Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Cláudio Tadeu Daniel Ribeiro / Banca: Érika Martins Braga / Banca: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Érika Cristina Pavarino Bertelli / Resumo: O presente estudo avaliou a resposta de anticorpos contra diferentes antígenos de merozoíto e esporozoíto de Plasmodium vivax, relacionando com as variantes da porção repetitiva do domínio central do gene da Proteína Circunsporozoítica (CSP) do parasito (VK210, VK247 e P. vivax-like) e com os polimorfismos do HLA-DRB1 no hospedeiro humano. A resposta de anticorpos foi avaliada para peptídeos das regiões conservadas e centrais variáveis da CSP, da porção N-terminal da Proteína de Superfície do Merozoíto 1-MSP1 (Pv200L), e recombinante do Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) e a Proteína de ligação ao Duffy (DBP) por ELISA, em amostras de plasma de pacientes naturalmente infectados com P. vivax. Inicialmente nós avaliamos a distribuição destas variantes da CSP em cinco diferentes áreas da Amazônia a fim de entender sua atual dinâmica de transmissão. A variante VK210 continua sendo a mais prevalente em todas as áreas estudadas. No entanto, pela primeira vez documentamos a presença das variantes VK247 e P. vivax-like como infecções simples na Amazônia brasileira evidenciando um novo perfil distribuição destas, o que possa sugerir um processo de adaptação das mesmas. Quando comparamos a resposta de anticorpos e a infecção pelas variantes de P. vivax, não foram observadas associações significativas entre a presença de determinada variante da CSP e a freqüência de resposta de anticorpos contra os três peptídeos do merozoíto analisados, MSP1 (Pv200L), AMA-1 e DBP e nem contra as frações conservadas da CSP no esporozíto, N-terminal [N] e C-terminal [C]. A falta de associações significativas entre resposta sorológica contra esses peptídeos fornece informações promissoras quanto à utilização destes antígenos para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Todavia, a variação na porção central da CSP deve ser considerada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study evaluated the antibody response against merozoite and sporozoite antigens of Plasmodium vivax and its relationship with the variants of the repetitive central region of the gene for Circunsporozoite protein (CSP) in parasite (VK210, VK247 and P. vivax-like) and, with the HLA-DRB1 polymorphisms in human host. The antibody response to synthetic peptides of the CSP conserved and variable regions and of the N-terminal portion of Merozoite surface protein - MSP1 (Pv200L), and, to recombinants peptides of the Apical Membrane Antige 1 (AMA-1) and of the Duffy Binding Protein (DBP) was evaluable by ELISA in plasma samples of malaria patients naturally infected with P. vivax. Firstly, we evaluated the CSP variants distribution among five different areas from Brazilian Amazon, in order to understand their current dynamic of transmissions. VK210 variant remains the most prevalent in all study areas. However, it is the first detection of VK247 e P. vivax-like variants as simple infection in the Brazilian Amazon, showing a new distribution profile, which may suggest an adaptation process of them. When comparing the antibody response and infection by variants of P. vivax, there were no significant associations between the presence of particular CSP variant and the frequency of antibody response against all three merozoite peptides analyzed, MSP1 (Pv200L), AMA-1, DBP and against the CSP conserved fractions in the sporozoite, N-terminal and C-terminal. The lack of significant associations among immune response against these peptides provides promising information regarding the use of these antigens for malaria vaccine development. On the other hand, the central variability of CSP should be considered to employment of this region as an immunogen, since the antibody response appears to be variant-specific. In order to evaluate the polymorphisms... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A malária, causada por protozoários intracelulares do gênero Plasmodium, é uma das doenças tropicais mais devastadoras existentes. Mais de 3 bilhões de pessoas vivem em regiões endêmicas para a malária. Cinco espécies de Plasmodium (falciparum, vivax, ovale, malariae e knowlesi) causam doenças em humanos e a infecção com P. falciparum, o mais letal desses parasitas, resulta em mais de 1 milhão de mortes anualmente. O desenvolvimento de resistência aos fármacos antimaláricos tradicionais, leva ao uso de combinações de fármacos como a quinina (QN) e a doxiciclina (DOX). Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e caracterizar formulação de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo a associação de QN/DOX, avaliar sua eficácia em um modelo in vivo de malária berghei, determinar a sua farmacocinética e o coeficiente de partição nos eritrócitos dos fármacos livres e nanoencapsulados. A formulação de NLS contendo QN/DOX (2,0/0,2 mg/mL) foi preparada pela técnica de homogeneização a alta pressão, utilizando polissorbato 80 e Lipoid® como emulsionantes e palmitato de cetila como matriz lipídica. No estudo preliminar de estabilidade, a formulação de NLS contendo QN/DOX apresentou tamanho de partícula adequado (152,8 ± 5,26 nm), índice de polidispersão (0,173 ± 0,006), potencial zeta (-38,6 ± 1,82 mV), alto conteúdo dos fármacos (95,9% ± 0,70/ 94,1% ± 2,41) e adequada eficiência de encapsulação (94,2% ± 1,14/83,0% ± 2,52), após 21 dias de armazenamento em temperatura ambiente. Para a análise do teor um método rápido e específico de cromatografia líquida-acoplada a espectrometria de massa (LC-MS/MS) foi desenvolvido e validado para a determinação simultânea de QN e DOX nas formulações. O método por LC-MS/MS utilizou coluna Waters Sun Fire C18 (50 mm x 3,0 mm de diâmetro) e a fase móvel foi composta de acetonitrila:ácido fórmico 0,1% (75:25, v/v), no fluxo de 0,45 mL/min (split 1:3). O volume de injeção foi de 10 μL. Ratos Wistar infectados por P. berghei foram utilizados para avaliar a eficácia da formulação de NLS contendo QN/DOX utilizando diferentes regimes de dose. As doses efetivas da formulação, i.v. (75/7,5 mg/kg/dia) e oral (105/10,5 mg/kg/dia), representam uma redução de quase 30% em comparação com os fármacos livres utilizados em associação. A farmacocinética foi avaliada após a administração dos fármacos livres ou nanoencapsulados pela vias i.v. (10/1 mg/ kg) e oral (25/2,5 mg/kg) em ratos Wistar infectados. Para a quantificação das amostras de plasma dos ratos, método por LC-MS/MS foi desenvolvido e validado. A QN, a DOX e a cimetidina (padrão interno, PI) foram extraídos do plasma através de precipitação de proteínas e a fase móvel consistiu de metanol/ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v), no fluxo de 0,5 mL / min (split 1:3). A detecção foi realizada através da ionização por electrospray positivo, no modo de monitoramento de reações múltiplas, onde foram monitoradas as transições 325,0>307,0, 445,0>428,1 e 252,8>159,0, para QN, DOX e PI, respectivamente. A análise foi realizada em 2,0 min e o método foi linear na faixa de concentração plasmática entre 5-5000 ng/mL. Nenhuma alteração significativa dos parâmetros farmacocinéticos foi observada para ambos os fármacos e vias de administração, após a nanoencapsulação. O coeficiente de partição da QN nos eritrócitos infectados por P. berghei aumentou (5,53 ± 0,28) quando a formulação de NLS contendo QN/DOX foi usada em comparação com os fármacos livres em associação (3,81± 0,23). Nenhuma alteração significativa na penetração intraeritrocitária da DOX foi observada com a nanoencapsulação. Os resultados demonstram que a nanoencapsulação da QN/DOX em NLS diminui a dose efetiva para o tratamento da malária, sendo uma alternativa interessante a ser investigada para o tratamento da malária falciparum resistente. / Malaria is one of the most devastating tropical diseases caused by intracellular protozoan parasites of the genus Plasmodium. More than 3 billion people live in malarial endemic regions. Five species of Plasmodium (falciparum, vivax, ovale, malariae and knowlesi) cause disease in humans and infection with P. falciparum, the most deadly of these parasites, results in more than 1 million deaths annually. The development of resistance to traditional antimalarial drugs leads to the use of drug combinations such as quinine (QN)/doxycycline (DOX). In this context, the aims of this work were to develop and characterize solid lipid nanoparticles (SLN) loaded with QN/ DOX, to evaluate their efficacy in an in vivo model of berghei malaria, and to determine their pharmacokinetics and erythrocyte partition coefficient compared to the non-encapsulated (free) drug association. The SLN were prepared by high pressure homogenization technique using polysorbate 80 and Lipoid® as emulsifiers and cetyl palmitate as lipid matrix. In the preliminary stability study, QN/DOX-loaded SLN (2.0/0.2 mg/mL) presented adequate particle size (152.8 ± 5.26 nm), polydispersion index (0.173 ± 0.006), zeta potential (-38.6 ± 1.82 