Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-20Bitstream added on 2014-06-13T20:11:39Z : No. of bitstreams: 1 vidale_mm_me_botfmvz.pdf: 990676 bytes, checksum: e0f154e998cb1f98077440b3e6f5df43 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os mastócitos são células provenientes do precursor CD34 da medula óssea, o mastocitoma (MCT) pertence ao grupo das neoplasias de células redondas e possui etiologia desconhecida, é a neoplasia cutânea mais comum em cães, sem predileção por raça, sexo ou idade. Seu comportamento biológico é bastante agressivo e de alta frequência. A graduação histopatológia proposta Patnaik et al., (1984), é o critério mais utilizado para a graduação histopatológica da neoplasia sendo o grau 1 uma neoplasia bem diferenciada, o grau 2 moderadamente diferenciada e o grau 3 pouco diferenciada ou anaplásica. O presente trabalho teve como objetivos a avaliação do ínidice proliferativo e apoptotico dos MCT em lâmina de Microarranjo de tecido (TMA) utilizando a técnica de imunoistoquiímica e TUNEL. Para tal utilizou-se 166 casos de MCT compondo um arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray (TMA) com 190 amostras, sendo avaliado o padrão de marcação da proteína Kit, a proliferação celular com o anticorpo primário Ki67 e apoptose com o anticorpo primário caspase-3 clivada e pela técnica da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick end Labeling Assey (TUNEL). Quando os casos foram avaliados quanto à imunoexpressão de c-KIT, os tumores (únicos e múltiplos) com expressão citoplasmática da proteína KIT tiveram uma taxa proliferativa maior e uma menor taxa apoptótica quando comparados aos com expressão membranosa. Os MCTs grau 3 tiveram um maior índice proliferativo (imunoexpressão de Ki67) quando comparados aos tumores de graus 1 e 2. Não foi observada correlação entre a imunomarcação do anticorpo primário caspase-3 clivada e a técnica de TUNEL, sendo que a técnica de TUNEL se mostrou mais eficaz na avaliação da apoptose que a imunomarcação para caspase-3 clivada / Mast cells are from precursor CD34 cells bone marrow, the mast cell tumor (MCT) belongs to the group of round cell malignancies and has unknown etiology, is the most common skin cancer in dogs without distinction of race, sex or age. Its biological behavior is very aggressive and high frequency. The histopathological grading proposal from Patnaik et al., (1984), is the most commonly used criterion for the histopathological grade of the tumor is a tumor grade 1 are well-differentiated, grade 2 are moderately differentiated and grade 3 are poorly differentiated or anaplastic. This study aimed to evaluate the proliferative and apoptotic index of MCT in blade tissue microarray (TMA) using the TUNEL technique and immunohistochemistry. To this end we used 166 cases of MCT composing an tissue microarray (TMA) with 190 samples, and evaluated the pattern of protein labeling kit, cell proliferation, with the primary antibody Ki67 and apoptosis with primary antibody and cleaved caspase-3 by the technique of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling Mediated Assey (TUNEL). When the cases were evaluated for immunoexpression of c-KIT, tumors (single and multiple) with cytoplasmic KIT protein expression had a higher proliferative rate and a lower apoptotic rate when compared to those with membranous expression. Grade 3 MCTs had a greater proliferative index (Ki67 immunostaining) when compared with tumor grades 1 and 2. No correlation was observed between the immunostaining of primary antibody caspase-3 cleavage and TUNEL technique, and TUNEL technique was more effective in assessing apoptosis that immunostaining for cleaved caspase-3

Orientador: Gervásio Henrique Bechara / Banca: Matias Pablo Juan Szabó / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Beatriz Rosseti Ferreira / Banca: Isabel Kinney Ferreira de Miranda Santos / Resumo: Este trabalho teve como objetivo avaliar a resposta cutânea e a correlação entre contagens de carrapatos e número de mastócitos em pele de bovinos artificialmente infestados. Para tanto, 148 animais F2 provenientes de animais F1 Holandês x Gir, foram infestados artificialmente com 1,0 x 104 larvas de B. microplus por animal e, após 21 dias, foi realizada contagem de carrapatos. Antes da infestação e 21 dias após, foram colhidos fragmentos da pele, os quais foram fixados, processados e corados com May-Grünwald & Giemsa e H.E. Os mastócitos cutâneos dos bovinos F0 (Gir puros), F1 e F2 foram contados em