Neste estudo avaliamos a resposta imune humoral de indivíduos naturalmente expostos à malária em áreas endêmicas no Brasil. Os anticorpos IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgA anti-formas eritrocitárias de Plasmodium falciparum foram determinadas por ELISA. Anticorpos IgG, IgG1, IgG2 de alta avidez e IgG3 de baixa avidez predominaram nos indivíduos sem complicações de malária ou assintomáticos, enquanto anticorpos IgG4, IgE e IgM predominaram nos indivíduos com complicações clínicas por malária. Os resultados mostram que mesmo em regiões com transmissão instável de malária pode ser observado o desenvolvimento de imunidade protetora quando anticorpos apropriados são produzidos / In this study, we have evaluated the humoral immune response of individuals naturally exposed to malaria living in endemic areas of Brazil. We determined IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE and IgA antibodies against Plasmodium falciparum blood stages by ELISA. We observed that the level of high avidity IgG, IgG1 and IgG2 and low avidity IgG3 antibodies were higher in asymptomatic individuals or with uncomplicated malaria, while IgG4, IgE and IgM antibodies were higher in individuals with complicated malaria. Taken together the results showed that even in unstable malaria regions it can be observed the development of protective immunity against malaria when appropriate antibodies are produced

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.

Objetivos: A deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) está associada a um maior risco de encefalopatia bilirrubínica e de crise hemolítica aguda grave desencadeada por drogas como a primaquina e a dapsona. Conhecer a prevalência dessa deficiência enzimática em área onde a malária e a hanseníase ainda estão presentes e conhecer a prevalência das principais mutações traz subsídios para planejamento de estratégias com vistas à redução de riscos associados a esta deficiência enzimática. Métodos: Estudo descritivo transversal conduzido em uma região do centro-oeste do Brasil. Exame de triagem para deficiência de G6PD foi realizado em 3573 recémnascidos. Exame confirmatório foi necessário em 188 crianças triadas como possíveis portadores de deficiência. Nas crianças em que foi confirmada a deficiência de G6PD foi feita pesquisa das mutações G202A (G6PD A-) e C563T (G6PD Mediterrâneo) por PCR. Resultados: A deficiência de G6PD foi confirmada em 63 crianças, sendo 60 meninos (95,2%) e três meninas (4,8%). O percentual de exames falso-positivos na fase de triagem foi de 66,5%, estando o percentual de falso-positivos associado à temperatura e tempo de transporte das amostras. Entre as crianças que confirmaram deficiência de G6PD, foi mais frequente a história de anemia em familiares e de icterícia neonatal. Houve associação entre hematócrito baixo e deficiência enzimática, mas não com hemoglobina, contagem de reticulócitos ou neutrófilos. A prevalência da deficiência de G6PD (IC95%) foi de 1,76% (1,37; 2,24) entre os recém-nascidos triados e de 3,34% entre os meninos (2,58; 4,25). A mutação C563T não foi identificada em nenhuma criança, mas a mutação G202A estava presente em 58 crianças - 92,06% (IC95%: 83,29 - 97,03): 56/60 meninos e em 2/3 meninas homozigotas. Foi identificado um menino com Kernicterus portador da mutação G202A em hemizigose. Conclusão: O elevado percentual de falso-positivos na etapa de triagem, o tempo necessário entre coleta e confirmação da presença de deficiência enzimática, associado ao alto custo da triagem universal, não apoiam a inclusão da triagem de deficiência de G6PD no programa de triagem neonatal brasileiro. Na região avaliada, a prevalência observada em meninos indica que a triagem de deficiência de G6PD deva ser realizada antes do uso de drogas como a primaquina e a dapsona somente em meninos. Foi elevada a prevalência da mutação G202A, de classe III, sendo esta mutação associada a uma menor morbidade. A identificação de um menino com Kernicterus com deficiência de G6PD indica que há necessidade de se planejar estratégias para minimizar o risco dessa morbidade associada à deficiência enzimática / Objective: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is associated with an increased risk of bilirubin encephalopathy in neonates and acute hemolytic crisis triggered by drugs such as primaquine and dapsone. In an area where malaria and Hansen\'s disease are still present, knowing the prevalence of this enzyme defect and determining the prevalence of major mutations is important for planning strategies for reducing the risks associated with this enzyme deficiency. Methods: Sectional study was conducted in a Midwestern region of Brazil. Screening for G6PD deficiency was performed in 3,573 neonates. Confirmatory tests were necessary for 188 positively screened children. After confirmation, PCR investigation was utilized to identify the mutations. Results: G6PD deficiency was confirmed in 63 children: 60 boys (95.2%) and 3 girls (4.8%). The percentage of false-positive cases in the