Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_vanusa_pousada_hora.pdf: 1554436 bytes, checksum: 0fd840bde10d345ca60494edec79f15c (MD5) Previous issue date: 2010-12-20 / Malaria and schistosomiasis are the major human parasitic diseases in developing countries and their coexistence is frequently observed in tropical regions of these countries. Co-infection by these two parasites may have an important influence on the regulation of inflammatory factors associated with the development of these infections and their respective morbidity. There is no safe and effective vaccine available to control these diseases. The Schistosoma mansoni proteins Sm29 and Sm14 and the Plasmodium spp. antigen AMA-1 are promising vaccine candidates against schistosoma and malaria infections, respectively. For a subunit vaccine, selection of the adjuvant is important. The non-toxic derivatives of the heat-labile toxin of Escherichia coli LTB and LTK63 have been reported as powerful adjuvants. The objective of this study was to evaluate the vaccine efficacy of recombinant Sm29, Sm14 and AMA-1 antigens formulated with LTB or LTK63, in infection and co-infection models with S. mansoni and P. chabaudi strain AS (prior to immunizations, naïve mice, pre-infected with S. mansoni and cured or P. chabaudi AS or infected with both and cured). Overall, rLTK63 stimulated high levels of antigen specific antibodies (IgG1, IgG2a and total IgG) and cytokines (IFN-, TNF-α and IL-13) to rSm29 and rAMA-1 than rLTB. Co-infected-cured mice immunized with rLTK63+rSm29 reduced the parasitic load by 46.45% in the schistosomiasis model. Naïve or co-infected-cured mice immunized with rLTK63+rAMA-1 had a reduction in the P. chabaudi parasitemia. Taken together, these data suggest that co-infection showed a positive trend in vaccine efficacy of rSm29 and rAMA-1 when formulated with rLTK63. rSm14 antigen was fused or co-administered with LTB and the best administration rote and protection induced was assessed. The rSm14 was more efective when fused to LTB and administrated by subcutaneous route. Despite the fact that rLTB-Sm14 induced a balanced ratio of IgG1/IgG2a and high levels of IgA and total IgG, rLTB-Sm14 did not protect mice against S. mansoni infection. / Malária e esquistossomose são as principais doenças parasitárias humanas nos países em desenvolvimento e a sua coexistência é frequentemente observada em regiões tropicais desses países. A co-infecção por estes dois parasitas pode ter uma importante influência na regulação dos fatores inflamatórios associados ao desenvolvimento destas infecções e suas respectivas morbidades. Não há uma vacina segura e eficaz disponível para o controle dessas doenças. As proteínas Sm29 e Sm14 de Schistosoma mansoni e a proteína AMA-1de Plasmodium spp. são promissores candidatos à vacinas contra esquistossomose e malária, respectivamente. Para qualquer vacina de subunidade, a seleção do adjuvante é importante. Os derivados não-tóxicos da toxina termolábil de Escherichia coli LTB e LTK63 têm sido relatados como potentes adjuvantes. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia vacinal dos antígenos Sm29, Sm14 e AMA-1 formulados com LTB ou LTK63 recombinantes em modelos de infecção e co-infecção com S. mansoni e P. chabaudi cepa AS (camundongos não infectados, pré-infectados com S. mansoni ou P. chabaudi e curados ou co-infectados com ambos e curados). Em geral, rLTK63 induziu níveis mais altos de anticorpos antígeno específicos (IgG1, IgG2a e IgG total) e citocinas (IFN-, TNF-α e IL-13) para rSm29 e rAMA-1 do que a rLTB. Camundongos co-infectados, curados e imunizados com rLTK63+rSm29 apresentaram redução na carga parasitária de 46.45 % em modelo de esquistossomose. Camundongos não infectados ou co-infectados, curados e imunizados com rLTK63+rAMA-1 tiveram redução na parasitemia de P. chabaudi. Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a co-infecção mostrou uma tendência positiva na eficácia da vacinas rSm29 e rAMA-1 quando formuladas com rLTK63. O antígeno rSm14 foi fusionado ou co-administrado com LTB e posteriormente foi avaliada a melhor via de administração e proteção induzida. A rSm14 foi mais efetiva quando fusionada à LTB e administrada por via subcutânea. Apesar da rLTB-Sm14 ter induzido uma razão equilibrada de IgG1/IgG2a e altos níveis de IgA e IgG totais, rLTB-Sm14 não protegeu camundongos contra infecção por S. mansoni.

