pallidum and was standardized and evaluated in serum samples from patients with malaria, Chagas disease and syphilis, in comparison with reference tests. The study was carried out on serum samples from 52 patients with chronic Chagas disease, 103 individuals with current (parasitemic) or past malaria (aparasitemic), 43 patients with syphilis, 30 with leishmaniosis, 21 individuals with heterologous antibodies and 100 blood donors. The diagnostic performance of Dot-ELISA-Multi for serum samples from patients with heterologous antibodies and from healthy blood donors, an overall 100% specificity was obtained for all antigens but TESA. A 100% sensitivity was observed in serum specimens from chronic-chagasic patients and 88% in serum specimens from syphilis patients. For malaria samples, the positivity was 90% for PvMSP119 and 47% for Pf-Zw antigen. In past malaria individuals, positivity was 92%. Sera from subjects who had had a P. vivax-malaria last episode presented negative association between time elapsed since their last malaria episode and results from Dot-ELISA-Multi PvMSP119; while positive association was observed between number of malaria episodes and results from Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. For individuals who had had a P. falciparum-malaria last episode, Dot-ELISAMulti Pf-Zw results showed positive association with number of malaria episodes only. Altogether, concerning the reactivity of the five antigens of the Dot-ELISAMulti, as compared with their respective reference tests, we have observed a very good level of concordance for TESA, EAE, PvMSP119 and for Tp-Zw and a good level for Pf-Zw

A malária apresenta um alto índice de mortalidade com mais de 500 mil mortes registradas em 2013. Para agravar a situação de saúde pública, foi descrito o surgimento de resistência às drogas usadas na terapêutica da doença. Torna-se necessário a identificação e o estudo de novos alvos antimaláricos. A via MEP se mostra como um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas contra P. falciparum uma vez que está ausente em humanos. Nossos objetivos foram avaliar a função da vitamina E biossintetizada pelo parasita, caracterizar a biossíntese de vitamina K1 e o metabolismo de fitol. Esse estudo determinou que a vitamina E biossintetizada pelo parasita atua no sistema redox do parasita. Por outro lado, mostramos que a biossíntese de vitamina K1 é ativa no parasita e detectamos sua forma reduzida. Por fim, observamos que existe uma via de reaproveitamento de fitol em P. falciparum assim como em plantas. O estudo abre oportunidades para um desenvolvimento racional de novos antimaláricos e aprofunda o conhecimento na biologia do parasita. / Malaria has the highest mortality rate with more than 500 000 deaths in 2013. The public health situation gets worse because it has been described the emergence of resistance to common drugs used in the treatment of disease. It is necessary to identify and study of new antimalarial targets. The MEP pathway is a potential target for drug development against Plasmodium falciparum once it is absent in humans. Our objectives were to evaluate the function of vitamin E biosynthesized by the parasite and characterize the biosynthesis of vitamin K1 and the phytol metabolism. This study determined that vitamin E biosynthesized by the parasite operates in the redox system of the parasite. We show the biosynthesis of vitamin K1 is active on parasite and we detected its reduced form. Finally, we demonstrate that there is a phytol salvage pathway in P. falciparum as well as plants. The study opens opportunities for the rational development of new antimalarials and deepens knowledge on parasite biology.

