Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde, en lien notamment avec la présence et la rupture de plaques d’athérome. Afin d’éviter la survenue d’évènements aigus, un traitement par statines peut être proposé. Cependant, leur utilisation engendre un risque d’effets délétères. Afin de réduire ce risque, une réduction des doses utilisées pourrait être envisagée. Ce travail de thèse étudie les effets potentiels d’un traitement à très faible dose d’atorvastatine et à long terme sur un modèle animal : le lapin Watanabe. Des mesures ont été menées sur des individus contrôles et traités de 3 à 12 mois. Le suivi de la lipidémie et des principaux facteurs biochimiques, de l’adhésion et de l’inflammation a été fait au niveau sanguin. Le développement de l’athérosclérose a été évalué en tomographie par cohérence optique (OCT). Des mesures en histologie ont permis de valider un classement proposé avec l’OCT et de quantifier les macrophages intra plaques. L’élasticité artérielle a été testée in vivo par la mesure de la vitesse de l’onde de pouls et in vitro par un test de traction statique. La fonction vasculaire a été appréhendée en vasoréactivité sur différents territoires (aorte, carotide, mésentérique). Le contenu en élastine et collagène de la paroi des vaisseaux a été effectué en microscopie à deux photons et génération de seconde harmonique. Enfin la respiration mitochondriale du myocarde et sa susceptibilité aux ROS a été évaluée sur fibres cardiaques perméabilisées, l’activité de systèmes antioxydants enzymatiques mesuré, ainsi que la peroxydation lipidique. Les résultats montrent des effets bénéfiques de ce traitement à très faible dose d’atorvastatine sur la fonction cardiovasculaire indépendamment d’un effet hypolipidémiant. / Cardiovascular diseases are the first worldwide causes of death, associated to the presence and rupture of atherosclerotic plaques. To limit acute events, statins may be prescribed. However, its use leads to deleterious effects risk. To reduce this risk, a dose reduction could be considered. The work of this thesis is to study potential effects of a very low dose of atorvastatin, taken in the long term, in an animal model: the Watanabe rabbit. Measurements are made on control and treated animals from the age of 3 to 12 months. Circulating lipids, biochemical parameters and parameters of adhesion and inflammation were studied. Atherosclerosis evolution was evaluated by optical coherence tomography (OCT). Histological measurements allowed to validate a ranking proposed with OCT observations and to quantify intra-plaque macrophage content. Arterial stiffness was tested in vivo with pulse wave velocity and in vitro with a static tensile test. Vascular function was approached with vasoreactivity in different territories (aorta, carotid, mesenteric). Elastin and collagen contents of the artery wall were determined with two-photon and second harmonic generation microscopy. Finally, mitochondrial respiration and its susceptibility to ROS were evaluated in permeabilized cardiac fibers, any enzymatic antioxidant systems and lipid peroxidation were measured. Results show beneficial effects of this very low dose atorvastatin treatment in cardiovascular function, independently of a lipid-lowering effect.Keywords: atherosclerosis,

Les cellules dendritiques (DC), principales cellules présentatrices d’antigène, jouent un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire. Leur état d’activation et de maturation conditionne notamment la réponse immunitaire anti-tumorale. Ainsi à un stade immature, les DC sont incapables d’activer la réponse immunitaire. Notre équipe a montré qu’en plus d’être inefficaces, les DC intra-tumorales acquièrent des propriétés immunosuppressives et inhibent l’activation lymphocytaire. A l’inverse, activées et matures, les DC peuvent être utilisées en immunothérapie des cancers. Notre équipe a montré que les DC peuvent dans certaines conditions devenir tumoricides et que ces DC tumoricides combinent une activité cytotoxique contre les cellules tumorales et la capacité d’activation des lymphocytes T spécifiques de la tumeur. Avant d’utiliser ces DC tumoricides en phase clinique, nous avons voulu étudier les interactions de ces cellules avec des cellules immunosuppressives générées par les tumeurs, les lymphocytes T régulateurs (Treg). Notre étude montre que les DC cytotoxiques (KDC), générées à partir du sang de patients atteints de tumeurs, sont capables d’inhiber la génération des lymphocytes T régulateurs, impliqués dans l’immunosuppression induite par les tumeurs. Elles sont également à l’origine de la polarisation des lymphocytes T naïfs en des lymphocytes T helper 1, principaux acteurs de la réponse immunitaire anti-tumorale. Sans parvenir à identifier les molécules impliquées, nous avons établi que l’inhibition de la génération des Treg par les KDC n’implique ni l’IL-6, ni le NO, mais est partiellement dépendante d’un contact cellulaire. La rate joue un rôle central dans les mécanismes de tolérance immunitaire, lors des cancers, mais également lors des maladies auto-immunes (MAI). Une meilleure compréhension de la réponse immunitaire au cours de ces 2 types de pathologies au niveau d’un organe lymphoïde majeur tel que la rate est indispensable pour adapter au mieux les thérapeutiques. Cependant, il n’existe que très peu d’études portant sur les DC spléniques humaines. Nos travaux sur les DC au sein de rates provenant de patients atteints de divers cancers et MAI mettent en évidence une répartition des sous populations de DC qui diffère selon les pathologies. Bien