microscópio de luz com retículo ocular quadriculado e objetiva de 40x na derme superficial e profunda, além disso, foram feitas contagens globais de células no sítio de fixação. Os valores obtidos mostraram que a infestação artificial induziu aumento significativo no número de mastócitos na derme de bovinos F2, e que este aumento foi acompanhado por intensa infiltrado de eosinófilos. O exame histopatológico do sítio de fixação dos carrapatos mostrou alterações gerais semelhantes às observadas por outros autores em períodos mais curtos de fixação. A contagem diferencial de células mostrou que houve predomínio de eosinófilos, neutrófilos e mononucleares e que houve significativa correlação negativa entre mastócitos e basófilos e entre mastócitos e neutrófilos. Correlação significativa entre número de carrapatos e contagem de mastócitos só foi observada na derme superficial, após infestação artificial. Também houve correlação altamente significativa entre idade e número de mastócitos. As populações mastocitárias de animais Gir puros e mestiços F1 e F2 não mostraram diferença significativa. / Abstract: This work had as objective to evaluate the cutaneous response and the correlation between tick infestation and mast cells number in the skin of artificially infested bovines. For this purpose, 148 bovines F2 crossbred Holstein x Gir cattle, were artificially infested with 1,0 x 104 B. microplus larvae and, after 21 days, ticks attached were counted. Before the infestation (B.I.) and 21 days after (A.I.), biopsies of the skin were harvested, fixed, processed and stained with May-Grünwald & Giemsa and H.E. Dermal mast cells of F0 (pure Gir), F1 and F2 crossbred cattle were counted under light microscopy with square-lined ocular reticulum and 40x objective in the superficial and deep dermis. Diferencial inflammatory cells countings of the tick attachment site were also done. The data obtained showed that artificial infestation induced a significant increase in the mast cell number in the dermis of F2 cattle, and that this increase was followed by intense eosinophils infiltration. The histopatological evaluation of the tick feeding sites 21 days A.I. showed general alterations similar to that observed by other authors in shorter periods of tick feeding and, the diferencial cells counts showed a negative correlation between mast cells and basophils and between mast cells and neutrophils. Significant correlation between tick number and mast cells counts were observed in the upper dermis after artificial tick infestation. A correlation was also detected between age and mast cells numbers. No significant differences in the mast cell populations of pure Gir and F1 and F2 crossbred cattle were observed. / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / No presente estudo avaliou-se os efeitos da inoculaÃÃo do carcinosarcoma 256 de Walker, bem como o curso de seu desenvolvimento, sobre a reaÃÃo inflamatÃria sistÃmica. Ratos Wistar machos, pesando entre 180 a 220g, foram inoculados, por via intramuscular, com 106 cÃlulas tumorais na coxa direita. Os experimentos foram realizados apÃs o 4Â, 7Â e 10Â dias (4D, 7D e 10D) da inoculaÃÃo do carcinossarcoma 256 de Walker. O grupo controle nÃo foi inoculado as cÃlulas tumorais. Os ratos foram divididos em grupos experimentais com n = 6, nos quais foram avaliados os seguintes parÃmetros: edema de pata por carragenina (Cg; 300μg/pata direita) ou dextrana (Dxt; 500μg/pata direita), atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), migraÃÃo de neutrÃfilos para cavidade peritoneal induzidas por carragenina (Cg; 300μg/pata direita), permeabilidade vascular cutÃnea induzidas por bradicinina (2μg/sÃtio), histamina (30μg/sÃtio), serotonina (1μg/sÃtio), substÃncia P (250ng/sÃtio), capsaicina (50μg/sÃtio) ou composto 48/80 (1μg/sÃtio) e degranulaÃÃo mastocitÃria induzida por composto 48/80. A intensidade do edema foi avaliada na pata contralateral ao tumor 1, 2, 3 e 4 hs (Cg) e 30â ,1 2, 3, ,4 hs (Dxt) por pletismometria. A migraÃÃo de neutrÃfilos foi induzida pela administraÃÃo de Cg (300μg/pata) na pata contralateral ao tumor ou na cavidade peritoneal. ApÃs 4 horas, os ratos foram sacrificados e as peles das patas foram retiradas para medir indiretamente a infiltraÃÃo de neutrÃfilos, pela tÃcnica da dosagem da atividade da MPO, e a migraÃÃo de neutrÃfilos para cavidade peritoneal foi avaliada atravÃs da contagem total e diferencial de leucÃcitos. Em relaÃÃo a permeabilidade vascular cutÃnea, imediatamente apÃs as injeÃÃes