A malária é um problema de saúde global, que hoje acomete aproximadamente 207 milhões de pessoas, e que levou ao óbito cerca de 607.000 indíviduos apenas no ano de 2013. No Brasil, 99% dos casos concentram-se na Amazônia Legal onde infecções por Plasmodium vivax são as principais causas da doença e podem ser fatais. Infecções por Plasmodium spp. podem levar à um quadro respiratório grave, com complicações pulmonares denominadas lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A LPA/SDRA é caracterizada pela lesão dos alvéolos e do parênquima pulmonar, com perda da função da barreira epitelial do alvéolo e do capilar pulmonar de células endoteliais e, consequentemente, presença de edema pulmonar de origem não-cardiogênica. A diminuição da capacidade de trocas gasosas, aumento da atividade leucocitária e de mediadores inflamatórios nos pulmões resultam em insuficiência respiratória. A dificuldade em se estudar a doença em humanos associado ao desconhecimento dos fatores envolvidos na síndrome faz com que essa disfunção pulmonar torne-se mal compreendida e leve cada vez mais pessoas a óbito. O objetivo central do presente trabalho foi reconhecer e caracterizar o perfil leucocitário pulmonar, os fatores inflamatórios e a morte celular que contribuem para o desenvolvimento da LPA/SDRA associada a malária. Neste trabalho foi utilizado como modelo experimental a associação entre camundongos da linhagem DBA/2 e o parasita murino Plasmodium berghei ANKA. Neste modelo 30-75% dos camundongos desenvolvem sintomas pulmonares agudos (LPA/SDRA) e os demais morrem tardiamente com hiperparasitemia (HP). Desenvolvemos a partir dos parâmetros respiratórios e da parasitemia um modelo preditivo para classificação dos animais em LPA/SDRA ou HP antes do momento da morte com alta sensibilidade e especificidade. Nossos resultados mostram que os macrófagos alveolares e os neutrófilos estão aumentados de maneira significativa nos animais classificados como LPA/SDRA e que a depleção dessas populações promove a sobrevida dos animais e o não desenvolvimento da síndrome. Verificamos também que as células TCD4+ e TCD8+ produzem grandes quantidades de IFN-? nos animais LPA/SDRA, contudo o sistema imunológico desses animais produz grandes quantidades de IL-10 como forma de regular a resposta inflamatória. Em nosso estudo mensuramos a apoptose no tecido pulmonar e verificamos que os animais com LPA/SDRA possuem um número maior de células morrendo em relação aos animais HP. Vimos também que a apoptose de neutrófilos e células dendríticas ocorrem de maneira significativa no lavado broncoalveolar dos animais LPA/SDRA. O estudo da expressão de genes pró e anti-apoptóticos mostrou que há o aumento da expressão de Casp-3, Casp-9, Bad, Bid, Bak, FADD, CAD e Ripk-1 nos animais LPA/SDRA, enquanto que Bcl-XL e Bcl2 estão mais expressos nos animais HP. / Malaria is a global health problem that now affects approximately 207 million people, and led to the deaths of about 607,000 individuals only in 2013. In Brazil, 99% of the cases are concentrated in the Amazon where infections by Plasmodium vivax are the major cause of morbidity and which can also be fatal. Infections with Plasmodium spp. can lead to a serious respiratory condition including pulmonary complications named as acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS). ALI /ARDS is characterized by damage to the alveoli and the lung parenchyma, loss of epithelial barrier function of the alveoli and pulmonary capillary endothelial cells and, consequently, pulmonary edema noncardiogenic origin. Decreased capacity for gas exchange, increased leukocyte activity and inflammatory mediators in the lungs resulting in respiratory failure. The difficulty in studying human disease associated with lack of knowledge of factors involved in the syndrome and makes the pulmonary dysfunction become misunderstood and take more people to death. The central objective of this study was to determine and characterize the lung leukocytes profile, inflammatory factors and cell death that contribute to the development of ALI / ARDS associated with malaria. In this work was used as an experimental model the association between DBA/2 mice strain and the Plasmodium berghei ANKA murine parasite. In this model, 30-75% of mice develop acute pulmonary symptoms (ALI/ARDS) and the others died too late with hyperparasitaemia (HP). Developed from the respiratory parameters and parasitaemia a predictive model for classification of animals in ALI/ARDS or HP before the moment of death with high sensitivity and specificity. Our results show that alveolar macrophages and neutrophils were increased significantly in animals classified as ALI/ARDS and the depletion of these populations promotes the survival of the animals and not development of the syndrome. We also observed that CD4+ and CD8+ T cells produce large amounts of IFN-? in animals ALI/ARDS, however the immune system of these animals produce large amounts of IL-10 in order to regulate the inflammatory response. In our study we measured apoptosis in lung tissue and found that animals with ALI/ARDS have a larger number of cells dying compared to HP animals. We also saw that apoptosis of neutrophils and dendritic cells occur significantly in BAL of animals ALI/ARDS. The study of the expression of pro and anti-apoptotic genes showed that there is increased expression of Casp-3, Casp-9, Bad, Bid, Bak, FADD, and Ripk CAD-1 in animals ALI/ARDS, as that Bcl XL and Bcl2 are more expressed in HP animals.