Schistosoma mansoni est un parasite helminthe responsable de la schistosomiase intestinale, qui affecte 200 millions de personnes dans les zones tropicales et subtropicales, et l’on estime que 600 millions de personnes sont exposées au risque de cette infection. Le cycle de vie du parasite est complexe et il requière, un hôte définitif, l’homme et un hôte intermédiaire, un mollusque d’eau douce appelé Biomphalaria glabrata. C’est chez le mollusque où le parasite se multiplie de forme massive de là l’importance du mollusque dans la transmission du parasite à l’homme. Lors de l’infection le mollusque met en place une réponse cellulaire et humorale très marquées pouvant dans certains cas tuer le parasite. Malgré l’importance du mollusque, les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces réponses sont largement inconnus et donc l’étude de l’immunité du mollusque est une priorité en recherche médicale. Nous avons identifié deux orthologues de la cytokine de mammifère MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor ) BgMIF1 et BgMIF2. En utilisant des approches biochimiques et moléculaires en combinaison avec la technique de RNAi in vitro et in vivo nous avons démontré le rôle de BgMIF 1 et BgMIF2 comme régulateurs centrales de l’immunité innée du mollusque. En particulaire BgMIF1 régule l’activation des hémocytes et la réponse d’encapsulation lors de l’infection. D’un autre côté BgMIF2 régule dans la réponse antibactérienne. Nos résultats montrent que chez B. glabrata il y une régulation fine de la réponse immune innée et une capacité pour répondre de façon différente lors d’un challenge immunitaire. De plus une régulation par une cytokine de type vertébré dans un invertébré n’avait jusqu’à présent jamais été décrite. Nos travaux établissent les bases pour mieux comprendre les relations hôte-parasite dans une maladie comme la schistosomiase, et aussi constituent une avancée importante du point de vue de l’évolution de l’immunité innée en général.l / We have identified and characterized a Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) family member in the Lophotrochozoan invertebrate, Biomphalaria glabrata, the snail intermediate host of the human blood fluke Schistosoma mansoni. In mammals, MIF is a widely expressed pleiotropic cytokine with potent pro-inflammatory properties that controls cell functions such as gene expression, proliferation or apoptosis. Here we show that the MIF protein from B. glabrata (BgMIF) is expressed in circulating immune defense cells (hemocytes) of the snail as well as in the B. glabrata embryonic (Bge) cell line that has hemocyte-like features. Recombinant BgMIF (rBgMIF) induced cell proliferation and inhibited NO-dependent p53-mediated apoptosis in Bge cells. Moreover, knock-down of BgMIF expression in Bge cells interfered with the in vitro encapsulation of S. mansoni sporocysts. Finally, the in vivo knock-down of BgMIF prevented the changes in circulating hemocyte populations that occur in response to an infection by S. mansoni miracidia. These results provide the first functional evidence that a MIF ortholog is involved in an invertebrate immune response towards a parasitic infection and highlight the importance of cytokines in invertebrate-parasite interactions.