intradÃrmicas dos estÃmulos (bradicinina, histamina, serotonina, substÃncia P, capsaicina ou composto 48/80), foi administrado azul de Evans (0,1mL/100g do animal), na veia do plexo peniano. ApÃs 30 min, os ratos foram sacrificados e a pele do dorso retirada, para avaliar o extravasamento do azul de Evans por espectrometria. A degranulaÃÃo de mastÃcitos do mesentÃrio foi avaliada apÃs coloraÃÃo com azul de toluidina, sendo contados os mastÃcitos degranulados num total de 100 cÃlulas. Os animais com tumor apresentaram uma inibiÃÃo significativa do edema de pata, com efeito mÃximo observado nos 7 Â e 10 Â dias, tanto com a Cg, quanto com Dxt, quando comparados com o controle sem tumor. Em nenhum dos dias estudados, foram observadas diferenÃas na atividade da MPO na pata e nem na avaliaÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade pÃritoneal induzidas por Cg. ApÃs 4 e 7 dias da inoculaÃÃo do tumor, o animais apresentaram uma significativa diminuiÃÃo na permeabilidade vascular cutÃnea induzida por bradicinina, serotonina, e composto 48/80. No entanto, o aumento da permeabilidade vascular induzida por histamina, substÃncia P e capsaicina nÃo foi alterada nesses dois dias. No 10 Â dia, observou-se uma diminuiÃÃo da permeabilidade vascular induzida por todos os estÃmulos quando comparado com o grupo sem tumor. A degranulaÃÃo mastÃcitÃria foi inibida em animais com tumor nos 4Â, 7Â e 10Â dias em comparaÃÃo com o grupo controle. Tais dados sugerem que o microambiente do tumor de Walker diminui o curso da resposta inflamatÃria atravÃs da inibiÃÃo da degranulaÃÃo dos mastocitos / Our objective was to evaluate the effect of the 256 Walker carcinossarcoma inoculation, as well as the time course of tumoral development, upon the acute inflammatory response in rats. Wistar rats, 180-220g, received intramuscular 106 tumor cells injections. At the end of 4, 7 or 10 days, wistar rats were separated into 4 groups, with 6 animals per group. The control group, were not inoculated with tumoral cells. Several parameters were evaluated: paw edema induced by carrageenan (Cg; 300μg/hind) or dextran (Dxt, 500μg/hind paw), myeloperoxidase activity (MPO), neutrophil migration to peritoneal cavity induced by carrageenan, cutaneous vascular permeability induced by bradykinin (2μg/site), serotonin (1μg/site), histamine (30μg/site), substance P (250ng/site), capsaicin (50μg/site) or 48/80 compound (1 μg/site) and mast cell degranulation induced by 48/80 compound. Paw edema was evaluated in the contra lateral hind paw of the tumor and measured at 0, 1, 2, 3 and 4h for Cg, and 0, 30â, 1, 2, 3 and 4h.for Dxt by plethysmometry. Neutrophil migration was induced by Cg injection in the contralateral hind paw or in the peritoneal cavity. After 4h, rats were sacrificed and the skin of the hind paw was harvested to measure neutrophil infiltration by MPO assay. Neutrophil migration induced by Cg was also evaluated in the peritoneal cavity, with the total e differential leucocytes counted. In order to measure cutaneous vascular permeability, immediately after intradermic stimulus injections (bradykinin, histamine, serotonin, substance P, capsaicin or 48/80 compound) Evans Blue dye was administrated (0,1mL/100g of per animal) by endovenous route. After 30 min rats were sacrificed and the skin was harvested to evaluate Evans Blue extravasations by spectrofotometry. Mast cells degranulation was evaluated in the in mesentery incubated with 48/80 compound and colored with toluidine blue. Our results shows that, in animals inoculated with the carcinossarcoma, there was a significant inhibition in the Cg and Dxt- induced paw edema, with maximal effect at the 7th and 10th days. There were no differences in MPO activity and neither in the peritoneal neutrophil infiltration induced by Cg in rats inoculated with the carcinossarcoma when compares to normal animals. After 4 and 7 days of the tumor inoculation, we observed a significant inhibition of the vascular permeability induced only by bradikinin, serotonin and 48/80 compound.. In the 10th day after the carcinossarcoma inoculation, there was a significant inhibition of the vascular permeability induced by all inflammatory stimulus tested, when we compared animals not inoculated. Mast cell degranulation was decreased in the 4th, 7th and 10th days after carcinossarcoma inoculation. These results suggested that the tumor microenvironment decreased the acute inflammatory response probably due to a inhibition of the mast cell degranulation.

