Made available in DSpace on 2015-07-08T03:26:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000471664-Texto+Completo-0.pdf: 569 bytes, checksum: d91bfdbecd6f108e0284e449cc6139a3 (MD5) Previous issue date: 2015 / The repair of injured peripheral nerves is one of the most difficult tasks in neurosurgery. Among the techniques used is distinguished using the artificial tube for nerve guidance during the regeneration process. The preparation of composites based on biodegradable polymers and conducting polymers related to growth factors, have been proposed as a promising approach for improving regeneration of injured peripheral nerves. However, it should be considered that during the regeneration process is necessary to have a control over the dosage and the time of release of the drug in question not to jeopardize the recovery process. In this work were based membranes prepared PLGA (lactic-co-glycolic poly-acid), polypyrrole (PPy) and Tacrolimus as a growth factor. Was reported as a factor of the process of degradation and the relationship between the composition of membrane PLGA / PPy / Tacrolimus with the release of the drug in the first days of incubation. It was found that membranes with higher PLGA thicker, resulting in a lower weight loss and delayed release of Tacrolimus. In this work PLGA membranes containing search polypyrrole nanofibers (PPy) and Tacrolimus, as a growth factor, were prepared by the solvent evaporation method. The process of degradation and drug release were assessed 28 days of incubation. It was observed that membranes with a higher concentration of PLGA. / A reparação de nervos periféricos lesionados é uma das tarefas mais difíceis na neurocirurgia. Entre as técnicas utilizadas destaca-se a utilização de tubos artificiais para orientar o nervo durante o processo de regeneração. A preparação de compósitos baseados em polímeros biodegradáveis e polímeros condutores, associados a fatores de crescimento, têm sido proposta como uma abordagem promissora para melhorar a regeneração de nervos periféricos lesionados. Porém, deve ser considerado que durante o processo de regeneração é necessário ter um controle sobre a dosagem e o tempo de liberação do fármaco em questão para não prejudicar o processo de recuperação. Assim, neste trabalho foram preparadas membranas baseadas em PLGA (poli-ácido láctico-co-glicólico), polipirrol (PPy) e Tacrolimus como fator de crescimento. Foi avaliado o processo de degradação e a relação entre a composição de membranas de PLGA/PPy/Tacrolimus com a liberação do fármaco nos primeiros dias de incubação. Foi verificado que membrana com maior quantidade de PLGA, mais espessa, resultou numa menor perda massa e retardou a liberação do tacrolimus. Neste trabalho de pesquisa membranas de PLGA contendo nanofibras de polipirrol (PPy) e Tacrolimus, como fator de crescimento, foram preparadas por meio da metodologia da evaporação do solvente. O processo de degradação e a liberação do fármaco foram avaliados durante 28 dias de incubação. Foi observado que membranas com uma maior concentração do PLGA.

Made available in DSpace on 2015-09-26T02:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475172-Texto+Completo-0.pdf: 1033533 bytes, checksum: 3695eeb1d157f2c6ed87073d37aa8b1e (MD5) Previous issue date: 2015 / Tuberculosis (TB) caused predominantly by Mycobacterium tuberculosis is an infectious disease responsible for a significantly number of deaths worldwide. The first line TB drugs that are currently used, and others available, present several problems, such as duration and complexity of treatment, and adverse effects, factors that decrease the patient adherence to treatment regimen. These problems increase the number of cases of drug resistant TB. The pentacyano(isoniazid)ferrate(II) (IQG-607) compound is an inorganic complex designed to treat INH-resistant strains of M. tuberculosis containing mutations in catalase-peroxidase gene, katG. The compound appears to be a promising anti-TB drug candidate according to previous studies that demonstrated its effectiveness both in vitro and in vivo. However, the difficulties encountered in the development of an analytical method for detection and quantification of the compound, due to its chemical properties, were impeding further studies, such as the pharmacokinetic studies. In this context, the present study describes two analytical methods for the detection of IQG-607 for the first time. The voltammetric method was shown to be a powerful analytical tool for quantification of IQG-607 and may be used to monitoring the stability and quality control. The proposed method, together with enzymatic inhibition assay, shown that the IQG-607 is stable for at least 1week at 4 ºC. The detection of IQG-607 by high performance liquid chromatography (HPLC) was also described, and we were able to observe the retention of the compound on the stationary phase of