mV), high drug content (95.9% ± 0.70/94.1% ± 2.41) and appropriate encapsulation efficiency (94.2% ± 1.14/83.0% ± 2.52) after 21 days of storage at room temperature. For the assay analysis, a fast and specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed and validated for the simultaneous determination of QN and DOX. The LC-MS/MS method was carried out on a Sun Fire Waters C18 column (50 mm x 3.0 mm I.D.) and the mobile phase consisted of acetonitrile:0.1% formic acid (75:25, v/v), run at a flow rate of 0.45 mL/min (split 1:3). The injection volume was 10 μL. Plasmodium berghei infected Wistar rats were used to evaluate the efficacy of QN/DOX-loaded SLN using different dosing regimens. The effective QN/DOX-loaded SLN i.v. (75/7.5 mg/kg/day) and oral (105/10.5 mg/kg/day) doses represent an almost 30% reduction compared to the free drugs in association. Plasma pharmacokinetics was evaluated after administration of free or nanoencapsulated QN/DOX by i.v. (10/1 mg/kg) and oral (25/2.5 mg/kg) routes to infected Wistar rats. For the quantification of the rat plasma samples, a fast, sensitive and specific LC-MS-MS method was developed and validated for the determination of QN and DOX. QN, DOX and cimetidine (internal standard, IS) were extracted from the plasma by protein precipitation and the mobile phase consisted of methanol/formic acid 0.1% (70:30, v/v), run at a flow rate of 0.5 mL/min (split 1:3). Detection was carried out by positive Electrospray Ionization in multiple reaction monitoring mode, monitoring the transitions 325.0>307.0, 445.0>428.1 and 252.8>159.0, for QN, DOX and IS, respectively. The analysis was carried out in 2.0 min and the method was linear in the plasma concentration range of 5-5000 ng/mL. No significant alteration of pharmacokinetic parameters was observed for both drugs and routes of dosing after nanoencapsulation. QN partition coefficient into P. berghei infected erythrocyte was increased (5.53 ± 0.28) when the QN/DOX-loaded SLN was used in comparison with the free drugs in association (3.81 ± 0.23). No significant alteration on DOX erythrocyte partition coefficient was observed. In summary, the results showed that QN/DOX nanoencapsulation into SLN allows the reduction of the effective antimalarial dose being an interesting alternative to be investigated for the treatment of falciparum resistant malaria.

This work aims the structural determination of phenazines compounds, and derivatives that present bioactivity for the treatment of malaria, using the X-ray diffraction method. Chapter 1 shows an introduction to pharmacologicol products and the importance of this structural resolution. Chapter 2 prejent the general characteristics of malaria in Brazil. Chapter 3 theoretical fundaments on the of X-ray diffraction technique, followed in chapter 4, by a description of the methods of crystallization and the steps of structural resolution. Finally, chapter 5, brings the discussion and results obtained in the structural resolution of four studed compounds. The studied phenazines composites were: 5,5-Dimetil-5,6-dihydro-7H- 4b,13-diazadibenzo[a,de]antracen-8-ona (FENA), 4-(3'-metil-but-2'-enil)-benzo[a]- fenazin-3-ona (FLA), cloro(dibenzo[a, c]fenazin-1-il-K2,C1, N14) piridinopaládio(II) (FENA-Pd), 8-bromine-7,7-dimethyl-5,10-dioxo-7,8,9,10- tetrahydro-5H-benzo[3,4 ] oxecino[5,6-b]quinoxaline-16-N-oxidates (FENA-Br). All the data collection had been obtained in on automatic KappaCCD diffractometer using MoKα monocromatic radiation, of wave length of 0.71073 Å (molybdenum). The compound called FENA crystallize in the monoclinic system and belongs to space group P21/a, with net parameters a = 7.1442(2) Å, b = 12.5463(3) Å, c = 17.1835(4) Å, β = 95.520(1) Å, with a volume, V = 1533.07(7) Å3. The calculation of the density, assuming Z = 4 molecules for unit cell, resulted in a value of 1.242 g.cm -3. The compound called FLA, crystallize in the monoclinic system and belongs to the space group C 2/c, with cell parameters of a = 21.0180(1)Å, b = 9.1359(3) Å, c = 17.7772(9) Å, β = 109.402(2), with a volume, V = 3219.70(24) Å 3. The calculation of the density, assuming Z = 8 molecules for unit cell, resulted in a value of 1.297 g.cm -3. The compound called FENA-Pd crystallize in the Monoclinic system, belongs to the space group P21/a, with parameters of a = 12.0413(4), b = 13.4986(6), c = 12.3869(5) Å, β = 106.074(2), V = 1934.6(1) Å3. The calculation of the density, assuming Z = 4 molecules for unit cell, resulted in a value of 1.72/g.cm-3 for the density of the crystal. The compound called FENA-Br, crystallize in the orthorombic system and belongs to the space group P 21 21 21, with cell parameters of a = 6.2552(1) Å, b = 14.6703(3) Å, c = 20.5061(5) Å, calculated density 1.558 g.cm -3, assuming Z = 4. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O presente trabalho objetiva a determinação estrutural de compostos fenazínicos e derivados, que apresentam bioatividade para o tratamento da malária, empregando o método de difração de Raios X. No capítulo 1 tem-se uma introdução aos produtos de interesse farmacológicos e a importância da resolução estrutural. O capítulo 2 apresenta as características gerais sobre a malária no mundo e no Brasil. O capitulo 3 baseia-se em uma fundamentação teórica sobre a técnica de difração de Raios X, seguido, no capítulo 4, da descrição sobre os métodos de recristalização e as etapas de resolução estrutural por difração de Raios X. Por último, o capítulo 5, traz os resultados e discussões obtidos na resolução dos quatro compostos em estudo. Os compostos fenazínicos estudados neste trabalho foram: 5,5-Dimetil- 5,6-dihydro-7H-4b,13-diazadibenzo[a,de]antracen-8-ona (FENA), 4-(3 -metil-but-2 - enil)-benzo[a]-fenazin-3-ona (FLA), cloro(dibenzo[a,c]fenazin-1-il-K2,C1,N14) piridinopaládio(II) (FENA-Pd), 8-bromo-7,7-dimetil-5,10-dioxo-7,8,9,10- tetrahidro-5H-benzo[3,4]oxecino[5,6-b]quinoxalino-16-N-oxido (FENA-Br). Todos os dados das intensidades difratadas foram obtidos num difratômetro automático KappaCCD, utilizando radiação monocromatizada por um cristal de grafite, de comprimento de onda igual a 0,71073 Å (molibdênio). O composto denominado como FENA, cristaliza no sistema monoclínico e pertence ao grupo espacial P21/a, com parâmetros de rede, a = 7,1442(2) Å, b = 12,5463(3) Å, c = 17,1835(4) Å, β = 95,5200(10) Å, com um volume, V= 1533,07(7) Å 3. O cálculo da densidade supondo Z = 4 moléculas por cela unitária resultou num valor de 1,242 g.cm-3. O composto denominado como FLA, cristaliza no sistema monoclínico e o grupo espacial C2/c, com parâmetros de rede, a = 21,0180(1) Å, b = 9,1359(3) Å, c = 17,7772(9) Å, β = 109,402(2)°, com um volume, V= 3219,70(24) Å 3. O cálculo da densidade supondo Z = 8 moléculas por cela unitária resultou num valor de 1,297 g.cm-3. O composto denominado como FENA-Pd cristaliza no sistema cristalino Monoclínico, pertencente ao grupo espacial P21/a, com parâmetros de rede a = 12,0413(4), b =13,4986(6), c =12,3869(5) Å, β = 90°, V = 1934,66(12) Å3. O cálculo da densidade supondo Z = 4 moléculas por cela unitária resultou num valor de 1,72g.cm-3 para a densidade do cristal. O composto denominado como FENA-Br, cristaliza no sistema ortorrômbico sendo seu grupo espacial P 212121, com parâmetros de rede a = 6,25520(10) Å, b = 14,6703(3) Å , c = 20,506(5) Å , e densidade calculada de 1,558 g.cm-3, supondo Z = 4.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000016.pdf: 46547429 bytes, checksum: 18c7868a9f15b2733d20b658bd7fe2c8 (MD5) Previous issue date: 2009 / O objetivo da tese é refletir sobre as atividades de saneamento no Estado do Amazonas no período da Primeira República no Brasil. O momento coincide com o auge e o declínio da economia da borracha, fazendo da Região um importante centro de repercussão da cultura e das idéias científicas. Analisamos como as idéias da medicina tropical foram apropriadas por médicos do Amazonas e como foram colocados em prática os princípios daquela disciplina, com o objetivo de realizar a profilaxia da febre amarela e da malária. Essas duas endemias mobilizaram os diversos atores em torno das teorias, que debatiam sobre os mecanismos de transmissão e sobre as formas de combater e controlar os vetores. Diferentes comissões atuaram no Amazonas nesse período, que envolveram: médicos,cientistas e engenheiros de Manaus, da Capital Federal e de Instituições internacionais. A única comissão que realizou o saneamento do interior do Estado foi o Serviço de Saneamento e Profilaxia Rural, que transformou o posto rural em posto itinerante. O saneamento do Amazonas foi proposto e realizado por estas diferentes comissões, que teve como pano de fundo o ambiente e o regime das águas: na capital os igarapés, e no interior a imensa rede de rios e lagos. O Amazonas, nesse período, constituiu-se, portanto, em uma espécie de laboratório para a pesquisa e a experimentação das idéias científicas correntes. A região, em relação à nação, afirmou a sua autonomia e a sua identidade, através da ação dos médicos e cientistas que refletiram sobre a o saneamento do Estado .

