De plus en plus de preuves montrent que le transport axonal rapide (FAT) joue un rôle crucial au cours des maladies neurodégénératives (NDs). La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative causée par une expansion anormale de polyglutamines dans la partie Nterminale de la protéine huntingtine (HTT) : une grande protéine d’échafaudage impliquée dans la régulation du transport. La présence de HTT mutante comme l’absence de la HTT induisent des défauts de transport chez les mammifères. Chez la Drosophile, la HTT mutante reproduit le phénotype observée chez les mammifères, cependant la fonction conservée de la HTT chez la Drosophile melanogaster (DmHTT) n’est pas encore clairement établie. Ici nous mettons en évidence que DmHTT s’associe aux vésicules, aux microtubules et intéragit avec la proteine dynéine. Dans les neurones corticaux de rat, DmHTT remplace partiellement la HTT de mammifère dans le transport axonal rapide, et les drosophiles invalidées pour la HTT montrent des défauts de transport axonal in vivo. Ces résultats suggèrent que la fonction de la HTT est conservée dans le modèle Drosophile.Le FAT est un processus qui requiert un apport constant d’énergie. Les mitochondries sont les principales sources de production d’ATP de la cellule. Cependant nous avons démontré que le FAT ne dépend non pas de cette source d’énergie là, contrairement à ce que l’on pensait, mais de l’ATP glycolytique produit par les vésicules. La dérégulation de GAPDH ou de PK, les deux enzymes glycolytiques productrices d’ATP, ralentit le transport vésiculaire. Néanmoins, l’invalidation de GAPDH n’affecte pas le transport mitochondrial. En outre, toutes les enzymes glycolytiques sont associées à des vésicules dynamiques et sont capables de produire leur propre ATP. Enfin nous montrons que l’ATP produit est suffisant pour assurer leur propre transport, prouvant l’autonomie énergétique des vésicules pour le transport. / Growing evidence support the idea that impairments in Fast Axonal Transport (FAT) play a crucial role in Neurodegenerative Diseases (NDs). Huntington’s Disease is neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine expansion in the N-Terminal part of huntingtin (HTT), a large scaffold protein implicated in transport regulation. Both the presence of the mutated HTT as the loss of HTT leads to transport defects in mammals. In the fruit fly overexpression of the mutant HTT recapitulates the phenotype observed in mammals. However, it is still unclear whether HTT’s function is conserved in D. melanogaster. Here, we show that D. melanogaster HTT (DmHTT) associates with vesicles, microtubules, and interacts with dynein. In rat cortical neurons, DmHTT partially replaces mammalian HTT in fast axonal transport, and DmHTT KO flies show axonal transport defects in vivo. These results suggest that HTT function in transport is conserved in D. melanogaster.FAT is a process that requires a constant supply of energy. Mitochondria are the main producers of ATP in the cell. However, we have demonstrated that FAT does not depend on this source of energy, as previously thought, but it depends on glycolytic ATP produced on vesicles. Perturbing GAPDH or PK, the two ATP generating glycolytic enzymes, slows down vesicular transport. However, knocking down GAPDH does not affect mitochondrial transport. Furthermore, all of the glycolytic enzymes are associated with dynamic vesicles, and are capable of producing their own ATP. Finally, we show that this ATP production is sufficient to sustain their own transport, demonstrating the energetical autonomy of vesicles for transport.

L’atteinte neuromusculaire, responsable notamment d’une dégradation des muscles, entraine une insuffisance respiratoire sévère. Cette dernière constitue la composante majeure de la maladie, tant en termes de pronostic que de prise en charge. A ce jour, seule la ventilation mécanique permet de compenser l’affection respiratoire. Elle s’impose donc comme indication thérapeutique incontournable et son efficacité n’est plus à prouver. En effet, l’utilisation de la ventilation mécanique a permis l’impact de l’atteinte respiratoire très tôt le pronostic vital. En 40 ans, ce traitement a permis d’allonger considérablement l’espérance de vie des malades, passant pour par exemple les myopathies de Duchenne de Boulogne de 15 ans à plus de 30 ans à l’heure actuelle.Aujourd’hui, pour ces personnes dont la durée de vie a pu être allongée, se pose l’inévitable question de leur Qualité de vie, d’autant plus que cet allongement de vie s’accompagne d’une aggravation de la déficience musculaire et donc des dysfonctions motrices. De plus, il apparaît que la ventilation mécanique, si elle assure un confort respiratoire indispensable, accroît considérablement le niveau de dépendance des malades et fait émerger chez eux de nouvelles problématiques identitaires, psychosociales ou même économiques. Il s’avère essentiel d’identifier les conséquences de la maladie et du Handicap qu’elle entraine. Il convient ensuite d’analyser l’impact direct de la ventilation mécanique sur la qualité de vie des malades et notamment son effet délétère sur la communication et la déglutition des patients. L’objectif principal de ce travail est de proposer en réponse à notre problématique des alternatives visant à améliorer la qualité de vie des patients en optimisant les deux grandes fonctions physiologiques que sont la parole et la déglutition / Neuromuscular diseases responsible of a wasting of the muscles, may involve severe respiratory failure. It is a major component of the disease, both in terms of prognosis and management. Up to now, only mechanical ventilation can compensate the respiratory disease. It is therefore required as an essential therapeutic indication and its effectiveness is already proven. Indeed, mechanical ventilation has allowed a significant increase of life expectancy. Over the past 40 years, this treatment has considerably increased the life expectancy of patients; for instance patients with Duchenne who passed away in their late teens survive now over their 30’s. Nowadays, for those people whose life has been extended, the question of their quality of life is unavoidable, especially as this longer life is accompanied by a worsening of muscle impairment and of motor disorder. Moreover, it appears that mechanical ventilation, if it provides breathing comfort, increases the level of dependency of patients and leads to the emerging psychological and even economical problems. It is essential to identify the consequences of the disease and the disability that it involves. It is then necessary to analyze the direct impact of mechanical ventilation on the quality of life of patients and especially its deleterious effects on communication and swallowing