a chromatography column for the first time in this work. In addition, the analysis of IQG-607 in mouse plasma by HPLC was also demonstrated. Therefore, this conventional method will be optimized and validated to conduct pharmacokinetics studies. / A tuberculose (TB) causada predominantemente por Mycobacterium tuberculosis é uma doença infecciosa responsável por um número considerável de mortes em todo o mundo. Os medicamentos utilizados no tratamento de primeira linha atual, e os demais disponíveis, apresentam diversos problemas, como a duração, complexidade, e efeitos adversos, dificultando a adesão dos pacientes ao regime terapêutico. Isto favorece o aumento do número de casos de TB resistente a medicamentos. O pentaciano(isoniazida)ferrato(II) (IQG-607) é um composto proposto para agir contra casos de TB resistentes à INH devido a infecção com cepas que possuem mutações no gene katG. O composto demonstrou ser um promissor agente anti-TB em estudos prévios, e a sua eficácia in vitro e in vivo foi comprovada. No entanto, as dificuldades encontradas no desenvolvimento de um método analítico para a detecção e quantificação do composto devido as suas características químicas estavam impedindo a realização de outros estudos, e dentre eles, a determinação de parâmetros farmacocinéticos. Tendo isto em vista, o presente trabalho descreve, pela primeira vez, dois métodos analíticos para detecção de IQG-607. O método voltamétrico mostrou potencialidade na quantificação do composto, podendo ser utilizado para monitorar a estabilidade e em controle de qualidade. Observamos, por meio deste método, juntamente com ensaios de inibição enzimática, que o IQG-607 é estável em solução por até 1 semana se for mantido a 4ºC. A detecção do IQG-607 por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) também foi demonstrada, e, pela primeira vez, observamos a interação do composto em coluna cromatográfica. Ainda, por CLAE, demonstramos a detecção do IQG-607 no plasma de camundongos, e por ser um método convencional, será otimizado e validado para a realização de futuros estudos de farmacocinética.

Made available in DSpace on 2016-06-02T12:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478692-Texto+Completo-0.pdf: 1934289 bytes, checksum: ad294c842ebebac268c4523f0b1f9420 (MD5) Previous issue date: 2016 / Tuberculosis is the infectious disease that causes more deaths worldwide, along with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Great efforts have been exerted in recent years to the search for new anti-tuberculosis drugs without success. Drug development platforms fail at different stages of the research and development process and one aspect that contributes to this is the lack of knowledge of the potential molecular drug targets. Both the elucidation of the bioactive compounds mechanism of action and the identification of their cellular targets are important for the development of new drugs. As an experimental alternative to the identification of molecular targets is pulse proteolysis technique, which determines the fraction of proteins differentially degraded after a brief incubation with proteases when comparing samples treated and untreated with a ligand. In this work, we developed the PePTID method: a new method for identification of molecular targets using pulse proteolysis and mass spectrometry analysis. The application of PePTID resulted in a reproducible procedure that minimizes the required amount of sample and provides a more robust analysis method compared to other approaches that use pulse proteolysis. / A tuberculose é, junto com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), a doença infecciosa que mais causa mortes no mundo. Grandes esforços foram exercidos nos últimos anos para a busca de novos fármacos antituberculose, porém sem muito sucesso. As plataformas de desenvolvimento de fármacos falham em diferentes etapas do processo de pesquisa e desenvolvimento e um dos aspectos que contribui para isso é a falta de conhecimento dos alvos moleculares de potenciais fármacos. Tanto a elucidação do mecanismo de ação de compostos bioativos quanto a identificação de seus alvos celulares são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Como alternativa experimental para a identificação de alvos moleculares está a técnica de proteólise pulsada, a qual determina a fração de proteínas diferencialmente degradadas após breve incubação com proteases quando comparadas as amostras tratadas e não tratadas com um ligante. Nesse trabalho, desenvolvemos o método PePTID: um novo método para identificação de alvos moleculares usando a proteólise pulsada e análise por espectrometria de massa. A aplicação do método PePTID resultou em um procedimento reprodutível que minimiza a quantidade necessária de amostra e que apresenta uma metodologia de análise mais robusta em relação a outras abordagens que utilizam a proteólise pulsada.

