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Tesis por compendio / [ES] Resumen Como pez de gran valor económico, procedente de una de las líneas de teleósteos más antiguas, con un ciclo de vida misterioso, un potencial de acuicultura excepcional, y con importancia cultural y actividades de pesca en casi todos los países de Europa, la anguila europea posee un enorme valor socioeconómico. Este valor se suma a la desgraciada situación actual en peligro crítico de población natural de anguilas europeas. Como el ciclo de vida de la anguila aún no se ha conseguido cerrar en cautiverio, si la especie se extingue en la naturaleza, no seremos capaces de recuperarla. El cierre del ciclo de vida de la anguila europea ha sido, por lo tanto, el objetivo final de varios estudios. Sin embargo, a pesar de una investigación científica sustancial, desde la década de 1930, varios aspectos de la maduración de la anguila, como el mecanismo que bloquea la maduración de la anguila en la etapa prepúber en cautiverio, aún no se conocen bien. Por lo tanto, es necesario ampliar nuestro conocimiento sobre la reproducción de la anguila para inducir mejores hipótesis y lograr un progreso sustancial. Para profundizar en este campo, esta tesis se realizó con el objetivo específico de desarrollar métodos innovadores para la inducción de la maduración de la anguila y aumentar el conjunto de conocimientos sobre los procesos europeos de maduración de la anguila. Los procedimientos hormonales utilizados actualmente para la maduración sexual de la anguila artificial probablemente no induzcan el proceso natural de maduración. Por lo tanto, esta tesis ha evaluado el potencial de las hormonas recombinantes específicas de la anguila para inducir un proceso de maduración más natural. Este estudio específico mostró que la espermatogénesis completa y la espermiación se pueden inducir con gonadotropinas específicas de anguila recombinante; sin embargo, la calidad del gameto resultante es aún inferior a los resultados de los protocolos establecidos. Sin embargo, la utilización de hormonas recombinantes tiene un gran potencial para futuras implementaciones. Además, el experimento de gonadotropina recombinante ha generado nuevos detalles sobre el efecto de las gonadotropinas homólogas en el eje BPG de las anguilas europeas. Trabajos previos han llevado a la hipótesis de que un tratamiento térmico adecuado puede reducir o reemplazar parcialmente los tratamientos hormonales estándar para la maduración sexual de la anguila europea, o puede mejorar la calidad y / o cantidad de gametos. En esta tesis, se probó el efecto de varios regímenes térmicos en el eje BPG de machos de anguila europeos prepúberes, sin administración de hormonas. Los resultados muestran claramente que un tratamiento de agua de mar fría durante 2 semanas (10 ° C) afecta el eje BPG de los machos de anguila europeas. Los resultados específicos incluyeron un aumento en la sincronización de espermatogonias, niveles elevados de testosterona y 11-ketotestosterona en plasma, agrupamiento de muestras de transcriptomas del eje BPG del grupo tratado con agua de mar fría y posiblemente niveles aumentados de la proteína subunidad ß de la hormona luteinizante de la hipófisis. Los genes transcritos diferencialmente incluyeron varios genes, procesos y vías interesantes, que parecen estar involucrados en la maduración "natural" temprana de la anguila y que pueden ser biomarcadores adecuados para las distintas etapas de este proceso. Para un análisis adecuado de los datos transcriptómicos, se creó un transcriptoma de anguila europea de novo. Se demostró que este transcriptoma de novo posee una superior integridad al genoma de anguila europea disponible y, por lo tanto, es una herramienta útil para el análisis adicional de genes específicos. Un análisis de este transcriptoma reveló un gran número de pares de genes parálogos, que mostraron una baja divergencia entre secuencias sinónimas. Entre las hipótesis potenciales sobre e / [CA] Com a espècie de renom culinari que pertany a un dels llinatges teleostis més antics, amb un cicle vital misteriós, un potencial d'aqüicultura excepcional, i una tradició pesquera a gairebé tots els països d'Europa, l'anguila europea posseeix un enorme valor socioeconòmic. No obstant això, aquest valor només fa que augmentar la preocupació de la seva població, que actualment es troba catalogada com "en perill crític d'extinció". Atès que el cicle de vida de les anguiles encara no ha estat tancat en captivitat, l'espècie no serà salvable en el cas que s'extingeixi en estat natural, per la qual cosa tancar el cicle de vida d'aquesta espècie ha estat l'objectiu final de diversos grups d'investigació durant els últims anys.. No obstant això, i malgrat la investigació científica de qualitat duta a terme des de la dècada de 1930, encara hi han diversos aspectes de la maduració de les anguiles -com el mecanisme que bloqueja la maduració sexual de l'anguila a l'etapa pre-puberal en captivitat- que son poc coneguts en l'actualitat. Per tal d'ampliar els coneixements sobre la reproducció de les anguiles i aconseguir un progrés substancial, aquesta tesi es va dur a terme amb l'objectiu específic de desenvolupar mètodes innovadors per a la inducció de