A galectina-1 (Gal-1) pertence à uma família de proteínas ligantes de ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, tais como a modulação da resposta inflamatória. Os mastócitos desempenham um importante papel em eventos inflamatórios e alérgicos. Entretanto, o impacto da Gal-1 na biologia dos mastócitos é pouco conhecido. Neste trabalho, foram analisados os aspectos morfológicos e funcionais de células RBL-2H3 tratadas com Gal-1. Além disso, foi investigado o efeito da ausência de Gal-1 endógena sobre a desgranulação in vivo. A avaliação da interação de Gal-1Texas-Red com células RBL-2H3, por citometria de fluxo, indicou que esta lectina ligou-se às superfícies dessas células de modo dose-dependente. A Gal-1 foi capaz de promover a exposição de fosfatidilserina (FS, um marcador de apoptose) nas superfícies dessas células por meio de reconhecimento de carboidratos. Entretanto, as células RBL-2H3 tratadas com Gal-1 não apresentaram apoptose e/ou necrose, como indicado pelos resultados obtidos dos ensaios de TUNEL, DNA laddering, hipodiploidia, citotoxicidade e microscopia eletrônica de transmissão. As análises de microscopia eletrônica de varredura e Differential Interference Contrast (DIC) de células tratadas com Gal-1 (10 µM-1 hora) indicaram que essa lectina induziu ondulações apenas nas porções apicais das membranas plasmáticas de células RBL-2H3. Além disso, a Gal-1 modulou negativamente a formação de ondulações nas superfícies de células RBL-2H3 estimuladas via Fc?RI. A distribuição de componentes de Lipid Rafts relacionados ao processo de ativação celular via Fc?RI (Lyn, LAT e GD1b) foi modificada pelo tratamento dessas células com Gal-1 (10 µM), por 1 hora. As células RBL-2H3 tratadas com Gal-1(10µM-45 minutos) apresentaram níveis de liberação da enzima ?-hexosaminidase (?-HEX) semelhantes ao do controle negativo, sugerindo que essa lectina não promove a desgranulação de células RBL-2H3. Por outro lado, a Gal-1 inibiu a desgranulação de células RBL-2H3 ativadas via Fc?RI. O valor máximo de inibição (80%) da liberação de ?-HEX foi atingido quando as células foram tratadas com 10 µM de Gal-1 por 24 horas. Este efeito inibitório não foi detectado quando as células foram tratadas com Gal-1 na presença de ?-D-Tiogalactopiranosídeo (TDG), quando estimuladas com ionóforo de cálcio ou tratadas com a forma monomérica da Gal-1. Os dados de microscopia confocal mostraram que os grânulos secretórios de células submetidas ao procedimento de estimulação via Fc?RI, foram fracamente marcados com o anticorpo AD1 e apresentaram uma distribuição citoplasmática difusa. Entretanto, células tratadas com Gal-1 (10 µM - 24 horas) e estimuladas via Fc?RI foram intensamente marcadas com anticorpo AD1 e mostraram um padrão perinuclear, como detectado em células não estimuladas. De modo interessante, camundongos deficientes para o gene de Gal-1 quando submetidos ao ensaio de anafilaxia passiva cutânea (PCA) apresentaram uma reação significativamente maior que os animais selvagens. Com base no conjunto de resultados obtidos sugere-se que a Gal-1 pode participar da homeostase de mastóctios sem provocar apoptose e/ou necrose dessas células. Além disso, a Gal-1 pode modular o processo de exocitose de mastócitos por meio das propriedades lectínica e de dimerização dessa proteína e esse efeito modulatório parece estar associado a eventos de sinalização celular anteriores ao influxo de cálcio. / Galectin-1 (Gal-1) belongs to a family of ?-galactoside-binding proteins and is involved in several biological processes, including modulation of the inflammatory response. Mast cells play a critical role in allergic and inflammatory events, however, little is known about the impact of Gal-1 on mast cell biology. In this study, we examined the role of Gal-1 in mast cell function using RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia) and galectin-1 deficient mice. We report that Gal-1 recognized glycoconjugates on mast cells and this interaction promotes phosphatidylserine (PS) exposure in the absence of cell death or apoptosis. Morphological analysis of Gal-1-treated RBL-2H3 cells, by scanning electron microscopy and Differential Interference Contrast (DIC), indicated that Gal-1 induces modifications on cell membranes and modulation of ruffles formation on cell surface of stimulated RBL-2H3 cells. Interesting, Gal-1 treatment of RBL-2H3 cells, with or without stimulation, promotes alterations in the distribution of the components (Lyn, LAT and GD1b) of Lipid Rafts. Gal-1 did not promote degranulation on RBL-2H3 with or without prior sensitization with IgE. However, Gal-1 treatment inhibits the cell degranulation mediated by via Fc?RI and this effect was time and dose-dependent. Also, this inhibition was related to carbohydrate recognition domain and required Gal-1 dimerization. Importantly, confocal microscopy analysis showed that Gal-1 was distributed in cytoplasm close to secretory granules stained AD-1 antibody on RBL-2H3 with or without prior stimulation with Fc?RI. In addition, we found significantly increased passive cutaneous anaphylaxis reaction in Gal-1 deficient mice. The results demonstrated that Gal-1 may participate of homeostasis and exocytose in mast cells suggesting that Gal-1 can have important role in allergic and inflammatory process.