Orientador: Paulo Roberto Bueno / Banca: Alselmo Gomes de Oliveira / Banca: Humberto Gomes Ferraz / Resumo: Nos últimos anos, as doenças degenerativas do cérebro têm aumentado consideravelmente nas pessoas de idade avançada. A doença de Alzheimer representa uma das 10 primeiras causas de morte em pacientes acima dos 60 anos, correspondendo a um problema de saúde pública em todo o mundo. Desta forma, o número de pesquisas tem aumentado em busca de tratamentos mais eficazes que possam amenizar ou reverter os efeitos ocasionados por esta doença. O tratamento da doença de Alzheimer fundamenta-se na administração de fármacos inibidores da enzima colinesterase, tais como Donepezil, Tacrina, Galantamina, entre outros. No entanto, estes fármacos produzem efeitos colaterais graves como insuficiência hepática e renal. Desta forma, os sistemas de liberação modificada, podem reduzir esses efeitos. No presente trabalho, diversos sistemas de matrizes poliméricas foram sintetizados e caracterizados para liberação controlada do fármaco Bromidrato de Galantamina. Estes sistemas carreadores foram baseadas nos polímeros hidroxipropilmetilcelulose, Eudragit L-100 e polivinilpirrolidona, com o objetivo de possíveis carregadores de galantamina, fármaco empregado no tratamento da doença de Alzheimer. Esse procedimento pode evitar assim oscilações da concentração do fármaco no organismo, causada por administrações sucessivas, diminuindo, sim, os efeitos adversos. As características morfológicas, formas de incorporação e testes de estabilidade da atividade do fármaco encapsulado nas matrizes poliméricas foram estudados por meio de diversas técnicas de caracterização. Os resultados obtidos no estudo apresentam efetivamente uma incorporação do fármaco dentro das diferentes matrizes, junto com a formação de interpolimeros, no entanto, a matriz contendo a concentração de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Over the last years, there has been a considerable increase in the degenerative diseases of the brain among the elderly people. Alzheimer is known to be one of the primary causes of mortality of patients over 60 years old, and considered today as a chronic public health problem around the world. For this reason, there has been a huge increase in the number of research works in quest for more efficient treatments capable of diminishing or reversing the effects of this disease. The treatment of Alzheimer involves the use of drugs capable of inhibiting the activity of the cholinesterase enzyme, such as Donepezil, Tacrine, Galantamine, to name just a few. On the other hand, these drugs produce collateral effects in the organism, such as renal and hepatic insufficiency. In virtue of this, diverse polymeric matrix systems were synthesized and characterized for the controlled release of Galantamine Hydrobromide in this present research. These matrix systems were based on the following polymers: HPMC (hydroxypropylmeticellulose), Eudragit L-100, and PVP, with the aim of using them as possible carriers of the drugs used in the treatment of Alzheimer, thereby avoiding oscillations of the drug concentration in the human body and as such diminishing the adverse effects. Morphological characteristics and the form of incorporation as well as stability tests of the encapsulated drug activity in the polymeric matrixes were studied through a range of characterization techniques. The results obtained in the study show an incorporation of the drug within the different matrixes, though the matrix containing 2% concentration of HPMC and 20% of Eudragit L-100 presented a more homogenous morphology as compared to the others, thus making it a possible system that can be used in drug release control / Mestre

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:07:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431554-Texto+Completo-0.pdf: 1140347 bytes, checksum: 1a8e9f1d9a303deab64243aa1e2049fe (MD5) Previous issue date: 2011 / Introduction: Some limitations have been raised over the murine models with ovalbumin (OVA) sensitization in asthma research. However, this model is still widely used and the acute OVA protocol in mice still plays a role in pre-clinical investigation. The use of adjuvant and long sensitization periods are some of the limitations raised. Aims: We have tested whether a shorter period of subcutaneous sensitization with OVA, with no adjuvant, induces a similar eosinophilic pulmonary response in mice, when compared with previous well-established control protocols. Methods: Adult female BALB/c mice were used and divided into groups, according to the number of OVA sensitizations (once or twice, OVA: 20 μg) and the number (two or three times) /dosage(40 μg and 100 μg) of intranasal OVA challenge. The shorter protocol (10 days-length) consisted of one subcutaneous OVA sensitization and three OVA challenges (100 μg). Total (TCC) and differential cell counts from bronchoalveolar lavage (BAL), eosinophil peroxidase (EPO) from lung tissue and histopathology (HE) of the lungs were performed 24 hours after the last OVA challenge. Results: Cell counts from BAL, EPO from lung tissue and histological lung abnormalities were not different between the groups studied. The shorter protocol induced a similar allergic lung response to OVA, when compared with the positive control, the same occurring with the other groups. Conclusion: We concluded that the use of one subcutaneous OVA sensitization elicit a strong allergic pulmonary response, free of adjuvant, in a 10-day-length protocol. Our findings suggest that this protocol may be used a first-line pre-clinical test, reducing cost and time of experiments, and avoiding the use of artificial adjuvants. / Introdução: Várias limitações têm sido levantadas em estudos de asma utilizando modelos murinos agudos sensibilizados com ovalbumina (OVA), mas este modelo é ainda amplamente usado, ainda mantendo sua importância em estudos pré-clínicos. Algumas limitações encontradas são o uso de adjuvante e os longos períodos de sensibilização. Objetivos: Testar se a sensibilização com OVA em um período curto, sem adjuvante, induziria uma resposta pulmonar eosinofílica em camundongos similar aos protocolos já previamente estabelecidos.Métodos: Fêmeas adultas de camundongos BALB/c foram utilizadas e divididas em grupos de acordo com o número de sensibilizações com OVA (uma ou duas vezes, OVA: 20 μg) e o número(duas ou três vezes)/dosagem(40 μg e 100 μg) de desafios intranasais. O protocolo mais curto (10 dias) consistiu de uma sensibilização subcutânea e três desafios com OVA (100 μg). Contagem total (CTC) e diferencial de células no lavado broncoalveolar (LBA), ensaio da peroxidase eosinofílica (EPO) do tecido pulmonar e histopatologia (HE) dos pulmões foram realizados 24 horas após o último desafio com OVA. Resultados: Contagem celular do LBA, EPO do tecido pulmonar e alterações inflamatórias da histologia pulmonar não foram diferentes entre os grupos estudados. O protocolo mais curto induziu uma resposta eosinofílica pulmonar à OVA semelhante ao grupo controle, ocorrendo o mesmo com os outros grupos. Conclusão: O uso de sensibilização subcutânea com OVA, sem adjuvante, resulta em uma significativa resposta pulmonar alérgica, permitindo sua utilização em protocolos de duração mais curta. Nossos achados sugerem que este protocolo pode ser utilizado como teste pré-clínico de primeira linha para pesquisa de novos fármacos, reduzindo custo, tempo e uso de adjuvante.

