Introdução: O Carcinoma Urotelial de Bexiga (CUB) é o segundo tumor urológico mais prevalente no Brasil. Devido ao elevado custo médico no processo que envolve seu diagnóstico, tratamento e seguimento, o CUB é um dos tipos de tumores mais caros para os sistemas de saúde. Embora existam fatores prognósticos definidos, como o estadiamento patológico, a diferenciação histológica e a presença de invasão angiolinfática (IAL), os mesmos demonstram-se insuficientes para uma acurada definição de comportamento da doença. Com a evolução da pesquisa molecular um grande número de potenciais novos marcadores de agressividade tem surgido. As Metaloproteinases da matriz (MMP) sao proteínas teciduais, pertencentes à família das endoproteinases, que degradam vários componentes da matriz extracelular. A expressão de diversas MMPs, especialmente MMP-2 e MMP-9 (gelatinases), bem como seus ativadores e inibidores, tem sido estudada como potencial marcador de comportamento tumoral em várias neoplasias. Objetivos: Avaliarmos os níveis de expressão dos genes das gelatinases MMP-2 e MMP-9 no CUB, assim como proteínas envolvidas em suas vias de ativação e inibição (MMP-14, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, RECK e TGF-! ). Material e Método: Estudamos pela técnica de qRT-PCR a expressão dos 8 genes em amostras de CUB de 40 pacientes submetidos a RTUb, tendo como grupo controle amostras de urotélio sem câncer de 6 pacientes submetidos a prostatectomia aberta por HPB, bem como sua relação com marcadores prognósticos clássicos (estádio, grau e IAL). Resultados: Houve uma superexpressão de MMP-9 na maioria das amostras de CUB, bem como subexpressão de MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, IL-8, TGF-! e RECK. Comparando os níveis de expressão dos genes com o estádio patológico, houve uma superexpressão de MMP-9 nos tumores pT1-2, quando comparados com pTa (p=0,026), bem como maior expressão de IL-8 nos tumores pT1 e pT2 (p=0,015 e p=0,048, respectivamente). Embora estatisticamente nao significativa, houve uma superexpressão de MMP-14 nos tumores pT2, quando comparados aos demais (p=0,087). Com relação ao grau histológico, também identificamos superexpressão de MMP-9 nos tumores de alto grau, quando comparados aos de baixo grau (p=0,012), assim como maior expressão de IL-8 nos tumores de alto grau (p=0,003). Conclusão: Houve uma superexpressão de MMP-9 e uma subexpressão de MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, IL-8 e TGF-! no CUB, quando comparado com o grupo controle. Também identificamos uma superexpressão de MMP-9 e IL-8 em tumores pT1-2 quando comparados com pTa e de alto grau quando comparados com baixo grau. A subexpressão dos principais inibidores da MMP-9 (TIMP-1 e RECK) pode explicar sua superexpressão no CUB, assim como a superexpressão de IL-8 nos tumores invasivos e de alto grau pode agir como fator ativador da MMP-9 nestes mesmos tumores / Introduction: Bladder cancer (BC) is the second most common urological tumor in Brazil. Because its high cost on diagnosis, treatment and follow-up, BC is one of the most expensive malignancies for health care providers. Although we have well-known prognostic factors, like pathological stage, histologic grade and lymphovascular invasion, they are insufficient to figure more accurate tumor aggressiveness. Recent molecular biology helped us to discover a huge amount of potential markers. Matrix metalloproteinases (MMP) are tissue endopeptidases that degrade components of extracellular matrix. Expression of several MMP, specially MMP-2 and MMP-9 (gelatinases), and their activators and inhibitors, are investigated as potential behavior markers in many neoplasms. Objectives: The aim of this study was to evaluate expression levels of gelatinases MMP-2 and MMP-9 genes by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in BC, as well as other proteins evolved in the activation and inhibition pathways (MMP-14, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, RECK e TGF-b). Material and Method: Present study analyzed tissue expression of 8 genes in BC samples of transutethral resection of 40 patients by qRT-PCR, as well as their relation with current prognostic factors (stage, grade and LVI). The control group was composed of utothelial tissue from 6 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) treated surgically with retropubic prostatectomy. Results: In the tumor samples, MMP-9 presented an overexpression and MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, IL-8, and TGF-b were underexpressed in BC tissue compared to control. Comparing gene level expression to pathologic stage, there was MMP-9 overexpression in pT1-2 tumors