la maduració de l'anguila europea, a més de afegir-hi el coneixement en els processos de maduració bàsics d'aquesta espècie. Els procediments hormonals utilitzats actualment per a la maduració artificial de l'anguila europea no acaben d'induir el procés de maduració natural tal i com probablement es dóna a la natura. Doncs, en primer lloc, aquesta tesi va avaluar el potencial d'hormones recombinants específiques d'anguila europea per induir un procés de maduració molt més natural. Aquest estudi específic va mostrar que mitjançant estes gonadotropines específiques d'anguila europea és possible induir l'espermatogènesi i l'espermiació completes. Tot i que els resultats van mostrar que la qualitat dels gamets va ser inferior als resultats que generen els protocols establerts fins ara amb un altre tipus d'hormones (generalment d'origen humà), la utilització d'hormones recombinants específiques es presenta amb un gran potencial per a la seva implementació futura en la inducció de la maduració sexual de l'anguila europea, ja que l'estudi va generar noves idees sobre l'efecte de les gonadotropines l'eix BPG de l'anguila europea. En segon lloc, i treballant amb la hipòtesi que un tractament tèrmic adequat pot reduir o substituir parcialment els tractaments hormonals estàndards per a la maduració sexual de l'anguila europea, en aquesta tesi es va provar l'efecte de diversos règims tèrmics (sense administració d'hormones) en l'eix BPG dels mascles europeus pre-puberals amb l'objectiu de millorar la qualitat i / o quantitat dels gamets. Els resultats mostraren clarament que un tractament d'aigua de mar de 2 setmanes a baixa temperatura (10 °C) va afectar l'eix BPG dels mascles europeus d'anguila. Resultats més específics van mostrar un augment de la sincronització de les espermatogonies, elevats nivells plasmàtics de testosterona i 11-ketotestosterona, una agrupació de mostres de transcriptoma de l'eix BPG del grup tractat amb aigua de mar freda i, possiblement, un augment dels nivells de la proteïna de la subunitat ß de la hormona luteinitzant de la hipofisi. Els gens transcrits diferencials van al·ludir a diversos gens, processos i vies interessants, que semblen estar implicats en la maduració inicial de l'anguila "natural" i podrien resultar biomarcadors adequats per a les etapes d'aquest procés. No obstant això, es necessiten estudis addicionals per avaluar el potencial dels biomarcadors d'aquests gens i, de manera complementària, comprovar si un pre-tractament d'aigua de mar freda pot millorar la resposta de les anguiles europees a un tractament hormonal artificial, com suggereixen els resultats. Finalment, amb l'objectiu / [EN] As an expensive fish from one of the most ancient teleost lineages, with a mysterious life cycle, exceptional aquaculture potential, and cultural associations and fishing activity in almost every country in Europe, the European eel possess huge socioeconomic value. This value only adds to the misfortune of the current critically endangered state of the wild European eel population. As the eel lifecycle has not yet been closed in captivity, the species will not be salvable if it went extinct in the wild. Closing the life-cycle of the European eel has thus been the ultimate objective of several studies. However, despite the substantial scientific investigation, since the 1930s, several aspects of eel maturation, such as the mechanism which blocks eel sexual maturation at the pre-pubertal stage in captivity, is still poorly understood. Therefore, it is necessary to broaden our knowledge of eel reproduction to induce better hypotheses and therethrough achieve substantial progress. In order to further this field, this thesis was conducted with the specific objective of developing innovative methods for induction of eel maturation and add to the pool of knowledge of European eel maturation processes. The hormonal procedures currently used for artificial eel sexual maturation are probably not inducing the natural maturation process. Therefore, this thesis has evaluated the potential of eel specific recombinant hormones to induce a more natural maturation process. This specific study showed that full spermatogenesis and spermiation can be induced with recombinant eel specific gonadotropins; however, the resulting gamete quality is still inferior to the results of established protocols. Nevertheless, the utilization of recombinant hormones holds a large potential for future implementation. Furthermore, the recombinant gonadotropin experiment has generated novel insights into the effect of homologous gonadotropins on the BPG axis of European eels. Previous work has led to the hypothesis that the right thermal environmental treatment may reduce or partially replace the standard hormonal treatments for sexual maturation of European eel, or may improve gamete quality and/or quantity. In this thesis, the effect of various thermal regimes was tested on the BPG axis of pre-pubertal European eel males, without administration of hormones. The results clearly show that a 2 week cold (10 °C) seawater treatment effects the BPG-axis of European eel males. Specific results included an increase in the synchronization of spermatogonial cells, elevated testosterone and 11-ketotestosterone