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450558-Texto+Completo-0.pdf: 2693787 bytes, checksum: e4ffe9234a98b2ddfc9bc350c708c01c (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB), one of the oldest recorded human afflictions, is still one of the biggest killers among the infectious diseases. The HIV co-infection and the emergence of multidrug resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. The modern approach to the development of new chemical compounds against complex diseases, especially the neglected endemic ones, such as TB, is based on the use of defined molecular targets. Enzymes from the pyrimidine biosynthesis pathway have been considered potential targets for identification or development of novel anti-mycobacterial agents since in bacteria, pyrimidine nucleotide interconvertion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. Cytidine 5'-monophosphate kinase from Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) catalyzes the ATP-dependent phosphoryl group transfer preferentially to CMP and dCMP. Here, initial velocity studies and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) measurements showed that MtCMK follows a random-order kinetic mechanism of substrate binding, and an ordered mechanism for product release. The thermodynamic signatures of CMP and CDP binding to MtCMK showed favorable enthalpy and unfavorable entropy, and ATP binding was characterized by favorable changes in enthalpy and entropy. The contribution of linked protonation events to the energetics of MtCMK:phosphoryl group acceptor binary complex formation suggested a net gain of protons. Values for the pKa of a likely chemical group involved in proton exchange and for the intrinsic binding enthalpy were calculated. The Asp187 side chain of MtCMK is suggested as the likely candidate for the protonation event. Data on thermodynamics of binary complex formation were collected to evaluate the contribution of 2'-OH group to intermolecular interactions. The data are discussed in light of functional and structural comparisons among CMP/dCMP kinases and UMP/CMP ones. / A tuberculose (TB), uma das doenças mais antigas da humanidade, ainda é uma das principais causas de morte entre as doenças infecciosas. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e tem estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Novas abordagens para o desenvolvimento de compostos contra doenças complexas, especialmente doenças endêmicas negligenciadas, são baseadas no uso de alvos moleculares definidos. Enzimas envolvidas no metabolismo de pirimidinas tornam-se alvos moleculares interessantes para compostos inibidores, uma vez que em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biossíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. A citidina 5'-monofosfato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) em estudo, catalisa a transferência reversível de um grupamento fosforil a partir de ATP, preferencialmente para CMP e dCMP. Neste trabalho, os estudos de velocidade inicial e experimentos de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) demonstraram que a adição dos substratos (CMP e ATP) à MtCMK segue um mecanismo cinético sequencial aleatório, e que a liberação dos produtos ocorre de forma ordenada, onde o ADP é o primeiro produto a ser liberado. As assinaturas termodinâmicas da ligação do CMP e do CDP à MtCMK mostraram variações favoráveis da entalpia e desfavoráveis da entropia, e, a ligação do ATP foi caracterizada por mudanças favoráveis da entalpia e da entropia. As contribuições energéticas oriundas dos eventos de protonação, associados à formação do complexo binário MtCMK:receptor do grupamento fosforil, sugerem um ganho líquido de prótons. Além disso, foram calculados os valores de pKa de um provável grupo envolvido na troca de prótons, e da entalpia de ligação intrínseca. A cadeia lateral do Asp187 da MtCMK é sugerido como provável candidato para o evento de protonação. As medidas termodinâmicas da formação do complexo binário foram coletados a fim de avaliar a contribuição do grupo 2'-OH da pentose nas interações intermoleculares. Os dados obtidos foram discutidos comparando-se as características estrutural e funcional entre as CMKs já estudadas e a UMP/CMP quinase humana.

