As proteínas ligadoras de ácidos graxos (Fatty Acid Binding Proteins, FABPs) de parasitos têm um papel importante no processo de infecção por estes organismos. Por este motivo, estas proteínas são antígenos candidatos para vacina contra a infecção por Schistosoma mansoni e Fasciola hepatica. No presente trabalho foram caracterizadas FABPs de F. hepatica e comparadas com a proteína Sm14 de S. mansoni, a FABP de parasito melhor caracterizada, mediante análise de sequências e estruturas modeladas. Também foram clonadas, expressas e purificadas as FABPs tipo 1 e tipo 3 de F. hepatica. Os resultados do presente estudo indicam que a FABP tipo 3 de F. hepatica é relacionada estrutural, imunológica e funcionalmente com a Sm14, um candidato vacinal amplamente estudado. Devido à importância da Sm14 como alvo para o desenvolvimento de vacina para a esquistossomose, as características apresentadas pela FhFABP3 de F. hepatica apontam esta proteína como um candidato importante também para o desenvolvimento de uma vacina contra a fasciolose / Parasites fatty acid binding proteins (FABPs) have an important role in infection process by these organisms. For this reason, these proteins are candidates as vaccine antigens against Schistosoma mansoni and Fasciola hepatica infection. In the present study, FABPs from F. hepatica were characterized and compared with Sm14 protein from S. mansoni, the best characterized parasite FABP, by sequence analysis and modeled structure. Type 1 and type 3 FABPs from F. hepatica were also cloned, expressed and purified. The results of this study indicated that type 3 FABP from F. hepatica is structural, immunological and functionally related with Sm14, a vaccine candidate widely studied. Due to the importance of Sm14 as a target for vaccine development for schistosomiasis, the characteristics presented by the FhFABP3 from F. hepatica suggest this protein as a candidate also important for the development of a vaccine against fasciolosis

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. A esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d´água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 207 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. Os medicamentos disponíveis no mercado causam graves efeitos colaterais. Além disso, há relatos de cepas de S. mansoni resistentes à esses medicamentos, justificando assim a busca por novos fármacos. O Schistosoma mansoni não possui a via de novo para a biosíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessa. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar as constantes catalíticas e a estrutura tridimensional da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que participam da via de salvação de purinas, e é desta forma essencial para a reprodução do parasita. Esta enzima foi expressa de forma heteróloga, purificada e cristalizada. A proteína foi submetida à ensaios cinéticos em sistema acoplado, onde foram determinadas as constantes catalíticas. A proteína foi também cristalizada em condições que continham 100 mM de Bis-tris ou MES com pH variando entre 6,1 a 6,5 e PEG3350, cuja concentração variou ente 14-18%. Os cristais foram submetidos à difração de raios-X no LNLS e no DLS. Foram obtidos, quatro conjuntos de dados, que foram processados, refinados e analisados. Obteve-se estrutura apoenzima em complexo com fosfato, em complexo com adenina e sulfato, em complexo com tubercidina e sulfato e em complexo com adenina e glicerol em um grupo espacial diferente dos demais. Através da estrutura secundária, foi possível analisar o sítio ativo, além de obter informações preliminares do mecanismo catalítico da enzima alvo. Este trabalho colabora para a futura elucidação completa da via de salvação de purinas em S. mansoni, e fornece informações básicas para que a busca por novos fármacos tenha novos ramos a serem explorados. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. Schistosomiasis mansoni also known as water belly or snail´s disease is a chronic parasitic illness that affects approximately 207 million people worldwide with approximately 6 million in Brazil. Schistosomiasis is treated by the use of drugs that are not-in fact effective for the eradication of the disease, and although their efficiency cause serious side effects. In addition, there are reports of S. mansoni´s resistant strains to these drugs, thus justifying the search for new drugs. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the de novo pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathways for its purine requirement. Thus this study aimed to determine the catalytic constants and three-dimensional structure of MTAP (EC 2.4.2.28), an enzyme that is involved in purine salvation pathway, and is thus essential to the reproduction of the parasite. The MTAP was heterologously expressed, purified and crystallized. The protein was submitted to kinetic assays in coupled system, to determine the catalytic constants. The protein was crystallized in 100mM Bis-tris or MES pH 6.1-6.5 and 14-18% PEG 3350. The crystals were submitted to diffraction of rays-X in the LNLS and DLS. Data sets were obtained, processed, refined and analyzed. Structures were obtained in apoenzyme form complexed with fosfate, complexed with adenine and sulfate, complexed with tubercidin and sulfate, and with adenine and glycerol in a space group different of the others. Through the secondary structure, it was possible to analyze the active site and obtained preliminary information of the catalytic mechanism of the target enzyme. This study contributes to the complete elucidation of the purine salvation pathway in S. mansoni, and provides basic information for the research of the new drugs.

Septinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 Å para a forma ligada a GDP e 2.1 Å para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita β em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas. / Septins belong to the GTPase family of proteins and are involved in a variety of cellular processes. We have identified four genes encoding septins in Schistosoma mansoni, one of the main causative agents of schistosomiasis, these genes were named SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2. The aim of this study was to clone the cDNA of these genes in order to subject the resulting proteins to a set of biophysical and functional studies. Biophysical characterizations were undertaken with SmSEPT5 and SmSEPT10 because of the higher solubility of these proteins, which were dimeric in solution and stable over a wide range of pH, although increasing temperatures promoted the aggregation of these proteins. The nucleotide binding assays revealed that both were capable of binding GTP and GDP, although only SmSEPT5 presented GTPase activity. Mg2+ has shown to be essential for GTP binding in both proteins while GDP binding was independent of this cofactor. Crystallization assays with the GTPase domain of SmSEPT10 have resulted in crystals of high quality and consequently high resolution structures were obtained: 1.9 Å to the GDP bound form and 2.1 Å to the GTP bound form, the best resolution achieved to date for any septin member. The sobreposition of the structures obtained enabled us to observe a strand slippage in β3 strand suggesting that it might be part of an activation mechanism involved in the association of these proteins to membranes. A coexpression system was produced, in which SmSEPT5, SmSEPT10 and SmSEPT7.2 were coexpressed and copurified. These proteins were able to assemble into heterocomplexes that further polymerize into filaments. Functional studies performed with a drug (FCF) that affects the dynamics of septin filaments have resulted in a reversible paralysis phenotype in the parasite. Immunolocalization experiments revealed the colocalization of septins and actin in muscular structures of the parasite, suggesting that the interaction of septin and actin filaments might have an important role in the motor activity of the parasite. The immunolocalization also revealed the presence of septins in the ephitelial plates of miracidia, germ cells of miracidia and sporocysts and protonephridia of cercariae. The results presented here constitute the first description of septins in phatyhelmintes and enabled us the establishment of structural and functional relaltionships among septins from S. mansoni and analogous septin complexes in other organisms, contributing to elucidate the function of this family of proteins.

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. Causada pelo parasita Schistosoma mansoni a esquistossomose mansônica afeta aproximadamente 259 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. O S. mansoni não possui a via \"de novo\" para a biossíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessas bases, portanto, essa via é um alvo em potencial. Agentes capazes de bloquear a atividade das enzimas participantes desta via atuam de forma inespecífica e são quase sempre tóxicos ao homem e por isso o estudo minucioso das pequenas diferenças encontradas entre as enzimas do hospedeiro e do parasita são de extrema importância. Uma diferença marcante entre a via de salvação de purinas do parasita e do hospedeiro humano é a presença de atividade para adenosina fosforilase, que no parasita é exercida por duas entidades distintas: pela enzima Metiltioadenosina fosforilase de S. mansoni (SmMTAP) e por uma enzima até então desconhecida. A enzima SmMTAP naturalmente converte 5\'-deoxi-5\'-metiltioadenosina (MTA) em adenina livre, mas ao contrário do que é visto no hospedeiro, no parasita essa enzima atua preferencialmente na conversão de adenosina. Substituições encontradas no sítio ativo dessa enzima, podem explicar tamanha preferência pelo substrato alternativo, revelando mecanismos distintos da enzima humana. A enzima Purina nucleosídeo fosforilase de S. mansoni (SmPNP) converte inosina e guanosina à hipoxantina e guanina, respectivamente, mas não possui atividade catalítica para adenosina. No entanto, no genoma de S. mansoni é descrita uma isoforma para a SmPNP (SmPNP2), cuja atividade catalítica