screening phase, 66.5% and was associated with the temperature and transportation time of the samples. Family history of anemia and jaundice was more frequent among the children with confirmed G6PD deficiency. An association between a low hematocrit and enzyme deficiency was observed. However, there was no association with hemoglobin reticulocyte or neutrophils counts. The prevalence of G6PD deficiency (CI95%) was 1.76% (1.37; 2.24) among all screened neonates and 3.34% (2.58; 4.25) among male children. The C563T mutation was not identified in any child. The G202A mutation was present in 58 children - 92.06% (CI95%: 83.29 - 97.03), 56/60 boys and 2/3 homozygous girls. One boy with a hemizygous G202A mutation was identified as having Kernicterus. Conclusion: The high percentage of false-positive results when first screening for G6PD deficiency; the long delay time between the test and result; along with the high cost of the this screening test, are all factors that do not support adding this test to the already established Brazilian neonatal screening programs. The prevalence observed among boys does indicate that screening for G6PD deficiency should be performed in this region before the use of drugs such as primaquine and dapsone only in boys. This study found a high prevalence of the G202A mutation, a Class III variant associated with lower morbidity. The identification of a G6PD deficient boy with Kernicterus reinforces the necessity for strategies to abolish the morbidity associated with this enzyme deficiency

A malária mata mais de um milhão de pessoas por ano, sendo uma das doenças infecciosas mais relevantes e um grande problema de saúde pública. Além disso, o surgimento de cepas resistentes aos quimioterápicos utilizados faz necessário o estudo de novos alvos para tratamentos contra esta doença. No nosso laboratório foi demonstrada a biossíntese de isoprenóides, em P. falciparum pela via MEP. Sabe-se que substâncias inibidoras da biossíntese de isoprenóides, dentre essas os terpenos, apresentam atividade antimalárica. Levando em consideração o anterior, nós avaliamos o potencial antimalárico do álcool perilico (POH) em P. falciparum e P. berghei. Nossos resultados demonstraram que o POH teve efeito inibitório contra o crescimento do P. falciparum in vitro, nas cepas 3D7 e K1 com uma IC50 de 4,8 ± 0,5 &mu;M, e 10,41±2,33 &mu;M, respectivamente. Além disso, o POH não teve efeito tóxico na linhagem celular Vero. Ainda, Comprovamos que o POH inibiu a farnesilação de proteinas entre 20 e 37 KDa de P. falciparum. Por outro lado, os experimentos in vivo não mostraram eficácia do tratamento do POH contra PbGFP em camundongos Balb/c. Em contraste, foi demostrada a eficácia do POH na de malária cerebral experimental (MCE), , indicando uma redução na taxa de incidência da MCE no grupo tratado com POH, comparado o não tratado ( P<0,05). Além disso, o POH reduziu a inflamação no cérebro dos animais tratados, uma vez que teve uma redução significativa na adesão de leucócitos aos vasos cerebrais (P<0.001), como também, o numero de hemorragias foi menor comparados com os animais não tratados. (P<0.0001). Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa abrem novas alternativas no estudo do mecanismo de ação do POH como um terpeno com grande potencial para tratar MC. / Malaria kills over one million people a year worldwide, and is one of the most important infectious diseases and a major public health problem. Furthermore, the emergence of resistant strains to chemotherapeutic agents used, make it necessary to study new targets for treatments against this disease. In our laboratory we have demonstrated the isoprenoids biosynthesis in P. falciparum, by the MEP pathway. It is known that the substances that inhibit isoprenoid biosynthesis, among these terpenes, have antimalarial activity in vitro and in vivo. Considering this, we evaluate the antimalarial potential of PA (POH) in P. falciparum and P. berghei. Our results showed that the POH had inhibitory effect against the growth of strains 3D7 and K1 of P. falciparum in vitro, with an IC50 of 4.8 &mu;M ± 0.5, and 10.41 ± 2.33 &mu;M, respectively. Furthermore, the POH had no toxic effect on cell line Vero. Moreover, the POH proved that inhibited proteins farnesylation from 20 to 37 kDa of P.falciparum. On the other hand, in vivo experiments did not show efficacy on treatment against POH PbGFP in BALB/c mice. In contrast, the effectiveness of POH in the experimental cerebral malaria (MCE) was demonstrated, indicating a reduction in the incidence rate of MCE in the group treated with POH, compared with of untreated animals (P <0.05). In addition, the POH reduced inflammation in the brain of treated animals, since it had a significant reduction in leukocyte adhesion to cerebral vessels (P <0.001), as also the number of bleeding was lower compared to untreated animals (P<0.0001). Therefore, the results obtained in this work provide new alternatives to study the POH\'s mechanism of action as a terpene with great potential to treat MC.