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450257-Texto+Completo-0.pdf: 1851494 bytes, checksum: 45b94fe1b9cb73399670961f3d6d6798 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB), an illness that results from Mycobacterium tuberculosis infection, remains a major health problem worldwide, accounting for an estimated 8. 7 million new cases globally in 2011. Problems related to treatment of M. tuberculosis infection are related to its ability to persist latently in host tissues, getting protection against drug treatment and creating a reservoir of disease. Addictionaly, the emergence of multi, extensively and totally drug-resistant strains, TB-HIV co-infection and the complexity of the treatment currently used, underline the need of new antitubercular drugs, with novel mechanisms of action. The enzyme adenylosuccinate lyase (ASL) is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Here we describe M. tuberculosis ASL (MtASL) cloning and expression in Escherichia coli. N-terminal amino acid sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses confirmed the identity of homogeneous MtASL. Size exclusion chromatography showed that the protein is a homotetramer in solution. Steady-state kinetics revealed that MtASL exhibits hyperbolic kinetics and confirmed that the recombinant enzyme indeed catalyses the cleavage of S-AMP in AMP and fumarate. The pH-rate profile showed that MtASL follows an overall acid-basic mechanism of catalysis and these studies, combined with multiple sequence alignment analysis led us to propose what amino acid residues are involved in the MtASL chemical reaction. In addition, product inhibition studies and isothermal titration calorimetry of binding products allowed us to propose the MtASL kinetic mechanism. The results here reported could lead to the identification of nucleoside analogs that potently inhibit M. tuberculosis viability, with minor damages to the human host. / A tuberculose humana (TB) é uma doença infectocontagiosa provocada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis e permanece sendo um importante problema mundial de saúde. Estima-se que 8,7 milhões de novos casos tenham ocorrido em 2011. Problemas relacionados ao tratamento da infecção ocorrem devido à sua habilidade de persistir de forma latente no hospedeiro criando um reservatório da doença. Adicionalmente, a emergência de cepas multi, extensivamente e totalmente resistentes, a coinfecção TB-HIV e a complexidade do tratamento utilizado atualmente, alertam para a necessidade de novos medicamentos, que possuam novos mecanismos de ação. A enzima adenilossuccinato liase (ASL) está envolvida em ambas as vias de biossíntese de purinas. Neste trabalho, nós descrevemos a amplificação, clonagem da ASL de M. tuberculosis (MtASL) e expressão em Escherichia coli. O sequenciamento N-terminal juntamente com análises por espectrometria de massas confirmaram a identidade da MtASL homogênea. Foi demonstrado através de cromatografia de exclusão por tamanho que a proteína é um homotetrâmero em solução. Ensaios de cinética no estado estacionário revelaram que a MtASL exibe um modelo de cinética hiperbólica e que catalisa a clivagem de S-AMP a AMP e fumarato. Estudos de perfil de pH demonstraram que a MtASL realiza um mecanismo catalítico ácido-básico e, tais estudos, combinados ao alinhamento múltiplo de sequências, permitiram propor os resíduos de aminoácidos envolvidos na reação. Adicionalmente, estudos de inibição pelos produtos somados a estudos de calorimetria de titulação isotérmica da ligação dos mesmos, permitiram propor o mecanismo cinético da MtASL. Os resultados deste trabalho podem auxiliar na posterior identificação de análogos de nucleotídeos que sejam capazes de inibir a viabilidade do M. tuberculosis, com poucos danos ao hospedeiro humano.