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:12:26Z No. of bitstreams: 1 Bernardo Simões Franklin.pdf: 11748497 bytes, checksum: e1831598c734af4113b0028438c1b84f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernardo Simões Franklin.pdf: 11748497 bytes, checksum: e1831598c734af4113b0028438c1b84f (MD5) Previous issue date: 2009 / Desde sua descoberta, os receptores do tipo Toll (TLRs) têm sido envolvidos em quase todas as doenças que afetam a saúde humana. Seu papel na proteção contra vários patógenos, incluindo protozoários está bem estabelecido. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel dos TLRs na malária. No presente estudo, investigamos o papel dos TLRs durante a malária murina e humana. Nossos resultados mostraram que camundongos com deficiência para MyD88, um adaptador essencial para a sinalização dos TLRs, produzem níveis de citocinas pró-inflamatórias significativamente menores e apresentam sintomas mais amenos durante a infecção por Plasmodium chabaudi. Entretanto, estes animais retêm a capacidade de controlar a parasitemia sugerindo que os TLRs possuam um papel na patogênese e não na proteção contra a malária. Posteriormente, mostramos que ambas, a infecção natural humana por P. falciparum e a experimental murina por P. chabaudi, aumentam a expressão e a responsividade dos TLRs nas células do sistema imune inato. O estado hiper-responsivo das células durante a malária é derivado da ativação de TLR9 e a produção de IFN por células T, levando a uma alta susceptibilidade ao choque séptico durante a malária aguda. Finalmente, em colaboração com a EISAI Research Institute, desenvolvemos um antagonista de TLR9 e testamos seu efeito na Malária Cerebral (CM), uma das manifestações clínicas mais graves da malária. O tratamento oral com este composto inibiu os sintomas, tais como extravasamento vascular cerebral, protegendo camundongos da morte por CM. Em conjunto, nossos resultados mostram um importante papel dos TLRs, especialmente TLR9, na patogênese da malária e que a intervenção na função destes receptores é uma potencial quimioterapia anti-inflamatória contra essa doença. / Toll-like receptors (TLRs) have been involved in almost every know disease that afflict human health so far and their role in resistance to several pathogens, including protozoan parasites, has been well established. The role of TLRs in malaria, however, still remains to be elucidated. Here we studied the role of TLRs in experimental and naturally acquired malaria infection. We showed that mice with deficiency to MyD88, an essential adaptor to TLRs signaling, produce significant lower levels of proinflammatory cytokines and commensurate better clinical outcome upon infection with Plasmodium chabaudi. Nevertheless, these mice can still control parasite loads suggesting that TLRs are involved in pathogenesis rather than protection during malaria. We further studied cellular responsiveness of innate immune responses during human and murine malaria. We showed that both natural acquired P. falciparum infection in humans and experimental infection of mice with P. chabaudi increase TLR expression in innate immune cells causing pro-inflammatory priming of TLR responses. The cellular hyper-responsiveness during Malaria is caused by TLR9 activation and IFN production by T cells conferring high susceptibility to septic shock during the acute disease. Finally, in collaboration effort with EISAI Research Institute, we develop and tested an antagonist of TLR9, on Cerebral Malaria (CM), one of the most severe manifestations of malaria. Oral treatment of mice with this compound inhibited CM symptoms, such as vascular leakage, and prevented death from CM. All together our results show an important role of TLRs, especially TLR9, in malaria pathogenesis and that the therapeutic targeting of TLRs is a potential anti-inflammatory chemotherapy against malaria.