A malária é uma doença grave, cujos vetores são mosquitos do gênero Anopheles. Esse gênero é composto por cerca de 500 espécies e aproximadamente 45 são responsáveis pela transmissão do parasito em todo o mundo. Alguns destes vetores são componentes de complexo de espécies crípticas como Complexo Albitarsis e Complexo Triannulatus. O Complexo Albitarsis é formado por quatro espécies: An. albitarsis s.s, An. albitarsis B, An. marajoara e An. deaneorum. O Complexo Triannulatus é composto por três espécies: An. triannulatus, An. halophylus e An. triannulatus C. Algumas técnicas moleculares são utilizadas para auxiliar na distinção destas espécies crípticas. Dessa forma, DNA de An. albitarsis s.l e An. triannulatus s.l., capturados na Usina de Porto Primavera, foram amplificados para ITS2 e para o gene ND4 do DNAmt. Todas as amostras foram submetidas à técnica de RFLP. Algumas amostras foram seqüenciadas diretamente ou clonadas para posterior seqüenciamento a fim de se confirmar a espécie. Das amostras do Complexo Albitarsis, 62,85% foram identificadas como An. deaneorum para ITS2-RFLP. As restantes foram amplificadas para ND4-RFLP e foram identificadas como An. albitarsis s.s. Observou-se, no entanto, que as amostras do Complexo Albitarsis não exibiram similaridade total com as depositadas no GeneBank sendo que para ITS2-PCR estas foram identificadas como An. albitarsis s.s. e An. deaneorum, enquanto que para o gene ND4 todas foram identificadas como An. albitarsis B. O ITS2-RFLP para o An. triannulatus s.l demonstrou polimorfismos entre as espécies. No seqüenciamento, estas amostras foram similares àquelas depositadas no GeneBank. O emprego de marcadores moleculares podem, em parte, auxiliar na distinção de espécies crípticas, porém outros marcadores devem ser avaliados a fim de se elucidar a identificação do Complexo Albitarsis. / Malaria is a severe disease whose vectors are mosquitoes belonging to the genus Anopheles. This genus contains 500 species of which approximately 45 are responsible for the worldwide transmission of these parasites. Some of these vectors belong to cryptic species such as those of the Albitarsis and Triannulatus Complex. The Albitarsis Complex is composed of four species: An. albitarsis s.s., An. albitarsis B, An. marajoara and An. deaneorum. The Triannulatus Complex contains three species: An. triannulatus, An. halophylus and An. triannulatus C. We used molecular techniques to differentiate these cryptic species. Thus, DNA of An. albitarsis s.l and An. triannulatus s.l, captured at the Porto Primavera Dam had their ITS2 and their mtDNA, ND4 genes amplified. All samples were analyzed by the RFLP technique. Some samples were directly sequenced while others were cloned for subsequent sequencing for species confirmation. Within the Albitarsis Complex, 62.85% were identified as An. deaneorum by RFLP-ITS2. The remaining were amplified by RFLP-ND4 and identified as An. albitarsis s.s. However the results of sequencing of the samples of the Albitarsis Complex did not overlap entirely with those deposited in the GeneBank since those amplified by RFLP-ITS2 were identified as An. albitarsis s.s. and An. deaneorum while those obtained by RFLP-ND4 were identified as An. albitarsis B. Also RFLP-ITS2 of A. triannulatus s.l. contained polymorphic regions among different species. By sequencing, these samples were similar to those deposited in the GeneBank. The use of molecular markers did, in some instances help to distinguish species within cryptic complexes, however other markers need to be evaluated to elucidate further identification of the Albitarsis Complex.

A malária mata mais de um milhão de pessoas por ano, sendo uma das doenças infecciosas mais relevantes e um grande problema de saúde pública. Além disso, o surgimento de cepas resistentes aos quimioterápicos utilizados faz necessário o estudo de novos alvos para tratamentos contra esta doença. No nosso laboratório foi demonstrada a biossíntese de isoprenóides, em P. falciparum pela via MEP. Sabe-se que substâncias inibidoras da biossíntese de isoprenóides, dentre essas os terpenos, apresentam atividade antimalárica. Levando em consideração o anterior, nós avaliamos o potencial antimalárico do álcool perilico (POH) em P. falciparum e P. berghei. Nossos resultados demonstraram que o POH teve efeito inibitório contra o crescimento do P. falciparum in vitro, nas cepas 3D7 e K1 com uma IC50 de 4,8 ± 0,5 &mu;M, e 10,41±2,33 &mu;M, respectivamente. Além disso, o POH não teve efeito tóxico na linhagem celular Vero. Ainda, Comprovamos que o POH inibiu a farnesilação de proteinas entre 20 e 37 KDa de P. falciparum. Por outro lado, os experimentos in vivo não mostraram eficácia do tratamento do POH contra PbGFP em camundongos Balb/c. Em contraste, foi demostrada a eficácia do POH na de malária cerebral experimental (MCE), , indicando uma redução na taxa de incidência da MCE no grupo tratado com POH, comparado o não tratado ( P<0,05). Além disso, o POH reduziu a inflamação no cérebro dos animais tratados, uma vez que teve uma redução significativa na adesão de leucócitos aos vasos cerebrais (P<0.001), como também, o numero de hemorragias foi menor comparados com os animais não tratados. (P<0.0001). Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa abrem novas alternativas no estudo do mecanismo de ação do POH como um terpeno com grande potencial para tratar MC. / Malaria kills over one million people a year worldwide, and is one of the most important infectious diseases and a major public health problem. Furthermore, the emergence of resistant strains to chemotherapeutic agents used, make it necessary to study new targets for treatments against this disease. In our laboratory we have demonstrated the isoprenoids biosynthesis in P. falciparum, by the MEP pathway. It is known that the substances that inhibit isoprenoid biosynthesis, among these terpenes, have antimalarial activity in vitro and in vivo. Considering this, we evaluate the antimalarial potential of PA (POH) in P. falciparum and P. berghei. Our results showed that the POH had inhibitory effect against the growth of strains 3D7 and K1 of P. falciparum in vitro, with an IC50 of 4.8 &mu;M ± 0.5, and 10.41 ± 2.33 &mu;M, respectively. Furthermore, the POH had no toxic effect on cell line Vero. Moreover, the POH proved that inhibited proteins farnesylation from 20 to 37 kDa of P.falciparum. On the other hand, in vivo experiments did not show efficacy on treatment against POH PbGFP in BALB/c mice. In contrast, the effectiveness of POH in the experimental cerebral malaria (MCE) was demonstrated, indicating a reduction in the incidence rate of MCE in the group treated with POH, compared with of untreated animals (P <0.05). In addition, the POH reduced inflammation in the brain of treated animals, since it had a significant reduction in leukocyte adhesion to cerebral vessels (P <0.001), as also the number of bleeding was lower compared to untreated animals (P<0.0001). Therefore, the results obtained in this work provide new alternatives to study the POH\'s mechanism of action as a terpene with great potential to treat MC.

A Malária continua sendo a mais difundida e devastadora doença infecciosa, com aproximadamente 300 milhões de casos anuais e mais de 2 milhões de pessoas vivendo em áreas de risco. Entre os parasitas do gênero plasmodium causadores da malária em humanos, o plasmodium falciparum é a espécie mais letal. Este projeto teve como objetivo a síntese de pró-fármaco recíproco de cloroquina e primaquina e de pró-fármacos duplicados de cloroquina e de primaquina utilizando, para tanto, espaçantes inespecíficos (carboxílicos). Espera-se que o pró-fármaco recíproco permita a cura radical em casos de malária vivax e que os derivados duplicados apresentem maior eficácia, com diminuição da toxicidade, especialmente no caso do derivado de primaquina. Além desses compostos, propôs-se a síntese de pró-fármacos duplicados de cloroquina mediante a ligação com grupo espaçante específico (peptídeos) à cisão pela falcipaína. Tais derivados são potencialmente ativos em malária causada pelo P. falciparum resistente à cloroquina. / Malaria remains the world\'s most widespread and devastating infectious disease, with approximately 300 million annual cases and more than 2 million casualties. Among the protozoan parasites of the genus Plasmodium causing malaria in humans, Plasmodium falciparum is the most lethal species. This project had as objective the synthesis of reciprocal prodrug of chloroqine and primaquine using, for in such a way, inespecífics agents (carboxylics). One expects that the mutual prodrug allows to the radical cure in cases of malaria vivax and that the derivatives duplicates present greater effectiveness, with reduction of the toxicity, especially in the case of the primaquine derivative. Beyond these composites, it was considered synthesis of mutual prodrugs of chloroquine by means of the linking with specific carrier group (peptides) to the split for falcipain. Such derivatives are potentially active in malaria caused for the resistant P. falciparum to the chloroquine.