Le syndrome d'apnée du sommeil (SAS) est une maladie multifactorielle caractérisée par des épisodes récurrents de pauses respiratoires ou des réductions significatives de l'amplitude respiratoire pendant le sommeil. Ces épisodes peuvent provoquer des réactions cardiorespiratoires aiguës; délétères à long terme. Plusieurs thérapies ont été proposées, étant la pression positive continue des voies respiratoires (CPAP) le traitement de référence. Malgré ces excellents résultats chez les patients symptomatiques, le taux de refus initial est de 15% et une adhésion à long terme est difficile à atteindre. Par conséquent, le développement de méthodes de traitement non invasives, avec une meilleure acceptabilité, reste d’une importance majeure. Dans ce contexte, l’hypothèse qui sous-tend ce travail est qu’une stimulation kinesthésique contrôlée, délivrée au cours de la phase précoce de l’apnée, peut réduire la durée des événements respiratoires et, par la suite, limiter les désaturations d’oxygène associées, par une activation contrôlée du réflexe de sursaut. La première partie de ce manuscrit est consacrée à la description d'un nouveau système (PASITHEA) de surveillance en temps réel et de neuromodulation thérapeutique, qui fonctionne comme un dispositif polyvalent de diagnostic et de traitement de SAS par stimulation kinesthésique. Les principales contributions de cette thèse se concentrent sur les aspects du traitement du signal et du contrôle de ce système, ainsi que sur l'électronique associée. Une autre contribution est liée à l'évaluation de ces méthodes et dispositifs par des protocoles cliniques spécifiques. Dans une deuxième partie, nous proposons une première méthode de contrôle On/Off optimale pour délivrer la stimulation, en utilisant comme variable de contrôle la sortie d'un détecteur d'événements respiratoires en temps réel. Lors de la détection d'un événement, une stratégie de stimulation unique avec amplitude de stimulation constante est appliquée, cette dernière a été mise en œuvre dans le cadre d'un premier protocole clinique dédié à l'évaluation de la réponse du patient au traitement. Les résultats ont montré que 75% des patients répondaient correctement au traitement en termes de durées des épisodes respiratoires. De plus, des diminutions significatives de la variabilité du SaO2 ont également été constatées lors de la mise en œuvre d'une nouvelle méthode d'analyse aiguë. Puisque nous avons supposé qu'une sélection inappropriée des patients pourrait expliquer l'absence de réponse observée chez 25% des patients. Nous avons proposé une méthode pour différencier les patients qui pourraient bénéficier de cette thérapie, basée sur l'estimation d'indices de variabilité cardiaque. Les résultats de ces analyses ont montré que l'efficacité de cette thérapie semble corrélée à un système nerveux autonome fonctionnel. Enfin, une méthode améliorée de contrôle en boucle fermée, intégrant des correcteurs proportionnels-dérivés (PD) couplés et simultanés a été proposée afin de modifier de façon adaptative l’amplitude de stimulation kinesthésique délivrée au patient par le système thérapeutique, en utilisant comme variables de contrôle des signaux physiologiques enregistrés en temps réel. Un deuxième protocole clinique visant à valider l'algorithme de contrôle de la stimulation kinesthésique adaptative spécifique au patient a été initié. Plusieurs améliorations ont été effectuées à la première version du système afin de permettre l'intégration du contrôleur proposé. Les résultats préliminaires de cette étude ont validé le fonctionnement de notre contrôleur et ont montré que notre système était capable de fournir une stimulation kinesthésique adaptative en fonction des réponses propres au patient. Une autre phase de cette étude, mettant en œuvre le contrôleur avec un ensemble des paramètres de contrôle présélectionnés, est actuellement en cours. / Sleep apnea syndrome (SAS) is a multifactorial disease characterized by recurrent episodes of breathing pauses or significant reductions in respiratory amplitude during sleep. These episodes may provoke acute cardiorespiratory responses along with alterations of the sleep structure, which may be deleterious in the long term. Several therapies have been proposed for the treatment of SAS, being continuous positive airway pressure the gold standard treatment. Despite its excellent results in symptomatic patients, there is a 15% initial refusal rate and long term adherence is difficult to achieve in minimally symptomatic patients. Therefore, the development of non-invasive SAS treatment methods, with improved acceptability, is of major importance. The objective of this PhD thesis is to propose new signal processing and control methods of non-invasive neuromodulation for the treatment of SAS. The hypothesis underlying this work is that bursts of kinesthetic stimulation delivered during the early phase of apneas or hypopneas may elicit a controlled startle response that can activate sub-cortical centers controlling upper airways muscles and the autonomic nervous system, stopping respiratory events without generating a cortical arousal. In this context, the first part of this manuscript is dedicated to the description of a novel real-time monitoring and therapeutic neuromodulation system, which functions as a multi-purpose device for SAS diagnosis and treatment through kinesthetic stimulation. This system has been developed in the framework of an ANR TecSan project led by our laboratory, with the participation of Sorin CRM SAS. The main contributions in this thesis are focused on the signal processing and control aspects of this system, as well as the electronics associated. Another contribution is related to the evaluation of these methods and devices through specific clinical protocols. In a second part, we propose a first optimal On/Off control method for delivering kinesthetic stimulation, using as control variable the output of a real-time respiratory event detector. A unique stimulation strategy where a constant stimulation amplitude is applied upon event detention was implemented in a first clinical protocol, dedicated to assessing the patient response to therapy. Results showed that 75% of the patients responded correctly to therapy, showing statistically significant reductions in respiratory event durations. Also, significant decreases in the SaO2 variability were also found when implementing a novel acute analysis method. Since we hypothesized that inappropriate patient selection could explain the observed lack of response in 25% of patients, we proposed a method to differentiate patients who could benefit from this therapy based on the estimation of complexity-based indexes of heart rate variability. Results of these analyses showed that the effectiveness of this therapy seems correlated to a functional autonomic nervous system. Finally, an improved closed-loop control method integrating concurrent, coupled proportional-derivative (PD) controllers in order to adaptively change the kinesthetic stimulation was proposed. It uses as control variables three physiological signals recorded in real-time: Nasal pressure, oxygen saturation and the electrocardiogram signal. A second clinical protocol with the main objective of validating the control algorithm for patient-specific adaptive kinesthetic stimulation was launched. Several improvements to the first version of the system were developed to allow the integration of the proposed controller. Preliminary results from the first phase of this study validated the proposed controller operation and showed that the controller was able to provide adaptive kinesthetic stimulation in function of the patient-specific responses. A second phase of this study implementing the proposed controller and the set of the selected control parameters from the first phase is currently ongoing.