In the Amazonian region occurs a variation in the malaria incidence, which is related to the pluviometric variation annual. The mathematical model proposed here considers this seasonality and different treatment intensities accessible to the infected people. The numerical evidence the seasonal fluctuation and the relationship between the environment temperature and treatment efficiency, showing that the temperature increase strongly affects the extrinsic latent period,reducing the healthy care efficiency. Because malaria treatment already exists it should be import. For another hand, even the investment in treatment is an efficient form to block the epidemy, it is not always sufficient, because the protozoan has been more resistent to the medicine; then scientists are creating transgenic mosquitoes refractory to malaria to couple with wild one, generating descending transgenic. To avaliate this situation, we consider here a mathematical model that describes the relatioship between these populations. Then, we formulate and solve an optimal control problem indicating how the transgenic mosquitoes should be introduced in the environment. The numerical simulations show the effectiveness of the control. / Na Amazônia ocorre uma variação na incidência de malária que está intimamente relacionada à variação pluviométrica ao longo do ano. O modelo matemático aqui proposto considera esta sazonalidade e diferentes intensidades de tratamento acessíveis às pessoas infectadas. Experimentos numéricos descrevem a flutuação sazonal e evidenciam uma relação inversa entre a temperatura e eficiência do tratamento, mostrando que um aumento na temperatura afeta fortemente o período latente extrínseco, reduzindo a eficiência do investimento em saúde. Como o tratamento para os infectados existe, é importante concentrar esforços nesse sentido para obter sucesso no controle da malária. Por outro lado, embora o investimento em tratamento seja uma forma eficaz de impedir a epidemia, isso nem sempre é suficiente, pois é fato que o protozoário tem se mostrado cada vez mais resistente aos medicamentos; por esse motivo, cientistas estão criando mosquitos transgênicos refratários à malária que devem acasalar com os mosquitos selvagens, gerando descendência transgência. Para avaliar esta situação, consideramos neste trabalho um modelo matemático que descreve de maneira simplificada a relação entre estas duas populações. A partir desse modelo, formulamos e resolvemos um problema de controle ótimo indicando uma forma adequada de introduzir esses mosquitos transgênicos. Experimentos numéricos mostram a eficácia do controle adotado.

Um importante fator de patogenicidade de P. falciparum, causador da malária, é a presença de antígenos altamente polimórficos, codificados por famílias multigênicas como var e rif. O grande polimorfismo destes genes em isolados de diferentes regiões contrasta com o fato de existirem, em diferentes isolados de campo brasileiros, alelos conservados. Respostas humorais contra estas proteínas são consideradas importantes na aquisição de proteção contra os sintomas da doença em regiões endêmicas. Portanto, medimos a resposta humoral contra antígenos recombinantes PfEMP1 e RIFIN e detectamos níveis baixos de resposta tanto em indivíduos sintomáticos quanto em indivíduos assintomáticos infectados pelo parasita. Estas respostas foram baixas quando comparadas às respostas contra MSP119 da superfície do merozoíta e parecem ser de curta duração. Com base nestes resultados, as respostas contra domínios DBLa, em situações hipoendêmicas, parecem ocorrer em função da presença do parasita circulante, e não são relacionadas à proteção contra os sintomas clínicos da doença. / An important factor in the pathogenicity of P. falciparum, the causing agent of malaria is the expression of highly polymorphic antigens encoded by the multigene families var and rif. The extreme polymorphism of these genes in strains from different geographical regions is in contrast with the observation of a number of conserved alleles found in Amazonian isolates. The humoral response against these proteins is considered an important factor in the immunity against symptomatic infection in áreas with high transmission. We measured the antibody response against recombinant PfEMP1 and RIFIN antigens and detected low responsiveness of symptomatic and asymptomatic malaria infected individuals. These responses were not only weak when compared to the anti-merozoite surface protein 1 response, but also ceased rapidly after the removal of circulating parasites. On the basis of these results, the response against DBLa seems to be dependent on the presence of parasites and not important for the observed protection against symptomatic infection in hypoendemic settings.