Cette thèse porte sur le métabolisme du parasite Schistosoma mansoni. Au cours de son cycle de vie, S. mansoni subit des changements drastiques de l'environnement qui comprennent les étapes de libre-vie dans l'eau et l’endoparasitisme en invertébrés hôtes (à savoir les escargots) et en vertébrés hôtes (à savoir les mammifères). En conséquence, ce parasite montre une plasticité métabolique étonnante caractérisée par d’importants changements métaboliques d'une étape à une autre. L'un des plus intéressants changements est le passage de la phosphorylation oxydative à la glycolyse aérobie qui se produit lorsque l’étape libre-vie, c’est-à-dire le stade cercaires, infecte l'hôte mammifère. Ce changement est dépendant du glucose de l’hôte et est totalement réversible lorsque la concentration en glucose est faible. Ici, nous étudions en détail l'évolution des transporteurs de glucose de S. mansoni, ainsi que le rôle potentiel des enzymes de modification des histones (à savoir les sirtuines) dans la régulation du changement métabolique. La thèse est organisée en trois chapitres. Le chapitre I est une introduction générale au genre Schistosoma, à sa taxonomie et à ses membres les plus importants, à leur épidémiologie et aux stratégies de contrôle actuelles. Nous présentons en outre nos connaissances actuelles sur le mécanisme épigénétique de ces parasites, ainsi que sur la famille des protéines sirtuines. Dans le chapitre II, nous présentons les résultats de la thèse et ce chapitre est séparé en deux parties: (i) l'évolution et les propriétés moléculaires des transporteurs de glucose dans S. mansoni, (ii) et le rôle de la Sirtuine 1 dans la régulation du métabolisme mitochondrial des schistosomules, le stade mammifère de S. mansoni. Nous avons constaté que les transporteurs de glucose de S. mansoni, SGTP1, SGTP2, SGTP3 et SGTP4 suivaient différentes voies évolutives. Nos résultats suggèrent que les transporteurs de glucose de classe I de S. mansoni (SGTP2 et SGTP3) ont perdu leur capacité de transport du glucose et que cette fonction a évolué indépendamment dans les transporteurs de glucose spécifiques des Plathelminthes (SGTP1 et SGTP4). En ce qui concerne le rôle des sirtuines dans la régulation du métabolisme du glucose dans S. mansoni, nous avons constaté qu’à des concentrations élevées de glucose, les Sirtuines 1 de S. mansoni (SmSirt1) stimulent l'activité mitochondriale. Des inhibiteurs de Sirtuines 1 ainsi qu’un knockdown/qu’une inactivation du gène de SmSirt1 par ARN interférence réduisent l'activité mitochondriale des schistosomules. En outre, SmSirt1 est un répresseur de la pyruvate déshydrogénase kinase 1 (PDK1), un régulateur majeur de l'activité mitochondriale. Cependant, SmSirt1 ne semble pas réprimer les transporteurs de glucose de S. mansoni. Ceci est en accord avec notre analyse de l’évolution des transporteurs du glucose, car chez les mammifères, Sirt1 régule l'expression des transporteurs de glucose de classe I et nos résultats ont montré que les transporteurs de glucose de classe I ne transportent pas de glucose chez S. mansoni. Enfin, dans le chapitre III, nous faisons une discussion générale sur les principales conclusions de la thèse. / This thesis focuses on the metabolism of the parasite Schistosoma mansoni. During its life cycle, S. mansoni experiences drastic environmental changes that include: free-living stages in water and endoparasitism in invertebrate (i.e. snails) and vertebrate (i.e. mammals) hosts. In consequence, this parasite shows an amazing metabolic plasticity characterized by drastic metabolic switches from one stage to another. One of the more interesting is the switch from oxidative phosphorylation to aerobic glycolysis that occurs when the free-living stage, cercariae, infects the mammalian host. This switch is dependent on host glucose and is totally reversible when glucose concentration is low. Here, we study in details the evolution of the glucose transporters of S. mansoni as well as the potential role of histone modifying enzymes (i.e. sirtuins) in the regulation of the metabolic switch. The thesis is organized of three chapters. Chapter I is a general introduction to genus schistosoma, its taxonomy and more prominent members, their epidemiology and current control strategies. We further introduce our current knowledge on the epigenetic machinery of these parasites as well as the sirtuin protein family. In Chapter II we present the results of the thesis and this chapter is separated in two parts: (i) the evolution and molecular properties of glucose transporters in S. mansoni, (ii) and the role of Sirtuin 1 in the regulation of the mitochondrial metabolism of schistosomula, the mammalian stage of S. mansoni. We found that the glucose transporters from S. mansoni, SGTP1, SGTP2, SGTP3 and SGTP4 followed different evolutionary paths. Our results suggested that S. mansoni class I glucose transporters (SGTP2 and SGTP3) lost their capacity to transport glucose and that this function evolved independently in the Platyhelminthes-specific glucose transporters (SGTP1 and SGTP4). Regarding the role of sirtuins in the regulation of glucose metabolism in S. mansoni, we found that at high concentrations of glucose, S. mansoni sirtuin 1 (SmSirt1) stimulate mitochondrial activity. Sirtuin 1 Inhibitors as well as SmSirt1 gene knockdown, by RNA interference, reduce the mitochondrial activity of schistosomula. In addition, SmSirt1 is a repressor of pyruvate dehydrogenase kinase 1 (PDK1), a major regulator of mitochondrial activity. However, SmSirt1 did not appear to repress the S. mansoni glucose transporters. This is in agreement with our analysis of glucose transporter evolution because in mammals, Sirt1 regulates the expression of class I glucose transporters and our results showed that class I glucose transporters in S. mansoni do not transport glucose. Finally, in Chapter III we make a general discussion of the main findings of the thesis.