O Antígeno-1 de Membrana Apical (AMA-1) de merozoítas de Plasmodium é um dos principais candidatos a compor uma vacina contra a malária. A função biológica de AMA-1 não é totalmente conhecida, entretanto, existem evidências que sugerem a participação dessa proteína na ligação a eritrócitos de diferentes espécies de Plasmodium. O objetivo deste estudo foi investigar a participação de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) na ligação a eritrócitos humanos utilizando células COS-7 transfectadas com plasmídios recombinantes codificando diferentes regiões do ectodomínio de PvAMA-1. Para isso, os genes que codificam os domínios I-II ou III de PvAMA-1 foram inseridos no vetor pDisplay-EGFP, que permite a expressão das proteínas recombinantes em fusão com a porção N-terminal da Proteína Fluorescente Verde (GFP). Em paralelo, utilizamos construções contendo os genes que codificam a região C-terminal de 19 kDa da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (PvMSP119) e a região II da Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). As quatro construções foram utilizadas para transfectar células COS-7 na presença de lipofectamina. A eficiência das transfecções transientes foi confirmada por imunofluorescência utilizando anticorpos específicos. Em seguida, estudamos a participação dos diferentes domínios de PvAMA-1 na ligação aos eritrócitos. Nossos resultados mostraram que os domínios contíguos I-II, ao contrário do domínio III, foram capazes de se ligar a eritrócitos in vitro. Essa ligação foi específica, pois soros de indivíduos infectados por P. vivax e soros policlonais de camundongos contendo anticorpos anti-PvAMA-1 foram capazes de inibir essa ligação em 82,0% e 79,8%, respectivamente. Além disso, anticorpos monoclonais dirigidos contra o domínio II dessa proteína foram capazes de inibir parcialmente essa ligação. Após o tratamento de eritrócitos com tripsina ou quimiotripsina, estas células perderam grande parte de sua capacidade de ligação, sugerindo que o receptor para PvAMA-1 tenha constituição predominantemente protéica. Em conjunto, nossos resultados podem servir de base para futuros estudos visando um melhor entendimento da função de anticorpos gerados durante a infecção natural ou induzidos após vacinação com PvAMA-1. / The Apical Membrane Antigen (AMA-1) of Plasmodium merozoites is one of the main candidates to be part of a vaccine against malaria. The biological function of AMA-1 is unknown. However, there are evidences that suggest the participation of this protein in the interaction with erythrocytes (RBC) of different Plasmodium species. Using transfected COS-7 cells with recombinant plasmids encoding different portions of the PvAMA-1 ectodomain, our aim was to identify possible domains of PvAMA-1 able to interact with human RBC. The genes that encoded domains I and II in combination or domain III of PvAMA-1 were cloned into the pDisplay-EGFP vector. This vector allows expression of the protein fused to the N-terminus of enhanced green fluorescent protein (GFP). In parallel, we also used constructions containing the genes that encoded the 19 kDa C-terminal region of Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP119) and region II of the Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). Constructions were used to transiently transfect COS-7 cells. The efficiency of expression of all constructs was confirmed by immunofluorescence assay using specific antibodies. After that, we studied the participation of the different domains of PvAMA-1 in the binding to human RBC. We found that COS-7 cells expressing domains I-II, but not domain III, bound to human RBC in vitro. This binding was specific, because sera from malaria-infected patients and mouse polyclonal sera containing antibodies to PvAMA-1 were able to block the adhesion by 82.0% and 79.8%, respectively. Moreover, monoclonal antibodies directed against domain II were partially inhibitory in the cytoadherence assays. The receptor recognized on the surface of COS-7 cells expressing the domains I and II was partially removed after human RBC were treated with trypsin or chymotrypsin, suggesting that its composition is predominantly protein. In conclusion, our results can be used as basis for future studies aimed at better understating the function of the antibodies generated during the natural infection or after vaccination with PVAMA-1.

Foi estudado o perfil nosológico da população ribeirinha do Baixo Rio Machado em Rondônia, área de Amazônia Ocidental no Brasil. Neste estudo, escolhemos abordar o perfil das seguintes doenças: malária, hepatite viral B e C, parasitose intestinal e papilomavírus humano. Estas doenças foram priorizadas devido à importância clínica e epidemiológica e também escassez de estudos referentes nas populações ribeirinhas amazônicas. Para isto, foi realizado um estudo descritivo no Baixo Rio Machado que se localiza a 250 km de Porto Velho (capital do Estado de Rondônia) pela margem direita do Rio Madeira, que é um afluente volumoso do Rio Amazonas, no Brasil. Nesta área, vivem aproximadamente 806 pessoas distribuídas em 55 comunidades ribeirinhas isoladas. Em Rondônia, encontramos locais, como o Rio Machado, que abrigam a presença de portadores assintomáticos do Plasmodium, fato que pode contribuir para a persistência desta doença na região. Para caracterizar o perfil da malária ribeirinha, focalizando aspectos da infecção assintomática e sintomática, foram realizados hemoscopia e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com amplificação do DNA ribossomal do parasita para Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum para o diagnóstico da malária. Foi considerado como assintomático o paciente com hemoscopia positiva ou PCR positivo que permaneceu sem