que limité par le nombre d’échantillons humains, nous avons également déterminé le profil d’activation de ces sous populations de DC après stimulation par différents TLR. Etant donné le rôle clé des DC dans l’initiation de la réponse immunitaire spécifique, ces nouvelles connaissances pourraient permettre de cibler certains sous-types de DC afin de les activer ou de les inhiber lors de ces différentes pathologies. Ces observations offrent d’importantes perspectives pour la future utilisation des DC dans les stratégies d'immunothérapie. / Known for years as professional antigen presenting cells (APC), dendritic cells (DC) play a crucial role in immune response regulation. Their state of activation and maturation conditions the antitumor immune response. Thus, at an immature stage, the DC are unable to activate the immune response. Our team demonstrated that besides being ineffective, intra-tumoral DC acquire immunosuppressive properties and inhibit T cell activation. Conversely, activated and mature DC can be used in cancer immunotherapy. Previous reports from our research team deciphered that under certain conditions DC can become tumoricidal. These DC combine a cytotoxic activity against tumor cells and the capacity to activate tumor specific T cells. Prior launching the possibility of the application of such cytotoxic DC (referred as KDC for Killer DC) in clinic, we explored the interactions of these cells with regulatory T cells (Treg), -major immunosuppressive cells promoted by tumor microenvironment. Our study revealed that KDC, generated from the blood of cancer patients, can inhibit Treg generation and deviate naive T cell polarization into T helper 1 cells, key players in the anti-tumor immune response. We have further established that the inhibition of Treg generation by the KDC requires cell to cell contact, though implies neither IL-6 nor NO, but the mechanism still to be deciphered. Spleen, a major lymphoid organ, drives foremost mechanisms in immune tolerance during cancer and autoimmune diseases (AID). A better understanding of the immune response specifications during these 2 types of diseases in the spleen is therefore essential goal for therapeutic developments. Nevertheless, there is negligible volume of studies on human splenic immune cells, in particular DC. Our research on splenic DC, derived from patients with various cancers and AID, display distinct DC subset distribution respective to the disease. Although limited by the availability of human splenic samples, we also determined the activation profile of DC subsets after stimulation by different TLR ligands. Given the key role of DC in initiating specific immune response, this novel findings could be implemented to target certain DC subset activation or inhibition in these pathologies. These investigations provide important knowledge for more refine exploitation of DC in immunotherapeutic strategies as treatment tools or as targets.

Les bactéries appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) peuvent causer des infections pulmonaires dévastatrices chez les patients atteints de mucoviscidose. Les bactéries Bcc sont capables de survivre et se multiplier dans les macrophages in vitro. Des études cliniques ont confirmé que ces bactéries opportunistes se localisent au niveau des cellules phagocytaires et ne forment pas des biofilms dans les poumons des patients infectés comme on le croyait généralement. En utilisant le modèle d'infection zebrafish, nous avons établi précédemment que les macrophages constituent un site clé pour la réplication bactérienne et le développement de l'infection aiguë mortelle. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle des stades intracellulaires de B. cenocepacia en développant des nouvelles lignées transgéniques reportrices pour les études d’imagerie en temps réel, nous avons étudié le rôle de l'autophagie in vivo et analysé le profil « transcriptomique » des macrophages lors de l'infection par B. cenocepacia chez le poisson zèbre.En accord avec les études in vitro, nous avons constaté que la protéine « Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 » (Lc3), protéine clé dans l’autophagie, a été recrutée au niveau des vacuoles contenant B.cenocepacia K56-2. Nous avons observé en temps réel que les bactéries étaient capables de se répliquer dans ces organelles. Cependant la modulation de l'autophagie par voie génétique et pharmacologique n'a pas changé de manière significative le profil de réplication de B.cenocepacia K56-2 lors de l'infection. En dépit de la charge bactérienne inchangée, une baisse de l’autophagie était reliée avec une augmentation de la mortalité par rapport aux embryons de type sauvage. Ceci suggère une corrélation entre l'autophagie et l'inflammation, et nous proposons que la capacité de B. cenocepacia à arrêter la maturation des (auto) phagosomes et la présence de « cross-talk » entre l’autophagie d’une part et l’inflammasome de l’autre jouent un rôle important dans les réactions inflammatoires observées. Pour approfondir les connaissances sur le rôle des macrophages lors de l'infection aiguë, nous avons déterminé le profil transcriptomique des macrophages isolés à partir d'embryons de poisson zèbre infectés par B. cenocepacia après l'infection. Notre analyse bio-informatique a montré que la plupart des gènes surexprimés sont impliqués dans la signalisation de la réponse immunitaire, tandis que la plupart des gènes sous exprimés sont associés à la transcription et à la traduction. Nous avons confirmé l’activation de l’expression de tnfa dans les macrophages, et nous avons