compared to pTa (p=0.026), as wall as IL-8 overexpression in pT1 and pT2 tumors (p=0.015 e p=0.048, respectively). Although not statiscally significant, there was MMP-14 overexpression in pT2 tumors in comparison to pTa-1 (p=0.087). About grade, there was MMP-9 overexpression in high-grade tumors compared to low-grade (p=0.012), as well as IL-8 overexpression in high-grade tumors (p=0.003). There was not relation of any gene expression to LVI. Conclusions: We found overexpression of MMP-9 and underexpression of MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, TGF-b and IL-8 in BC compared with the control group. According to the prognostic factors we found increased levels of MMP-9 and IL-8 gene expression in pT1-2 compared to pTa tumors and high-grade compared to low-grade tumors. Underexpression of major MMP-9 inhibitors (TIMP-1 and RECK) could explain MMP-9 overexpression in BC, as well as IL-8 overexpression in high-grade and stage tumors could act as activation factor of MMP-9 in these tumors

Células-tronco adultas podem ser isoladas de vários tecidos, dentre eles a polpa dentária humana, tecido originado na papila dentária do dente em desenvolvimento. Estas linhagens multipotentes podem ser estudadas sob vários aspectos, como na elucidação da histogênese de tumores. O objetivo deste estudo foi inferir a histogênese do mixoma odontogênico, neoplasia odontogênica benigna, analisando a expressão de proteínas da matriz extracelular (MEC) e de metaloproteinases da matriz (MMPs) em células-tronco adultas de polpa dentária humana. Três linhagens diferentes de células-tronco originadas de polpas dentárias humanas IDPSCs (DL-1, DL-2 e DL4) foram utilizadas. As proteínas analisadas foram as mesmas expressas na neoplasia: vimentina, colágeno tipo I, fibronectina, tenascina, ácido hialurônico e MMPs (MMP-1, MMP-2 e MMP-9). Imunofluorescência e ensaios enzimáticos foram utilizados para analisar a presença de proteínas nas células cultivadas e no meio de cultura condicionado por estas células, respectivamente. Todas as linhagens celulares expressaram a vimentina e nenhuma expressou o ácido hialurônico. A linhagem celular DL-1 expressou todas as outras proteínas da matriz extracelular estudadas, enquanto que na linhagem DL-2 apenas não foi observada a expressão do colágeno tipo I. Fibronectina e tenascina não foram observados na linhagem DL-4. Todas as linhagens expressaram todas as MMPs, sendo que a produção de MMP-2 nas três linhagens foi significantemente maior que a de todas outras MMPs. Baseado nas condições deste estudo, é possível concluir que a expressão de proteínas da MEC e de MMPs em células-tronco de polpa dentária humana apresentaram perfil similar àquela apresentada no mixoma odontogênico, exceto pela ausência de marcação do ácido hialurônico em todas as linhagens. A ausência de secreção de ácido hialurônico pelas IDPSCs poderia indicar que o mixoma odontogênico deriva de uma célula mais diferenciada que as células-tronco. / Adult stem cells can be isolated from different tissues including the human dental pulp, a structure originated from the dental papillae. These cell lineages are of importance in a series of studies, as the analysis of tumors histogenesis. The aim of this study was to infer the histogenesis of odontogenic myxoma, a benign odontogenic neoplasia by analyzing the ECM and MMPs molecules expressed in human dental pulp stem cells. Three different lineages of immature dental pulp stem cells (IDPSCs) (DL-1, DL-2 and DL-4) were used. The proteins searched were those expressed by the tumoral cells: vimentin, type I collagen, fibronectin, tenascin and hialuronic acid (HA) and the matrix metalloproteinases (MMP-1, MMP-2 and MMP-9). Immunofluorecence and enzymatic assays were used for analyzing the presence of the proteins in the cells and in the culture media conditioned by the cells, respectively. All the lineages expressed vimentin; however none expressed HA. DL-1 lineage expressed all the other ECM proteins, and the expression of type I collagen was not observed in the DL-2 lineage. Fibronectin and tenascin were not observed in the DL-4 lineage. All the lineages expressed all the MMPs. The release of MMP-2 from all cell lineages was significantly higher than those of all other MMPs. Based on the conditions of this study its possible to conclude that the overall expression of MEC proteins and MMPs in the lineages of human dental pulp stem cells were similar to those found in the odontogenic myxoma, except for the absence of hyaluronic acid. The absence of HA secretion by the IDPSCs could indicate that the odontogenic myxoma tumoural cells derive from a cell more differentiated than the stem cells.