sintomas durante pelo menos 60 dias. Foi realizado acompanhamento longitudinal de 70 dias após o primeiro corte transversal (nC1=585 pessoas) para observação dos pacientes assintomáticos diagnosticados por hemoscopia, onde 25 pacientes (4,25%) permaneceram assintomáticos durante todo esse seguimento. Após, foi realizado mais dois cortes transversais a cada 6 meses (nC2=583 pessoas, nC3=607 pessoas), com tratamento dos indivíduos assintomáticos diagnosticados por PCR no corte transversal anterior ou hemoscopia atual e também dos casos sintomáticos. Foi estudado, na população que permaneceu na área durante toda a pesquisa (n=379), o perfil e o impacto do tratamento da infecção assintomática. Houve diminuição da infecção por P. falciparum de seis vezes e aumento da prevalência de malária por P. vivax de aproximadamente três vezes. O diagnóstico por PCR foi de 2-5 vezes mais eficiente do que por hemoscopia e a prevalência de infecção assintomática foi de 16 a 22% nos cortes transversais. Assim, foi observada a importância do tratamento dos indivíduos assintomáticos para o controle da malária no local, sendo que o incremento de malária por Plasmodium vivax deve ter ocorrido devido a recaídas da doença. Com o estudo entomológico da área, foi verificado que o vetor Anopheles possui atividade hematofágica moderada e principalmente em região peridomiciliar, sendo o A. darlingi a principal espécie da região. Existem poucos dados sobre a prevalência de hepatites na população ribeirinha de Rondônia, o que dificulta a vigilância epidemiológica nestas regiões amazônicas. Foi realizado um estudo de prevalência de hepatite B e C na área, com 123 pacientes pertencentes a 5 comunidades ribeirinhas, incluindo todas as pessoas que estavam presentes na área no momento do corte transversal, de todas as faixas etárias. Foi realizada sorologia para os marcadores de hepatite B: HbsAg, Anti-Hbc (total) e Anti-Hbs e sorologia para hepatite C com o marcador anti-HCV. Foram encontrados 12 (14,7%) pacientes com hepatite B aguda, 29 (38,7%) pacientes apresentaram imunidade vacinal para hepatite B e 7 (9,3%) pacientes apresentaram hepatite C, sendo que um (1,3%) paciente tinha co-infecção para hepatite B e C. Notou-se que esta população ribeirinha está exposta às hepatites virais, sendo necessário intensificar a vigilância epidemiológica na área, assim como a cobertura vacinal e também fornecer cuidados preventivos, curativos e paliativos em relação a estas doenças. A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é altamente prevalente, sendo detectada em aproximadamente 10% a 20% da população sexualmente ativa entre 15 e 49 anos de idade. A introdução de testes mais acurados para a detecção do DNA do HPV em investigações epidemiológicas confirmou a importância do HPV, principalmente dos tipos de alto risco, como o principal fator de risco para o desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial cervical e câncer do colo uterino. Não foram encontrados estudos sobre a existência do HPV em populações ribeirinhas amazônicas na literatura médica. Foi realizado, então, um estudo transversal para levantar a prevalência de HPV nesta população, com 84 participantes em idade sexualmente ativa presentes na área. Após coleta de consentimento informado e questionário clínico-epidemiológico, foi realizado exame para isolar o HPV. A tipagem do HPV foi realizada com amplificação dos DNAs por PCR empregando iniciadores genéricos seguida de hibridização em pontos, capaz de identificar mais de 40 tipos diferentes de HPVs. Foram encontradas 18 pacientes contaminadas pelo HPV, perfazendo 21,4% da amostra. Os tipos de HPV encontrados foram: 53, 58, 31, 56, 16, 83, 55, 66, 45, 51, 40, 42, 6, 68. Os tipos de HPV mais freqüentes foram 51 (23%), 58 (19%), 53 (7,7%), 83 (7,7%), sendo HPV 16 encontrado em 3,8% das pacientes HPV positivas e a prevalência do HPV de alto risco oncogênco foi de 13,1%. Desta forma, foi encontrado alta prevalência de HPV na população ribeirinha amazônica estudada, evidenciando a necessidade de vigilância epidemiológica para câncer de colo uterino na região. Por fim, foi estabelecido a prevalência de parasitoses intestinais na população, abordando a correlação das enteroparasitoses com malária assintomática e anemia, realizando um inquérito coproparasitológico na área incluindo pacientes de todas as faixas etárias, que estivessem dispostos a participar do estudo. A análise das amostras foi realizada pelo método da Sedimentação Espontânea (método de Lutz ou Hoffmann, Pons & Janer). Entre os 268 exames de fezes realizados, a prevalência de parasitose intestinal encontrada na região em estudo foi de 86,6%. Entre os helmintos, Ascaris lumbricoides (47%), Ancilostomideos (37,3%), Trichuris trichiura (3,4%), Capillaria hepatica (2,3%), foram os parasitas mais encontrados. Entre os protozoários foram encontrados: Entamoeba coli (21,4%), Entamoeba histolytica (12%), Giardia intestinalis (15,4%), Endolimax nana (10,1%) e Iodamoeba butschlii (7,5%). A alta prevalência de parasitose intestinal encontrada na pesquisa foi concordante com outros dados desenvolvidos na Região Amazônica. Com este estudo, a região da Amazônia Ocidental insere-se no cenário geográfico mundial de distribuição da Capillaria hepatica, particularmente, a região do Baixo Rio Machado. / Was studied the nosological profile of the riverside population of the Baixo Rio Machado in Rondônia, Western Amazon area of Brazil. In this study, was chosed the profile of following diseases: malaria, hepatitis B and C, intestinal parasite and human papillomavirus. These diseases have been prioritized due to clinical and epidemiological importance and scarcity of studies in the riverside Amazon population. For this, was conducted a descriptive study in the Baixo