constaté que l'expression des cytokines cxcl8 et Il1b, induite par l'infection, ne dépendait pas de la signalisation par le récepteur TNFa, TNFRSF1A.Nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de l'interaction entre B. cenocepacia et les macrophages in vivo, et peuvent contribuer à l’identification de nouvelles cibles pour le développement de thérapies anti-infectieuses pour lutter contre ces bactéries intracellulaires. / Opportunistic bacteria belonging to Burkholderia cepacia complex (Bcc) can cause devastating pulmonary infections in cystic fibrosis patients. These bacteria can survive and replicate in macrophages in vitro. Clinical evidence confirmed that the bacteria localize in phagocytic cells, and do not form biofilms in the lungs of infected patients as generally believed. Using a zebrafish infection model we established previously that macrophages are a critical site for bacterial replication and development of acute fatal infection. In the present study, we further explored the role of the intracellular stages of B. cenocepacia by developing new transgenic reporter lines for real time imaging of subcellular trafficking, studying in detail the role of autophagy in vivo, and performing host transcriptome analysis of FACS-sorted macrophages from zebrafish larvae infected with B. cenocepacia.In agreement with in vitro studies, we found that the autophagy related protein Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (Lc3) was recruited to B. cenocepacia K56-2-containing vacuoles. Although not critical, using real time confocal microscopy, we observed that the bacteria were able to replicate in such organelles. Both genetic and pharmacological modulation of autophagy did not significantly change the replication profile of B. cenocepacia K56-2 during infection. However, reduction in autophagy resulted in more rapid embryo death compared to wild type embryos. This suggests an inverse correlation between autophagy and fatal inflammation, and we hypothesize that the ability of B. cenocepacia to arrest maturation of (auto)phagosomes, and cross talk between autophagy and inflammasome signaling pathways during B. cenocepacia infection play an important role in the observed inflammatory responses. This study further describes the host transcriptome profile of macrophages isolated from infected zebrafish embryos. Our bio-informatics analysis showed that most of the genes up-regulated during infection were involved in immune response signaling, while the major group of down-regulated genes was associated with transcription and translation. We experimentally confirmed rapidly increased expression of tnfa in macrophages, and found that infection-induced expression of the cytokines cxcl8 and il1b did not depend on signalling through the Tnfa receptor, Tnfrsf1a.Our results contribute to a better understanding of the interaction between B. cenocepacia and macrophages in vivo, and the zebrafish may help finding new targets for development of anti-infectious therapies to combat these intracellular bacteria.

Sous le terme de maladies mitochondriales, on désigne des maladies multi-systémiques ou à expression tissu-spécifique dues à un déficit de la phosphorylation oxydative qui est assurée par le fonctionnement de 5 complexes protéiques enzymatiques (chaîne respiratoire) parmi lesquelles 13 sous-unités sont codées par le génome mitochondrial, les autres par le génome nucléaire. Ces pathologies recouvrent donc en pratique des maladies génétiques par mutation de l’ADN mitochondrial (ADNmt) mais aussi des maladies génétiques à hérédité mendélienne classique. Dans les cytopathies mitochondriales liées à des mutations de gènes nucléaires, il existe deux sortes de gènes (i) à effet direct correspondant à des gènes codant pour les sous-unités protéiques de la chaîne respiratoire ou leur assemblage, et (ii) à effet indirect correspondant à des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien et la réplication de l'ADN mitochondrial. Des mutations dans cette dernière classe de gènes peuvent s'accompagner d'anomalies quantitatives ou qualitatives de l'ADNmt : déplétion de l'ADNmt (réduction majeure du nombre de molécules d'ADNmt) et délétions multiples.Après des dosages enzymatiques de l’activité des complexes respiratoires mitochondriaux chez les patients, le ou les types de complexes altérés sont connus. Un grand nombre de gènes mutés responsables de pathologies mitochondriales ont été identifiés, tous codant des constituants des différents complexes de la chaîne respiratoire. Ces dernières années, le groupe d’Agnès Rötig (Hôpital Necker, Paris) a identifié de nouveaux gènes grâce à une approche gènes candidats ou grâce à des tours de génome de familles consanguines de patients qui permettent de délimiter une région chromosomique portant la mutation à l’état homozygote. La validation de l’effet délétère de la mutation identifiée se fait en général en utilisant des organismes modèles d’étude comme les cellules humaines en culture ou bien la levure. Cependant, il reste un grand nombre de cas où la mutation n’a pas pu être identifiée, soit parce que le déficit de tel ou tel complexe ne met pas en jeu un des composants connus de ce complexe ou bien plusieurs complexes de la chaîne respiratoire sont déficitaires mettant en jeu, dans un grand nombre de cas, le maintien de l’ADN mitochondrial pour lequel peu de gènes sont connus.Au laboratoire d’Orsay, nous disposons de deux organismes modèles d’étude, la levure S. cerevisiae et le nématode C. elegans. La levure S. cerevisiae est l’organisme modèle de choix pour étudier