Le cerveau humain est un réseau très complexe. Le fonctionnement cérébral ne résulte donc pas de l'activation de régions cérébrales isolées mais au contraire met en jeu des réseaux distribués dans le cerveau (Bassett and Sporns, 2017; McIntosh, 2000). Par conséquent, l'analyse de la connectivité cérébrale à partir des données de neuroimagerie occupe aujourd'hui une place centrale dans la compréhension des fonctions cognitives (Sporns, 2010). Grâce à son excellente résolution spatiale, l'IRMf est devenue l'une des méthodes non invasives les plus couramment utilisées pour étudier cette connectivité. Cependant, l'IRMf a une faible résolution temporelle ce qui rend très difficile le suivi de la dynamique des réseaux cérébraux. Un défi considérable en neuroscience cognitive est donc l'identification et le suivi des réseaux cérébraux sur des durées courtes (Hutchison et al., 2013), généralement <1s pour une tâche de dénomination d'images, par exemple. Jusqu'à présent, peu d'études ont abordé cette question qui nécessite l'utilisation de techniques ayant une résolution temporelle très élevée (de l'ordre de la ms), ce qui est le cas pour la magnéto- ou l'électro-encéphalographie (MEG ou EEG). Cependant, l'interprétation des mesures de connectivité à partir d'enregistrements effectués au niveau des électrodes (scalp) n'est pas simple, car ces enregistrements ont une faible résolution spatiale et leur précision est altérée par les effets de conduction par le volume (Schoffelen and Gross, 2009). Ainsi, au cours des dernières années, l'analyse de la connectivité fonctionnelle au niveau des sources corticales reconstruites à partir des signaux du scalp a fait l'objet d'un intérêt croissant. L'avantage de cette méthode est d'améliorer la résolution spatiale, tout en conservant l'excellente résolution temporelle de l'EEG ou de la MEG (Hassan et al., 2014; Hassan and Wendling, 2018; Schoffelen and Gross, 2009). Cependant, l'aspect dynamique n'a pas été suffisamment exploité par cette méthode. Le premier objectif de cette thèse est de montrer comment l'approche « EEG connectivité source » permet de suivre la dynamique spatio-temporelle des réseaux cérébraux impliqués soit dans une tache cognitive, soit à l'état de repos. Par ailleurs, les études récentes ont montré que les désordres neurologiques sont le plus souvent associés à des anomalies dans la connectivité cérébrale qui entraînent des altérations dans des réseaux cérébraux «large-échelle» impliquant des régions distantes (Fornito and Bullmore, 2014). C'est particulièrement le cas pour l'épilepsie et les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson) qui constituent, selon l'OMS, un enjeu majeur de santé publique. Dans ce contexte, la demande clinique est très forte pour de nouvelles méthodes capables d'identifier des réseaux pathologiques, méthodes simples à mettre en œuvre et surtout non invasives. Ceci est le deuxième objectif de cette thèse. / The human brain is a very complex network. Cerebral function therefore does not imply activation of isolated brain regions but instead involves distributed networks in the brain (Bassett and Sporns, 2017, McIntosh, 2000). Therefore, the analysis of the brain connectivity from neuroimaging data has an important role to understand cognitive functions (Sporns, 2010). Thanks to its excellent spatial resolution, fMRI has become one of the most common non-invasive methods used to study this connectivity. However, fMRI has a low temporal resolution which makes it very difficult to monitor the dynamics of brain networks. A considerable challenge in cognitive neuroscience is therefore the identification and monitoring of brain networks over short time durations(Hutchison et al., 2013), usually <1s for a picture naming task, for example. So far, few studies have addressed this issue which requires the use of techniques with a very high temporal resolution (of the order of the ms), which is the case for magneto- or electro-encephalography (MEG or EEG). However, the interpretation of connectivity measurements from recordings made at the level of the electrodes (scalp) is not simple because these recordings have low spatial resolution and their accuracy is impaired by volume conduction effects (Schoffelen and Gross, 2009). Thus, during recent years, the analysis of functional connectivity at the level of cortical sources reconstructed from scalp signals has been of increasing interest. The advantage of this method is to improve the spatial resolution, while maintaining the excellent resolution of EEG or MEG (Hassan et al., 2014; Hassan and Wendling, 2018; Schoffelen and Gross, 2009). However, the dynamic aspect has not been sufficiently exploited by this method. The first objective of this thesis is to show how the EEG connectivity approach source "makes it possible to follow the spatio-temporal dynamics of the cerebral networks involved either in a cognitive task or at rest. Moreover, recent studies have shown that neurological disorders are most often associated with abnormalities in cerebral connectivity that result in alterations in wide-scale brain networks involving remote regions (Fornito and Bullmore, 2014). This is particularly the case for epilepsy and neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's) which constitute, according to WHO, a major issue of public health.In this context, the need is high for new methods capable of identifying Pathological networks, from easy to use and non-invasive techniques. This is the second objective of this thesis.