plasma levels, clustering of BPG-axis transcriptome samples from the cold seawater treated group and possibly increased levels of pituitary luteinizing hormone ß-subunit protein. Differentially transcribed genes alluded to several interesting genes, processes, and pathways, which appears to be involved in early "natural" eel maturation and may prove to be suitable biomarkers for the stages of this process. In order for proper analysis of the transcriptomic data, a de novo European eel transcriptome was assembled. This de novo transcriptome was proven to have superior completeness to the available European eel genome and is thus a useful tool for further analysis of specific genes. An analysis of this transcriptome revealed a large number of paralog gene pairs, which showed low synonymous sequence divergence. Among the potential hypothesis regarding the origin of these paralog gene pairs, the hypothesis of a 4R whole genome duplication is among the most parsimonious. Several of these duplicated genes were involved in reproduction and the onset of puberty. Regardless of the origin, further analysis of these genes may reveal eel specific adaptations, which could help to better understand the exceptional reproductive system of eels. / Rozenfeld, C. (2019). Development of innovative methods for induction of European eel (Anguilla anguilla) spermatogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/125697 / Compendio

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'algue unicellulaire Gonyaulax polyedra est notre modèle pour l'étude des mécanismes reliant l'horloge interne aux rythmes circadiens observés. La bioluminescence, présente lors de la phase de nuit, ainsi que la division cellulaire observée au début de la phase de jour sont les deux rythmes sur lesquels porte la présente étude. Chez Gonyaulax, la présence des protéines LBP et luciférase, limitée à la phase obscure, permet la production de lumière. Une régulation au niveau de la traduction par une protéine inhibitrice CCTR se fixant en région 3 de l'ARNm LBP permet l'expression cyclique de la protéine LBP in vivo chez Gonyaulax polyedra . La construction d'une banque d'ADNc dans un vecteur d'expression constitutive (le p425 GPD) représente l'outil nécessaire pour l'isolation d'un ADNc codant pour la protéine CCTR. Cette isolation repose sur un mécanisme moléculaire d'interaction in vivo de la protéine CCTR avec la région régulatrice de l'ARNm lbp annexée à un gène létal inductible (le gène GSP1) dans la construction du plasmide pCS7. La transformation de levure possédant le pCS7 avec la banque d'ADNc permettrait la production de CCTR actif dans la levure et ainsi l'inhibition de la traduction de l'ARNm GSP1 par fixation du CCTR à la région régulatrice de lbp. Le criblage d'une banque d'ADNc comportant 2,8 x 105clones a été effectué. La croissance de 127 colonies a été observée lors du premier criblage de la banque. Chaque colonie a été soumise à une extraction d'ADN plasmidique et les plasmides obtenus ont été utilisés pour une seconde transformation dans les levures porteuses du pCS7. Le second criblage nous a permis de constater qu'aucun de ces positifs ne peut produire une protéine CCTR fonctionnelle. Une contamination par des levures d'une autre souche ou par une source de carbone permettant la croissance (telle que le glucose), une présence de "révertants" ou le clonage d'un ADNc codant pour le facteur de sélection du pCS7 peuvent être à l'origine de ces "faux positifs" obtenus. La production de clones supplémentaires afin d'augmenter statistiquement les chances de représentation d'un gène impliqué dans la génération d'un rythme circadien, ainsi que la transformation répétée de la banque dans les mêmes cellules pour permettre de réunir les différentes composantes qui pourraient être nécessaires à la formation d'un CCTR actif, pourraient permettre d'isoler un ADNc codant pour une protéine CCTR active. Chez la majorité des dinoflagellés on observe la présence d'une phase S dans le cycle cellulaire. De plus, chez Gonyaulax, la division cellulaire est limitée à l'aurore. Il est donc probable que la protéine kinase p34œk2qui régule la formation de l'hétérodimère MPF (impliqué dans l'initiation de la division cellulaire) soit également sujette à une régulation par l'horloge circadienne. L'isolation d'un homologue de la protéine kinase p34ede2repose sur une technique de clonage par compensation d'une mutation. Les levures de la souche cdc28 ne peuvent se diviser normalement à température restrictive de 34°C à cause d'une mutation thermosensible de la protéine kinase p34edc2. La transformation de la banque d'ADNc construite dans des levures de cette souche, puis l'incubation à température restrictive, permet le criblage pour un homologue de la p34cdc2. Le premier criblage de la banque a permis la croissance de sept colonies qui ont toutes été soumises à une extraction d'ADN plasmidique puis à une retransformation dans les cellules de la souche cdc28. Aucun des positifs n'a franchi le seuil de ce second test. Le criblage de clones supplémentaires ou encore le criblage pour un homologue de la cycline (la seconde composante du MPF) pourrait permettre d'isoler directement ou indirectement l'homologue de la p34cdc2.

Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert. AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden. AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized. AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form. AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.

Das Dokument enthält eine fehlerhafte Darstellung der Abbildung 3.3 (Seite 38). DieOriginalabbildung ist dem entsprechenden Fachartikel im Scandinavian Journal of Medicineand Science in Sports zu entnehmen:Mersmann, F., Bohm, S., Schroll, A., Boeth, H., Duda, G., Arampatzis, A. (2015): Muscleshape consistency and muscle volume prediction of thigh muscles. Scandinavian Journal ofMedicine & Science in Sports, 25: e208–e213 doi: 10.1111/sms.12285.The document contains a corrupted rendering of figure 3.3 (page 38). The original figurecan be obtained in the respective journal article:Mersmann, F., Bohm, S., Schroll, A., Boeth, H., Duda, G., Arampatzis, A. (2015): Muscleshape consistency and muscle volume prediction of thigh muscles. Scandinavian Journal ofMedicine & Science in Sports, 25: e208–e213 doi: 10.1111/sms.12285. / Bei jugendlichen Athleten wirken sowohl die körperliche Reifung als auch die erhöhte mechanische Belastung auf die Entwicklung des Muskel- und Sehnengewebes. Die Interaktion dieser beiden adaptationswirksamen Stimuli könnte, insbesondere bei Sportlern aus Sprungdisziplinen, Dysbalancen des Kraftpotenzials der Muskulatur und der Widerstandsfähigkeit der Sehne auslösen und somit potentiell das Verletzungsrisiko der Sehne erhöhen. Vor diesem Hintergrund untersucht die vorliegende Arbeit mittels Magnetresonanztomographie, Ultraschall und Dynamometrie die Entwicklung der morphologischen und mechanischen Eigenschaften der Knieextensoren und der Patellarsehne bei jugendlichen Kader-Volleyballathleten. Durch eine Querschnitts- und zwei Längsschnittstudien konnte Evidenz dafür erbracht werden, dass sich unter dem Einfluss der sportartspezifischen Belastung Kraft und Morphologie des Muskels in Relation zu den mechano-morphologischen Eigenschaften der Patellarsehne bei den jugendlichen Athleten nicht ausgewogen entwickeln, was zu einer erhöhten chronischen Belastung und Beanspruchung des Sehnengewebes führt. Darüber hinaus können muskulotendinöse Dysbalancen im Trainingsprozess durch erhöhte Fluktuationen der Muskelkraft und einer nicht-adäquaten Modulation der Widerstandsfähigkeit der Sehne zu episodischen Spitzen der mechanischen Beanspruchung der Sehne führen. Eine derart unausgewogene Entwicklung von Muskel und Sehne könnte für die Ausprägung von Überlastungsbeschwerden in der hier untersuchten Risikogruppe für Tendinopathien prädisponieren. Im Rahmen der Forschungsbemühungen wurde darüber hinaus ein Verfahren zur Vorhersage des Volumens von Oberschenkelmuskeln auf der Basis einfach zu erhebender Parameter entwickelt. Durch das Verfahren ließe sich zukünftig der Zeit- und Kostenaufwand muskelmorphologischer Diagnostik deutlich reduzieren. / In adolescent athletes, the development of muscle and tendon tissue is influenced both by maturation and mechanical loading. The interaction of these two driving stimuli could initiate imbalances in the development of the muscle strength capacity and tendon stiffness, especially in athletes from sports that feature a high frequency of jumps. A consequence could be an increased mechanical demand placed upon the tendon by the working muscle, which might increase the risk of tendon injury. Considering the lack of information on the effects of maturation and superimposed mechanical loading on the muscle-tendon unit during adolescence, the present work examines the development of the morphological and mechanical properties of the knee extensors and patellar tendon in adolescent elite volleyball athletes by means of magnetic resonance imaging, ultrasound and dynamometry. A cross-sectional comparison and two longitudinal studies provided evidence that the two-fold stimulus of sport-specific loading and maturation results in and imbalanced development of muscle strength and morphology in relation to the mechano-morphological properties of the patellar tendon in mid-adolescent volleyball athletes and results in increased tendon stress and strain. Moreover, during a training process, fluctuations of muscle strength and an inadequate modulation of tendon stiffness initiate episodes of high-level tendon strain during maximum muscle contractions. Such an imbalanced development of muscle and tendon could predispose for the development of tendon overuse injury in adolescent volleyball athletes, which are known to be at high risk of developing tendinopathy. Moreover, in the context of the described research endeavour, a method for the volume prediction of thigh muscles on the basis of easily measurable parameters has been developed, which could greatly reduce the time and costs involved in the diagnostics of muscle morphology in the future.