les fonctions mitochondriales grâce à ses caractéristiques comme la respiration facultative, mais aussi et surtout par la puissance de sa génétique et le fait que les mitochondries peuvent être transformées. Cependant de par sa respiration facultative et sa division clonale, elle ne se prête pas facilement à des études sur la stabilité de l’ADNmt. En effet, S. cerevisiae perd très facilement son ADNmt après inactivation d’un grand nombre de gènes impliqués dans pratiquement toutes les voies de la biogenèse mitochondriale. Cette levure ne peut donc pas être utilisée de façon simple pour l’étude de la transmission de l’ADN mitochondrial. C’est pourquoi nous nous sommes alors intéressés à l’autre organisme modèle développé au laboratoire, le nématode C. elegans dont ses caractéristiques en font un excellent modèle complémentaire à la levure. / Mitochondrial respiratory chain diseases of nuclear origin represent one of the major causes of metabolic disorders. These diseases are characterized by a huge clinical and genetic heterogeneity which is a major problem in identifying the disease causing gene. Although several gene mutations have already been found in some patients or families, the disease causing gene of the majority is yet to be determined. The overall structure and gene content of the mitochondrial genome and the proteins required for mtDNA transactions are largely conserved from yeast to human offering the opportunity to use animal models to understand the molecular basis of mitochondrial dysfunctions. To expand the number of human candidate genes of mitochondrial diseases involved in mtDNA maintenance, we have developed in this study, the nematode Caenorhabditis elegans as a model organism to identify new proteins involved in mtDNA maintenance by combining RNAi and ethidium bromide exposure. We have developed a large-scale screening method of genes required for mtDNA maintenance in the worm and initially indentified four new C. elegans genes (atad-3, dnj-10, polrmt, phi-37 and immt-1) involved in mtDNA stability. The human homologs of these genes (ATAD3, DNAJA3, POLRMT and ATP5A1) can be now considered as candidate genes for patients with quantitative mtDNA deficiencies. Using our screening design we have begun to screen all the C. elegans genes encoding mitochondrial proteins. Of the 721 estimated C. elegans mitochondrial genes homologous to human genes, we have tested 185 genes and found that 41 genes are required for the maintenance of the mitochondrial genome in post mitotic cells. These genes fall into three main functional categories of metabolism, protein synthesis and oxidative phosphorylation. Finally, in this study, we investigated the reversibility of mtDNA depletion with drugs to counteract POLG dificiency. Three molecules, Chlorhexidine, Resveratrol and Bezafibrate, have been tested to restore normal mtDNA content and worm life cycle. These experiments hold promise for future work using C. elegans as a pharmacological model for mitochondrial diseases.Altogether, the data generated in this work is a starting point for promising advances in the mitochondrial field, showing the relevance of the nematode as a model organism to study fundamental processes as well as human health research.

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation sévère de l'intestin grêle et du côlon et comprennent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Les MICI sont des maladies complexes faisant intervenir des facteurs génétiques : certains senseurs bactériens, l'autophagie et le stress du réticulum endoplasmique. Un défaut de barrière de l'épithélium digestif est également fortement impliqué dans la physiopathologie du processus inflammatoire. La fonction barrière de l'épithélium digestif est assurée par plusieurs types cellulaires, synthétisant entre autres, des peptides antimicrobiens (PAM) et des mucines. Dans les MICI, une augmentation de la perméabilité intestinale et une perte de muco-sécrétion ont été décrites. Les protéases jouent un rôle fondamental dans la digestion du bol alimentaire mais également dans le maintien de l'homéostasie intestinale en activant ou dégradant divers motifs moléculaires, ou in induisant des signaux spécifiques aux cellules par l'activation de quatre récepteurs : les PARs (Protease-Activated Receptor). Dans les MICI, un excès d'activité protéolytique de type trypsine est observé. L'origine de cette activité est théoriquement attribuée aux cellules immunitaires, à une surproduction pancréatique ou au microbiote, mais les cellules épithéliales intestinales semblent également être une source majeure de protéases. L'objectif de mon projet de thèse visait à étudier l'impact des principales voies impliquées dans les MICI sur l'homéostasie des protéases épithéliales et le rôle de celles-ci dans la déstabilisation de la fonction de barrière. Nos résultats ont confirmé un excès de protéases à sérine dans les cellules épithéliales de patients atteint de MC ou de RCH. In vitro, sur des monocouches de cellules Caco-2, l'induction de l'autophagie diminuait la libération apicale de protéase de type trypsine, alors que le senseur bactériens NOD2 n'avait aucun effet. A l'inverse, une stimulation du Stress du réticulum endoplasmique (SRE) par la Thapsigargin, induisait une libération accrue de protéases actives de type trypsine au pôle apical des cellules. [...] / Crohn's disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are two forms of Inflammatory Bowel Disease (IBD), a chronic inflammatory pathology affecting the digestive tract. Patients suffer from relapsing