Made available in DSpace on 2013-12-21T01:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000452946-Texto+Completo-0.pdf: 4295769 bytes, checksum: 7a8634a037c064cad84539c03a441c4a (MD5) Previous issue date: 2013 / Human thymidine phosphorylase (hTP) also known as platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) or gliostatin, has an important role in nucleotide metabolism. hTP is a molecular target for anticancer drug development since it is overexpressed in certain solid tumours, and its catalityc activity has been shown to be essencial to promote angiogenesis. This work describes amplification, cloning, and recombinant expression in E. coli, purification to homogeinity of both precursor and mature protein hTP. Mass spectrometry analysis confirmed the identity of homogeneous hTP and size exclusion chromatography showed that hTP proteins are a dimer in solution. Kinetic studies allowed the determination of apparent and true kinetic constants for forward reaction, and showed that enzymes displayed substrate inhibition for thymidine. Initial velocity and isothermal titration calorimetry (ITC) studies suggested that hTP catalysis follows a rapid-equilibrium random bi-bi kinetic mechanism. Thermodynamics constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates/products binding patterns identification. Additionally, these studies showed differences in the kinetic constants and the thermodynamic parameters between the precursor and the mature protein and these differences were revealed by structural analysis using molecular modeling. The pH-rate profiles suggested that maximal enzyme activity was achieved at low pH values, and functional groups with a pK values of 5. 1 – 5. 2 and 9. 0 – 9. 2 are involved in thymidine binding, and groups with pK value of 6. 1 – 6. 2 and 7. 8 – 8. 6 are involved in phosphate binding. The enzyme characterization provides additional data that may be useful for the rational design of novel inhibitors hTP. Chemical compounds designed and synthesized as potential inhibitors against hTP activity were active in both forms of the enzyme, whereas the compound 5g showed the best inhibitory potential. The compound 5g was characterized as noncompetitive inhibitor towards hTP substrates thymidine and phosphate. The noncompetitive inhibiton mechanism points to the existence of an allosteric binding site at hTP, different from the substrate binding sites. This allosteric site could be considered an important molecular target for the development of potent and selective hTP inhibitors. / A Timidina fosforilase humana (hTP), também conhecida como PD-ECGF e gliostatina, é uma enzima importante no metabolismo de nucleotídeos. A hTP é um alvo molecular para o desenho de inibidores enzimáticos com possível uso na terapia do câncer, visto que essa enzima encontra-se superexpressa em alguns tipos de tumores sólidos e sua atividade catalítica é essencial para promoção da angiogênse. Esta tese descreve a amplificação, clonagem, expressão heteróloga em E. coli, purificação e caracterização bioquímica do precursor e da proteína madura hTP. Análises de espectrometria de massa confirmaram a identidade das proteínas recombinantes e ensaios de cromatografia de exclusão por tamanho revelaram que ambas as enzimas encontram-se como dímeros em solução. Estudos cinéticos permitiram a determinação das constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para a reação direta e mostraram que as enzimas apresentam inibição pelo substrato tidimina. Estudos espectofotométricos de velocidade inicial e estudos de ligação por microcalorimetria de titutalação isotérmica (ITC) sugerem que a catálise enzimática segue um mecanismo cinético bi-bi aleatório de rápido equilíbrio. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos/produtos naturais das enzimas com seus sítios de ligação. Além disto, esses estudos revelaram diferenças nas constantes cinéticas e nos parâmetros termodinâmicos entre o precursor e a proteína madura e tais diferenças foram evidenciadas por meio da análise estrutural de ambas as enzimas.O perfil de pH mostrou que a atividade enzimática máxima foi obtida em valores de pH baixos, e que grupamentos funcionais com valores de pK de 5,1 – 5,2 e 9,0 – 9,2 estão envolvidos na ligação à timidina e grupamentos com valores de pK de 6,1 – 6,2 e 7,8 – 8,6 estão envolvidos na ligação ao fosfato. Os resultados da caracterização da enzima fornecem dados adicionais que podem ser úteis para o desenho racional de novos inibidores da hTP. Os compostos químicos planejados e sintetizados como possíveis inibidores da atividade da hTP foram ativos em ambas as formas da enzima, sendo que o composto 5g apresentou o melhor potencial inibitório. O composto 5g foi caracterizado como um inibidor não competitivo em relação aos substratos naturais timidina e fosfato. O mecanismo de inibição não competitiva sugere a existência de um sitío de ligação alostérico na hTP, diferente dos sítios de ligação aos substratos, podendo ser considerado um alvo molecular importante para a busca de inibidores potentes e seletivos para hTP.