Rio Machado which is located 250 km from Porto Velho (capital of Rondônia State) in the right bank of the Rio Madeira which is a large tributary of the Amazon River in Brazil. In this area, live about 806 people distributed in 55 riversides communities isolated. In Rondônia, we find places such as the Rio Machado, which shelter to the presence of asymptomatic carriers of Plasmodium, which may contribute to the persistence of this disease in the region. To characterize the profile of malaria riverside, focusing on aspects of symptomatic and asymptomatic infections, were performed haemoscopia and Polymerase Chain Reaction (PCR) with amplification of ribosomal DNA for the parasite Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum to the diagnosis of malaria. Was considered as asymptomatic patient with positive haemoscopia or positive or PCR that remained without symptoms for at least 60 days. Longitudinal follow-up was conducted for 70 days after the first cross section (nC1 = 585 people) for observation of asymptomatic patients diagnosed by haemoscopia where 25 patients (4.25%) remained asymptomatic throughout the follow-up. After was performed two cross cuts every 6 months (nC2 = 583 people, nC3 = 607 people), with treatment of asymptomatic individuals diagnosed by PCR in previous transverse cross-sections or haemoscopia a current and also symptomatic cases. We studied in the population that remained in the area throughout the study (no= 379), the profile and impact of treatment of asymptomatic infection. There was a decrease in infection by P. falciparum of six times and increased prevalence of malaria by P. vivax approximately three times. The diagnosis by PCR was 2-5 times more efficient than haemoscopia and the prevalence of asymptomatic infection was 16 to 22% in transverse cross-sections. Thus, was saw the importance of treatment of asymptomatic individuals for the control of malaria in the place, and the increase in malaria by Plasmodium vivax should have occurred due to relapse of the disease. With entomological study of the area, was saw that the vector Anopheles has moderate blood activity and especially in peridomiciliary region and the A. darlingi the main species in the region. There are few data on the prevalence of hepatitis in riverside population of Rondônia, which makes surveillance in Amazonian regions. Was conducted a study of prevalence of hepatitis B and C in the area, with 123 patients belonging to 5 communities, including all the people who were present in the area at the cross section of all ages. Serology was performed for markers of hepatitis B: HBsAg, anti-HBc (total) and anti-HBs and serology for hepatitis C with anti-HCV marker. Was found 12 (14.7%) patients with acute hepatitis B, 29(38.7%) patients demonstrated immunity to hepatitis B vaccine and 7(9.3%) patients had hepatitis C, with one (1.3%) patient had co-infection for hepatitis B and C. Realize that this riverside population is exposed to viral hepatitis, being necessary to intensify epidemiological surveillance in the area, as well as immunization coverage and provide preventive care, curative and palliative for these diseases. The infection by human papillomavirus (HPV) is highly prevalent, being detected in approximately 10% to 20% of the sexually active population between 15 and 49 years of age. The introduction of more accurate tests for the detection of HPV DNA in epidemiological investigations confirmed the importance of HPV, particularly types of high risk, as the main risk factor for the development of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. Was found no studies on the existence of HPV in riverside Amazonian populations in the medical literature. The transversal cross-section study was take up to raise the prevalence of HPV in this population, with 84 participants in sexually active age in the area. After collection of informed consent and clinical-epidemiological questionnaire, was conducted to isolate the HPV test. The typing of HPV was taking with the DNAs for PCR using generic primers followed by hybridization in points, able to identify over 40 different types of HPV. Was found 18 patients infected by HPV, comprising 21.4% of the sample. The HPV types found were: 53, 58, 31, 56, 16, 83, 55, 66, 45, 51, 40, 42, 6, 68. The most common HPV types were 51 (23%), 58 (19%), 53 (7.7%), 83 (7.7%) with HPV 16 found in 3.8% of HPV positive patients and prevalence the high risk HPV oncogenic was 13.1%. Thus, was find high prevalence of HPV in riverside Amazonian population studied, highlighting the need for surveillance for cancer of the cervix in the region. Finally, was established the prevalence of intestinal parasites in the population, deal the correlation of intestinal with asymptomatic malaria and anemia, taking the fecal examination conducting in the area including patients of all ages, who were willing to participate in the study. The analysis of samples was performed by the spontaneous sedimentation method (method of Lutz or Hoffmann, Pons & Janer). Among the 268 fecal examinations, the prevalence of intestinal parasite found in the region under study was 86.6%. Among helminths, Ascaris lumbricoides (47%), Ancilostomideos (37.3%), Trichuris trichiura (3.4%), Capillaria hepatica (2.3%) were found more parasites. Among the protozoa were: Entamoeba coli (21.4%), Entamoeba histolytica (12%), Giardia intestinalis (15.4%), Endolimax nana (10.1%) and Iodamoeba butschlii (7.5%).The high prevalence of intestinal parasite found in the survey was consistent with other data developed in the Amazon region. In this study, the region of the Western Amazon is part of the scenario of global geographic distribution of Capillaria hepatica, particularly the region of the Baixo Rio Machado.