Esquistossomose é uma das doenças parasitárias com maior incidência mundial. Schistosoma mansoni, a única espécie encontrada no Brasil, tem um ciclo de vida complexo que inclui seis estágios de desenvolvimento distintos e dois hospedeiros, sendo um deles o homem. Nosso grupo identificou um gene que codifica um receptor que possui homologia com o receptor de TNF-&#945; humano em S. mansoni (SmTNFR) e descrevemos o efeito in vitro da citocina humana TNF-&#945; sobre a expressão gênica em larga escala no parasita. A via de sinalização através da qual o TNF-&#945; atua sobre o parasita permanece desconhecida. Em humanos, o TNF-&#945;, ao se ligar à isoforma do receptor que é mais semelhante ao SmTNFR, inicia uma cascata de fosforilação que conduz à ativação de diversas proteínas quinases que levam à ativação de fatores de transcrição. A nossa hipótese é a de que esta citocina humana atuaria no parasita de forma semelhante, resultando na alteração da expressão gênica do parasita observada em nosso trabalho anterior. No presente trabalho tivemos como objetivo verificar se há aumento de proteínas fosforiladas após o tratamento in vitro de vermes com o TNF-&#945; humano, e identificá-las, elucidando a via de sinalização induzida por esta citocina em S. mansoni. A fim de identificar as proteínas que são significativamente diferencialmente fosforiladas após exposição de S. mansoni à citocina humana, vermes machos adultos foram incubados em cultura por 15 min com TNF-&#945; (20 ng / ml), ou somente com o veículo, em controles, seguido da extração de proteínas totais. Utilizamos a abordagem fosfoproteômica por meio da realização de eletroforese bidimensional, seguida de coloração com corante específico para fosfoproteínas Pro-Q Diamond (Invitrogen). Para identificar quais proteínas tiveram fosforilação alterada pelo tratamento, fizemos uma análise quantitativa dos spots (volume dos spots) nas imagens dos géis corados com Pro-Q, utilizando o software 2D Platinum (GE). Em seguida a coloração de proteína total dos géis foi realizada utilizando Coomassie Blue Coloidal, para localização de todos os spots de proteínas de cada gel. Cortamos dos géis os spots de proteínas que apresentaram mudanças estatisticamente significativas na fosforilação (n = 3 réplicas; p <0,05, teste-t), com base na comparação de seus volumes relativos nas imagens dos géis das amostras tratadas comparadas com as controles, e em seguida as proteínas das amostras foram identificadas por espectrometria de massa. Analisamos três réplicas biológicas e observamos 45 spots que tiveram fosforilação significativamente alterada, sendo que 42 deles apresentaram fosforilação aumentada e 3 apresentaram fosforilação diminuída após o tratamento com a citocina. Entre os spots identificados por espectrometria de massa, verificou-se que proteínas relacionadas a processos metabólicos, sinalização celular, citoesqueleto e contração muscular estavam entre as que sofreram aumentos de fosforilação com o tratamento com TNF-&#945; humano. Embora a abordagem experimental adotada para este estudo não tenha sido sensível o suficiente para concluir qual via canônica de transdução de sinal é ativada por TNF-&#945; humano em S. mansoni, este estudo confirmou o aumento da fosforilação de proteínas-alvo induzido por TNF-&#945; humano, abrindo novos caminhos para uma investigação mais aprofundada que caracterize o papel das proteínas identificadas como alteradas por essa via de sinalização, e permita entender melhor a importância do TNF-&#945; humano na biologia do S. mansoni e na interação parasita-hospedeiro. / Schistosomiasis remains one of the parasitic diseases with the highest incidence worldwide. Schistosoma mansoni, the only species found in Brazil, has a complex life cycle which includes six life stages and two hosts, one of them being humans. Our group has identified a gene that encodes a TNF-alpha receptor-like in S. mansoni (SmTNFR) and described the in vitro effect of human TNF-alpha cytokine on large-scale gene expression of the parasite. The signaling pathways by which TNF-alpha acts upon the parasite remain unknown. In humans, when TNF-alpha binds to the receptor isoform that is most similar to SmTNFR it initiates a phosphorylation cascade that activates a signaling pathway leading to the activation of transcription factors. Our hypothesis is that this cytokine could act in the parasite through a phosphorylation cascade that activates transcription factors resulting in the change of gene expression observed in our previous work. The aim of this work was to verify if there were proteins that showed increased