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-09-21T19:14:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInVitro.pdf: 1439306 bytes, checksum: 7f71a06de5db3f1824c5314ed19c43b4 (MD5) / Rejected by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br), reason: on 2017-10-10T17:00:49Z (GMT) / Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-17T18:38:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInVitro.pdf: 1439306 bytes, checksum: 7f71a06de5db3f1824c5314ed19c43b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-11-24T15:00:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInVitro.pdf: 1439306 bytes, checksum: 7f71a06de5db3f1824c5314ed19c43b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-24T15:00:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInVitro.pdf: 1439306 bytes, checksum: 7f71a06de5db3f1824c5314ed19c43b4 (MD5) Previous issue date: 2011-08-12 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O artesunato representa uma das principais drogas utilizadas como antimaláricos em diversos países. É um composto semi-sintético derivado de artemisinina, substancia extraída da planta chinesa Artemisia annua L. Apesar da ampla utilização do artesunato na terapêutica antimalárica, estudos demonstrando seus efeitos genotóxicos e citotóxicos em cultura de linfócitos humanos são ainda hoje quase inexistentes. Portanto, no presente trabalho, avaliamos os efeitos genotóxicos e citotóxicos do artesunato em cultura de linfócitos humanos. Nossos resultados demonstraram aumento significativo (p<0,05) no número de células apoptóticas dos linfócitos, tanto em 24 quanto em 48 h de tratamento. Desta forma, demonstrou-se em nosso trabalho, que o artesunato é uma droga genotóxica e citotóxica em cultura de linfócitos humanos, nas condições avaliadas. / Artesunate is one of the main drugs used as antimalarials in various countries. It is a semi-synthetic compound from artemisinin, a substance extracted from the Chinese plant Artemisia annua L. Despite the widespread use of antimalarial artesunato in malaria treatment, studies demonstrating its cytotoxic and genotoxic effects in human lymphocyte cultures are almost nonexistent. Therefore, in this study, we evaluated possible cytotoxic and genotoxic effects of artesunate on cultured human lymphocytes. A significant increase (p <0.05) in the rate of DNA damage and micronucleus frequency was observed after artesunato treatment. We also observed that artesunato induces a statically significant increase (p <0,05) in the number of apoptotic cells in both 24 and 48 h of treatment. Thus, we conclude in our work that artesunate is a highly cytotoxic and genotoxic drug in cultured human lymphocytes.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-22T12:53:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoInVitro.pdf: 4204396 bytes, checksum: a66ea9273f20dfc9a3cd37f2eab74163 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-03-27T12:50:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoInVitro.pdf: 4204396 bytes, checksum: a66ea9273f20dfc9a3cd37f2eab74163 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T12:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoInVitro.pdf: 4204396 bytes, checksum: a66ea9273f20dfc9a3cd37f2eab74163 (MD5) Previous issue date: 2015-10-23 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / A malária é uma das patologias infecto-contagiosas mais graves no mundo, apresentando distribuição geográfica bastante extensa em zonas tropicais. Seu tratamento é baseado na administração de drogas específicas, como, a artemisinina e seus derivados: artesunato, o qual será objeto deste estudo, e artemeter. O artesunato, é um composto semi-sintético derivado da artemisinina, substância extraída da planta chinesa Artemisia annua L. Apesar da ampla utilização do artesunato na terapia antimalárica, e de haver fortes evidências de que outros antimaláricos como, a partenina e a cloroquina, apresentem efeitos genotóxicos in vitro; ainda hoje são escassos os trabalhos que demonstrem seus efeitos genotóxicos em linfócitos humanos. Em estudos prévios realizados no laboratório de citogenética humana, foi demonstrado que o artesunato induz danos genotóxicos e citotóxicos ao DNA de linfócitos humanos em cultura. Apesar destes achados, os mecanismos indutores de tais efeitos não foram devidamente caracterizados devido a limitações das técnicas utilizadas. Assim, o presente estudo teve como objetivo caracterizar in vitro os efeitos genotóxicos e citotóxicos do artesunato em linfócitos de sangue periférico humano utilizando técnicas como FISHMN, ensaios de estresse oxidativo e imunocitoquímica por imunofluorescência. Pretendeu-se através do uso de tais técnicas, elucidar os mecanismos responsáveis pelos efeitos do artesunato no DNA de linfócitos humanos. A partir dos resultados encontrados no presente estudo foi possível inferir que o artesunato induz a formação de ROS e outros radicais livres e que estas substâncias estão causando danos no DNA dos linfócitos humanos em cultura. Assim, as células com o DNA danificado, não sendo capazes de reverter tal condição, ativam a apoptose pelas vias extrínseca e intrínseca. / Malaria is one of the most serious infectious disease in the world, with quite extensive geographic distribution in tropical areas. Its treatment is based on administration of specific drugs, as artemisinin and its derivatives: artesunate, which will be the subject of this study, and artemether. The artesunate is a semi-synthetic compound derived from artemisinin, a substance extracted from the Chinese plant Artemisia annua L. Despite the widespread use of artesunate in antimalarial therapy and the strong evidences that other