As doenças alérgicas alcançaram proporções mundialmente epidêmicas. A ativação de receptores para IgE, Fc RI, em mastócitos, é o mecanismo chave para a iniciação e propagação das respostas patofisiológicas dos processos alérgicos. Após a interação destas células com um alérgeno, há a ativação de uma cascata de eventos de sinalização, a qual resulta na secreção de mediadores alérgicos pré-formados, através de um processo regulado de exocitose, além da síntese e secreção de mediadores lipídicos e citocinas. Desta forma, a inibição da responsividade dos mastócitos, quando ativados por um alérgeno, representa uma via importante para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos com indicação antialérgica. Neste sentido, este trabalho buscou, num primeiro momento, contribuir com a compreensão dos papéis desempenhados por um glicerofosfolipídeo de membrana, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2), em eventos de sinalização em mastócitos, mediados por IgE. Este trabalho permitiu destacar a importância de PtdIns(4,5)P2 como um regulador chave das respostas de Ca2+ e das alterações de morfologia de mastócitos estimulados por um alérgeno. Foi observado ainda que níveis reduzidos de PtdIns(4,5)P2 determinaram a inibição do processo de endocitose de receptores Fc RI ativados, um evento crucial para a redução da transdução de sinais. Estes resultados não somente trazem um ganho de conhecimento acerca dos detalhes que orquestram os eventos de sinalização em mastócitos estimulados por um alérgeno, como também apontam que a regulação dos níveis de PtdIns(4,5)P2 pode certamente ser apontada como alvo para o desenvolvimento de novas moléculas inibidoras da ativação mastocitária. A segunda etapa deste trabalho teve como objetivo avaliar o potencial inibitório de alguns compostos de origem natural e sintética sobre a degranulação de mastócitos, evento em que mediadores alérgicos, como a histamina, são secretados, em resposta ao estímulo celular. Inicialmente, avaliou-se o efeito inibitório de um conjunto de arilcumarinas sintéticas, estruturalmente relacionadas, sobre a degranulação. Um número significativo de moléculas foram ativas e, dentre elas, algumas substituições junto à estrutura do anel 3-fenilcumarínico, como as hidroxilações das posições 6, 2\'e 5\', puderam ser identificadas como importantes para o potencial bioativo. Finalmente, o trabalho apresentou uma molécula de origem natural, como um potente inibidor da degranulação de mastócitos e da secreção de citocinas. Trata-se da piridovericina, um metabólito secundário, isolado do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana. Dessa forma, tanto as cumarinas, como a piridovericina podem ser apontadas como compostos de partida de grande potencial para o desenvolvimento de novos fármacos anti-alérgicos. / Allergic diseases have approached epidemic proportions worldwide. The activation of IgE receptors, Fc RI, from mast cells, is the key event for the initiation and propagation of pathophysiological responses involved in the allergic processes. The interaction between mast cells and allergens triggers a signaling cascade, which results in secretion of pre-formed allergic mediators, through regulated exocytosis, in addition to the synthesis and secretion of lipid mediators and cytokines. In this way, the inhibition of mast cell responsiveness, upon allergen stimulation, represents an important pathway for the development of new antiallergic drug candidates. Thus, the present work tried, firstly, to gain better insight of the roles played by phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PtdIns(4,5)P2) during IgE-mediated mast cell signaling. This work highlighted the importance of PtdIns(4,5)P2 as a key regulator of Ca2+ responses and mast cell morphological alteration, when activated by an allergen. It was observed that reduced levels of PtdIns(4,5)P2 determined the inhibition of activated Fc RI endocytosis, a crucial event for signal transduction termination. Those results not only improve the actual knowledge in mast cell signaling but also point out the regulation of PtsIns(4,5)P2 levels as a target to be pursued during the development of new inhibitors of mast cell activation. The second part of this work aimed to evaluate the capacity of both synthetic and natural compounds to inhibit mast cell degranulation, characterized by the release of granule-contained allergic mediators, such as histamine, upon cell stimulation. Initially, the inhibitory effect of a set of structurally related synthetic arylcoumarins was evaluated. A significant number of molecules were active, and a few substitutions within such molecules could be pointed as important for the biological activity, such as the hydroxylation of carbons 6, 2\' e 5\' of the 3-phenylcoumarin ring. Lastly, this work presents a natural compound as a potent inhibitor of mast cell degranulation and cytokine secretion. The refered compound is pyridovericin, a secondary metabolite isolated from the entomophatogenic fungus Beauveria bassiana. Therefore, both the coumarin derivatives and pyridovericin can be regarded as lead compounds for the development of new anti-allergic drugs.