phosphorylation upon the in vitro treatment of worms with human TNF-alpha, identifying them, to try and elucidate the signaling pathway by which the cytokine acts in S. mansoni. In order to identify which proteins are significantly differentially phosphorylated upon exposure of S. mansoni to the human cytokine, we incubated male adult worms for 15 min in culture with human TNF-alpha (20 ng / ml), or with vehicle only, in controls, and we extracted total proteins from the parasites. We used the phosphoproteomics approach of bidimensional gel electrophoresis followed by phospho-specific staining of gels using Pro-Q Diamond dye (Invitrogen). To identify which proteins were phosphorylated or had their phosphorylation changed due to the treatment, we quantified the spots (determined the spots volumes) from Pro-Q stained gels using Image Master 2D Platinum software (GE). A total protein staining of the gels was performed using Coomassie Brilliant Blue (CBB) in order to localize all protein spots in the gel. We excised from CBB stained gels the protein spots that showed statistically significant changes in phosphorylation (n= 3 replicates; p-value<0.05, t-test), based on the relative volumes of their spot images with respect to the total volume of spots in the gel, with samples from treated compared to control parasites, and subsequently the proteins in these samples were identified by mass spectrometry. We have analyzed three biological replicates and observed 45 spots that were differentially phosphorylated; 42 of them had their phosphorylation increased and 3 had their phosphorylation decreased upon a 15-min-treatment of male adult worms with the cytokine. Among the spots identified by mass spectrometry, we found proteins related to metabolic process, cell signaling, and cytoskeleton and muscle contraction. Although the experimental approach adopted for this study was not sensitive enough to conclude which canonical signal transduction pathway is activated by human TNF-alpha in S. mansoni, this kind of study confirmed the increase in phosphorylation of target proteins induced by human TNF-alpha, opening new paths for further investigation in order to characterize the role of the proteins identified as altered by this specific signaling, which will lead to a better understanding of the importance of this cytokine in the biology of S. mansoni and in host-parasite interaction.

Neste trabalho caracterizou-se a família das nucleotídeo pirofosfatases/ fosfodiesterases do parasita S. mansoni visando avaliá-los como antígenos vacinais. O parasita possui quatro proteínas desta família (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c e SmNPP-6), sendo que duas delas possuem maior expressão gênica nos estágios que infectam o homem. Dos anticorpos produzidos, apenas o anti-SmNPP-5a apresentou especificidade para a proteína nativa e utilizando-os demonstrou-se que a SmNPP-5a é uma glicoproteína associada às membranas do tegumento dos vermes adultos. Também se verificou que esses anticorpos inibiram parcialmente a atividade da enzima em parasitas vivos. Assim avaliamos a SmNPP-5a recombinante como antígeno vacinal juntamente com uma apirase (SmATPDase) e com a fosfatase alcalina (SmAP), outras duas nucleotidases presentes no tegumento de parasitas adultos. A SmNPP-5 e a SmNTDPase apresentaram menor imunogenicidade que a SmAP. Porém só verificamos a redução da carga parasitária em animais imunizados com a SmAP e tratados com doses subcurativas de praziquantel. / In this work the family of nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (NPP) from S. mansoni was characterized in order to evaluate them as vaccine antigens. The parasite has four proteins of this family (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c and SmNPP-6), whereas two of them present higher gene expression in stages that infect humans. Only anti-SmNPP-5a anitbodies showed specificity for the native protein. We use them to characterize SmNPP-5a as a glycoprotein associated with tegument membranes from adult worms. It was also found that these antibodies were able to partially inhibit the activity of the enzyme in live parasites. Thus we evaluated SmNPP-5a as recombinant vaccine antigen together with an apyrase (SmATPDase) and alkaline phosphatase (SmAP), two other nucleotidases involved in nucleotide metabolism and present in the tegument of adult parasites. SmNTDPase and SmNPP-5 were less immunogenic than SmAP. However, we only verified the reduction of parasite burden in mice immunized with SmAP, when the animals also received a subcurative treatment with praziquantel.