A exposição limitada ao Plasmodium chabaudi induz proeminente imunidade celular, associada à proteção de células T da apoptose. Este estudo tem como objetivo verificar a influência da carga parasitária na geração e manutenção dos linfócitos T e B de memória ao P. chabaudi. Assim, camundongos C57BL/6 foram submetidos à infecção tratada (subpatente) ou não (patente) com cloroquina após a inoculação de 106 eritrócitos parasitados (EP) e analisados nos dias 0, 20, 60, 120 e 200. Com relação à memória de linfócitos T, no dia 20, as freqüências de células CD4+ memória/ativadas e respondedoras aos EP foram significativamente maiores nos animais do grupo subpatente. Os níveis máximos de IgG2a específica foram encontrados no dia 120 em ambos os grupos. O desafio dos animais com 108 EP mostrou que a imunidade protetora declina progressivamente, mas os grupos ainda são capazes de estabelecer resposta secundária eficiente que elimine o parasita. Assim, podemos concluir que a carga parasitária influencia a fase aguda, mas não impede a geração e manutenção das células T e B de memória. / One of the main characteristics of malaria is the intense policlonal activation of splenic T and B lymphocytes induced by the parasite and the consequent elimination, through apoptosis, of part of these cells. However, the limited exposure to the bloodstage malaria seems to induce a prominent cellular immunity, associated with the protection of T lymphocytes from apoptosis. With this in mind, this study aimed to verify the influence of the parasite load in the generation and maintenance of memory T and B cells specific for Plasmodium chabaudi chabaudi AS. In order to evaluate this idea, C57BL/6 mice were infected with 106 parasitized red blood cells (pRBC) and submitted to a patent (untreated) or subpatent infection (controlled with sub-curative doses of chloroquine every time parasitemia reached 1%). Splenocytes from these mice were analyzed at 20, 60, 120 and 200 days after infection, regarding the pRBC-specific T cell proliferation and the expression of surface molecules, as CD4, CD8, CD62L, CD45RB, CD44, CD45R-B220 and IgG. The parasitemia and the splenocyte phenotype were also monitored after the challenge with 108 pRBC. Regarding T cell memory, at day 20 of infection, the frequencies of effector/activated CD4+ T cells (CD62LLOW CD45RBLOW/HIGH) were significantly increased in animals from the patent group, which was strict linked with the highest cellular activation observed in these animals. On the other hand, the total numbers of pRBCproliferating T (CD4+ and CD8+) cells per spleen were approximately 3-fold increased in subpatent animals, indicating that these cells were protected from apoptosis as a result of the limited exposure to the parasite. However, in both groups, these parameters decreased to values similar to those in controls at day 200. The splenocytes from both groups produced Th1 cytokines in response to pRBC in all times of analysis, but at the early phase of infection, Th2 cytokines were also observed, but without differences between the infected groups. Regarding memory B cells, the frequency of sIgG+ cells was increased at day 20 of infection, when 11% and 9% of CD45R+ cells from patent and subpatent animals were positive, respectively. For both groups, specific IgG2a antibodies attained maximum serum levels at day 120, but at day 200, it is possible to observe a significant decrease of these levels only in the serum of patent mice. Moreover, at day 200 of infection, mice of subpatent group showed significantly higher amounts of IgG2a that recognized the intra-erythrocytic forms of the parasite and the surface of infected erythrocytes. Challenge of mice with 108 pRBC showed that protective immunity progressively decline with time and despite the higher levels of specific antibody in subpatent mice, both groups showed similar protection. In experiments of adoptive transference to CD28-/- mice, cells from 200-day infected mice were able to produce specific IgG2a antibodies, in a T CD4+ cell dependent way. In addition, we verified that CD45R+ cells of subpatent mice, when transferred to CD28-/- mice, secreted higher amounts of specific IgG2a and IgG1 antibodies, comparing to cells of patent mice. So, from this work, we can conclude that the parasite load has a great influence in the early immune response to P. chabaudi malaria and it also affects the generation and/or maintenance of memory B cells. Furthermore, according to our data, at least during the analyzed period, the loss of protective immunity against this parasite does not seem to be influenced by the acute-phase parasite load, but it can be a consequence of the progressive decline of T-cell memory response that occurs in patent and subpatent groups with time of infection.