Introduction : L’inflammation intestinale observée dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) est essentiellement située au niveau du côlon et peut sur le long terme provoquer l’apparition du cancer colorectal (CCR). Cette inflammation est étroitement régulée par les cellules immunitaires de la muqueuse intestinale qui sont majoritairement représentées par les macrophages. Ces derniers jouent un rôle clé dans la pathogenèse des MICI et contribuent au maintien de l’inflammation intestinale. A l’heure actuelle, les traitements disponibles proposés pour traiter ces pathologies visent surtout à diminuer l’inflammation. Les travaux menés au cours de cette thèse, s’inscrivent dans ce contexte. En effet, des expériences précédentes réalisées par notre laboratoire avaient montré que des surnageants de biofilms du probiotique Lactobacillus induisaient une réponse anti-inflammatoire chez les macrophages humains. Il avait également été remarqué que l’immunodéplétion de GroEL (une protéine de choc thermique) du surnageant bactérien abrogeait de manière dose-dépendante ces propriétés anti-inflammatoires. Méthodes : Par conséquent, au cours de ce travail de thèse nous nous sommes intéressés aux effets bénéfiques que pourrait exercer GroEL sur l’inflammation intestinale via son action au niveau des macrophages. Pour ce faire, nous avons étudié les effets de GroEL provenant de la souche Lactobacillus reuteri sur des modèles in vitro (macrophages humains), ex vivo (explants tissulaires de côlon) et in vivo (modèles murins d’inflammation intestinale et de polypose). Résultats : Nous avons démontré que la protéine GroEL provenant de la souche L. reuteri prévient la polarisation des macrophages vers un phénotype M1 (pro-inflammatoire) tout en favorisant la polarisation des macrophages vers un phénotype M2 (anti-inflammatoire). De façon similaire, le traitement des macrophages par cette protéine a permis de diminuer l’inflammation et le stress oxydant induits par le LPS. Ces expériences ont été confirmées sur des explants tissulaires de côlon, où le traitement par GroEL a permis de réduire l’inflammation, l’apoptose et le stress oxydant provoqués par le LPS. Par ailleurs, l’effet anti-inflammatoire de GroEL de L. reuteri a pu être démontré sur un modèle murin d’inflammation intestinale induite par le DSS. Dans ce modèle, l’administration intra-rectale de GroEL de L. reuteri a permis de prévenir le raccourcissement du côlon, la dégradation de la muqueuse intestinale et la perte de poids provoqués par le DSS. Enfin, nous avons également remarqué que GroEL de L. reuteri pouvait agir comme un agent prophylactique étant donné que les souris APCMin/+ traitées avec cette protéine présentaient une diminution significative du nombre de polypes sporadiques situés au niveau du côlon. Conclusion : La protéine GroEL de L. reuteri, par ses propriétés anti-inflammatoires, pourrait être un complément thérapeutique intéressant aux traitements disponibles dans la prise en charge des MICI et la prévention du CCR.Mots clés : GroEL, inflammation du côlon, probiotiques, MICI et CCR. / Introduction : Intestinal inflammation observed in inflammatory bowel disease (IBD) is mainly located in the colon and could lead to the onset of colorectal cancer (CRC). This inflammation is tightly regulated by the immune cells of the intestinal mucosa which are predominantly represented by macrophages. These cells play a key role in the pathogenesis of IBD and contribute to the maintenance of intestinal inflammation. Currently, available treatments proposed to treat these pathologies are aimed primarily at reducing inflammation. The work carried out during this thesis is part of this context. Indeed, previous experiments performed by our laboratory showed that supernatants of probiotic Lactobacillus biofilms induced an anti-inflammatory response in human macrophages. It was also noted that this effect was abrogated upon immunodepletion of the stress protein GroEL (a heat shock protein). Methods : Therefore, during this thesis work we have been interested in the beneficial effects that GroEL could exert on intestinal inflammation via its action on human macrophages. In order to do this, we used GroEL from the Lactobacillus reuteri strain and its effect in vitro (in human macrophages isolated from buffy coats), ex vivo in colon human explants and in vivo in two different models was analyzed (murine models of intestinal inflammation and polyposis). Results : We found that Lactobacillus reuteri GroEL inhibited the polarization of macrophages towards a M1-like phenotype (pro-inflammatory) while facilitating the polarization of macrophages towards an M2-like phenotype (anti-inflammatory). As a consequence, macrophages treated with L. reuteri GroEL presented a decrease in inflammation and oxidative stress induced by LPS. This was confirmed in colon tissues from biopsies, where L. reuteri GroEL was able to decrease inflammation, apoptosis and oxidative stress induced by LPS. Besides, the beneficial anti-inflammatory effect of Lactobacillus GroEL was demonstrated in a mice model of DSS-induced intestinal inflammation. Rectal administration of L. reuteri GroEL prevented colon shortening and degradation of intestinal mucosa. Further, it abrogated the drastic weight loss induced by DSS. We also showed the potential role of GroEL as a prophylactic agent since APCMin/+ mice treated with L. reuteri GroEL exhibited a significant decrease in the number of sporadic colonic polyps. Conclusion : L. reuteri GroEL protein, by its anti-inflammatory properties, could be an interesting adjunct therapy to the available treatments in the care of IBD and the prevention of CRC.Keywords : GroEL, colonic inflammation, probiotics, IBD and CRC.