antimalarials such as partenin and chloroquine present genotoxic effects in vitro; there are few studies that demonstrate artesunate genotoxic effects in human lymphocytes. In previous studies carried out in laboratory human cytogenetics, it was shown that artesunate induces cytotoxic and genotoxic effects in human lymphocytes in vitro. Despite these findings, the mechanisms of these effects have not been adequately characterized due to limitations of the techniques used. This study aimed to assess in vitro the cytotoxic and genotoxic effects of artesunate on human peripheral blood lymphocytes using assays such as FISHMN, oxidative stress and immunocytochemistry by immunofluorescence. We aimed through these tools elucidate the mechanisms responsible for the effects of artesunate in DNA of human lymphocytes. The results found in this study suggest that the artesunate induces the formation of ROS and other free radicals and that these substances are causing DNA damage in human lymphocytes in culture. Thus cells with damaged DNA, not being able to reverse this condition, activate apoptosis through the extrinsic and intrinsic pathways.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-06-26T15:23:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoAdesaoTratamento.pdf: 2067376 bytes, checksum: 3c5af254a9831ca1ae13900e6d751a32 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-06-26T18:28:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoAdesaoTratamento.pdf: 2067376 bytes, checksum: 3c5af254a9831ca1ae13900e6d751a32 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoAdesaoTratamento.pdf: 2067376 bytes, checksum: 3c5af254a9831ca1ae13900e6d751a32 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / A malária é uma doença que ameaça 50% da população mundial, que vivem em zonas endêmicas, como África, Sudoeste Asiático e América Latina. No que se refere à malária causada por Plasmodium vivax no Brasil, cujo tratamento é baseado em primaquina e cloroquina, é um importante problema de saúde pública que atrapalha o desenvolvimento da região Amazônica e que a adesão à terapia medicamentosa é um dos principais fatores que influenciam na eficácia do tratamento. Este estudo utiliza métodos indiretos para avaliar a adesão ao tratamento, correlacionando-a com a concentração plasmática de primaquina e carboxiprimaquina. Desse modo foi realizado um estudo observacional transversal controlado com 27 pacientes, na cidade de Anajás - Pará, antes (D0) durante (D1) e após (D7) o tratamento com o antimalárico, seguido de avaliação os pacientes com perguntas baseadas no teste de Morisky-Green ao final do tratamento. Foi possível observar maior prevalência da malária vivax em indivíduos do sexo masculino (70,4%) e na faixa etária de 20 a 39 anos (55,56%), o teste de Morisky-Green indicou uma adesão de 75%, 15 de um total de 20 pacientes, com uma taxa de acerto de 80%, 65%, 70% e 65% para as perguntas. A concentração média de primaquina no D1 foi de 134,8 ng/mL, no D7 de 131,9 ng/mL, e os valores de carboxiprimaquina foram de 408 ng/mL e 529,4 ng/mL respectivamente. É possível observar diferença estatisticamente significativa entre os valores do carboxiprimaquina em D1 e D7 no grupo dos aderentes definido pelo teste de Morisky-Green, mostrando que a carboxiprimaquina se acumula no organismo, sendo assim mais indicada para avaliar a adesão ao tratamento. Dessa forma, é importante ressaltar que estas concentrações de primaquina e carboxiprimaquina são as primeiras determinações de fármacos e metabólitos encontradas para o tratamento curto preconizado pelo Ministério da Saúde para malária vivax na região amazônica, corroborando para a pesquisa de avaliação da adesão aos antimaláricos. / Malaria is a disease that threatens 50% of the world population living in endemic areas such as Africa, Asia and Latin America. Concerning malaria caused by Plasmodium vivax in Brazil, which treatment is based on primaquine and chloroquine, it is a major public health issue that hinders the development of the Amazon region and adherence to drug therapy is one of the main factors that influence the effectiveness of the drug. This study uses indirect methods assess treatment adherence, correlating it with plasma concentrations of primaquine and carboxyprimaquine. Thus, a cross-sectional observational controlled study was conducted with 27 patients in Anajás, Pará before (D0), during (D1) and after (D7) treatment using the antimalarials, followed by the assessment of the patients with questions based on Morisky-Green test at the end of the treatment. Higher prevalence of vivax malaria was observed in males (70.4%) and age group of 20-39 years (55.56%), Morisky-Green test indicated adherence of 75%, 15 out of 20 patients, with hit rates of 80%, 65%, 70% and 65% to the questions. Mean-value of primaquine concentration on D1 was 134.8 ng/mL, and 131.9 ng/mL on D7, values for carboxyprimaquine are 408 ng/ml and 529.4 ng/mL respectively. It is possible to observe a statistically significant difference in the carboxyprimaquine values between D1 and D7 in the acceding group defined by the Morisky-Green tests, showing that carboxyprimaquine accumulates in the body; therefore being more suitable for assessing adherence to treatment. Therefore, it is important to point out these concentrations of primaquine and carboxyprimaquine consist as the first determination study of drugs and metabolites found for the short-course treatment suggested by the Ministry of Health for vivax malaria in the Amazon region, supporting the studies of adherence surveys regarding antimalarials.