é desconhecida e, portanto, essa enzima pode também atuar na conversão de adenosina juntamente com a SmMTAP. Assim, os objetivos deste trabalho foram realizar estudos bioquímicos da ação da enzima SmMTAP e realizar a caracterização estrutural e funcional da enzima SmPNP2. Para isso, foram realizadas mutações no sítio ativo da SmMTAP (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L), as mutantes da SmMTAP juntamente com a enzima SmPNP2 foram clonadas, expressas de forma heteróloga e purificadas. Foram realizados ensaios de cristalização e cinéticos por espectrofotometria utilizando um sistema acoplado. A atividade da SmPNP2 foi ainda avaliada por calorimetria e HPLC. Foram determinadas as constantes catalíticas da forma nativa e para os cinco mutantes da SmMTAP para cinco diferentes substratos. Foi determinada atividade catalítica da SmPNP2 por 3 diferentes substratos: adenosina, inosina e citidina, as constantes catalíticas foram determinadas para os três substratos. Foram obtidos cristais para os mutantes da SmMTAP e da SmPNP2, que foram submetidos à difração de raios X nas linhas I04-1 e I02 do laboratório de radiação síncrotron Diamond Light Source (DLS). Foram resolvidas 9 estruturas dos mutantes da SmMTAP e 4 da proteína SmPNP2. Os dados cinéticos, juntamente com os dados estruturais, permitiram compreender mecanismos catalíticos e de interação das proteínas estudadas, complementando o conhecimento do metabolismo do parasita Schistosoma mansoni e revelando alvos em potencial para o desenvolvimento de fármacos específicos. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. The schistosomiasis is caused by Schistosoma mansoni parasite and affects approximately 259 million people worldwide with 6 million only in Brazil. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the \"de novo\" pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathway for its purine requirement, therefore this pathway is a potential target. Compounds able to block the enzymes from this pathway, are not specific and are often toxic to humans, thus the thorough study about the particularity found between enzymes from host and parasite are extremely important. A notable difference between human and parasite metabolism, is the activity existence to Adenosine phosphorylase that in parasite is carried out by two distinct entities: by Methylthioadenosine phosphorylase (SmMTAP) and by a hitherto unknown enzyme. The SmMTAP enzyme, naturally converts 5\'-deoxy-5\'-methylthioadenosine (MTA) to free adenine and in opposition to host, in the parasite this enzyme acts manly in adenosine conversion. Substitutions found in the active site from SmMTAP, can explain the huge preference by alternative substrate and to expose a distinct mechanisms from human enzyme. The Purine nucleoside Phosphorylase from S. mansoni (SmPNP) converts inosine and guanosine to hypoxanthine and guanine, respectively, but it not possess catalytic activity to adenosine conversion. However in the S. mansoni genome there is a isoform to SmPNP, whose activity is unknown, thus is possible that SmPNP2 enzyme also can to convert adenosine. This study aimed to perform biochemical studies to investigate the SmMTAP enzyme action and perform the structural and functional characterization of SmPNP2. For this propose was made site-directed mutagenesis (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L). The SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme were cloned, expressed by heterolog process and purified. Were perform kinetic assays by spectrophotometric method in a coupled system. The SmPNP2 activity was also available by calorimetry and HPLC methods. Were determined the catalytic constants to wild and mutants SmMTAP to five different substrate. Was determinated to SmPNP2 catalictical activity and kinetics parameters to three substrate: adenosine, inosine e cytidine. Were obtained crystals from SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme, those crystals were submitted to X-rays diffractions in the I04-1 and I02 beamlines from Diamond Light Source (DLS). Nine structures were obtained from SmMTAP mutants and four from SmPNP2 enzyme. The kinetics and structural data allowed understanding the catalytic and interaction mechanisms about the protein studied, supplementing the knowledge around Schistosoma mansoni metabolism and reporting potential targets for the specific drugs development.