Os problemas decorrentes de doenças alérgicas é tema em destaque atualmente devido ao aumento de pessoas que vêm apresentando sintomas e sofrendo as consequências de mudanças aceleradas nos costumes da nossa sociedade. Apesar das diversas terapias oferecidas, pacientes alérgicos ainda sofrem com efeitos colaterais decorrentes do uso de medicamentos anti-alérgicos. Assim, a busca por novas alternativas que possam amenizar os sintomas alérgicos torna-se relevante. As substâncias naturais tem sido alvo de intensa investigação devido às propriedades farmacológicas no tratamento de diversas doenças incluindo as alérgicas. Neste contexto, este trabalho foi focado no extrato Vimang e seu componente majoritário, a mangiferina (Mgf), que tem apresentado atividades biológicas diversas. Sabendo-se que a atividade biológica de um extrato pode ser potencializada pelo sinergismo entre seus componentes, foi avaliado o efeito sinérgico de substâncias isoladas do Vimang, tais como mangiferina, quercetina, catequina, ácido gálico e benzóico. Esses componentes foram combinados e as misturas avaliadas quanto à capacidade em inibir a desgranulação mastocitária. O Vimang, a quercetina e mangiferina inibem a desgranulação mastócitária enquanto catequina, ácido gálico e benzóico não são ativos; e porisso, não foram incluídos na determinação do isobolograma de aditividade, adotado no estudo de sinergismo. O isobolograma de aditividade mostra sinergismo para as concentrações de mangiferina iguais a 5, 10, 20 e 40 ?M e quercetina iguais a 0,2, 1 e 1,6 ?M; e mostra antagonismo para mangiferina 80 ?M e quercetina 0,4 e 0,8 ?M. Tais resultados sugerem que altas concentrações de mangiferina atrapalham a interação sinérgica entre estas substâncias e altas concentrações de quercetina exercem um efeito contrário, ou seja, favorecem o sinergismo entre quercetina e mangiferina. A baixa solubilidade de flavonóides em meio fisiológico levou ao estudo da interação da Mgf com lipossomos de Dimiristoil-L-?-Fosfatidilcolina (DMPC) para aplicação nos ensaios biológicos. A Interação da Mgf com lipossomos de DMPC, bem como a estabilidade lipossomal, foram avaliadas quanto aos efeitos de pH, força iônica e presença de colesterol. O pH influencia a eficiência de incorporação (EI) da Mgf que é maior em pHs ácidos. Em soluções de pH ácido ou fisiológico há aumento de tamanho do lipossomo na presença de Mgf, o que reforça a hipótese de interação desta com a bicamada lipídica. O aumento da força iônica, na ausência de Mgf, diminui a estabilidade do lipossomo. Na ausência de sal, a Mgf favorece a formação de agregados e diminui a estabilidade dos lipossomos e na presença de sal, a Mgf previne a agregação e estabiliza os agregados lipossomais. A EI da Mgf nos lipossomos de DMPC preparados pelo método da injeção etanólica, em pH fisiológico, foram ao redor de 13%. A tentativa de otimizar a EI foi realizada pela adição de colesterol em diferentes proporções lipídio:colesterol. Um aumento de 13% para 17% foi observado para a proporção DMPC:colesterol (9:1). A Mgf livre inibe a desgranulação dos mastócitos de forma concentração-dependente; mas a presença de lipossomos, preparados pelo método da injeção etanólica não altera significativamente esse perfil. A EI da mangiferina em lipossomos de DMPC:colesterol (9:1), preparados pelo método do filme lipídico, foi igual a 45%. Os resultados de potencial antialérgico, para este caso, mostraram que os lipossomos de DMPC favorecem o potencial antialérgico da Mgf em concentrações acima de 25 ?M. Esses resultados abrem perspectivas na busca de sistemas lipossomais mais estáveis e que possam ser aplicados em ensaios biológicos in vitro e in vivo. / The problems due to allergic diseases are currently a highlighted topic due to the increase of people who are showing symptoms and suffering the consequences of rapid changes in the habits of our society. Despite various therapies offered, allergic patients still suffer side effects from the use of anti-allergic drugs. Thus, the search for new alternatives that can alleviate the allergic symptoms becomes relevant. Natural substances have been the subject of intense research due to the pharmacological properties in the treatment of several diseases, including allergic ones. In this context, this work was focused on Vimang extract and its major component, the mangiferin (Mgf), which has shown several biological activities. Given that the biological activity of an extract can be enhanced by the synergism between its components, the synergistic effect of compounds isolated from Vimang such as mangiferin, quercetin, catechin, gallic acid and benzoic acid was evaluated. These components were combined and the mixtures tested for their ability to inhibit mast cell degranulation. The Vimang, quercetin and mangiferin inhibit mast cell degranulation while catechin, gallic acid and benzoic acid are not active and for that reason they were not included in the determination of the isobologram adopted in the synergism study. The isobologram of additivity shows synergism for the concentration of mangiferin equal to 5, 10, 20 and 40 ?M and quercetin equal 0.2, 1 and 1.6 ?M, and shows antagonism for mangiferin 80 ?M and quercetin 0.4 and 0.8 ?M. The low solubility of flavonoids in physiological medium led to the study of the interaction of Mgf with liposomes of L-?-dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) for application in biological assays. The interaction of Mgf with DMPC liposomes as well as the liposomal stability was evaluated considering the effects of pH, ionic strength and cholesterol presence. The pH influences the incorporation efficiency (IE) of mangiferin, which is higher in acidic pHs. In solutions of acidic or physiological pH, the liposome size increases in the presence of Mgf, which reinforces the hypothesis of interaction of Mgf with the lipid bilayer. The increased ionic strength in the absence of Mgf decreases the stability of the liposome. In the absence of salt, Mgf favors the formation of aggregates and decreases the stability of the liposomes. When in presence of salt, Mgf prevents the aggregation and stabilizes the liposomal aggregates. The IE of mangiferin in DMPC prepared by the ethanol injection method, at physiological pH, were around 13%. The attempt to optimize the IE was performed by the addition of cholesterol in different proportions lipid:cholesterol. An increase from 13% to 17% was observed for the proportion of DMPC:cholesterol (9:1). Free mangiferin inhibits mast cells degranulation in a dose-dependent manner, but the presence of liposomes prepared by the ethanol injection method does not significantly change this profile. The IE of mangiferin in liposomes of DMPC:cholesterol (9:1), prepared by the method of lipidic film was equal to 45%.The results of antiallergic potential in this case show that DMPC liposomes favor the mangiferin antiallergic potential at concentrations above 25 mM. These results open perspectives in the search for more stable liposomal systems and can be applied to biological assays in vitro and in vivo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Gout is characterized by the deposition of monosodium urate (MSU) crystals. Despite being one of the most painful forms of arthritis, gout and the mechanisms responsible for its acute attacks are poorly understood. In the present study, we found that MSU caused dose-related nociception (DE50=0.04 (0.01-0.11) mg/paw) and edema (DE50=0.08 (0.04-0.16) mg/paw) when injected into the hind paw of rats. Treatment with the selective TRPV1 receptor antagonist SB366791 largely inhibited nociceptive and edematogenic responses to MSU. Moreover, the desensitization of capsaicin-sensitive afferent fibers as well as the pretreatment with the tachykinin NK1 receptor antagonist RP 67580 also significantly reduced MSU-induced nociception and edema. Once MSU was found to induce mast cell stimulation, we investigated the participation of these cells on MSU effects. Prior degranulation of mast cells by repeat treatment with compound 48/80 decreased MSU-induced nociception and edema or histamine and serotonin levels in the injected tissue. Moreover, pretreatment with the mast cell membrane stabilizer cromolyn effectively inhibited nociceptive and edematogenic responses to MSU. MSU induced a release of histamine, serotonin and tryptase in the injected tissue, confirming mast cell degranulation Furthermore, the antagonism of histaminergic H1 and serotoninergic receptors decreased the edema, but not the nociception, of MSU. Finally, the inhibition of tryptase activity was capable of largely reducing either MSU-induced nociception or edema. Collectively, the present findings demonstrate that MSU produces a nociceptive and edematogenic response mediated by TRPV1 receptor activation and mast cell degranulation. / A gota é caracterizada pela deposição de cristais de urato monossódico (MSU) nas articulações. Apesar de ser um dos mais dolorosos tipos de artrite, os mecanismos responsáveis pela indução da dor durante os ataques agudos de gota são pouco entendidos. No presente estudo, objetivamos investigar o papel do receptor TRPV1 na nocicepção e edema induzidos por cristais de MSU em ratos. Assim, demonstramos que o MSU causa nocicepção (DE50=0.04 (0.01-0.11) mg/pata) e edema dependentes da dose (DE50=0.08 (0.04-0.16) mg/pata) quando injetado na pata dos ratos. O tratamento com o antagonista seletivo do receptor vanilóide TRPV1 SB 366791 inibiu significativamente as respostas nociceptiva e edematogênica causadas pelo MSU. De maneira semelhante, a dessensibilização de fibras aferentes sensíveis a capsaicina bem como o tratamento com o antagonista do receptor para taquicinina NK1 RP67580 também reduziram significativamente a nocicepção e o edema induzidos pelo MSU. Sabendo que estudos prévios demonstraram que MSU induz a estimulação de mastócitos, nós investigamos a participação destas células nos efeitos do MSU. A desgranulação prévia de mastócitos por tratamento repetido com o composto 48/80 reduziu a nocicepção e o edema induzidos pelo MSU assim como os níveis de histamina e serotonina no tecido injetado. Adicionalmente, o tratamento com o estabilizador de membrana de mastócitos cromolina, reduziu efetivamente as respostas nociceptivas e edematogênicas ao MSU. A administração de MSU induziu a liberação de histamina, serotonina e triptase no tecido injetado, confirmando a desgranulação mastocitária. Além disso, o antagonismo de receptores histaminérgicos H1 e serotoninérgicos, reduziram o edema, mas não a nocicepção causados pelo MSU. Finalmente, a inibição da atividade da triptase foi capaz de reduzir amplamente a nocicepção e o edema induzidos pelo MSU. Coletivamente, nossos resultados demonstram que o MSU produz uma resposta nociceptiva e edematogênica mediada pela ativação do receptor TRPV1 e pela desgranulação de mastócitos.