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde, en lien notamment avec la présence et la rupture de plaques d’athérome. Afin d’éviter la survenue d’évènements aigus, un traitement par statines peut être proposé. Cependant, leur utilisation engendre un risque d’effets délétères. Afin de réduire ce risque, une réduction des doses utilisées pourrait être envisagée. Ce travail de thèse étudie les effets potentiels d’un traitement à très faible dose d’atorvastatine et à long terme sur un modèle animal : le lapin Watanabe. Des mesures ont été menées sur des individus contrôles et traités de 3 à 12 mois. Le suivi de la lipidémie et des principaux facteurs biochimiques, de l’adhésion et de l’inflammation a été fait au niveau sanguin. Le développement de l’athérosclérose a été évalué en tomographie par cohérence optique (OCT). Des mesures en histologie ont permis de valider un classement proposé avec l’OCT et de quantifier les macrophages intra plaques. L’élasticité artérielle a été testée in vivo par la mesure de la vitesse de l’onde de pouls et in vitro par un test de traction statique. La fonction vasculaire a été appréhendée en vasoréactivité sur différents territoires (aorte, carotide, mésentérique). Le contenu en élastine et collagène de la paroi des vaisseaux a été effectué en microscopie à deux photons et génération de seconde harmonique. Enfin la respiration mitochondriale du myocarde et sa susceptibilité aux ROS a été évaluée sur fibres cardiaques perméabilisées, l’activité de systèmes antioxydants enzymatiques mesuré, ainsi que la peroxydation lipidique. Les résultats montrent des effets bénéfiques de ce traitement à très faible dose d’atorvastatine sur la fonction cardiovasculaire indépendamment d’un effet hypolipidémiant. / Cardiovascular diseases are the first worldwide causes of death, associated to the presence and rupture of atherosclerotic plaques. To limit acute events, statins may be prescribed. However, its use leads to deleterious effects risk. To reduce this risk, a dose reduction could be considered. The work of this thesis is to study potential effects of a very low dose of atorvastatin, taken in the long term, in an animal model: the Watanabe rabbit. Measurements are made on control and treated animals from the age of 3 to 12 months. Circulating lipids, biochemical parameters and parameters of adhesion and inflammation were studied. Atherosclerosis evolution was evaluated by optical coherence tomography (OCT). Histological measurements allowed to validate a ranking proposed with OCT observations and to quantify intra-plaque macrophage content. Arterial stiffness was tested in vivo with pulse wave velocity and in vitro with a static tensile test. Vascular function was approached with vasoreactivity in different territories (aorta, carotid, mesenteric). Elastin and collagen contents of the artery wall were determined with two-photon and second harmonic generation microscopy. Finally, mitochondrial respiration and its susceptibility to ROS were evaluated in permeabilized cardiac fibers, any enzymatic antioxidant systems and lipid peroxidation were measured. Results show beneficial effects of this very low dose atorvastatin treatment in cardiovascular function, independently of a lipid-lowering effect.Keywords: atherosclerosis,

Les cellules dendritiques (DC), principales cellules présentatrices d’antigène, jouent un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire. Leur état d’activation et de maturation conditionne notamment la réponse immunitaire anti-tumorale. Ainsi à un stade immature, les DC sont incapables d’activer la réponse immunitaire. Notre équipe a montré qu’en plus d’être inefficaces, les DC intra-tumorales acquièrent des propriétés immunosuppressives et inhibent l’activation lymphocytaire. A l’inverse, activées et matures, les DC peuvent être utilisées en immunothérapie des cancers. Notre équipe a montré que les DC peuvent dans certaines conditions devenir tumoricides et que ces DC tumoricides combinent une activité cytotoxique contre les cellules tumorales et la capacité d’activation des lymphocytes T spécifiques de la tumeur. Avant d’utiliser ces DC tumoricides en phase clinique, nous avons voulu étudier les interactions de ces cellules avec des cellules immunosuppressives générées par les tumeurs, les lymphocytes T régulateurs (Treg). Notre étude montre que les DC cytotoxiques (KDC), générées à partir du sang de patients atteints de tumeurs, sont capables d’inhiber la génération des lymphocytes T régulateurs, impliqués dans l’immunosuppression induite par les tumeurs. Elles sont également à l’origine de la polarisation des lymphocytes T naïfs en des lymphocytes T helper 1, principaux acteurs de la réponse immunitaire anti-tumorale. Sans parvenir à identifier les molécules impliquées, nous avons établi que l’inhibition de la génération des Treg par les KDC n’implique ni l’IL-6, ni le NO, mais est partiellement dépendante d’un contact cellulaire. La rate joue un rôle central dans les mécanismes de tolérance immunitaire, lors des cancers, mais également lors des maladies auto-immunes (MAI). Une meilleure compréhension de la réponse immunitaire au cours de ces 2 types de pathologies au niveau d’un organe lymphoïde majeur tel que la rate est indispensable pour adapter au mieux les thérapeutiques. Cependant, il n’existe que très peu d’études portant sur les DC spléniques humaines. Nos travaux sur les DC au sein de rates provenant de patients atteints de divers cancers et MAI mettent en évidence une répartition des sous populations de DC qui diffère selon les pathologies. Bien que limité par le nombre d’échantillons humains, nous avons également déterminé le profil d’activation de ces sous populations de DC après stimulation par différents TLR. Etant donné le rôle clé des DC dans l’initiation de la réponse immunitaire spécifique, ces nouvelles connaissances pourraient permettre de cibler certains sous-types de DC afin de les activer ou de les inhiber lors de ces différentes pathologies. Ces observations offrent d’importantes perspectives pour la future utilisation des DC dans les stratégies d'immunothérapie. / Known for years as professional antigen presenting cells (APC), dendritic cells (DC) play a crucial role in immune response regulation. Their state of activation and maturation conditions the antitumor immune response. Thus, at an immature stage, the DC are unable to activate the immune response. Our team demonstrated that besides being ineffective, intra-tumoral DC acquire immunosuppressive properties and inhibit T cell activation. Conversely, activated and mature DC can be used in cancer immunotherapy. Previous reports from our research