Orientador: José Eduardo Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:39:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_FlaviaMagazoni_D.pdf: 13094273 bytes, checksum: b37b538d1e8c37ba2a2ec5c8c99a5a30 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A migrânea é uma cefaleia primária comum e altamente incapacitante que atinge cerca de 10% da população mundial, especialmente as mulheres. Apesar dos esforços, a fisiopatologia da migrânea não está completamente elucidada. No entanto, acredita-se que as metaloproteinases da matriz (MMPs) estejam envolvidas no rompimento da barreira-hematoencefálica durante uma crise de migrânea. O objetivo do presente trabalho é avaliar se polimorfismos funcionais nos genes da MMP-2 (C-1306T e C-735T) e da MMP-9 (C-1562T, -90(CA)n e R(279)Q) e haplótipos estão associados com a migrânea e se eles podem modificar os níveis circulantes de MMPs na migrânea. Para avaliar o efeito de polimorfismos da MMP-9, foram estudadas 102 mulheres sem migrânea (grupo controle) e 187 mulheres com migrânea (141 com migrânea sem aura; MSA e 46 com migrânea com aura; MA). As genotipagens para os polimorfismos C-1562T, -90(CA)n e R(279)Q da MMP-9 foram realizadas por PCR-RFLP, PCR convencional seguida de eletroforese em gel de poliacrilamida e PCR em Tempo Real, utilizando-se o sistema Taqman® para discriminação de alelo, respectivamente. As concentrações plasmáticas de MMP-9 e TIMP-1 foram determinadas por ELISA. Os genótipos para os polimorfismos da MMP-2 foram determinados por PCR em Tempo Real, utilizando-se o sistema Taqman® para discriminação de alelo em 148 mulheres sem migrânea e em 204 mulheres com migrânea (153 MSA e 51 MA). As concentrações plasmáticas da MMP-2 e do TIMP-2 foram avaliadas, respectivamente, por zimografia e por ELISA. Os haplótipos foram inferidos utilizando o programa PHASE. Este estudo é o primeiro a mostrar que polimorfismos funcionais e haplótipos nos genes da MMP-2 e da MMP-9 podem afetar os níveis circulantes das MMPs em pacientes com migrânea. Enquanto o haplótipo H6 (CLQ) da MMP-9 foi associado aos maiores níveis plasmáticos de MMP-9 nas pacientes com migrânea (359,8±69,53ng/ml versus 195,8±9,70ng/ml para o CLR; 201,5±18,67ng/ml para o CHR e 200,2±17,02ng/ml para o CHQ), as maiores concentrações de MMP-2 foram encontradas nas pacientes com migrânea com aura com o genótipo CC para o polimorfismo C-735T (1,29±0,07U.A. versus 0,96±0,06U.A. para os genótipos CT ou TT) e com o haplótipo H1 (CC) (1,24±0,05U.A. versus 0,94±0,05U.A. para o haplótipo CT) no gene da MMP-2. Apesar de não investigarmos os mecanismos moleculares que explicam esses resultados, podemos sugerir que o aumento dos níveis das MMPs associados a genótipos e haplótipos específicos podem predispor essas pacientes a um aumento da permeabilidade vascular da barreira hematoencefálica, promovendo assim o desenvolvimento de um ambiente neuroinflamatório no sistema nervoso central, contribuindo para uma crise de migrânea / Abstract: Migraine is a common primary headache and highly disabling, affecting approximately 10% of the population worldwide, especially women. Despite the efforts, the pathophysiology of migraine is not completely understood. However, it is believed that the matrix metalloproteinases (MMPs) are involved in the disruption of blood-brain barrier (BBB) during migraine attacks. The aim of this study was to evaluate whether functional polymorphisms in MMP-2 (C-1306T and C-735T) and MMP-9 (C-1562T, -90(CA)n and R(279)Q) genes and haplotypes are associated with migraine and whether they modify circulating MMPs levels in migraine. To evaluate the effect of MMP-9 polymorphisms, we studied 102 healthy women (controls) and 187 women with migraine (141 migraine without aura; MWA, and 46 migraine with aura; MA). Genotypes for C-1562T, -90(CA)n e R(279)Q MMP-9 polymorphisms were determined by PCR-RFLP, by conventional PCR followed by electrophoresis in polyacrylamide gels and by real time-PCR using Taqman® allele discrimination assays, respectively. The plasma MMP-9 and TIMP-1 concentrations were measured by ELISA. Genotypes for MMP-2 polymorphisms were determined by real time-PCR using Taqman® allele discrimination assays in 148 healthy women without history of migraine and in 204 women with migraine (153 MWA and 51 MA). The plasma concentrations of MMP-2 and TIMP-2 were evaluated by gelatin zymography and ELISA, respectively. Haplotypes were inferred using the PHASE program. This is the first study to show that functional MMP-2 and MMP-9 polymorphisms and haplotypes can affect the circulating MMPs levels in patients with migraine. While the MMP-9 H6 (CLQ) haplotyple is associated with high MMP-9 concentrations in patients with migraine (359,8±69,53ng/ml versus 195,8±9,70ng/ml for CLR; 201,5±18,67ng/ml for CHR and 200,2±17,02ng/ml for CHQ) , the highest concentrations of MMP-2 were found in patients with migraine with aura carrying the CC genotype for C-735T polymorphism (1,29±0,07A.U. versus 0,96±0,06A.U. for CT or TT genotypes) and the H1 (CC) haplotype (1,24±0,05A.U. versus 0,94±0,05A.U. for CT haplotype) in the MMP-2 gene. Although we have not investigated the molecular mechanisms explaining these results, we can suggest that an increase of the MMPs levels associated with these genotypes and haplotypes may predispose these patients to increased vascular BBB permeability, thus promoting the development of an inflammatory environment in their central nervous systems, which contributes to migraine attacks / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_luiz_eduardo_rilling_nova_cruz.pdf: 941247 bytes, checksum: b51c3277dc5892c9cf7c0ddc659e85c4 (MD5) Previous issue date: 2010-06-01 / The objective of the present study was the immunohistochemical evaluation of the proportion of mononuclear cells and the expression of MMP-2 and 9 on chronic periodontitis