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000431776-0.pdf: 1282146 bytes, checksum: 0e730de9372a1cf67e1a480c1b56faa2 (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / Objectives: To evaluate the efficacy of the association of a proton pump inhibitor (omeprazole) with Ca(OH)2 as intracanal medication in a rat model of periapical lesions. Methods: Periapical lesions were induced on the first right mandibular molar of male Wistar rats (6 per group) and left open in the oral cavity for 28 days. After that period, the distal canal of each tooth was prepared, filled with the respective dressing (Negative Control - PEG 400; Positive Control - Ca(OH)2 + PEG400; Test - Ca(OH)2 + Omeprazole + PEG 400), and sealed with amalgam for 15 or 28 days. Microbiological samples were taken in three periods: S1 - after 28 days of lesion induction; S2 - after the biomechanical preparation; S3 - after the abovementioned medication periods (15 and 28 days). The animals were euthanized, and the teeth were processed for radiographic and histological analysis. Results: The radiographic and histological analysis revealed that both test and positive control groups had a reduction of periapical lesion areas, at 28 days, when compared to the negative control group. The reduction of periapical lesions and of inflammatory cells infiltration was significantly improved by associating omeprazole to Ca(OH)2, with a visible increase of reparative bone areas. The microbiological assessment showed a significant decrease of CFU counting from S1 to S2 or S3 collecting times, but no differences were observed between the S2 and the S3 time-periods, or among the experimental groups within the S3 period, either at 15 or 28 days of medication. However, further bacterial characterization showed a possible selective activity of the medications, despite the similar CFU count results. Conclusions: Our data showed that association of omeprazole to Ca(OH)2 favored a superior repair of periapical lesions in rats, and seems to display different selective activity over the endodontic microbiota, in comparison to the conventional Ca(OH)2 dressing. / OBJETIVOS : Avaliar a eficácia da associação de um inibidor de bomba de prótons (omeprazol) com Ca(OH)2, como medicação intracanal em dentes de ratos com lesões periapicais.MÉTODOS : As lesões periapicais foram induzidas pela abertura do primeiro molar inferior direito de 36 ratos Wistar, machos (seis por grupo); as cavidades foram deixadas abertas por 28 dias. Após esse período, o canal distal de cada dente foi preparado, preenchido com as respectivas medicações (Controle Negativo - PEG 400; Controle Positivo - Ca (OH)2 + PEG 400; Teste - Ca (OH)2 + Omeprazol + PEG 400) e seladas com amálgama por 15 ou 28 dias. As amostras microbiológicas foram coletadas em três períodos: S1 - após 28 dias de indução da lesão; S2 - após o preparo biomecânico; S3 - após 15 ou 28 da medicação. Os animais foram de eutanasiados e os dentes processados para análise radiográfica e histológica. RESULTADOS : Foi observado, por meio de análise radiográfica e histológica, que em ambos os grupos teste e controle positivo ocorreu uma redução das áreas de lesão periapical, em 28 dias, quando comparados ao grupo controle negativo. A redução das lesões periapicais e do infiltrado de células inflamatórias foi significativamente maior com a associação de omeprazol ao Ca(OH)2, sendo observada uma maior área de reparo ósseo. A avaliação microbiológica mostrou uma diminuição significativa na contagem de UFC de S1 para S2 ou S3, mas não houve diferença nem entre os períodos de tempo S2 e S3, nem entre os grupos experimentais em S3, em 15 ou 28 dias de medicação. Entretanto, a caracterização bacteriana revelou uma possível atividade seletiva dos medicamentos, apesar dos resultados semelhantes na contagem de UFC. CONCLUSÕES : Nossos dados mostram que a associação de omeprazol ao Ca(OH)2 favoreceu um padrão de reparo superior das lesões periapicais induzidas em ratos, além de parecer apresentar uma atividade seletiva sobre a microbiota endodôntica, quando compararada ao Ca(OH)2 utilizado de forma isolada.

Submitted by Ginamara Lima (ginaj@pucrs.br) on 2013-05-27T17:57:40Z No. of bitstreams: 1 448377.pdf: 1426545 bytes, checksum: f1669e15db70f927851ffb6f75f2d99a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-27T17:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 448377.pdf: 1426545 bytes, checksum: f1669e15db70f927851ffb6f75f2d99a (MD5) / Na Endodontia, o preparo químico-mecânico produz uma redução significativa da quantidade de bactérias no interior do sistema de canais radiculares. Este procedimento pode ser complementado pelo uso de medicações intracanal, a fim de aumentar a possibilidade de sucesso da terapia endodôntica. O presente estudo teve como objetivo avaliar a efetividade de diferentes medicações intracanal, em esquemas isolados ou em associação, para o controle de lesões periapicais em ratos. Esta tese foi dividida em capítulos, contemplado as diferentes medicações estudadas e os artigos originados. No capítulo 1, foi enfatizada a metodologia utilizada, com aplicação da Tomografia Cone Beam (CBTC), como ferramenta para avaliar o reparo das lesões periapicais após terapia endodôntica e, curativo de demora, demonstrando a eficácia do exame para finalidade proposta. Testou-se o hidróxido de cálcio (lado direito) versus grupo controle negativo (lado esquerdo), sem medicação. Na avaliação com CBTC, a área da lesão no grupo controle foi de 9.38 ± 0.68 mm2 e, no grupo tratado de 7.08 ± 0.44 mm2, sendo esta diferença significativa (p<0.05). No capítulo 2, foi avaliado o efeito do antioxidante, resveratrol e, das medicações consideradas padrão-ouro em Endodontia, clorexidina e hidróxido de cálcio, em esquemas isolados ou em associações. Ademais, o resveratrol foi testado em conjunto com a vitamina E ou com