Micro RNA sind nicht-kodierende dsRNA ~22 Nukleotiden lang, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Regulation in beinahe allen Eukaryoten spielen. MiRNAs binden target mRNA, was zu einer Blockierung der Proteintranslation führt. Viele Krankheiten sind bekannt, die durch veränderte miRNA Expressionsmuster entweder beeinflusst oder verursacht werden. Demnach könnte eine Manipulation der miRNA-Bildung einen therapeutischen Ansatz darstellen. MiRNA werden im Zytoplasma von längeren haarnadelförmigen prekursor RNA (pre-miRNA) durch das Enzym Dicer freigsetzt. Inhibition dieser Spaltung könnte durch spezifische pre-miRNA-bindende Moleküle erfolgen. Selektive Binder der pre-miRNA als Inhibitoren der miRNA-Reifung können durch testen von Substanzbibliotheken mit Hochdurchsatzscreening (HTS) gefunden werden. Diese Arbeit beschreibt den ersten homogenen Assay der miRNA-Reifung. Eine Fluoreszenzsonde in Form einer pre-miRNA wurde benutzt, die einen 5´-Fluorophor (FAM, Cy3, oder TMR) und einen 3´-Quencher (DABCYL) aufweist. Durch die nahe Nachbarschaft von Fluorophor und Quencher in der nativen Haarnadelstruktur erfolgt Fluoreszenzlöschung. Dicer spaltet diese Struktur effizient, was zur Dissoziation von Fluorophor und Quencher und somit zu einem Fluoreszenzanstieg führt. Der Assay wurde für HTS optimiert. Die ersten Verbindungen wurden auf deren Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Mit einem Duplexassay, wobei zwei unterschiedliche pre-miRNA Sonden mit verschiedenen Fluorophoren eingesetzt wurden, konnte etwas spezifische Inhibition gezeigt werden. Der Assay wurde in Zellen durchgeführt und der Fluoreszenzanstieg mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Somit ist ein Zell-basiertes Screening von Inhibitoren möglich. Eine einfachere Synthese der Sonde mittels in vitro Transkription und anschließender enzymatischen Ligation wurde entwickelt. Verwendung des Assays um hoch selective Inhibitoren der miRNA-Reifung zu entdecken könnte zu therapeutischen Ansätzen führen. / Micro RNAs (miRNAs) are non-coding dsRNAs of ~22 nucleotides that play a vital role in development and regulation in nearly all eukaryotes. MiRNAs bind target mRNA, thus blocking protein translation. Many diseases have been found to be influenced or caused by aberrant expression of miRNAs. A manipulation of miRNA formation may have therapeutic potential. MiRNAs are cleaved from longer hairpin precursor RNA (pre-miRNA) in the cytoplasm by the enzyme Dicer. It might be possible to inhibit this cleavage through specific pre-miRNA binding molecules. Selective binders of pre-miRNA as inhibitors of miRNA maturation can be found by testing large libraries of substances through high throughput screening (HTS) using an appropriate assay. This work describes the first homogenous assay of miRNA maturation. A fluorescent probe in the form of a pre-miRNA containing a 5´-fluorophore (FAM, Cy3, or TMR) and a 3´-quencher (DABCYL) was used. This ‘beacon’ in its native hairpin formation brings the fluorophore and quencher moieties into close proximity, resulting in fluorescence quenching. Dicer efficiently cleaves this structure, leading to dissociation of fluorophore and quencher and thus a fluorescence increase. In the presence of an RNA ligand that blocks cleavage, a lower fluorescence increase is seen. The assay was optimized for HTS. The first compounds were tested for their inhibition of miRNA maturation. Using a duplex assay, with two different pre-miRNA probes each containing a different fluorogenic group, some specific inhibition was shown. The assay was performed in cells using fluorescence microscopy to measure the fluorescence. This would allow for a cell-based screening of inhibitors. A simpler approach of beacon synthesis using in vitro transcription followed by enzymatic ligation was also established. Use of this assay to discover highly selective inhibitors of miRNA maturation may lead to disease therapeutics.