A classe de proteínas das MEGs (codificadas por genes de micro-éxon) presente em Schistosoma mansoni, ganhou evidência após a publicação do genoma deste parasita, principalmente por ser majoritariamente secretada, estando em contato direito com moléculas do hospedeiro, e possuir alta taxa de variação, o que poderia ter relação com um possível um mecanismo de evasão do sistema imune. Assim, foram escolhidas proteínas da classe das MEGs, todas com predição de hélice anfipática em sua estrutura, para investigação neste trabalho. Hélices anfipáticas são amplamente descritas na literatura como tendo alta propensão à interação com membranas celulares e interessantes funções fisiológicas. O objetivo deste projeto foi estudar a dinâmica de interação com membranas e estabelecer possíveis indícios de função biológica das proteínas MEG-24 e MEG-27 a partir de técnicas biofísicas. Optou-se por trabalhar com essas proteínas produzidas a partir da síntese química. Utilizando as técnicas de CD, Fluorescência e DLS, observou-se que a presença de miméticos de membrana induzem o enovelamento e o aumento da estabilidade térmica de MEG-27, e interferem no seu estado oligomérico. Para MEG-24, também foi observado aumento da estabilidade térmica e influência no estado oligomérico na presença de sistemas miméticos de membrana. Utilizando OCD, inferiu-se que MEG-27 possivelmente interage com a superfície da membrana, a passo que MEG-24 se insere na bicamada. Adicionalmente, ambas foram capazes de interferir na dinâmica de vesículas, conforme observado pelo ensaio de vazamento de calceína e DSC. Utilizando células de eritrócito e um modelo de membrana a partir dessas células (ghosts) foram realizados ensaios biológicos, DSC e EPR. A capacidade de MEG-24 e MEG-27 realizarem hemólise e hemoaglutinação, respectivamente, reitera o potencial de interação destas proteínas com membranas biológicas. Os resultados de DSC apontaram que ambas interferem nas transições das proteínas de membrana embebidas na bicamada de ghosts de eritrócitos. Por EPR, notou-se que MEG-27 tem maior efeito na dinâmica de lipídios em detrimento a MEG-24, possivelmente devido a um mecanismo de acomodação envolvendo domínios raft e a diferença de orientação de interação entre ambas as proteínas. A expressão de MEG-27 exclusivamente na região da glândula do esôfago em vermes adultos verificada por WISH, sugere que a mesma deva entrar em contato com células recém ingeridas pelo parasita. Não foi observada atividade antimicrobiana para ambas e não foram encontrados parceiros de interação proteínas pela técnica de Duplo-híbrido para MEG-27. Concluiu-se que os peptídeos estudados interagem com membranas biológicas, podendo ter papéis importantes na interface de interação parasito-hospedeiro. / The class of MEGs proteins (coded by micro-exon genes) present in Schistosoma mansoni, drawn attention after the parasite genome publication. This proteins are mostly secreted, being in direct contact with host molecules and with a high rate of variation, which could be a mechanism of Imune system evasion. Thus, proteins of the MEGs class, all with amphipathic prediction in their structure, were chosen for investigation in this work. Amphipathic helices are widely described in the literature with high propensity to interact with membranes and, consequently, probability of related biological function. The objective of this project was to study the interaction dynamics with membranes and to establish possible indications of biological function of MEG-24 and MEG-27 proteins from biophysical techniques. We chose to work with these proteins produced by chemical synthesis. Using CD, Fluorescence and DLS techniques, it was observed that the presence of membrane mimetics induced the folding and increased thermal stability of MEG-27, and interfered with its oligomeric state. For MEG-24, an increase in thermal stability and influence on the oligomeric state was also observed when in the presence of membrane mimetic systems. The results of OCD suggest that MEG-27 possibly interacts with the membrane surface, whereas MEG-24 is inserted into the bilayer. Both were able to interfere with vesicle dynamics, as observed by the Leakage and DSC tests. Using a more realistic membrane model from erythrocyte cells, biological assays, DSC and EPR were performed. The ability of MEG-24 and MEG-27 to perform hemolysis and hemagglutination, respectively, provides evidence of the potential for interaction of these proteins with biological membranes. The DSC results indicated that both interfere with the transitions of the membrane proteins embedded in the bilayer of erythrocyte ghosts. By EPR, it was noted that MEG-27 has a greater effect on lipid dynamics than MEG-24, possibly due to an accommodation mechanism involving raft domains and the difference in orientation of interaction between both proteins. The expression of MEG-27 exclusively in the region of the esophagus gland in adult worms verified by WISH suggests that it should come into contact with cells just ingested by the parasite. No antimicrobial activity was observed for both and no protein interaction partners were found by the MEG-27 double-hybrid technique. It was concluded that the studied peptides interact with biological membranes and may have important roles in the parasite-host interaction interface.