between smokers and non-smokers. From the 127 patients examined 31(16 non-smokers and 15 smokers) fulfill the inclusion criteria were included in the study. These patients underwent surgical procedures and 31 biopsies were collected and divided in two parts, one for histological preparation and the other for zymography. Each sample was histologically processed and exposed to monoclonal antibodies for B cells (anti-CD20), memory T cells (anti-CD45RO) and macrophages or monocytes (anti-CD68) detection. The samples showed a similar pattern, with connective tissue rich in inflammatory cells. The histometric analysis showed that the total amount of mononuclear inflammatory cells labeled did not differ significantly between smokers and non-smokers (p> 0.05). Evaluating each cell type separately, significant differences were not detected between groups (p> 0.05). When stratifying the samples into regions (coronal, middle and apical third) to evaluate the presence of individual cell types in each region significant differences between the groups were not detected (p> 0.05). The zymography of the samples suggested that the expression of MMP-2 and 9 showed no statistically significant differences between the two groups (p> 0.05). Thus, within the limits of this study, we can conclude that sites with chronic periodontitis in smokers and non-smokers did not differ in the amount of mononuclear inflammatory cells and in the expression of MMPs 2 and 9. / O estudo teve como objetivo a avaliação imunoistoquímica da proporção de células mononucleares e da expressão zimográfica da MMP-2 e 9 na periodontite crônica em fumantes e não-fumantes. Foram examinados 127 pacientes dos quais 31 preencheram os critérios de inclusão e foram inseridos no estudo, sendo 16 não-fumantes e 15 fumantes. Estes pacientes foram operados e 31 biópsias foram coletadas de área interproximal de dentes com bolsa periodontal >5mm e divididas longitudinalmente em duas partes, uma para análise histológica e outra para zimografia. As amostras foram processadas histologicamente e expostas aos anticorpos monoclonais para células B (anti-CD20), células T de memória (anti-CD45RO) e monócitos ou macrófagos (anti-CD68). De maneira geral, as amostras apresentaram padrão semelhante, com um tecido conjuntivo subjacente ao epitélio oral rico em células inflamatórias. A análise histométrica demonstrou que a quantidade total de células inflamatórias mononucleares marcadas não diferiu entre fumantes e não-fumantes (p>0,05). Ao avaliar cada tipo celular separadamente, também não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p>0,05). Ao dividir as amostras em regiões (terço coronal, médio e apical) e avaliar a presença de cada tipo celular em cada uma das regiões também não foram detectadas diferenças estatísticas significantes entre os grupos (p>0,05). A avaliação das zimografias sugere que a expressão de MMP-2 e 9 não apresentaram diferenças estatisticamente significantes entre os dois grupos (p>0,05). Assim, dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que os sítios com periodontite crônica de fumantes e não-fumantes não diferem em relação à quantidade e localização de células inflamatórias mononucleares e na expressão de MMPs 2 e 9.

Introdução: O Carcinoma Urotelial de Bexiga (CUB) é o segundo tumor urológico mais prevalente no Brasil. Devido ao elevado custo médico no processo que envolve seu diagnóstico, tratamento e seguimento, o CUB é um dos tipos de tumores mais caros para os sistemas de saúde. Embora existam fatores prognósticos definidos, como o estadiamento patológico, a diferenciação histológica e a presença de invasão angiolinfática (IAL), os mesmos demonstram-se insuficientes para uma acurada definição de comportamento da doença. Com a evolução da pesquisa molecular um grande número de potenciais novos marcadores de agressividade tem surgido. As Metaloproteinases da matriz (MMP) sao proteínas teciduais, pertencentes à família das endoproteinases, que degradam vários componentes da matriz extracelular. A expressão de diversas MMPs, especialmente MMP-2 e MMP-9 (gelatinases), bem como seus ativadores e inibidores, tem sido estudada como potencial marcador de comportamento tumoral em várias neoplasias. Objetivos: Avaliarmos os níveis de expressão dos genes das gelatinases MMP-2 e MMP-9 no CUB, assim como proteínas envolvidas em suas vias de ativação e inibição (MMP-14, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, RECK e TGF-! ). Material e Método: Estudamos pela técnica de qRT-PCR a expressão dos 8 genes em amostras de CUB de 40 pacientes submetidos a RTUb, tendo como grupo controle amostras de urotélio sem câncer de 6 pacientes submetidos a prostatectomia aberta por HPB, bem como sua relação com marcadores prognósticos clássicos (estádio, grau e IAL). Resultados: Houve uma superexpressão de MMP-9 na maioria das amostras de CUB, bem como subexpressão de MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, IL-8, TGF-! e RECK. Comparando os níveis de expressão dos genes com o estádio patológico, houve uma superexpressão de MMP-9 nos tumores pT1-2, quando comparados com pTa (p=0,026), bem como maior expressão de IL-8 nos tumores pT1 e pT2 (p=0,015 e p=0,048, respectivamente). Embora estatisticamente nao significativa, houve uma superexpressão de MMP-14 nos tumores pT2, quando comparados aos demais (p=0,087). Com relação ao grau histológico, também identificamos superexpressão de MMP-9 nos tumores de alto grau, quando comparados aos de baixo grau (p=0,012), assim como maior expressão de IL-8 nos tumores de alto grau (p=0,003). Conclusão: Houve uma superexpressão de MMP-9 e uma subexpressão de MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, IL-8 e TGF-! no CUB, quando comparado com o grupo controle. Também identificamos uma superexpressão de MMP-9 e IL-8 em tumores pT1-2 quando comparados com