O BCG é um bacilo atenuado de Mycobacterium bovis atualmente investigado na expressão de antígenos heterólogos. Genes oriundos de vírus, bactérias e parasitas são clonados em vetores de expressão micobacterianos e a partir deles, são geradas cepas de BCG recombinante, rBCG. Duas cepas micobacterianas, BCG e M. smegmatis, demonstraram a expressão do antígeno SmStoLP-2 e animais imunizados com este BCG não demonstra diferença na proteção contra a infecção por cercárias, apesar da resposta imune diferenciada. A otimização do códon de SmTSP-2 e SmVAL-5 permitiu sua expressão em M. smegmatis recombinante, mas não em BCG. M. smegmatis transformado com uma biblioteca de plasmídeos contendo o promotor L5p mutagenizado à montante de egfp demonstra acentuada diferença na fluorescência. 3 destes plasmídeos definidos como \'\'forte\'\' e \'\'fraco\'\', com base em sua capacidade de produzir GFP foram utilizados para expressar em BCG o antígeno Sm29 em maior e menor nível. / BCG is an attenuated bacillus derived from Mycobacterium bovis currently being investigated to express foreign antigens. Genes from viruses, bacteria and parasites are cloned to mycobacterial vectors and with them, recombinant BCG strains are created. Recombinant BCG and M. smegmatis strains where capable to express SmStoLP-2 and mice immunized with these rBCGs do not show better protection against infection with cercariae, although the distinct immune response observed. The use of codon optimization made possible the expression of SmTSP-2 and SmVAL-5 in M. smegmatis but not BCG. M. smegmatis transformed with a library of plasmids containing the L5p upstream egfp gene show a wide range in fluorescence. 3 of these plasmids strong and weak defined as their ability to produce GFP were used to express in BCG the antigen Sm29 at different levels by each promoter.

Anteriormente, foi identificada a atividade esquistossomicida da piplartina, um alcalóide-amida isolado em nossos estudos de bioprospecção em plantas da família Piperaceae. Neste trabalho, foi analisada a estrutura e as propriedades de uma série de análogos da piplartina para avaliar a relação estrutura-atividade. A atividade de análogos sintéticos da piplartina foi avaliada in vitro em vermes adultos de S. mansoni. Primeiro, os análogos foram testados a 50 e 100 &mu;g/mL. Os compostos ativos foram selecionados para a determinação dos valores de IC50. Ao todo, 36 análogos com modificações em três regiões da piplartina foram avaliados. Todas as modificações tiveram uma influência negativa na atividade biológica; no entanto, uma seletividade específica entre os gêneros foi observada. Seis análogos tiveram os valores de IC50 determinados, variando entre 72,33 a 216,86 &mu;M. As diferenças na atividade esquistossomicida entre a piplartina e seus análogos podem ser atribuídas a alterações na forma, equilíbrio hidrofílico-lipofílico e distribuição de carga eletrostática. / Previously, the schistosomicidal activity of piplartine, an alkaloid-amide isolated in our bioprospection studies with plants from Piperaceae species, was identified. In this work, we analyzed the structure and properties of a series of piplartine derivatives to propose a structure-activity relationship model. In vitro activity was evaluated in S. mansoni adult worms exposed in vitro to piplartine synthetic analogs. First, analogs were screened at 50 and 100 &mu;g/mL. Active compounds were selected to the determination of IC50 values. A total of 36 synthetic piplartine analogs with modifications in three regions of the piplartine molecule were evaluated. All the modifications had a negative influence in the biological activity; nevertheless, a gender specific selectivity was observed. Of all the analogs, 6 had the IC50 values determined, ranging from 72.33 a 216.86 &mu;M. Differences in the schistosomicidal activity between piplartine and its analogs could be attributed to changes in shape, hydrophilic-lipophilic equilibrium and electrostatic charge distribution.

Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). / This work shows purification of an apyrase from the tegument membrane of S. mansoni adult worms that exhibited an ADP/ATP hydrolysis ratio near 2. MALDI-TOF analyses showed that helicase and carboxylesterase were present in the sample, however in the literature there is no ADPase activity described for either enzyme. Western blot analyses showed that the purified apyrase ha no epitopes common to members of the CD39 apyrase family. On the other hand, a CD39-like apyrase remained in the insoluble fraction that was not used in the purification procedures. This work studied the construction of cDNA libraries with Hybrid Consensus-degenerate Oligonucleotide Primers (40bp) and low stringency RT-PCR. Introduction of touch-down PCR in the standard ORESTES technique improved the number of non-redundant sequences per library twofold. Association of touch-down with hybrid consensus-degenerated oligonucleotide primers increased this number to 300 sequences per library. The modifications resulted in a 10-fold decrease in the amount of work required for libraries construction and high-throughput sequencing (Fietto et al., 2000; addendum to patent application #196,716 - Ludwig Institute for Cancer Research). The best amplification profiles were obtained in RT-PCR reactions with low salt and a slow temperature ramp. Libraries made with shorter hybrid primers (25bp) showed more redundant sequences, reflecting a higher specificity for few templates. These shorter primers were used in combination with tegument mRNA to clone a gene fragment homologous to CD39 of mouse. This sequence was used in RACE-PCR reactions (rapid amplification of cDNA ends) to clone a 2.9 Kb cDNA corresponding to most of the predicted coding sequence of the Schistosoma gene.

No description available.

This study aimed to evaluate laboratory aspects (total IgE and eosinophils) in patients with Schistosoma mansoni and geohelminths in three localities in Rio Largo, Alagoas. Coprological survey was conducted in 3030 subjects and examined two slides for each stool sample by the Kato-Katz technique, blood count to determine the absolute and relative number of eosinophilic and quantification of serum total IgE using the automated chemiluminescence system (Automated Chemiluminescence Systems) ACS: 180 SIEMENS, adapted to the System II and MAGIC LITE using commercial kits in 547 individuals from three localities infested by the snail Biomphalaria glabrata, close to the river Mundaú and environmental similarities. The subjects were divided into four groups, G1 (co-infected with S. mansoni and geohelminths): n = 115 (21.02%) with mean age 21.18 ± 13.08 years, G2 (infected only by S. mansoni): n = 127 (23.22%) with mean age 29.59 ± 16.54 years; G3 (infected only by geohelminths): n = 149 (27.24%) with mean age 23.99 ± 15.52 years and G4 (negative for S. mansoni and geohelminths, the control group): n = 156 (28.52%) with mean age 25.44 ± 14.60 years. The parasitic load of S. mansoni was quantified and classified according to intensity of infection by the number of eggs per gram of feces detected. The study was approved by the Ethics Committee of the Federal University of Alagoas and implemented in accordance with the resolution MS-CNS 196/96. For processing and data analysis used the software SPSS 11.5. In all analysis was considered the 5% level of significance. The descriptive statistical analysis of qualitative and quantitative variables were performed by the distribution of relative frequencies and absolute position measurements (mean) and dispersion (standard deviation). He applied the normality test, t test, analysis of variance oneway (ANOVA), chi-square test, Fisher exact test, Pearson and Spearman correlation and linear regression. Of the 3030 samples, 1,209 (39.90%) were positive for any helminth, and 679 (22.41%) positive for A. lumbricoides, 546 (18.02%) for T. Trichiura, 220 (7.26%) to Ancyostomatidae and 242 (8.0%) for S. mansoni. There was no statistically significant difference (p>0.05) of individuals positive for S. mansoni separated by gender, age and locality, the mean parasite burden was moderate and 111 epg (minimum 24 and maximum of 4,080 epg). Eosinophils increased significantly with increasing parasite load (p<0.05). The