Die Modifizierung von Proteinsequenzen unter anderem durch den Austausch von Aminosäuren ist ein zentraler Aspekt in evolutionären Prozessen. Solche Prozesse ereignen sich nicht nur innerhalb großer Zeiträume und resultieren in der Vielfalt des Lebens, das uns umgibt, sondern sind auch täglich beobachtbar. Diese mikroevolutionären Prozesse bilden eine Grundlage zur Immunabwehr höherer Wirbeltiere und werden durch das humorale Immunsystem organisiert. Im Zuge einer Immunantwort werden Antikörper wiederholt der Diversifizierung durch somatische Hypermutation unterworfen. Ziele dieser Arbeit waren, neue Kenntnisse über die Mikroevolution von Antikörpern während der Immunantwort zu gewinnen und die Beziehung zwischen Aminosäureaustauschen und Affinitätsänderungen zu verstehen. Zu diesem Zweck wurde zunächst gezeigt, dass die SPOT Synthese eine präzise Methode ist, um Signalintensitäten drei verschiedenen Bindungsaffinitätsklassen zuzuordnen. Antikörper-Peptid Bindungsdaten, die aus SPOT Synthese Experimenten generiert wurden, bildeten die Grundlage zur Konstruktion der Substitutionsmatrix AFFI - der ersten Substitutionsmatrix, die ausschließlich auf Bindungsaffinitätsdaten beruht. Diese bildete die Grundlage für die Gewinnung eines reduzierten Aminosäuresatzes. Durch einen theoretischen Ansatz konnte gezeigt werden, dass der reduzierte Aminosäuresatz eine optimale Basis für die Epitopsuche darstellt. Für den Prozess der somatischen Hypermutation und Selektion wurde ein neuer Ansatz präsentiert, um für die Affinitätsreifung relevante Mutationen zu identifizieren. Die Analyse zeigte, dass das Spektrum der selektierten Mutationen viel umfangreicher ist als bisher angenommen wurde. Die Tatsache, dass auch einige stille Mutationen stark bevorzugt werden, deutet darauf hin, dass entweder die intrinsische Mutabilität stark unterschätzt wurde oder, dass Selektion nicht nur auf Affinitätsreifung von Antikörpern basiert sondern auch auf ihrer Expressionsrate. / A central task of the evolutionary process is the alteration of amino acid sequences, such as the substitution of one amino acid by another. Not only do these amino acid changes occur gradually over large time scales and result in the variety of life surrounding us, but they also happen daily within an organism. Such alterations take place rapidly for the purposes of defense, which in higher vertebrates, is managed by the humoral immune system. For an effective immune response, antibodies are subjected to a micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification by somatic hypermutation resulting in increased binding affinity to a particular pathogen. The goal of this work was to provide insights into the microevolution of antibodies during the immune response, including the relationship between amino acid substitutions and binding affinity changes. A preliminary step in this work was to determine the accuracy of the SPOT synthesis technique, which could be shown to be an accurate method for assigning measured signal intensities to three different binding affinity classes. A substitution matrix based on data produced with these binding experiments was constructed and named AFFI. AFFI is the first substitution matrix that is based solely on binding affinity. A theoretical approach has additionally revealed that an AFFI-derived reduced set of amino acids constitutes an optimal basis for epitope searching. For the process of somatic hypermutation and selection, a novel approach to identify mutations relevant to affinity maturation was presented. The analysis revealed that the spectrum of mutations favored by the selection process is much broader than previously thought. The fact that particular silent mutations are strongly favored indicates either that intrinsic mutability has been grossly underestimated, or that selection acts not only on antibody affinity but also on their expression rates.