pTa e de alto grau quando comparados com baixo grau. A subexpressão dos principais inibidores da MMP-9 (TIMP-1 e RECK) pode explicar sua superexpressão no CUB, assim como a superexpressão de IL-8 nos tumores invasivos e de alto grau pode agir como fator ativador da MMP-9 nestes mesmos tumores / Introduction: Bladder cancer (BC) is the second most common urological tumor in Brazil. Because its high cost on diagnosis, treatment and follow-up, BC is one of the most expensive malignancies for health care providers. Although we have well-known prognostic factors, like pathological stage, histologic grade and lymphovascular invasion, they are insufficient to figure more accurate tumor aggressiveness. Recent molecular biology helped us to discover a huge amount of potential markers. Matrix metalloproteinases (MMP) are tissue endopeptidases that degrade components of extracellular matrix. Expression of several MMP, specially MMP-2 and MMP-9 (gelatinases), and their activators and inhibitors, are investigated as potential behavior markers in many neoplasms. Objectives: The aim of this study was to evaluate expression levels of gelatinases MMP-2 and MMP-9 genes by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in BC, as well as other proteins evolved in the activation and inhibition pathways (MMP-14, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, RECK e TGF-b). Material and Method: Present study analyzed tissue expression of 8 genes in BC samples of transutethral resection of 40 patients by qRT-PCR, as well as their relation with current prognostic factors (stage, grade and LVI). The control group was composed of utothelial tissue from 6 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) treated surgically with retropubic prostatectomy. Results: In the tumor samples, MMP-9 presented an overexpression and MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, IL-8, and TGF-b were underexpressed in BC tissue compared to control. Comparing gene level expression to pathologic stage, there was MMP-9 overexpression in pT1-2 tumors compared to pTa (p=0.026), as wall as IL-8 overexpression in pT1 and pT2 tumors (p=0.015 e p=0.048, respectively). Although not statiscally significant, there was MMP-14 overexpression in pT2 tumors in comparison to pTa-1 (p=0.087). About grade, there was MMP-9 overexpression in high-grade tumors compared to low-grade (p=0.012), as well as IL-8 overexpression in high-grade tumors (p=0.003). There was not relation of any gene expression to LVI. Conclusions: We found overexpression of MMP-9 and underexpression of MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, TGF-b and IL-8 in BC compared with the control group. According to the prognostic factors we found increased levels of MMP-9 and IL-8 gene expression in pT1-2 compared to pTa tumors and high-grade compared to low-grade tumors. Underexpression of major MMP-9 inhibitors (TIMP-1 and RECK) could explain MMP-9 overexpression in BC, as well as IL-8 overexpression in high-grade and stage tumors could act as activation factor of MMP-9 in these tumors

[pt] A identificação algorítmica de matrizes de Jacobi a partir de variáveis espectrais é um tema tradicional de análise numérica. Uma nova representação, as coordenadas bidiagonais, naturalmente exigiu que fosse considerado um novo algoritmo. O algoritmo é apresentado e confrontado com as técnicas habituais. / [en] Algorithms relating Jacobi matrices and spectral variables are standard objects in numerical analysis. The recent discovery of bidiagonal coordinates led to the search of an appropriate algorithm for these new variables. The new algorithm is presented and compared with previous techniques.

A sinalização da matriz extracelular (MEC) é essencial para a determinação do destino e comportamento de células epiteliais da glândula mamária. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A via Hippo, uma cascata de sinalização que participa da regulação de diversos comportamentos celulares, incluindo o tamanho de órgãos, parece ser uma importante candidata a mediadora sinalização da MEC. Resultados preliminares do laboratório indicam que a arquitetura tecidual e a membrana basal, componente da MEC de epitélios e outros tecidos, influenciam a localização, concentração e atividade de YAP, uma proteína efetora da via Hippo, em células epiteliais mamárias. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas que interagem com Yap (ortólogo de YAP em camundongo) nas células epiteliais da glândula mamária em resposta à membrana basal. Foram utilizadas células EpH4, uma linhagem mamária não-tumoral murina, como modelo de diferenciação funcional e formação de ácinos em um ensaio de cultura tridimensional (3D). O tratamento de estruturas multicelulares 3D pré-formadas em placas nãoadesiva com uma matriz rica em laminina (lrECM) alterou a localização e o padrão subcelular de Yap, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e dos alvos de Yap, mas não alterou a expressão das proteínas da via em nível de proteína. O ensaio de co-imunoprecipitação (CoIP) seguida de análise por espectrometria de massas identificou um conjunto diferencial de proteínas que interagem com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 cultivadas na ausência ou na presença de lrECM em um modelo de ECM-overlay. Uma análise realizada junto à database KEGG Pathways revelou que os possíveis interagentes Yap nas células cultivadas não-tratadas com lrECM participam de processos relacionados à proteólise mediada por ubiquitina, enquanto nas células expostas à lrECM os possíveis interagentes estão associados a processos metabólicos e são especialmente proteínas-chave do metabolismo de lipídios. A busca na plataforma de redes de interação STRING não identificou trabalhos que destaquem a interação de Yap com estas proteínas. A plataforma Vizit indica a participação de