flares, diarrhea, abdominal pain and bleeding. Although the molecular mechanisms of IBD are poorly understood, recent data suggest that IBD occurs in genetically predisposed individuals developing an abnormal immune response to intestinal microbes after, being exposed to specific environmental triggers. Genetic studies have reported more than 170 polymorphisms susceptible to be involved in IBD pathogenesis. The strongest associations have highlighted three main pathways altered in IBD including bacterial sensing (NOD2, CD), autophagy (ATG16L1 and IRGM, CD) and endoplasmic reticulum stress (ER-Stress) (XBP1, UC). The role of intestinal barrier function is also strongly implicated in IBD pathogenesis, and is modulated by factors present in the lumen derived from microbiota, food or at a molecular level, by factors such as proteases. In IBD pathophysiology, the inflammatory process is characterized by impaired intestinal biology including disruption of tight junctions and leaky gut, decreased amount of Paneth and Goblet cells, and translocation of luminal antigens triggering inflammation. Previous studies have demonstrated an increased level of active serine proteases in the stools and tissues of IBD patients, supposing that proteases originate from infiltrated immune cells, pancreatic secretion or microbiota. However, our team has reported that intestinal epithelial cells are a major source of serine proteases, in particular trypsin-like enzymes, are released by a stressed epithelium in pathogenic context such as irritable bowel syndrome. In this project, we aimed at better understanding whether the three main pathways involved in IBD (Nod2, autophagy, ER-stress) could be linked to an epithelial release of trypsin and reciprocally, if epithelial trypsin is able to induce or modulate these three IBD pathways. We confirmed that trypsin-like activity was significantly higher in biopsies from UC and CD patients compared to healthy controls. In Caco-2 monolayers cultured in transwells, secreted trypsin-like proteolytic activity remained stable upon NOD2 stimulation but decreased under autophagy induction. Thapsigargin (Tg) stimulation a well-known ER-stress inducer, enhanced the apical release of trypsin-like activity in Caco2 cells. [...]

Les parasites de la classe des Kinetoplastidae, comprenant notamment les trypanosomes et les leishmanies, sont responsables pour plusieurs maladies d’importance socio-économique et de santé publique. La maladie du sommeil, la maladie de Chagas et la leishmaniose, classées comme maladies tropicales négligées (NTD) par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et la Surra, reportée par l’Organisation pour l’alimentation et l’agriculture, des Nations Unies (FAO). La Trypanosomiase Animale Africain sub-saharienne entraîne la mort de 3 millions bovins par an accompagné d'une perte annuelle de l'économie de 4,5 milliards de dollars américains. La leishmaniose cutanée, une maladie zoonose, présente 1,5 millions de nouveaux cas chaque année.Trypanosoma brucei (T. brucei) est un ancien eucaryote, utilisé comme organisme modèle dans le laboratoire pour l’étude des cils et des flagelles. Le remodelage du cytosquelette des trypanosomes est essentiel pour la morphologie cellulaire, le positionnement et la division des organites. L’étude des protéines essentielles du cytosquelette permet de mieux comprendre les processus cellulaires. Ces protéines pourraient également constituer des cibles potentielles pour des traitements thérapeutiques. Les trypanosomes échappent au système immunitaire de l’hôte en modifiant périodiquement les antigènes de présent à leur surface. En effet ces antigènes de surface sont endocytés, ainsi que les anticorps de l’hôte qui y sont attachés, au niveau d’une structure appelée la poche flagellaire (FP). TbBILBO1 est une protéine structurelle du collier de la poche flagellaire (FPC), essentielle à la biogenèse du FPC et à la survie du parasite. En raison du rôle majeur de la protéine TbBILBO1 dans le parasite, des partenaires de TbBILBO1 ont été recherchés.Dans ce travail, j’ai pu caractériser une nouvelle protéine essentielle du cytoskelette, la protéine FPC6, partenaire de TbBILBO1, qui se situe au niveau du complexe FPC/Complexe du Hook de T. brucei. L’ARN interférence de FPC6 conduit à une mort rapide des formes sanguines des trypanosomes, accompagnée d’un blocage de l’endocytose. Ensuite, j’ai produit un nanobody (Nb48), dirigé contre TbBILBO1, dans le système d’expression bactérien. Je l’ai également exprimé dans les lignées de trypanosomes. Le Nb48 reconnait TbBILBO1 sur les trypanosomes fixés par immunofluorescence et dans les extraits totaux de protéines dénaturées. L’analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) a confirmé une haute affinité du Nb48 pour TbBILBO1. L’expression de Nb48 dans le parasite T. brucei en tant qu’intrabody demontrant que ce nanobody pouvait être exprimé de manière fonctionnelle, capable de reconnaitre spécifiquement sa cible protéique, TbBILBO1, intra-cellulaire et de bloquer sa fonction conduit à un effet trypanocide rapide. Ces études ouvrant ainsi la voie pour de nouvelles utilisations potentielles thérapeutiques dans le traitement des trypanosomiases. / Kinetoplastid parasites, including trypanosomes and leishmania, are responsible for several diseases of socio-economic and public health importance worldwide. These include the Neglected Tropical Diseases: Sleeping Sickness, Chagas disease and Leishmaniasis, as classified by the World Health Organisation (WHO) and the global wasting disease of animals, Surra, as reported by the Food and Agricultural Organisation of the United Nations (FAO). Animal African Trypanosomiais (AAT) causes the death of 3 million cattle per year in sub-Saharan Africa, with an annual loss of 4.5 billion US dollars to the African economy. Cutaneaous leishmaniasis is a zoonotic disease, with 1.5 million new cases reported globally each year.Trypanosoma brucei is an ancient, early diverging eukaryote, used as a model organism in the laboratory for studying eukaryotic cilia and flagella. Remodelling of the trypanosome cytoskeleton is essential for cell morphology, organelle positioning and division. Study of essential proteins of the cytoskeleton provides insight into intracellular processes and could provide potential targets for therapeutic interventions. Trypanosomes evade the host immune system by periodically changing their external surface coat, which is endocytosed, along with any attached host antibodies, via a structure called the flagellar pocket. TbBILBO1 is a structural protein of the Flagellar Pocket Collar (FPC) that is essential for FPC biogenesis and parasite survival. Due to the importance of TbBILBO1 for the parasite, protein partners were investigated.In my thesis, I describe, firstly, the characterisation of a novel and essential cytoskeletal protein, FPC6, of the FPC/Hook complex of T. brucei; FPC6 is a partner of TbBILBO1. RNAi Knock-down of FPC6 protein leads to rapid cell death in the blood-stream form of the parasite accompanied with a block in endocytosis. Secondly, I describe the purification and intracellular expression of a nanobody (Nb48), raised against TbBILBO1. The purified Nb is able to identify TbBILBO1 in fixed trypanosomes and denatured protein. Surface Plasmon Resonance analysis confirmed a high affinity of Nb48 to TbBILBO1. Expression of Nb48 as an intrabody in T. brucei, reveals that it binds precisely to its target, TbBILBO1 and leads to rapid cell death. Further exploration of the potential uses of this trypanocidal nanobody is warranted.

Les kinétoplastidés sont des protozoaires flagellés responsables de maladies tropicales négligées mortelles telles que la leishmaniose viscérale (L. donovani et L. infantum) ou la trypanosomiase humaine africaine (T. brucei), pour lesquelles les traitements disponibles sont très limités. Depuis quelques années, on observe un regain d'intérêt pour le développement de nitrohétérocycles aromatiques anti-infectieux tels que le delamanide et le féxinidazole. De récentes études indiquent que l'activité anti-kinétoplastidés de ces dérivés repose sur leur bioactivation sélective par des nitroréductases parasitaires, conduisant à la formation de métabolites réduits électrophiles, fortement cytotoxiques. Suite à des études préliminaires réalisées dans notre équipe en série 8-nitroquinoléin-2(1H)-one, ces travaux de thèse portent sur la synthèse et l'étude in vitro de l'activité antiparasitaire de 80 dérivés notamment fonctionnalisés en positions 3 et 6 du pharmacophore par divers motifs, notamment via la mise au point de réactions d'halogénation sélective et de couplages pallado-catalysés. Ainsi, 5 nouvelles molécules hits (4 anti-kinétoplastidés et 1 sélective de T. brucei) ont été identifiées (0,01 µM ≤ CI50 ≤ 7 µM et 13 < IS < 1500), trois d'entre-elles étant des substrats sélectifs des nitroréductases parasitaires de type I. Afin de préciser les relations structure-activité, une étude des potentiels de réduction a également été menée. Des études physico-chimiques (solubilité, test de perméabilité PAMPA) et pharmacocinétiques in vitro (stabilité microsomale et fixation à l'albumine humaine) sont venues compléter ce travail. Enfin, des évaluations de la mutagénicité et de la génotoxicité de ces hits sur des cellules procaryotes et humaines ont été conduites, dans le but de statuer sur leur potentiel pharmaceutique antiparasitaire humain et vétérinaire. / Kinetoplastids are flagellated protozoan parasites responsible for lethal neglected tropical diseases, such as visceral leishmaniasis (L. donovani and L. infantum) or sleeping sickness (T. brucei brucei), for which very few drugs are available. Nowadays, nitroheterocyclic compounds present a renewed interest as anti-infective agents, as illustrated by the development of fexinidazole and delamanid. Some recent studies demonstrated that the antikinetoplastid activity of these derivatives involves their selective bioactivation by parasitic nitroreductases, leading to the formation of electrophilic reduced metabolites, highly cytotoxic. Based on preliminary studies conducted in our team in 8-nitroquinolin-2(1H)-one series, this PhD work is about the synthesis and in vitro antiparasitic study of 80 derivatives mainly functionalized at positions 3 and 6 of the pharmacophore by various substituents, especially via the optimization of selective halogenation and pallado-catalyzed cross coupling reactions. Thereby, 5 new hit compounds (4 antikinetoplastid and 1 selective of T. brucei) were identified (0.01 µM ≤ IC50 ≤ 7 µM and 13 < SI < 1500), three of them being selective substrates of type I parasitic nitroreductases. In order to refine the structure-activity relationship studies, an analysis of reduction potentials was also conducted. In vitro physicochemical (solubility, PAMPA permeability assay) and pharmacokinetic (microsomal stability and human albumin binding) experiments completed this work. Finally, the mutagenicity and genotoxicity evaluations of these new hit compounds toward prokaryotic and human cells were realized, in order to assess their human and veterinary antiparasitic pharmaceutical potential.