team deciphered that under certain conditions DC can become tumoricidal. These DC combine a cytotoxic activity against tumor cells and the capacity to activate tumor specific T cells. Prior launching the possibility of the application of such cytotoxic DC (referred as KDC for Killer DC) in clinic, we explored the interactions of these cells with regulatory T cells (Treg), -major immunosuppressive cells promoted by tumor microenvironment. Our study revealed that KDC, generated from the blood of cancer patients, can inhibit Treg generation and deviate naive T cell polarization into T helper 1 cells, key players in the anti-tumor immune response. We have further established that the inhibition of Treg generation by the KDC requires cell to cell contact, though implies neither IL-6 nor NO, but the mechanism still to be deciphered. Spleen, a major lymphoid organ, drives foremost mechanisms in immune tolerance during cancer and autoimmune diseases (AID). A better understanding of the immune response specifications during these 2 types of diseases in the spleen is therefore essential goal for therapeutic developments. Nevertheless, there is negligible volume of studies on human splenic immune cells, in particular DC. Our research on splenic DC, derived from patients with various cancers and AID, display distinct DC subset distribution respective to the disease. Although limited by the availability of human splenic samples, we also determined the activation profile of DC subsets after stimulation by different TLR ligands. Given the key role of DC in initiating specific immune response, this novel findings could be implemented to target certain DC subset activation or inhibition in these pathologies. These investigations provide important knowledge for more refine exploitation of DC in immunotherapeutic strategies as treatment tools or as targets.

Les bactéries appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) peuvent causer des infections pulmonaires dévastatrices chez les patients atteints de mucoviscidose. Les bactéries Bcc sont capables de survivre et se multiplier dans les macrophages in vitro. Des études cliniques ont confirmé que ces bactéries opportunistes se localisent au niveau des cellules phagocytaires et ne forment pas des biofilms dans les poumons des patients infectés comme on le croyait généralement. En utilisant le modèle d'infection zebrafish, nous avons établi précédemment que les macrophages constituent un site clé pour la réplication bactérienne et le développement de l'infection aiguë mortelle. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle des stades intracellulaires de B. cenocepacia en développant des nouvelles lignées transgéniques reportrices pour les études d’imagerie en temps réel, nous avons étudié le rôle de l'autophagie in vivo et analysé le profil « transcriptomique » des macrophages lors de l'infection par B. cenocepacia chez le poisson zèbre.En accord avec les études in vitro, nous avons constaté que la protéine « Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 » (Lc3), protéine clé dans l’autophagie, a été recrutée au niveau des vacuoles contenant B.cenocepacia K56-2. Nous avons observé en temps réel que les bactéries étaient capables de se répliquer dans ces organelles. Cependant la modulation de l'autophagie par voie génétique et pharmacologique n'a pas changé de manière significative le profil de réplication de B.cenocepacia K56-2 lors de l'infection. En dépit de la charge bactérienne inchangée, une baisse de l’autophagie était reliée avec une augmentation de la mortalité par rapport aux embryons de type sauvage. Ceci suggère une corrélation entre l'autophagie et l'inflammation, et nous proposons que la capacité de B. cenocepacia à arrêter la maturation des (auto) phagosomes et la présence de « cross-talk » entre l’autophagie d’une part et l’inflammasome de l’autre jouent un rôle important dans les réactions inflammatoires observées. Pour approfondir les connaissances sur le rôle des macrophages lors de l'infection aiguë, nous avons déterminé le profil transcriptomique des macrophages isolés à partir d'embryons de poisson zèbre infectés par B. cenocepacia après l'infection. Notre analyse bio-informatique a montré que la plupart des gènes surexprimés sont impliqués dans la signalisation de la réponse immunitaire, tandis que la plupart des gènes sous exprimés sont associés à la transcription et à la traduction. Nous avons confirmé l’activation de l’expression de tnfa dans les macrophages, et nous avons constaté que l'expression des cytokines cxcl8 et Il1b, induite par l'infection, ne dépendait pas de la signalisation par le récepteur TNFa, TNFRSF1A.Nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de l'interaction entre B. cenocepacia et les macrophages in vivo, et peuvent contribuer à l’identification de nouvelles cibles pour le développement de thérapies anti-infectieuses pour lutter contre ces bactéries intracellulaires. / Opportunistic bacteria belonging to Burkholderia cepacia complex (Bcc) can cause devastating pulmonary infections in cystic fibrosis patients. These bacteria can survive and replicate in macrophages in vitro. Clinical evidence confirmed that the bacteria localize in phagocytic cells, and do not form biofilms in the lungs of infected patients as generally believed. Using a zebrafish infection model we established previously that macrophages are a critical site for bacterial replication and development of acute fatal infection. In the present study, we further explored the role of the intracellular stages of B. cenocepacia by developing new transgenic reporter lines for real time imaging of subcellular trafficking, studying in detail the role of autophagy in vivo, and performing host transcriptome analysis of FACS-sorted macrophages from zebrafish larvae infected with B. cenocepacia.In agreement with in vitro studies, we found that the autophagy related protein Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (Lc3) was recruited to B. cenocepacia K56-2-containing vacuoles. Although not critical, using real time confocal microscopy, we observed that the bacteria were able to replicate in such organelles. Both genetic and pharmacological modulation of autophagy did not significantly change the replication profile of B. cenocepacia K56-2 during infection. However, reduction in autophagy resulted in more rapid embryo death compared to wild type embryos. This suggests an inverse correlation between autophagy and fatal inflammation, and we hypothesize that the ability of B. cenocepacia to arrest maturation of (auto)phagosomes, and cross talk between autophagy and inflammasome signaling pathways during B. cenocepacia infection play an important role in the observed inflammatory responses. This study further describes the host transcriptome profile of macrophages isolated from infected zebrafish embryos. Our bio-informatics analysis showed that most of the genes up-regulated during infection were involved in immune response signaling, while the major group of down-regulated genes was associated with transcription and translation. We experimentally confirmed rapidly increased expression of tnfa in macrophages, and found that infection-induced expression of the cytokines cxcl8 and il1b did not depend on signalling through the Tnfa receptor, Tnfrsf1a.Our results contribute to a better understanding of the interaction between B. cenocepacia and macrophages in vivo, and the zebrafish may help finding new targets for development of anti-infectious therapies to combat these intracellular bacteria.