Mast cells are critical effectors of allergic disease that can be activated by numerous stimuli. We have examined mast cell control by the inflammatory cytokine, IL-33, as well as IgG. In the first study reported here, we found that the synthetic glucocorticoid, dexamethasone, potently and rapidly suppressed IL-33-induced cytokine production from murine bone marrow–derived and peritoneal mast cells, as well as human mast cells. Dexamethasone also antagonized IL-33-mediated enhancement of IgE-induced cytokine production and migration. Although dexamethasone had no effect on IL-33-induced phosphorylation of MAP kinases or NFκB p65 subunit, it antagonized AP-1 and NFκB-mediated transcriptional activity. Finally, intraperitoneal administration of dexamethasone completely abrogated IL-33-mediated peritoneal neutrophil recruitment and prevented plasma IL-6 elevation. These data demonstrate that steroid therapy may be an effective means of antagonizing the effects of IL-33 on mast cells in vitro and in vivo, acting partly by suppressing IL-33-induced NFκB and AP-1 activity. In the second study reported here, we found that Fcγ receptor crosslinkage activated the transcription factor Stat5B through a Fyn kinase-dependent pathway. We then showed that STAT5B is critical for IgG-induced cytokine production by mast cells but not macrophages. To expand these studies, we employed the K/BxN model of inflammatory arthritis, which has roles for mast cells and macrophages. In this model, Fyn or STAT5B deficiency only affected the arthritic flare that primarily depends on mast cell degranulation, without affecting the severity of the joint swelling. By contrast, Lyn kinase deficiency significantly exacerbated arthritis. These studies indicate a clinically relevant, lineage-restricted role for the Lyn/Fyn-STAT5 cascade. Collectively, our work demonstrates that mast cell activation by diverse stimuli can be suppressed by steroid intervention and selectively targeted by disrupting kinase-transcription factor pathways.

Mast cells (MCs) are long-lived immune cells, which were reported to play an important role in initiating innate and adaptive immune responses against various infections. MCs accumulate in high numbers in the stroma and at the invasion front of various human cancers, suggesting a possible contribution by MCs to tumour growth. Experimental studies using crosses of MC-deficient Kit-mutant mouse strains with mouse models of epithelial cancers have provided evidence for important MC tumour-promoting functions. However, the complex alterations of the immune system that characterize Kit-mutant mice in addition to their MC deficiency, limit the interpretation of these findings. Numerous key observations made in Kit mutant mice were not reproduced in novel, Kit-independent mouse models of MC deficiency. Thus, the impact of MCs on tumour biology remains unclear. The aim of this study is to clarify the contribution of MCs to the biology of Human papilloma virus (HPV)-induced skin cancer in a Kit-independent mouse model of MC deficiency. In K14-HPV16 transgenic mice, HPV oncogenes are constitutively expressed in the epidermis resulting in epidermal hyperplasia with 100% penetrance and squamous cell carcinoma in about 50% of the animals. A cross to a Kit-mutant line suggested that MCs are important tumour promoters in this model. We crossed K14-HPV16 mice to M5Cre R-DTA line, in which MCs are constitutively depleted with high efficiency and selectivity. Unexpectedly, the loss of MCs neither affected keratinocyte proliferation indices nor altered keratinocyte apoptosis at any stage of HPV-induced neoplasia. Furthermore, the loss of MCs did not result in any detectable changes in composition and gene expression of the inflammatory hematopoietic cell infiltrate in the tumour stroma. This shows that, contrary to current belief, MCs have no important function in orchestrating the tumour micro milieu. In keeping with this finding, MC deficiency resulted in no detectable difference in the incidence growth or grading of SSC in K14-HPV16 transgenic mice. Collectively, these results show that, despite their high density in HPV-induced neoplasia, MC have no role in cancerogenesis or neoplastic progression in the K14-HPV16 mouse model. Our findings also emphasize the importance of novel Kitindependent mouse models in the investigation of MC in vivo functions.

Human mast-cell chymase (EC 3.4.21.39) is a chymotrypsin-like serine protease that is stored in and released from mast-cell granules. This enzyme has been expressed in Pichia pastoris by homologous recombination of the cDNA coding for the mature active chymase into the Pichia genome. Cells producing the highest levels of recombinant human chymase were selected by activity screening and they were grown in a fermentor. Methanol induction resulted in the secretion of active chymase into the Pichia growth media and increasing levels of enzyme were detected in the media for 5 days. Active enzyme was purified from the culture media with a 22 % yield of activity by a simple two-step procedure involving hydrophobic-interaction chromatography followed by affinity chromatography on immobilized heparin. The major peak from the heparin column contained a single band of 30.6 kDa on SDS/PAGE. The purified recombinant human chymase was 96% active and the yield was 2.2 mg/l of growth media.