Para examinar como o nível de diversidade genética de Plasmodium vivax em uma comunidade varia no tempo e no espaço, investigamos a dinâmica de polimorfismos do parasito durante as primeiras fases de ocupação de um assentamento agrícola na Região Amazônica brasileira. A caracterização por microssatélites de 84 isolados de P. vivax, colhidos ao longo de três anos, revelou uma diversidade genética de moderada a alta (heterozigosidade esperada média, 0,699), com uma grande proporção (78,5%) de infecções por múltiplos clones (IMC), mas também um forte desequilíbrio de ligação (DL) consistente com um raro cruzamento entre os haplótipos. Observamos uma pequena influência temporal na diversidade genética dos haplótipos do parasito e nenhum padrão de distribuição espacial dos mesmos. Em amostras consecutivas colhidas de um mesmo indivíduo observou-se uma intensa renovação de haplótipos ao longo do tempo. Um único haplótipo foi compartilhado por três indivíduos cujas amostras foram colhidas durante um surto; todos os outros 81 haplótipos foram recuperados apenas uma vez. A menor diversidade parasitária, com a menor proporção de IMC e um DL mais intenso, foi observada no momento do surto, fornecendo um claro exemplo de uma estrutura populacional epidêmica de um patógeno humano. Todos os parâmetros populacionais retornaram aos valores prévios ao surto durantes os últimos anos de estudo, apesar da queda concomitante na transmissão de malária. Sugerimos que a genotipagem do parasito pode ser útil para monitorar a propagação de novas linhagens do parasito associadas a surtos em áreas que se aproximam da eliminação da malária. / To examine how community-level genetic diversity of the malaria parasite Plasmodium vivax varies across time and space, we investigated the dynamics of parasite polymorphisms during the early phases of occupation of a frontier settlement in the Amazon Basin of Brazil. Microsatellite characterization of 84 isolates of P. vivax sampled over 3 years revealed a moderate to high genetic diversity (mean expected heterozygosity, 0.699), with a large proportion (78.5%) of multiple-clone infections (MCI), but also a strong multilocus linkage disequilibrium (LD) consistent with rare outcrossing. Little temporal and no spatial clustering was observed in the distribution of parasite haplotypes. A single microsatellite haplotype was shared by 3 parasites collected during an outbreak; all other 81 haplotypes were recovered only once. The lowest parasite diversity, with the smallest proportion of MCI and the strongest LD, was observed at the time of the outbreak, providing a clear example of epidemic population structure in a human pathogen. Population genetic parameters returned to preoutbreak values during last 2 years of study, despite the concomitant decline in malaria incidence. We suggest that parasite genotyping can be useful for tracking the spread of new parasite strains associated with outbreaks in areas approaching malaria elimination.

A colina quinase, 1ª enzima de uma via que forma 45% da membrana de P. falciparum foi clonada, expressa e purificada, e um anticorpo policlonal desenvolvido. Estudos de transporte da enzima demonstraram que a PfChok é transportada para o citossol por uma via independente do inibidor Brefeldina A. Obteve-se informação da estrutura secundária e uma modelagem da estrutura terciária da proteína, tendo sido localizados sítios de fosforilação para proteínas quinases. Através de uma nova abordagem em genômica funcional de Plasmodium, o gene da proteína adaptadora PfRACK foi códon otimizado e inserido em células de mamíferos. Estudos de dinâmica de Ca2+ em microscopia confocal indicaram que sua sinalização nas células estudadas é inibida na presença de PfRACK, dependente da interação direta com receptores de IP3. A enzima localiza-se distintivamente em relação à RACK1 endógena. Nossos resultados abrem a possibilidade de novos estudos, ao estabelecer a transfecção de genes do parasita para estudos de mecanismos de transdução de sinal na interação Plasmodium-hospedeiro. / Choline Kinase, the first enzyme of a pathway responsible for up to 45% of Plasmodium falciparum parasite membrane, was cloned, expressed and purified, and a policlonal antibody was developed to follow its localization along the intraerythrocytic cycle. The enzyme is transported to parasite´s cytosol, through a pathway independent of the Endoplasmic Reticulum to Golgi apparatus. Information about the secondary structure was obtained, as well a model of the tertiary structure, where several kinases phosphorylation sites were identified. The PfRACK gene was codon-optimized and transfected in mammalian cells. Dynamic Ca2+ studies by confocal microscope have revealed that Ca2+ signaling of the transfected cells was inhibited by PfRACK, dependent on direct interaction with InsP3 receptors. The protein co-localizes distinctly of the endogenous RACK1. Our results open new possibilities of malaria functional genomics, by establishing the transfection of parasites genes into mammalian cells with the aim to study transduction signals mechanisms of the Plasmodium-host interaction.