Yap em processos relacionados à síntese e atividade de lipídios e hormônios, o que reforça as evidências de que está pode ser uma nova função de Yap ainda não explorada em detalhes. A fim de se obter resultados complementares à CoIP, padronizamos o ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) em células embrionárias de rim humano da linhagem 293FT. As proteínas isoladas por pulldown foram identificadas por espectrometria de massas e uma análise junto à database Gene Ontology indicou que os possíveis interagentes de Yap nestas células são em sua maioria proteínas relacionadas à via Hippo, o que reforça a robustez do ensaio. Nós pretendemos transpor este sistema para as células EpH4. A expectativa é que, em conjunto, estes resultados nos orientem em projetos futuros para compreender os mecanismos de sinalização da MEC na morfogênese e diferenciação da glândula mamária. / Extracellular matrix (ECM)-signaling is crucial for determination of epithelial cell fate and behavior in the mammary gland. However, little is known about the molecular mechanisms involved in these processes. The Hippo pathway, a signaling cascade involved in the regulation of several cellular processes, including organ size, seems to be an important candidate as a mediator of this signaling. Our preliminary results indicate that the tissue architecture and the basement membrane, an ECM component of epithelia and other tissues, influence the location, level and activity of YAP, an effector of the Hippo pathway. In this context, the goal of this work was to identify the proteins that interact with Yap (ortholog of YAP in mouse) in mammary epithelial cells in response to the basement membrane. We used EpH4 cells, a nontumoral murine mammary cell, in a functional differentiation and acini-forming in tridimensional (3D) culture assay. Treatment of 3D multicellular structures pre-formed on nonadhesive plates with a laminin-rich extracellular matrix (lrECM) altered the subcellular localization and pattern of Yap, as well as gene expression of Hippo pathway proteins and Yap targets, but did not altered the expression of the pathway members at the protein level. Coimmunoprecipitation (CoIP) followed by mass spectrometry analysis identified a differential set of proteins interacting with Yap in cytoplasmic fractions of EpH4 cells in the absence or presence of lrECM in an ECM-overlay culture model. An analysis performed with the KEGG Pathways database revealed that putative Yap interactors in non-treated cells participate in processes related to ubiquitin-mediated proteolysis, whereas in cells exposed to lrECM Yap interactors are associated to metabolic processes and are mainly key-proteins of metabolism of lipids and carbohydrates. A search in interaction networks platform STRING did not identify previous works that showing the interaction of Yap with these proteins. Vizit platform indicated the participation of Yap in processes related to the synthesis and activity of lipids and hormones, which reinforces the evidences that Yap can play a novel poorly explored role. To obtain complementary results to CoIP, we devised the proximity-dependent biotinylation identification (BioID) assay on embryonic renal cells of 293FT cell line. Pulldown-isolated proteins were identified by mass spectrometry and an analysis performed with Gene Ontology database revealed that putative Yap interactors are Hippo pathway-related proteins, which reinforces the robustness of the assay. We intend to transpose this system to the EpH4 cells. We expect that, together, these results will guide us in future projects to understand the signaling mechanisms of ECM in mammary gland morphogenesis and differentiation.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem seus efeitos terapêuticos predominantemente pela sua atividade parácrina. Como o secretoma desempenha um papel direto nas atividades biológicas das MSCs, a análise de seus componentes proteicos é um passo fundamental para identificar os principais responsáveis no controle e regulação dos muitos processos biológicos desenvolvidos por essas células. O secretoma de MSCs pode ser modificado e melhorado de forma in vitro para estimular efeitos celulares específicos desejados para aplicações terapêuticas, e uma maneira de modificá-lo é por meio de modificações nas condições de cultura. No presente estudo, objetivou-se descrever o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AD-MSCs) de gatos e cães submetidos a diferentes condições de cultivo, identificamos e comparamos os efeitos exercidos por diferentes modificações de cultivo. Para a produção de meio condicionado, as células foram descongeladas e cultivadas com meio DMEM/F12 com 20% de FBS, suplementado com antibióticos e antimicóticos em uma incubadora com umidade controlada a 37,5 °C, e 5% de CO2. Após atingir pelo menos 70% de confluência, as garrafas foram lavadas três vezes com solução salina balanceada Hanks (HBSS) e foram cultivadas em quatro condicionamentos distintos. O meio condicionado foi colhido após 4 dias, centrifugado por 10 min/300 g, filtrado em um filtro 0,22 μm e congelado a -80 °C. Foram realizadas a extração e concentração proteica de to... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is now known that mesenchymal stem cells (MSCs) exert their therapeutic effects predominantly through their paracrine activity. Since the secretome plays a direct role in the biological activities of MSCs, the analysis of their protein components is a fundamental step in identifying the main responsible for the control and regulation of the many biological processes developed by these cells. The MSCs secretome can be modified and improved in vitro to stimulate specific cellular effects desired for therapeutic applications, and one way of modifying it is through modifications in the culture conditions. In the present study, in addition to describing for the first time the secretome of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in feline species, we identified and compared the effects exerted by different culture modifications, such as the use of serum-free medium and hypoxia in the protein production by AD-MSCs in canines and felines. For the conditioned media production, the cells were thawed and cultured with DMEM/F12 medium with 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with antibiotics and antimycotics in controlled incubator ay 37.5 °C with 5% CO2. After reaching at least 70% confluency, the flasks were washed three times with Hanks balanced salt solution (HBSS) and were grown in four different conditions. Conditioned media were collected after 4 days, centrifuged for 10 min/300 g, filtered on a 0.22 μm filter and frozen at -80 °C. Protein extraction... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Existe uma relação entre o uso abrangente de inibidores da bomba de prótons (IBPs), como o omeprazol, e o aumento de risco cardiovascular. Essa relação está associada ao efeito dos IBPs de interferir na síntese e biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), um fator importante na homeostase vascular. Também foi evidenciado que o omeprazol causa disfunção endotelial junto a um desequilíbrio redox em aortas, mediado pela ativação da enzima xantina oxidoredutase (XOR), responsável pelo catabolismo das purinas e geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). As ERO decorrentes da atividade da XOR, podem aumentar a expressão e a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs), principalmente a MMP-2, que são promotoras de remodelamento tecidual. Assim, nosso objetivo foi analisar se o omeprazol causa remodelamento vascular em aorta de ratos, frente ao seu efeito de aumento do estresse oxidativo via XOR promovendo ativação de MMPs. Foram utilizados ratos wistar com peso entre 180-200 g (n=40), separados em 4 grupos de tratamento onde cada animal foi tratado com 0,5 mL de solução das drogas nas seguintes especificações: o grupo Controle (C) foi tratado com solução veículo tween 2% (vol./vol.) 1 vez ao dia por gavagem, o grupo Alopurinol (A) recebeu uma solução deste inibidor de XOR por gavagem (50 mg/kg/dia), o grupo Omeprazol (O) que recebeu uma solução de omeprazol diluída em tween 2% por via intraperitoneal (10 mg/kg/dia) e por fim, o grupo Omeprazol+Alopurinol (O+A) que recebeu as duas drogas concomitantemente. O protocolo experimental durou 4 semanas, durante as quais foram realizadas aferições da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda. Ao fim do tratamento, os animais foram submetidos à eutanásia, onde foi aferido o pH do lavado gástrico e foi coletada a aorta torácica para a análise de reatividade vascular, análise bioquímica de ERO, a análise morfométrica, e ensaio de atividade de MMPs. Não houve variação de pressão arterial em nenhum dos grupos. O tratamento com alopurinol não alterou nenhum dos parâmetros analisados em relação ao grupo controle neste estudo. O pH gástrico aumentou nos grupos tratados com omeprazol. Na reatividade vascular, observamos que o omeprazol diminuiu o efeito máximo da resposta vasodilatadora dos anéis de aorta à acetilcolina, mas que o tratamento associado ao alopurinol (O+A) preveniu essa diminuição. Em relação ao pD2, foi constatado que o tratamento com omeprazol resulta na diminuição da potência da acetilcolina em causar relaxamento vascular, e que a associação do tratamento com alopurinol, não foi capaz de prevenir essa diminuição. O grupo O também apresentou aumento de espécies reativas de oxigênio no leito vascular, observados no ensaio DHE e o tratamento com alopurinol preveniu este efeito. No ensaio de atividade gelatinolítica in situ observamos um aumento da atividade de MMPs no grupo O, e o tratamento com alopurinol também preveniu esse efeito. Na análise morfométrica observamos que o grupo O apresentou aumento dos parâmetros de remodelamento vascular, denotando um remodelamento hipertrófico, que foi prevenido pela associação com alopurinol. Com base nos resultados, é possível concluir que o tratamento com omeprazol causou remodelamento em aortas de ratos, e que esse efeito ocorreu paralelamente a outros prejuízos, como a diminuição da função vascular avaliada pela resposta à acetilcolina, aumento de espécies reativas de oxigênio e aumento de atividade de MMPs. Como todos esses efeitos resultantes do uso do omeprazol foram prevenidos pela associação do tratamento com alopurinol, é viável inferir que a XOR participe da via pela qual o omeprazol causa efeitos deletérios sobre a vasculatura / There is a relationship between the use of proton pump inhibitors (PPIs), such as omeprazole, and the increase of cardiovascular risk. This relation is associated with the effect of PPIs on nitric oxide synthesis and bioavailability, which is an important factor to vascular homeostasis. It also clear that omeprazole causes endothelial dysfunction by mechanisms involving xanthine oxidoreductase (XOR) mediated redox imbalance in aortas, which is responsible for purines catabolism, and generates reactive oxygen species (ROS). ROS derived from XOR activity, may increase matrix metalloproteinases expression and activity, mainly MMP-2 that are promoters of tissue remodeling. Thus, our aim was to analyze if omeprazole entails vascular remodeling in rat\'s aorta, with its effect of causing oxidative stress via XOR, promoting MMPs activation. Male rats weighing between 180-200g (n=40) were assigned to 4 groups with different treatments, where each animal was treated with 0.5 mL of drug solution, following the specification per group: Control group (C) was treated with the vehicle tween 2% (vol./vol.) 1 time a day by gavage; Allopurinol group (A) that received a solution of this XOR inhibitor by gavage (50mg/kg/day), Omeprazole group (O) which was treated by intraperitoneal route with a solution of omeprazole diluted at tween 2% (10 mg/kg/day) and at last, the Omeprazole+Allopurinol group (O+A), that received both drugs concomitantly. The experimental protocol lasted 4 weeks, during which, were performed systolic blood pressure measurements by tail cuff plethysmography. By the end of treatments, the animals were submitted to euthanasia, then the pH of the gastric washing was measured, and the thoracic aorta was collected to study vascular reactivity, biochemical analysis of ROS, morphometric analysis and MMPs activity assay. There was no blood pressure variation in any of the treatment groups. Treatment with allopurinol did not alter any of the parameters that were analyzed in the present study, in comparison to control group. Gastric washing pH increased in groups treated with omeprazole. In vascular reactivity, it was noticed that omeprazole decreased the maximum effect of the aortic ring\'s vasodilator response to acetylcholine, while the omeprazole treatment associated with allopurinol (O+A) prevented this decrease. Regarding to pD2, it was observed that omeprazole treatment results in decreased acetylcholine potency to cause vascular relaxation, and the association to allopurinol treatment was not capable of preventing this decrease. The O group also presented increased reactive oxygen species levels in the vascular bed, according to DHE assay, and the treatment with allopurinol prevented this effect. With respect to in situ gelatinolytic activity assay, we noticed an increase in MMPs activity in the O group, and the treatment with allopurinol prevented that. The morphometric analysis showed the O group with increased vascular remodeling parameters, denoting a hypertrophic remodeling, which was prevented by the association with allopurinol. Based on these results, is possible to conclude that the treatment with omeprazole caused aortic remodeling in rats, and combined to this effect, some other were observed, such as the vascular function impairment evaluated by the response to acetylcholine, the increase of ROS and increase in MMPs activity. As the effects of omeprazole treatment were prevented by the association of treatment with allopurinol, it is reasonable to infer that XOR participates of the pathway by which omeprazole exerts its deleterious effects on the vasculature

Orientador: Humberto Márcio Santos Milagre / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: Moacir Rossi Forin / Banca: João Henrique Ghilardi Lago / Resumo: Neste trabalho, a técnica Matrix Assisted Laser Dersoption/Ionization - Mass Spectrometry (MALDI-MS) foi utilizada em diferentes aplicações para a análise de peptídeos produzidos por cianobactérias. Esta técnica é extremamente rápida, possui alta resolução, requer pouquíssimo preparo de amostra e não permite que possíveis contaminantes presentes na amostra interfiram na análise. Por estes motivos MALDI- MS tem sido amplamente utilizada não somente na detecção de diferentes variantes de cianopeptídeos, mas também para quantificação das cianotoxinas. Este trabalho utilizou um sistema binário de matriz para a quantificação de microcistinas, utilizando as matrizes ácido α-ciano-4-hidroxicinamico e o ácido sinapínico (50/50, v/v) para obter uma mistura homogênea de matriz/analito, superando a baixa reprodutibilidade inerente da técnica MALDI-MS. Paralelamente, foi realizado o imageamento de espécies de cianobactérias de água doce cultivadas em meio sólido por MALDI-TOF-MS. Os resultados obtidos apresentaram novas perspectivas com relação à distribuição espacial dos peptídeos produzidos pelas espécies de cianobactérias estudadas, como a nodularina-R (m/z 825) e nodularina-[Har] (m/z 839) produzida pela espécie Nodularia harveyana PCC 7804, os peptídeos MC-LR (m/z 995) produzidos pela espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820, e o sideróforo anaquelina (m/z 761.3) produzidos pela espécie Anabaena Cylindrica PCC 7122. Além disto, amostras da floração de cianobactérias, que ocorre na ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work, the technique Matrix Assisted Laser Dersoption/Ionization - Mass Spectrometry (MALDI-MS) were used in different application for analysis of peptides produces by cyanobacteria. This technique is extremely fast, has high resolution, requires very little sample preparation and does not allow any contaminants present in the sample to interfere with the analysis. For these reasons, MALDI-MS has been widely used not only in the detection of different variants of cyanopeptides, but also for the quantification of cyanotoxins. This work utilized a matrix binary system for the quantification of microcystins, using the α-cyano-4-hydroxynamic matrix and sinapinic acid (50/20, v/v) to obtain a homogeneous matrix/analyte mixture, overcoming the low reproducibility inherent to the MALDI-MS technique. Simultaneously, we performed the imaging of freshwater cyanobacteria cultivated in solid medium by MALDI-TOF-MS. The results obtained presented new perspectives regarding the spatial distribution of the peptides produced by the studied cyanobacteria species, for exemple the nodularin-R (m/z 825), nodularin-[Har] (m/z 839) for the species Nodularia harveyana PCC 7804, MC-LR peptides (m/z 995) for the species Microcystis aeruginosa PCC 7820, and the siderophore anaquelin (m/z 761.3) for the species Anabaena cylindrica PCC 7122. In addition, samples of cianobacteria's bloom, present in Salto Grande Lagoon, located in Americana-SP, were analyzed and were identified some peptides, being four microcystins (MC-YR, MC-YR, MC-Hil and MC-RR), four aeruginosins (602, 298 A, 644 and 968), two cyanopeptolins (972 and 986), and one variant of microviridin(1707) ... (Full abstract, click on electronic access below). / Doutor