o óleo de arroz. Neste artigo, as comparações entre grupos tratados e controle demonstraram diferença significativa (p<0.05) nos grupos em que foi utilizado hidróxido de cálcio, resveratrol em propilenoglicol e resveratrol com clorexidina. Estes grupos apresentaram uma redução de aproximadamente 25% em relação ao seu grupo controle, de acordo com avaliação por CBTC. Os efeitos das medicações foram confirmados por análise histológica qualitativa, tendo sido observado maior infiltrado inflamatório, além de áreas de reabsorção e supuração nos grupos controle. Já, no capítulo 3, foi avaliada ação local da amoxicilina na região periapical, quando utilizada de maneira isolada ou, em combinações. Neste estudo, a amoxicilina mostrou-se bastante eficaz, tanto isoladamente, quanto em conjunto com hidróxido de cálcio ou clorexidina (p<0.05). As percentagens de redução foram de 47 ± 5%, para amoxicilina em propilenoglicol; 46 ± 5% para amoxicilina + gluconato de clorexidina e; 65 ± 10 % para amoxicilina + hidróxido de cálcio. Para confirmar os resultados da CBTC, foi realizada análise histológica qualitativa. Na coloração de H&E, o infiltrado inflamatório variou de leve a moderado nos grupos com medicação. No grupo controle, o infiltrado inflamatório foi classificado como intenso, com áreas de reabsorção. Na coloração de Mallory, os grupos teste mostraram grande quantidade de fibroblastos e fibras colágenas íntegras. Em contrapartida, o grupo controle apresentou infiltrado intenso, áreas de abscesso e supuração. Por fim, é apresentada uma discussão geral dos resultados, bem como, uma seção de considerações finais contemplando o desempenho das diversas medicações testadas e o significado do trabalho para a Endodontia. Conclui-se que a CBTC pode ser uma ferramenta importante para estudos pré-clínicos na área da endodontia, mostrando aplicação para determinação de alterações na região apical. Ademais, sugere-se que o agente antioxidante resveratrol ou o antibiótico amoxicilina podem ser alternativas efetivas como medicação intracanal. / In endodontics, the chemomechanical preparation produces a significant reduction in the amount of bacteria in the root canal system. It has been demonstrated that the adjuvant use of intracanal medications, might increase the possibility of success of endodontic therapy. The present study aimed to evaluate the effectiveness of different intracanal medications, when used alone or in combination, in a rat model of periapical lesions. This thesis was divided into three chapters, according to the scientific articles. The Chapter 1 emphasizes the methodology used, which employed Cone Beam Tomography to measure the repair of periapical lesions after endodontic therapy and root canal dressing, demonstrating the effectiveness of this tool. Calcium hydroxide was tested, versus control group, which had received no medication. The lesion area was 9.38 ± 0.68 mm2 in the control group, and 7.08 ± 0.44 mm2 in the treated group (p<0.05), according to CBTC evaluation. This data was confirmed by histological evaluation, indicating the applicability of CBTC in the rat model of apical periodontitis. The Chapter 2 evaluated the natural compound resveratrol, and the medications considered as gold standards in Endodontics, chlorhexidine and calcium hydroxide, in isolated schemes or in associations. The effects of resveratrol were also assessed in combination to vitamin E or rice oil, which also have known antioxidant effects. In this paper, the comparison between treated and control groups showed significant differences in the groups that received calcium hydroxide, resveratrol in propyleneglycol or resveratrol with chlorhexidine with inhibition percentages of about 25%. The effects of medications were confirmed by qualitative histological analysis, which showed higher inflammatory infiltrate, areas of resorption and suppuration in the control groups. The Chapter 3 shows data on the use of amoxicillin as intracanal medication, when used alone or in combined protocols. In this study, amoxicillin was highly effective, presenting significant differences when tested alone or in combination with calcium hydroxide or chlorhexidine. Amoxicillin vehicled in propyleneglycol produced an inhibition of 47 ± 5% of periapical lesion areas, and a similar degree of reduction was observed in the group that received amoxicillin plus chlorhexidine gluconate (46 ± 5%). Notably, the combination of amoxicillin and calcium hydroxide paste resulted in a marked inhibition of periapical lesions (65 ± 10 %). Qualitative H&E histological analysis showed that inflammatory infiltrate ranged from mild to moderate in the test groups, and the control samples presented intense inflammatory infiltrate, with visible resorption areas. Regarding the Mallory staining, it was possible to observe a massive presence of fibroblasts, surrounded by intact and well-bonded collagen fibers. Otherwise, the control groups showed intense inflammatory infiltrate and areas of abscess. There is a final chapter with a general discussion and some specific considerations on the various strategies tested herein and the meaning of our study for Endodontics. In conclusion, the CBTC might represent an important tool for studies in pre-clinical endodontics, showing applicability for measuring changes in the apical region. Furthermore, either the antioxidant resveratrol, or the antibiotic amoxicillin, appear to be useful strategies as alternative intracanal dressings.