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These parasites have developed resistance to commonly used drugs and therefore there is a need to develop new antimalarial agents. Aryltetralone lignans are compounds that show antiplasmodial activity in vitro against P. falciparum, but its mechanism of action is still not fully understood. In this work, we postulate a plausible mode of action of some aryltetralone lignans and according to the obtained results we suggest modifications to the ligands for a better biological activity. In order to achieve our objectives we first performed a search for similar chemical compounds, for which their macromolecular targets were known. From the results obtained, P. falciparum tubulin was selected as a potential target for these lignans. Since there is no experimentally determined three-dimensional structure for this protein, we performed a molecular homology modeling of P. falciparum tubulin and the structure of bovine tubulin complexed with colchicine was selected as template. The analysis of the obtained model showed that the three dimensional structure of Plasmodium tubulin is conserved in relation to the bovine tubulin with some important substitutions occurring in the colchicine binding site region: Ala250B by Ser248B, Ala316B by Cys314B and Ile318B by Met316B. Then, molecular docking of the aryltetralone lignans, colchicine and podophyllotoxin was performed in the modeled P. falciparum tubulin. The docking calculations results allowed to conclude firstly that, although the amino acid substitutions in the binding site, the colchicine binding mode in the P. falciparum tubulin is exactly the same as that already described in the literature for bovine tubulin. As for podophyllotoxin, a different binding mode from that described in the literature for bovine tubulin was obtained due to the replacement of Ala250B by Ser248B and the Val318B by Met316B. For the aryltetralone lignans studied, three different binding modes were obtained: one exhibited by compounds 1, 2 and 3, another by 4 and 6, and a third one by 5. The lignans 1, 2 and 3 are oriented in a way so that the C ring containing the dimethoxy or methylenedioxy group is positioned in the same region obtained for the ring containing the trimethoxy group in the case of colchicine and podophyllotoxin, performing a C-H...π interaction with Leu246B. Lignans 4 and 6 orient themselves with the aromatic ring C between Ala180A and Leu246B and being held in this position by C-H...π interactions. Lignan 5 is oriented with the aromatic ring C between Leu246B and Leu253B, performing C-H...π interactions with these residues, in a similar way to what was obtained with colchicine in this site. So the likely mechanism of action of the aryltetralone lignans studied here would be their binding to the same colchicine binding site in the tubulin protein of P. falciparum and thereby interrupting the divisions and other cellular functions. / A malária é uma doença febril aguda causada por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Plasmodium, sendo a espécie P. falciparum a responsável pela maioria das formas severas e mortes pela doença. Estes parasitas desenvolveram resistência aos fármacos comumente utilizados e, portanto, existe a necessidade de se desenvolver novos agentes antimaláricos. Lignanas ariltetralônicas são compostos que apresentam atividade antiplasmodial in vitro contra o P. falciparum, porém seu mecanismo de ação ainda não é totalmente compreendido. Neste trabalho, conseguimos postular o modo de ação de algumas lignanas ariltetralônicas e, a partir dos resultados obtidos, sugerimos modificações nestes compostos de modo a obter uma melhoria na sua atividade biológica. Para isso, primeiramente foi realizada uma busca por compostos químicos semelhantes, cujos alvos macromoleculares eram conhecidos. A partir dos resultados obtidos, selecionou-se a tubulina do P. falciparum como potencial alvo para estas lignanas. Como não há estrutura tridimensional determinada experimentalmente para esta proteína, foi realizada a modelagem molecular por homologia da tubulina do P. falciparum, selecionando como molde a estrutura da tubulina bovina complexada com colchicina. A partir da análise do modelo construído, verificou-se que a estrutura tridimensional da tubulina do Plasmodium é conservada em relação à tubulina bovina e que ocorrem algumas substituições importantes na região do sítio de ligação da colchicina: Ala250B por Ser248B, Ala316B por Cys314B e Ile318B por Met316B. Em seguida, foi realizado o docking molecular das lignanas ariltetralônicas, da colchicina e da podofilotoxina na tubulina do P. falciparum. Os resultados do docking permitiram concluir primeiramente que, embora ocorram algumas substituições de aminoácidos no sítio, o modo de ligação da colchicina na tubulina do P. falciparum é exatamente o mesmo ao já descrito na literatura para a tubulina bovina. Já para a podofilotoxina, foi obtido um modo de ligação diferente do descrito na literatura para a tubulina bovina, devido à substituição da Ala250B pela Ser248B e da Val318B pela Met316B. Para as lignanas ariltetralônicas estudadas, foram obtidos três modos de ligação diferentes: um exibido pelos compostos 1, 2 e 3, outro para 4 e 6 e um terceiro modo exclusivo para 5. As lignanas 1, 2 e 3 orientam-se de modo que o anel C, que contém o grupo dimetóxi ou metilenodióxi, se posiciona na mesma região do sítio obtida para o anel contendo o grupo trimetóxi da colchicina e da podofilotoxina, realizando uma interação C–H...π com a Leu246B. As lignanas 4 e 6 orientam-se com o anel aromático C entre a Ala180A e a Leu246B, sendo mantido nesta posição por interações C–H...π. No caso da lignana 5, esta se orienta com o anel aromático C entre a Leu246B e Leu253B, realizando interações C– H...π com estes resíduos, semelhante ao que foi obtido para a colchicina neste sítio. Assim, o mecanismo provável de ação das lignanas ariltetralônicas aqui estudadas passaria pela sua ligação ao mesmo sítio de ligação da colchicina na proteína tubulina do P. falciparum e, com isso, interrompendo as divisões e outras funções celulares.