Sous le terme de maladies mitochondriales, on désigne des maladies multi-systémiques ou à expression tissu-spécifique dues à un déficit de la phosphorylation oxydative qui est assurée par le fonctionnement de 5 complexes protéiques enzymatiques (chaîne respiratoire) parmi lesquelles 13 sous-unités sont codées par le génome mitochondrial, les autres par le génome nucléaire. Ces pathologies recouvrent donc en pratique des maladies génétiques par mutation de l’ADN mitochondrial (ADNmt) mais aussi des maladies génétiques à hérédité mendélienne classique. Dans les cytopathies mitochondriales liées à des mutations de gènes nucléaires, il existe deux sortes de gènes (i) à effet direct correspondant à des gènes codant pour les sous-unités protéiques de la chaîne respiratoire ou leur assemblage, et (ii) à effet indirect correspondant à des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien et la réplication de l'ADN mitochondrial. Des mutations dans cette dernière classe de gènes peuvent s'accompagner d'anomalies quantitatives ou qualitatives de l'ADNmt : déplétion de l'ADNmt (réduction majeure du nombre de molécules d'ADNmt) et délétions multiples.Après des dosages enzymatiques de l’activité des complexes respiratoires mitochondriaux chez les patients, le ou les types de complexes altérés sont connus. Un grand nombre de gènes mutés responsables de pathologies mitochondriales ont été identifiés, tous codant des constituants des différents complexes de la chaîne respiratoire. Ces dernières années, le groupe d’Agnès Rötig (Hôpital Necker, Paris) a identifié de nouveaux gènes grâce à une approche gènes candidats ou grâce à des tours de génome de familles consanguines de patients qui permettent de délimiter une région chromosomique portant la mutation à l’état homozygote. La validation de l’effet délétère de la mutation identifiée se fait en général en utilisant des organismes modèles d’étude comme les cellules humaines en culture ou bien la levure. Cependant, il reste un grand nombre de cas où la mutation n’a pas pu être identifiée, soit parce que le déficit de tel ou tel complexe ne met pas en jeu un des composants connus de ce complexe ou bien plusieurs complexes de la chaîne respiratoire sont déficitaires mettant en jeu, dans un grand nombre de cas, le maintien de l’ADN mitochondrial pour lequel peu de gènes sont connus.Au laboratoire d’Orsay, nous disposons de deux organismes modèles d’étude, la levure S. cerevisiae et le nématode C. elegans. La levure S. cerevisiae est l’organisme modèle de choix pour étudier les fonctions mitochondriales grâce à ses caractéristiques comme la respiration facultative, mais aussi et surtout par la puissance de sa génétique et le fait que les mitochondries peuvent être transformées. Cependant de par sa respiration facultative et sa division clonale, elle ne se prête pas facilement à des études sur la stabilité de l’ADNmt. En effet, S. cerevisiae perd très facilement son ADNmt après inactivation d’un grand nombre de gènes impliqués dans pratiquement toutes les voies de la biogenèse mitochondriale. Cette levure ne peut donc pas être utilisée de façon simple pour l’étude de la transmission de l’ADN mitochondrial. C’est pourquoi nous nous sommes alors intéressés à l’autre organisme modèle développé au laboratoire, le nématode C. elegans dont ses caractéristiques en font un excellent modèle complémentaire à la levure. / Mitochondrial respiratory chain diseases of nuclear origin represent one of the major causes of metabolic disorders. These diseases are characterized by a huge clinical and genetic heterogeneity which is a major problem in identifying the disease causing gene. Although several gene mutations have already been found in some patients or families, the disease causing gene of the majority is yet to be determined. The overall structure and gene content of the mitochondrial genome and the proteins required for mtDNA transactions are largely conserved from yeast to human offering the opportunity to use animal models to understand the molecular basis of mitochondrial dysfunctions. To expand the number of human candidate genes of mitochondrial diseases involved in mtDNA maintenance, we have developed in this study, the nematode Caenorhabditis elegans as a model organism to identify new proteins involved in mtDNA maintenance by combining RNAi and ethidium bromide exposure. We have developed a large-scale screening method of genes required for mtDNA maintenance in the worm and initially indentified four new C. elegans genes (atad-3, dnj-10, polrmt, phi-37 and immt-1) involved in mtDNA stability. The human homologs of these genes (ATAD3, DNAJA3, POLRMT and ATP5A1) can be now considered as candidate genes for patients with quantitative mtDNA deficiencies. Using our screening design we have begun to screen all the C. elegans genes encoding mitochondrial proteins. Of the 721 estimated C. elegans mitochondrial genes homologous to human genes, we have tested 185 genes and found that 41 genes are required for the maintenance of the mitochondrial genome in post mitotic cells. These genes fall into three main functional categories of metabolism, protein synthesis and oxidative phosphorylation. Finally, in this study, we investigated the reversibility of mtDNA depletion with drugs to counteract POLG dificiency. Three molecules, Chlorhexidine, Resveratrol and Bezafibrate, have been tested to restore normal mtDNA content and worm life cycle. These experiments hold promise for future work using C. elegans as a pharmacological model for mitochondrial diseases.Altogether, the data generated in this work is a starting point for promising advances in the mitochondrial field, showing the relevance of the nematode as a model organism to study fundamental processes as well as human health research.

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation sévère de l'intestin grêle et du côlon et comprennent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Les MICI sont des maladies complexes faisant intervenir des facteurs génétiques : certains senseurs bactériens, l'autophagie et le stress du réticulum endoplasmique. Un défaut de barrière de l'épithélium digestif est également fortement impliqué dans la physiopathologie du processus inflammatoire. La fonction barrière de l'épithélium digestif est assurée par plusieurs types cellulaires, synthétisant entre autres, des peptides antimicrobiens (PAM) et des mucines. Dans les MICI, une augmentation de la perméabilité intestinale et une perte de muco-sécrétion ont été décrites. Les protéases jouent un rôle fondamental dans la digestion du bol alimentaire mais également dans le maintien de l'homéostasie intestinale en activant ou dégradant divers motifs moléculaires, ou in induisant des signaux spécifiques aux cellules par l'activation de quatre récepteurs : les PARs (Protease-Activated Receptor). Dans les MICI, un excès d'activité protéolytique de type trypsine est observé. L'origine de cette activité est théoriquement attribuée aux cellules immunitaires, à une surproduction pancréatique ou au microbiote, mais les cellules épithéliales intestinales semblent également être une source majeure de protéases. L'objectif de mon projet de thèse visait à étudier l'impact des principales voies impliquées dans les MICI sur l'homéostasie des protéases épithéliales et le rôle de celles-ci dans la déstabilisation de la fonction de barrière. Nos résultats ont confirmé un excès de protéases à sérine dans les cellules épithéliales de patients atteint de MC ou de RCH. In vitro, sur des monocouches de cellules Caco-2, l'induction de l'autophagie diminuait la libération apicale de protéase de type trypsine, alors que le senseur bactériens NOD2 n'avait aucun effet. A l'inverse, une stimulation du Stress du réticulum endoplasmique (SRE) par la Thapsigargin, induisait une libération accrue de protéases actives de type trypsine au pôle apical des cellules. [...] / Crohn's disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are two forms of Inflammatory Bowel Disease (IBD), a chronic inflammatory pathology affecting the digestive tract. Patients suffer from relapsing flares, diarrhea, abdominal pain and bleeding. Although the molecular mechanisms of IBD are poorly understood, recent data suggest that IBD occurs in genetically predisposed individuals developing an abnormal immune response to intestinal microbes after, being exposed to specific environmental triggers. Genetic studies have reported more than 170 polymorphisms susceptible to be involved in IBD pathogenesis. The strongest associations have highlighted three main pathways altered in IBD including bacterial sensing (NOD2, CD), autophagy (ATG16L1 and IRGM, CD) and endoplasmic reticulum stress (ER-Stress) (XBP1, UC). The role of intestinal barrier function is also strongly implicated in IBD pathogenesis, and is modulated by factors present in the lumen derived from microbiota, food or at a molecular level, by factors such as proteases. In IBD pathophysiology, the inflammatory process is characterized by impaired intestinal biology including disruption of tight junctions and leaky gut, decreased amount of Paneth and Goblet cells, and translocation of luminal antigens triggering inflammation. Previous studies have demonstrated an increased level of active serine proteases in the stools and tissues of IBD patients, supposing that proteases originate from infiltrated immune cells, pancreatic secretion or microbiota. However, our team has reported that intestinal epithelial cells are a major source of serine proteases, in particular trypsin-like enzymes, are released by a stressed epithelium in pathogenic context such as irritable bowel syndrome. In this project, we aimed at better understanding whether the three main pathways involved in IBD (Nod2, autophagy, ER-stress) could be linked to an epithelial release of trypsin and reciprocally, if epithelial trypsin is able to induce or modulate these three IBD pathways. We confirmed that trypsin-like activity was significantly higher in biopsies from UC and CD patients compared to healthy controls. In Caco-2 monolayers cultured in transwells, secreted trypsin-like proteolytic activity remained stable upon NOD2 stimulation but decreased under autophagy induction. Thapsigargin (Tg) stimulation a well-known ER-stress inducer, enhanced the apical release of trypsin-like activity in Caco2 cells. [...]