In den letzten Jahrzehnten ist die Zahl der Erwachsenen und Jugendlichen, die an nicht organisierten oder wettbewerbsorientierten Sportarten teilnehmen, gestiegen. In der Pubertät beeinflussen sowohl hormonelle Veränderungen als auch mechanische Belastungen die Entwicklung von Muskeln und Sehnen. Derzeit gibt es keine Informationen über die Interaktion dieser beiden Stimuli, aber es besteht die Vermutung, dass im Zuge der Pubertät bei Athleten und Nicht-Athleten im Vergleich zu Muskelkraft und Sehnensteifigkeit ungleiche Verhältnisse auftreten können. Die Folge dieses Ungleichgewichts könnte eine höhere mechanische Belastung für die Sehnen sein, was weiter zu Verletzungen führen kann. Angesichts der unzureichenden Beweise für die Entwicklung des muskulotendinösen Gewebes während der Pubertät und des Mangels an Kenntnissen darüber, wie die Reifung die Muskel-Sehnen-Einheit, insbesondere die Interaktion mit überlagerten mechanischen Belastungen, beeinflusst, untersucht diese Arbeit die morphologische und mechanische Entwicklung von Knieextensoren und Patellasehne, indem Nicht-Athleten und Athleten aus drei Altersgruppen verglichen werden (frühe Pubertät: 12–14 Jahre, engl.:EA; späte Pubertät: 16–18 Jahre, engl.: LA; Erwachsene: 20–35 Jahre, engl.: YA). Athleten erreichten häufiger Dehnungsgrößen von mehr als 9% Dehnung im Vergleich zu Nicht-Athleten, was auf einen erhöhten mechanischen Bedarf an der Sehne hinweist. Obwohl das Training die Eigenschaften der M. quadriceps femoris-Sehnen-Einheit verbessert, bleibt ihre Entwicklung von früher Pubertät bis zum Erwachsenenalter bei Athleten und Nicht-Athleten ähnlich, mit dem Hauptunterschied zwischen früher Pubertät und später Pubertät. Alter und sportliches Training waren jedoch mit einer höheren Prävalenz von Ungleichgewichten innerhalb der Muskel-Sehnen-Einheit und einer damit einhergehenden erhöhten mechanischen Belastung oder Beanspruchung für die Patellasehne verbunden. / In recent decades, the number of adults and especially adolescents who participate in some kind of non-organized or competitive sports has been increasing. During adolescence, the development of muscle and tendons is affected both by maturation, due to hormonal changes, and by mechanical loading. However, there is no information currently on the interaction of this double fold stimulus although there is reason to believe that during adolescence in athletes and non-athletes there may be imbalances developing between muscle strength capacity and tendon stiffness. The result of this imbalance could be the tendon exposure to high mechanical demand by the associated working muscles, which might further lead to tendon injury. Considering the not satisfactory evidence of the musculotendinous tissue development during adolescence, and the lack of knowledge about how maturation affects the muscle-tendon unity, especially in interaction with superimposed mechanical loading, this thesis investigates the morphological and mechanical development of the knee extensors and patellar tendon, by comparing non-athletes and athletes in three different age groups (i.e., early adolescents: EA 12–14 years; late adolescents: LA 16–18 years, and young adults: YA 20–35 years). Athletes were more likely to reach strain magnitudes higher than 9% strain compared to non-athlete controls indicating an increased mechanical demand for the tendon. Although athletic training enhances the properties of the quadriceps femoris muscle-tendon unit, their development from early-adolescence to adulthood remains similar in athletes and non-athletes with the major alterations between early and LA. However, both age and athletic training were associated with a higher prevalence of imbalances within the muscle-tendon unit and a resultant increased mechanical demand for the patellar tendon.

Streptococcus suis est l’un des agents pathogènes les plus importants du porc causant des méningites des arthrites et la mort subite. De plus, S. suis est un agent zoonotique émergent responsable de chocs septiques et de méningites chez l’être humain. La caractérisation de facteurs de virulence de S. suis a permis une avancée considérable dans la compréhension des mécanismes de pathogenèse des infections à S. suis. Cependant, les connaissances sur la pathogenèse de l'infection sont incomplètes. Ainsi, il est essentiel d'approfondir les connaissances sur les facteurs qui contribuent à la pathogénèse de S. suis, en particulier en identifiant les composants bactériens qui contribuent à l'inflammation exacerbée qui est bien connue pour jouer un rôle crucial dans le développement de la maladie. Ainsi, l’objectifs de cette thèse est d’élucider le rôle des lipoprotéines et de leur maturation ainsi que de l’acide lipotéichoïque (LTA) dans la pathogénèse de S. suis. Dans un premier temps, le rôle des enzymes prolipoprotéine diacylglycéryl transférase (Lgt) et lipoprotéine signal peptidase (Lsp), responsables de la maturation des lipoprotéines, dans la pathogenèse de l'infection causée par trois « sequence typing » (ST) différents du sérotype 2 de S. suis a été évalué. À l’aide de mutant dépourvu de Lgt et Lsp, nous avons démontré que le manque de ces enzymes n’influençait pas l’adhésion et l’invasion de S. suis Cependant, en l'absence de Lgt et/ou Lsp, une réduction significative de la capacité de S. suis à activer les cellules phagocytaires et à induire des médiateurs pro-inflammatoires (in vitro et in vivo) a été observé. Enfin, nos données suggèrent que ces enzymes jouent un rôle différentiel dans la virulence, en fonction du fond génétique de la souche. Par la suite, à l’aide de mutant de lipoprotéines spécifiques, nous avons montrés qu’elles peuvent être capitales pour S. suis et peuvent avoir des rôles pléiotropes, notamment dans le métabolisme