absolute and relative eosinophilia appear to have greater significance in relation to group coinfected, because presented more frequently than the other groups. There were no significant differences (p>0.05) between worm burden of S. mansoni and total IgE levels, nor between serum total IgE and age. Thus the total IgE test was not considered relevant to the diagnosis of Schistosomiasis mansoni. There was no correlation between markers of total IgE and geohelminth infections, whether they are co-infected with S. mansoni. The results suggest the importance of including eosinophil counts in epidemiological surveys, the complementation of the findings and parasitological diagnosis of schistosomiasis, contributing to more precise investigations focused on the control of schistosomiasis in endemic areas. / Este estudo objetivou avaliar aspectos laboratoriais (IgE total e eosinófilos) em portadores de Schistosoma mansoni e geohelmintos em três localidades no município de Rio Largo, Alagoas. Foi realizado inquérito coprológico em 3.030 indivíduos e analisadas duas lâminas para cada amostra de fezes pela técnica de Kato-katz, hemograma para determinar o número absoluto e relativo de eosinífilos e quantificação sérica de IgE total utilizando o sistema de quimioluminescência automatizado (Automated Chemiluminescence Systems) ACS: 180 da SIEMENS, adaptado ao Sistema MAGIC LITE II e usando kits comerciais em 547 indivíduos de três localidades infestadas pelo molusco Biomphalaria glabrata, próximas ao rio Mundaú e com semelhanças ambientais. Os indivíduos foram divididos em 4 grupos, G1 (co-infectados por S. mansoni e geohelmintos): n=115 (21,02%) com média de idade 21,18 ± 13,08 anos; G2 (infectados apenas por S. mansoni): n=127 (23,22%) com média de idade 29,59 ± 16,54 anos; G3 (infectados exclusivamente por geohelmintos): n=149 (27,24%) com média de idade 23,99 ± 15,52 anos e G4 (negativos para S. mansoni e geohelmintos, considerado grupo controle): n=156 (28,52%) com média de idade 25,44 ± 14,60 anos. A carga parasitária do S. mansoni foi quantificada e classificada de acordo com a intensidade da infecção pelo número de ovos por grama de fezes detectados. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas e executado de acordo com a resolução CNS-MS 196/96. Para o processamento e análise dos dados utilizou-se o software SPSS 11.5. Em todas as análises foi considerado o nível de 5% de significância. A análise estatística descritiva das variáveis qualitativas e quantitativas foram realizadas através da distribuição de freqüências relativas e absolutas, medidas de posição (média aritmética) e dispersão (desvio padrão). Aplicou-se teste de normalidade, teste t, análise de variância one-way (ANOVA), teste do quiquadrado de Pearson, teste exato de Fisher, correlação de Pearson e Spearman e regressão linear simples. Das 3.030 amostras, 1.209 (39,90%) estavam positivas para algum helminto, sendo 679 (22,41%) positivas para A. lumbricoides , 546 (18,02%) para T. Trichiura, 220 (7,26%) para Ancyostomatidae e 242 (8,0%) para S. mansoni. Não houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) dos indivíduos positivos para S. mansoni separados por gênero, faixa etária e localidades, a média da carga parasitária foi moderada e de 111 opg (mínimo de 24 e máximo de 4.080 opg). Os eosinófilos aumentavam significantemente conforme o aumento da carga parasitária (p<0,05). As eosinofilias absoluta e relativa parecem ter maior significado em relação ao grupo de co-infectados, pois apresentram maior frequência em relação aos demais grupos. Não foram observadas diferenças significantes (p>0,05) entre carga parasitária de S. mansoni e níveis de IgE total, nem entre níveis séricos de IgE total e faixa etária. Desta forma o teste de IgE total não foi considerado relevante para o diagnóstico de esquistossomose mansoni. Não houve correlação entre os marcadores de IgE total e as infecções geohelmínticas, independente de estarem co-infectados por S. mansoni. Os resultados sugerem a importância da inclusão de contagem de eosinófilos em inquéritos epidemiológicos, na complementação dos achados parasitológicos e no diagnóstico da esquistossomose, contribuindo para investigações mais precisas voltadas para o controle da esquistossomose mansônica nas áreas endêmicas.