Este estudo desenvolveu-se no município de Bananal, São Paulo, uma área endêmica para esquistossomose com prevalência menor que 10% e baixa carga parasitária dos infectados. Teve como objetivo a identificação de formas clínicas da esquistossomose mansônica entre 109 pacientes diagnosticados parasitoscopicamente e medicados com oxamniquine, durante a realização do Plano de Intensificação das Ações de Controle da Esquistossomose Mansônica (1998-2000). Utilizou-se a ultra-sonografia abdominal e o exame de fezes (Kato-Katz) realizado, em média, quatro anos após o término do plano. Nesta casuística, foram identificados cinco pacientes com imagens ultra-sonográficas abdominais compatíveis com fibrose periportal periférica e central e hipertensão portal que tinham diagnósticos clínicos de esquistossomose na sua forma intestinal. A ultra-sonografia é um método de diagnóstico sensível, incruento, que possibilitou a identificação de casos de esquistossomose com comprometimento hepático mais extenso do que se expressava pelo exame físico. Mesmo considerando uma prevalência baixa de alterações hepáticas e de circulação portal nesta casuística, evidencia-se a importância do emprego do método ultra-sonográfico na avaliação individual dos pacientes esquistossomóticos, por permitir a detecção de alterações morfológicas e funcionais que podem ter conseqüências clínicas relevantes. Deve-se assinalar ainda que, no momento do exame, todos os pacientes tiveram coproscopias negativas, revelando a efetividade das ações de controle no médio prazo. Devemos considerar que a realização do estudo ultra-sonográfico em média quatro anos após o tratamento específico dessa população, provavelmente detectou menos alterações do que aconteceria se o estudo fosse feito no momento do diagnóstico parasitológico, pois se sabe que a involução, ainda que parcial da fibrose e de alterações funcionais conseqüentes a ela, ocorre após tratamento específico. Por fim, apesar do pequeno número de casos avaliados, a estratégia utilizada no presente trabalho começou a preencher a lacuna de avaliação do impacto da esquistossomose sobre a saúde do cidadão bananalense, percebida durante o desenvolvimento do Plano de Intensificação das Ações de Controle da Esquistossomose Mansônica, período de 1998 a 2000. / This study was developed in the municipality of Bananal, São Paulo, an endemic area for schistosomiasis with prevalence of less than 10% and low parasite load among infected individuals. The objective was to identify the clinical forms of intestinal schistosomiasis among 109 patients who had been diagnosed through parasitological tests and medicated with oxamniquine at the time of the Plan for Intensification of Schistosomiasis Control Actions (1998-2000). Abdominal ultrasonography and feces examination (Kato-Katz) were utilized: this was on average done four years after the ending of the plan. In this sample, five patients were identified whose abdominal ultrasound images were compatible with peripheral and central periportal fibrosis and portal hypertension who had had a clinical diagnosis of schistosomiasis in its intestinal form. Ultrasonography is a sensitive noninvasive diagnostic method that enables identification of the extent of liver involvement in schistosomiasis cases better than through its expression in physical examination. Even considering that there was a low prevalence of liver abnormalities and portal circulation in this sample, the importance of utilizing the ultrasound method for individual evaluations on the schistosomiasis patients was demonstrated. Through this, it was possible to detect morphological and functional alterations that could have important clinical consequences. It also should be noted that, at the time