Neste trabalho foi desenvolvido um Dot-ELISA capaz de detectar anticorpos anti-Plasmodium vivax, anti-Plasmodium falciparum, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Treponema pallidum, simultaneamente. O teste foi padronizado e aplicado em amostras de pacientes com malária, doença de Chagas e sífilis e comparado com testes de referência. Foi utilizado no estudo 52 amostras de pacientes com doença de Chagas, 43 pacientes com sífilis, 103 indivíduos com infecção presente (primo-infectado e não primo-infectados) ou passada de malária, indivíduos com anticorpos heterólogos, 30 indivíduos com leishmaniose 100 indivíduos saudáveis. O Dot-ELISA-Multi apresentou 100% de especificidade para todos os antígenos nas amostras de indivíduos saudáveis e com anticorpos heterólogos, com exceção do antígeno TESA que obteve 99%. A sensibilidade obtida foi de 100% em indivíduos chagásicos e 88% em pacientes com sífilis. Em indivíduos com malária a sensibilidade obtida foi de 90% para PvMSP119 (antígeno de P. vivax) e 47% para Pf-Zw (antígeno de P. falciparum). A positividade do teste em indivíduos não parasitados com histórico de malária foi de 92%. Nas amostras de malária observou-se que em indivíduos que tinham tido ultimo episódio de P. vivax, associação negativa foi observada entre o tempo passado desde o último episódio e reatividade de Dot-ELISAMulti PvMSP119, e associação positiva entre o número de episódios de malária e reatividade de Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. Indivíduos cujo o último episódio foi por P. falciparum, o Dot-ELISA-Multi Pf-Zw apresentou associação positiva com o número de episódios ocorridos. O comparado com os testes de referência utilizados apresentou um nível muito bom de concordância para TESA, EAE, PvMSP119 e um nível bom de concordância para Pf-Zw / In the present study, a Dot-ELISA was assembled to test antibodies against Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi and Treponema pallidum and was standardized and evaluated in serum samples from patients with malaria, Chagas disease and syphilis, in comparison with reference tests. The study was carried out on serum samples from 52 patients with chronic Chagas disease, 103 individuals with current (parasitemic) or past malaria (aparasitemic), 43 patients with syphilis, 30 with leishmaniosis, 21 individuals with heterologous antibodies and 100 blood donors. The diagnostic performance of Dot-ELISA-Multi for serum samples from patients with heterologous antibodies and from healthy blood donors, an overall 100% specificity was obtained for all antigens but TESA. A 100% sensitivity was observed in serum specimens from chronic-chagasic patients and 88% in serum specimens from syphilis patients. For malaria samples, the positivity was 90% for PvMSP119 and 47% for Pf-Zw antigen. In past malaria individuals, positivity was 92%. Sera from subjects who had had a P. vivax-malaria last episode presented negative association between time elapsed since their last malaria episode and results from Dot-ELISA-Multi PvMSP119; while positive association was observed between number of malaria episodes and results from Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. For individuals who had had a P. falciparum-malaria last episode, Dot-ELISAMulti Pf-Zw results showed positive association with number of malaria episodes only. Altogether, concerning the reactivity of the five antigens of the Dot-ELISAMulti, as compared with their respective reference tests, we have observed a very good level of concordance for TESA, EAE, PvMSP119 and for Tp-Zw and a good level for Pf-Zw