Le système du complément est une cascade de défense immunitaire complexe et étroitement régulée, conduisant à des dommages tissulaires lorsqu’il est suractivé. L’hème, un motif moléculaire de danger dérivant de l’hémolyse, est capable d’activer le complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales (CE) in vitro, suggérant un rationel pour examiner l’impact de l’activation du complément dans les maladies hémolytiques. L’objectif de ce projet était d’étudier si et comment l’hémolyse intravasculaire active le complément in vivo, et de comprendre les mécanismes sous-jacent conduisant à l’acquisition d’un phénotype activateur du complément par les CE afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons détecté des dépôts de complément, de C3 et de C5b-9, dans des reins de patients souffrants de nephropathie drépanocytaire ainsi que dans un modèle murin de drépanocytose. Nous avons mis en place un modèle murin d’hémolyse intravasculaire massive, déclenchée par la phénylhydrazine (PHZ), et caractérisé l’atteinte rénale. Nous avons détecté des dépôts de C3 au niveau des reins de ces souris. Cet effet a été inhibé par l’administration préventive du scavenger naturel de l’hème, l’hémopexine (Hx), et reproduit par des injections d’hème libre, démontrant une activation hème-dépendante in vivo. Les microvésicules d’érythrocytes (MVs) drépanocytaires représentent une source naturelle d’hème, de par leur concentration en hème trois fois supérieure à celle observée chez les donneurs sains. Nous avons démontré que les MVs drépanocytaires activent le complément dans le sérum et sur les CE, de manière en partie hème-dépendante. Ces résultats révèlent le rôle activateur de l’hème sur le complément dans les maladies hémolytiques. De plus, nous avons démontré que l’interaction de l’hème avec TLR4 peut en partie expliquer les dépôts de C3 sur l’endothélium in vivo et les CE in vitro. L’utilisation d’un inhibiteur de TLR4, le TAK-242, a réduit de 50% les dépôts de complément sur les CE, confirmé par une réduction des dépôts sur l’endothélium vasculaire chez des souris TLR4-/- traitées par PHZ ou hème. De plus, nous avons montré que ces dépôts hème/TLR4 dépendants sont liés à l’expression rapide de P-sélectine, qui recrute C3b et C3(H2O) à la membrane des CE, révélé par l’analyse des interactions protéiques en temps réel et l’utilisation d’un anticorps bloquant anti-P-sélectine. Ensemble, ce projet démontre que l’hème et les MVs sont les produits dérivés de l’hémolyse responsables de l’activation du complément. Au niveau cellulaire, l’induction par l’hème d’un phénotype activateur du complément des CE dépend de l’axe TLR4/P-sélectine, induisant des dépôts de C3 à la surface cellulaire. Ainsi, ces études soulignent les bénéfices potentiels de l’Hx et du TAK-242 contre l’activation du complément dans des pathologies associées à une hémolyse. / Complement system is a complex and tightly regulated innate immune defensive cascade, which can promote tissue damage, when overactivated. Hemolysis-derived danger associated molecular pattern heme is able to activate complement in serum and on endothelial cells (EC) in vitro, providing a rational for scrutinizing the impact of complement activation in hemolytic diseases. The objectives of this work were to study whether and how intravascular hemolysis induces complement activation in vivo, and to understand the underlying mechanism that leads to the acquisition of a complement activating phenotype of the endothelium in order to identify novel therapeutic strategies. We found complement deposits, including C3 activation fragments and C5b-9, within kidneys of patients with sickle cell disease (SCD) nephropathy (a prototypical hemolytic disease) as well as in a mouse model of SCD. We set up and characterized the renal injury of a mouse model of massive intravascular hemolysis, triggered by injection of phenylhydrazine (PHZ). We revealed C3 deposition within kidneys of the PHZ-treated animals. It was prevented by heme scavenging with hemopexin (Hx) and reproduced by injections of free heme, thus demonstrating the importance of heme for the complement activation in vivo. SCD erythrocytes microvesicles (MVs), are a pathologically relevant source of labile heme, since they carry three times more heme on their surface compare to MVs from healthy donors. We demonstrated that MVs, generated from SCD erythrocytes, activate complement in human serum and on EC surface, in part on a heme-dependent manner. These data highlight the importance of heme as a complement activator in hemolytic diseases. Further, we found that the C3 activation fragments deposits on endothelium in vivo and on EC in vitro can be in part explained by interaction of heme with TLR4. Indeed, the use of a specific inhibitor of TLR4, TAK-242, reduced about 50% the complement deposits on EC surface and such deposits on vascular endothelium in PHZ- or heme-injected mice were attenuated TLR4-/- mice. Moreover, we found that heme/TLR4-dependent complement deposition was mediated by the rapid expression of P-selectin, which in turn, recruited C3b and C3(H2O) on the EC surface, as evidenced by real time protein interaction analyses and using of blocking antibodies. Together our results demonstrated that heme and erythrocytes MVs are the hemolysis-derived products which promoted complement activation. At cellular level, heme induced complement-activating phenotype of EC by triggering TLR4/P-selectin axis and resulting in C3 activation fragments on cell surface. Together, these studies underline the potential benefits of Hx and TAK-242 against complement activation in pathologies related to hemolysis.