of the ultrasound examination, all the patients presented negative coproscopic test results, thus showing the effectiveness of the control actions over the medium term. It needs to be borne in mind that, because the ultrasound study was carried out on average four years after the specific treatment of this population, it is likely that fewer abnormalities were detected than there would have been if this study had been performed at the time of the parasitological diagnosis. This comes from the knowledge that involution occurs following specific treatment, even if only partially with regard to fibrosis and its consequent functional alterations. Finally, despite the small number of cases evaluated, the strategy utilized in the present study has started to fill the gap regarding assessing the impact of schistosomiasis on the health of the citizens of Bananal that was perceived during the development of the Plan for Intensification of Schistosomiasis Control Actions between 1998 and 2000.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Schistosomalmyeloradiculopathy (SMR) is a severe formofpresentationof schistosomiasis, in whichthe spinal cord isaffectedby species ofSchistosoma. Thisstudy aimed todevelopan animal modelof SRMcaused byS.mansoni, and characterize the sensory and motorchanges causedby the depositionofeggsof S. mansoniin the spinal cordand correlate thesensory aspects, engines and histologicalanimalsinfunction of time.Heldmechanicalsensitivitytests, behavioral and subsequenteuthanasiain two series(infected and control)animalsdividedinto six groups offivemale Wistar ratseachin5, 10, 20 and 30dayspost-infection. The experimental groupswere anaesthetizedwith halothane andinjected witha suspension ofS. mansonieggs in thesubarachnoid space.Control animalsunderwent the sameprocedure, but with phosphate buffersolution administration(PBS). The spinal cordwas removed,subjected tohistologicalanalysis ofT10and L5. It was observedreduction in surfacemechanical sensitivity, thermal sensitivityand muscle strengthcaused by theeggsof S. mansoniin the spinal cord; Changesobservedin nervous tissueof 25% of the animals following infectionof S. mansoni. The modelproved to besuitable forevaluation offunctional changesin ratsand may beuseful forpathogenesisstudiesofMRE. / Mielorradiculopatiaesquistossomótica (MRE) é uma forma grave de apresentação da esquistossomose, em que a medula espinhal é acometida por espécies de Schistosoma. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de modelo animal de MRE causada pelo S. mansoni, além de caracterizar as alterações sensoriais e motoras ocasionadas pelo depósito de ovos do S. mansoni na medula espinhal e correlacionar os aspectos sensoriais, motores e histológicos nos animais em função do tempo. Realizou-se testes de sensibilidade mecânica, comportamentais e posterior eutanásia em duas séries (infectada e controle) de animais divididas em seis grupos com 5 ratos Wistar machos cada nos 5º, 10º, 20º e 30º dias da pós-infecção. Os grupos experimentais foram anestesiados com halotano e injetou-se uma suspensão de ovos de S. mansoni no espaço subaracnóideo. Os animais controle foram submetidos ao mesmo procedimento, porém com administração de solução tampão-fosfato (PBS). A medula espinhal foi removida, submetida a análise histológica entre T10 e L5. Constatou-se redução na sensibilidade mecânica superficial, da sensibilidade térmica e da força muscular ocasionadas pelos ovos do S. mansoni na medula espinhal; Observou-se alterações no tecido nervoso de 25% dos animais após a infecção de S. mansoni. O modelo desenvolvido mostrou-se satisfatório para avaliação das alterações funcionais em ratos Wistar, podendo ser útil para estudos da etiopatogenia da MRE.

Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:14:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Allegretti_SilmaraMarques_D.pdf: 7173440 bytes, checksum: a0d4e606aad825810e374339d5ed7dce (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo verificar a ação da inoculação de hemolinfa total, hemolinfa livre de células e suspensão dc amebócitos no desenvolvimento do /..__. mansoni da linhagem BH em B. g/abrata melânica. Os parâmetros avaliados foram: taxa de infecção, taxa de mortalidade, período pré-patente, reação tecidual em tomo das larvas de S. mansoni, atividade fagocitária dos amebócitos e nÚmero de amebócitos na hemolintà. Para a determinação da taxa de infecção, taxa de mortalidade, período pré-patente, atividade fagocitária e número de amebócitos circulantes os moluscos foram infectados com 10 miracídios do tremalódeo. A reação tecidual foi observada em moluscos expostos a 100 miracídios. Os resultados indicaram que, a inoculação de hemolintà total provocou a facilitação da infecção observando-se diminuição do período pré-patente, aumento da taxa de mortalidade, pequena atividade fagocitária dos amebócitos e discreta reação amebocitária em tomo do esporocisto de ,)_. mansoni. A inoculação de hemolintà livre de células provocou um retardamento do desenvolvimento do parasita com o aumento do período pré-patente, e reação tecidual mais intensa em tomo do esporocisto de S. mansoni. A inoculação de suspensão de amebócitos produziu uma reação mais efetiva contra o parasita com aumento do período pré-patente, diminuição da mortalidade dos moluscos, aumento da atividade fagocitária, aumento das células estreladas na hemolinfa circulante e aumento das reações amebocitárias no tecido em tomo dos csporocistos. A inoculação de suspensão de células produziu maior resistência ao desenvolvimento do S. mansoni. / Abstract: The main purpose of this work was to verify the effects from the inoculation of diftercnt kinds of hemolymph on the development of SdÚS/OSOlIIll IIIlf/l lli in pigmcnted Biomphalaria glahrata. The S. mansoni belongs to the BH strain. The types of hemolymph were: complete hemolymph, cells-fTee hemolymph and amoebocyte suspenslOn. In order to achieve our purpose the following variables vere considered: intection rate, death rate, pre-patent period, tissue reactions arollnd S mansoJli larval, phagocytosis activity and number of amoebocytes in the circlIlation hemolymph R. [;/ahrala snail were infected with 10 miracidia trom the trematodes. The tissue reaction was observed on the snails that were exposed to 100 miracidia. The results have indicated that the inoculation of the complete hemolymph facilitated the infection with decrease on the pre-patent period as well as the increase on the death rate little phagocytosis activity on the amoebocytes and slight reaction around sporocyst of the S. mansoni. The inoculation of cells-tl'ee hemolymph postponed the parasite development with the increase of the pre-patent period and more intense tissue reaction arollnd sporocyst of S. mansoni. The inoculation of the amoebocytes slIspcnsion caused a more ctrcctive reaction against the parasite with the increase the pre-patent period, the decrease snails mortality, the increase phagocytosis activity the increase 01' granulocytes in the circulating hemolymph and the increase of amoebocytes reactions around sporocysts of S mansoni. The inoculation of the amoebocytes suspension produccd greater resistance to the S. mansoni development. / Doutorado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhaes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guerino_LauraRocha_M.pdf: 645841 bytes, checksum: c75feb38c5a946cf3347791584c0e3e8 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Moluscos terrestres de várias espécies têm sido relatados como hospedeiros naturais do Angiostrongylus costaricensis. Experimentalmente, Biomphalaria glabrata pode ser utilizada como hospedeira intermediária deste nematódeo, responsável pela angiostrongilíase abdominal. Os moluscos se infectam pela ingestão ou penetração ativa das larvas L1 de A. costaricensis. O objetivo deste trabalho foi verificar a capacidade de atração exercida por B. glabrata infectada com A. costaricensis sobre miracídios de Schistosoma mansoni da linhagem BH e verificar a suscetibilidade de B. glabrata submetida à infecção concomitante com A. costaricensis e S. mansoni. Para o estudo da atração miraxonal utilizamos B. glabrata infectada com 120 larvas L1 de A. costaricensis e após 20 dias de infecção os moluscos foram utilizados nos experimentos. Nesses experimentos foi utilizado um artefato de vidro composto por duas câmaras unidas por um canal e preenchido com água declorada. Os moluscos ou sua água de condicionamento (SCW) foram colocados aleatoriamente em uma das câmaras e dez miracídios foram colocados no centro do canal e seu comportamento foi observado