comme la lipoprotéine « Laminin binding protein ». Nos résultats ont démontré que cette lipoprotéine est indispensable pour la capture du zinc, un élément important pour la croissance bactérienne, élément qui vient à manquer in vivo. Ainsi nous avons montré que la baisse de virulence de ce mutant était due à un défaut de croissance plutôt qu’un rôle réel dans la pathogenèse de S. suis. Finalement, le rôle joué par le LTA dans la pathogénèse de S. suis a été évalué. Il a été déterminé qu’il n’a pas de rôle dans le déclenchement de l’inflammation et plus généralement de rôle critique dans la virulence de S. suis sérotype 2. Cependant, le LTA est impliqué dans le maintien du fitness de S. suis et d'une forme cellulaire appropriée. Les résultats obtenus lors de cette thèse apportent de nouvelles connaissances sur la pathogénèse de S. suis notamment dans les facteurs impliqués dans le déclenchement de l’inflammation exacerbée. De plus, les informations obtenues montrent l’importance de comprendre les voies moléculaires et les interactions hôte-bactérie de façon globale pour élucider le rôle réel d'un facteur de virulence putatif ou élément bactérien dans la pathogénie de la maladie. / Streptococcus suis is one of the most important pathogens of pigs causing meningitis, arthritis, and sudden death. In addition, S. suis is an emerging zoonotic agent responsible for septic shock and meningitis in humans. The characterization of S. suis virulence factors have enabled considerable progress in understanding the mechanisms of pathogenesis of S. suis infections. However, knowledge about the pathogenesis of infection is incomplete. Thus, it is essential to increase knowledge on the factors that contribute to the pathogenesis of S. suis, particularly by identifying the bacterial components that contribute to the exacerbated inflammation that is well known to play a crucial role in the development of disease. Thus, the objective of this thesis is to elucidate the role of lipoproteins and their maturation as well as lipoteichoic acid (LTA) in the pathogenesis of S. suis. Firstly, the role of the enzymes prolipoprotein diacylglyceryl transferase (Lgt) and lipoprotein signal peptidase (Lsp), responsible for the maturation of lipoproteins, in the pathogenesis of the infection caused by three sequence typing (ST) different from the serotype 2 of S. suis was evaluated. Using mutant lacking Lgt and Lsp, we demonstrated that the lack of these enzymes did not influence the adhesion and invasion of S. suis. However, in the absence of Lgt and/or Lsp, a significant reduction in the ability of S. suis to activate phagocytic cells and induce pro-inflammatory mediators (in vitro and in vivo) was observed. Finally, our data suggest that these enzymes play a differential role in virulence, depending on the genetic background of the strain. Subsequently, using mutants of specific lipoproteins, we showed that they can be essential for S. suis and can have pleiotropic roles, particularly in metabolism such as the lipoprotein Laminin binding protein. Our results demonstrated that this lipoprotein is essential for the capture of zinc, an important element for bacterial growth, an element which is lacking in vivo. Thus, we showed that the drop in virulence of this mutant was due to a growth defect rather than a real role in the pathogenesis of S. suis. Finally, the role played by LTA in the pathogenesis of S. suis was evaluated. It was determined that it has no role in triggering inflammation and more generally no critical role in the virulence of S. suis serotype 2. However, LTA is involved in maintaining the fitness of S. suis and of an appropriate cellular form. The results obtained during this thesis provide new knowledge on the pathogenesis of S. suis, particularly in the factors involved in the triggering of exacerbated inflammation. Furthermore, the information obtained demonstrates the importance of understanding molecular pathways and host-bacteria interactions comprehensively to elucidate the actual role of a putative virulence factor or bacterial element in disease pathogenesis.

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis. / Streptococcus suis is an important swine and human pathogen causing meningitis and septicemia. Recent studies suggest that S. suis possesses several virulence factors, including the capsular polysaccharide, which enable this pathogen to modulate dendritic cell (DCs) functions. DCs are key immune cells that bridge innate and adaptive immunity. Moreover, the difficulties in developing an effective vaccine suggest that S. suis interferes with the T-cell dependent response. The main objective of the project was to evaluate the effect of S. suis on CD4+ T-cell activation, as well as on the antigen presentation ability of DCs. We investigated the CD4+ T-cell memory response in an in vivo mouse model. A poor central memory response was obtained following primary and secondary infections with S. suis, thus suggesting that the adaptive immune response against this pathogen is limited. The major histocompatibility complex (MHC) class II is central to the antigen presentation pathway. We thus investigated in vitro and in vivo the expression of these molecules on DCs. We observed a modulation in the expression of MHC-II by S. suis. Transcriptional analysis of genes involved in transcriptional and post-transcriptional regulation of MHC-II suggests that S. suis downregulates synthesis of MHC-II molecules and promotes their lysosomal degradation. This strategy, in which the CPS would play only a partial role, might allow S. suis to evade the T-cell dependent adaptive response. Overall, these results provide new insights into the comprehension of the adaptive immune response during the infection by S. suis.