La menace du bioterrorisme, l'émergence de nouveaux pathogènes et la crainte d'une pandémie grippale ont favorisé, ces dix dernières années, la recherche de nouveaux outils et de nouvelles données pour la surveillance des maladies infectieuses. Dans cette thèse, ce problème est abordé d'une part avec des modèles statistiques pour la détection des épidémies à partir de données temporelles de surveillance (modèles de régression périodique), puis par l'évaluation de deux sources de données non cliniques (ventes de médicaments et recherches sur Internet) potentiellement intéressantes pour la surveillance des maladies infectieuses. Les modèles de régression périodique permettent la détection et la quantification des épidémies à partir de séries temporelles de surveillance, pour des maladies telles que la grippe ou la gastroentérite, où l'enjeu est d'extraire un signal en présence d'un niveau de base périodique. Nous avons déterminé les paramètres clés de ces modèles en effectuant une revue de la littérature. Une interface Internet autorisant la modification de ces paramètres clés a été construite pour permettre l'analyse de données temporelles et la comparaison de modèles. Ainsi, ce site Internet permet de tester rapidement des hypothèses d'analyse, de comparer des modèles et d'en choisir un, pour mettre en place une surveillance ou évaluer l'impact des épidémies. Nous avons ensuite construit et évalué un indicateur basé sur les ventes de médicaments pour la détection des épidémies de gastroentérite. Pour déterminer les classes thérapeutiques les plus informatives pour cette surveillance, une large base de ventes pharmaceutiques a été analysée par classification hiérarchique. L'indicateur obtenu a permis de détecter avec de très bonnes sensibilité, spécificité et rapidité, les épidémies de gastroentérite déclarées par le Réseau Sentinelles sur la base de la surveillance des diarrhées aiguës en médecine générale. Enfin, le nombre de requêtes effectuées sur le moteur de recherche Google au sujet de trois maladies infectieuses a été comparé aux données cliniques de surveillance fournies par le Réseau Sentinelles. Une corrélation élevée a été mise en évidence entre certaines requêtes et l'incidence des syndromes grippaux, des diarrhées aiguës et de la varicelle entre 2004 et 2008. Des modèles de régression multiple construits sur ces requêtes ont permis d'estimer, avec une bonne précision, les incidences de ces trois maladies sur cette période. Toutefois, ces mêmes modèles ont donné des prédictions erronées pour les syndromes grippaux durant la pandémie de grippe A/H1N1 de 2009.

Une connaissance approfondie de la résistance à R. solanacearum chez la tomate est nécessaire pour lutter efficacement contre le flétrissement bactérien. Les objectifs de ce travail sont d'identifier une source de résistance à la race 3, phylotype II (r3pII), de caractériser les bases génétiques de cette résistance et de les comparer à celles des souches de race 1. L. esculentum var. cerasiforme Hawaii 7996 a été identifié comme la meilleure source de résistance à une souche réunionnaise de r3pII parmi 82 génotypes de Lycopersicon sp. La cartographie des QTLs de résistance à la race 3 a été réalisée sur la descendance F3 issue de Hawaii 7996 x L. pimpinellifolium WVa700 (sensible), durant deux saisons, en étudiant différents critères (symptômes et colonisation bactérienne). Cette étude a montré la présence d'un QTL généraliste à effet majeur et de QTLs critère ou saison spécifiques. La cartographie des QTLs de résistance aux souches réunionnaises de r1pI et r3pII dans la descendance F8 et la comparaison avec d'autres études révèlent une spécificité phylotypiques des QTLs.