por 15 minutos. De acordo com os resultados obtidos, pudemos observar que B. glabrata infectada ou não com A. costaricensis ou sua SCW atraíram miracídios de S. mansoni. Verificamos ainda, haver maior atração miraxonal frente à SCW de B. glabrata infectada com A. costaricensis (89%) do que o próprio molusco infectado com A. costaricensis (71%). No estudo da suscetibilidade exemplares de B. glabrata foram expostos a 10 miracídios de S. mansoni BH e a 120 larvas L1 de A. costaricensis. Após 30 dias de infecção os moluscos foram examinados para a verificação de eliminação de cercárias. Após 60 dias de infecção os moluscos sobreviventes tiveram seu corpo digerido por pepsina e ácido clorídrico para a recuperação de larvas L3 de A. costaricensis. A infecção prévia de B. glabrata com A. costaricensis (com intervalo de 48 horas), facilitou a infecção pelo S. mansoni. Foi constatada maior taxa de infecção por S. mansoni (96,7%), maior número de cercárias liberadas (4955 cercárias/molusco) e baixa mortalidade dos moluscos (20%). A exposição prévia de B. glabrata ao A. costaricensis e posteriormente ao S mansoni, também facilitou o desenvolvimento do A. costaricensis, uma vez que na nona semana de infecção foi recuperada maior quantidade de larvas L3 (12 larvas/molusco), se comparado com moluscos expostos somente ao A. costaricensis (8 larvas/molusco). Entretanto a pré-infecção de B. glabrata com S. mansoni (com intervalo de 24 horas) e posteriormente com A. costaricensis mostrou-se muito prejudicial à B. glabrata provocando grande mortalidade dos moluscos (83%). A maior mortalidade dos moluscos provocou menor taxa de infecção pelo S. mansoni (63,3%), menor recuperação de larvas L3 de A. costaricensis (10 larvas/molusco) e menor número de cercárias liberadas (2722 cercárias/molusco) / Abstract: Several species of land mollusks are natural hosts of the Angiostrongylus costaricensis. Experimentally, Biomphalaria glabrata can be used as an intermediate host for this nematode, responsible for the abdominal angiostrongyliasis. The mollusks are infected through the ingestion or activate penetration by the first-stage larvae (L1) of A. costaricensis. The objective of this work was to verify the ability of B. glabrata, infected with A. costaricensis, to attract miracidia of the BH strain of Schistosoma mansoni and to verify the susceptibility of B. glabrata infected concomitantly with A. costaricensis and S. mansoni. For the study of the miraxonal attraction we used B. glabrata infected with 120 first-stage larvae of A. costaricensis and the mollusks were used in the experiments after twenty days of infection. In these experiments we used a glass apparatus consisting of two circular chambers connected by a channel and filled with chlorine free water. Aleatorily, the snails or their conditioning water (SCW) were placed in one chamber and ten miracidia were placed in the center of the channel and their behavior was observed for 15 minutes. According to the results obtained, we could observe that B. glabrata infected or not infected with A. costaricensis and their SCW attracted S. mansoni miracidia. We also verified, a larger miraxonal attraction to the SCW of B. glabrata infected with A. costaricensis (89%) than to the actual mollusk infected with A. costaricensis (71%). In the study of the susceptibility samples of B. glabrata were exposed to 10 miracidia of the BH strain of S. mansoni and to 120 first-stage larvae of A. costaricensis. After thirty days of infection the mollusks were examined for the cercariae elimination. After sixty days of infection the surviving mollusks had their bodies digested by pepsin and hydrochloric acid for the recovery of third-stage larvae of A. costaricensis. The prior infection of B. glabrata with A. costaricensis (with an interval of 48 hours), facilitated the infection with S. mansoni. A larger infection rate to S. mansoni was verified (96.7%), a larger number of liberated cercariae (4955 cercariae/mollusk) and a lower mortality of the mollusks (20%). The prior infection of B. glabrata with A. costaricensis and posteriorly to S. mansoni, also facilitated the development of the A. costaricensis, because in the ninth week of infection a larger amount of third-stage larva was recovered (12 larvae/mollusk), if compared with mollusks exposed only to the A. costaricensis (8 larvae/mollusk). However the prior infection of B. glabrata with S. mansoni (with an interval of 24 hours) and posteriorly with A. costaricensis it was shown to be very harmful to B. Glabrata causing a great mortality of the mollusks (83%). The larger mortality of the mollusks caused a smaller infection rate for the S. mansoni (63.3%), a smaller recovery of thirdstage larvae of A. costaricensis (10 larvae/mollusk) and a smaller number of liberated cercariae (2722 cercariae/mollusk) / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia