INTRODUÇÃO: A expansão e disseminação do consumo de crack e cocaína no Brasil vem se tornando um grave problema de saúde pública nos últimos vinte anos. Diferentes abordagens biológicas têm sido investigadas utilizando o fenótipo de abuso/dependência de crack/cocaína, cujos resultados têm demonstrado a participação importante do substrato genético, assim como a sua interação com os fatores ambientais no desenvolvimento desse transtorno. OBJETIVOS: Investigar o padrão de metilação do DNA do genoma de indivíduos que apresentam abuso/dependência de cocaína e de crack, comparando ao padrão de metilação de indivíduos controles. MÉTODOS: Foram selecionados 24 dependentes de cocaína e crack e 24 controles saudáveis, pareados por sexo e idade. Utilizando amostras de DNA extraídas de sangue periférico de cada um dos participantes, foi realizada a técnica de metilação global com o ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip. Os resultados iniciais foram normalizados considerando a heterogeneidade celular e analisados utilizando o pacote ChAMP (Chip Analysis Methylation Pipeline) para identificar genes e/ou regiões gênicas diferencialmente metiladas que possam representar fatores de vulnerabilidade para o comportamento de abuso/dependência do crack e da cocaína. Os processos biológicos e vias celulares com os quais os sítios diferencialmente metilados estão envolvidos foram explorados usando as ferramentas disponibilizadas pelo \"WebGestalt\" e pelo \"UCSC Genome Browser\". RESULTADOS: Foram observados 250 sítios diferencialmente metilados, associados a 246 genes na comparação dos perfis de metilação entre os casos e controles, sendo que 49% destes estavam localizados nas regiões promotoras dos genes, sugerindo que esses sítios podem estar relacionados com a expressão gênica. Alterações estatisticamente significantes no padrão de metilação entre casos x controles foram observadas em 23 sítios CpG (p-valor ajustado < 10-5 e |?beta| = 0,1). Observou-se também que três regiões diferencialmente metiladas foram associadas a genes hipometilados (BMP8A, GPR88 e RNF166) (p-valor ajustado < 0.05), cada uma com pelo menos três sítios. Alterações estatisticamente significantes também foram observadas em seis genes hiper-representados: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, envolvidos em processos biológicos e moleculares. CONCLUSÕES: Observou-se diferenças estatisticamente significativas no padrão de metilação genômico de usuários/dependentes de crack e cocaína quando comparados aos controles saudáveis em amostra de DNA extraídas de sangue periférico. Comparação de estudos de expressão em tecido cerebral correlacionaram-se parcialmente com os achados apresentados. Outros estudos utilizando amostras independentes são necessários para confirmar esses achados. A confirmação desses resultados poderá contribuir na identificação e compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos na dependência do crack/cocaína / BACKGROUND: The expansion and dissemination of crack and cocaine in Brazil has become a progressive and serious public health problem during the last twenty years. Different biological approaches have been investigated using the crack/cocaine abuser/dependent phenotype, with results confirming the important role of the genetic component, as well as its interaction with environmental factors. OBJECTIVES: To investigate the DNA methylation pattern levels in the genome of individuals with crack and cocaine abuse/dependence and comparing it with the DNA methylation pattern of the genome of control subjects. METHODS: 24 crack and cocaine abusers/dependents and 24 healthy controls were selected and matched by sex and age. Using DNA samples from peripheral blood of each participant, a global methylation technique was performed using the Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) Bead Chip assay. The initial results were normalized for cellular heterogeneity and re-analyzed using ChAMP package (Chip Methylation Analysis Pipeline) to identify differentially methylated genes or/and DNA regions that may represent biological/genetic risk factors for crack and cocaine abuse/dependence behavior. The biological processes and cellular pathways were explored using tools provided by \"WebGestalt\" and \"UCSC Genome Browser\". RESULTS: 250 differentially methylated sites associated with 246 genes in methylation comparison profiles between cases and controls were identified, of which almost half were located in the promoter regions of genes (49%), suggesting that these sites may be related to gene expression. Statistically significant changes in the methylation patterns between cases and controls were observed in 23 CpG sites (adjust p-value < 10-5 and |deltabeta| = 0.1). In addition, three differentially methylated regions were associated with hipomethylated genes (BMP8A, GPR88 e RNF166) (adjust p-value < 0.05), each one with at least three sites. Statistically significant changes were also observe with six hiper-represented genes: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, which are involved in biological and molecular processes. CONCLUSIONS: Crack and cocaine users/dependents presented significant statistical differences in the methylation pattern when compared to healthy controls in DNA samples extracted from peripheral blood. Results from gene expression studies using brain tissue can be correlated with our results. In order to confirm the present findings, future studies should be replicated using independent samples. The confirmation of these results will contribute to the understanding of the biological mechanisms involved in crack/cocaine dependence

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T17:16:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T17:41:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T17:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Aline Almeida Barbaresco D'Alessandro - 2014.pdf: 3202318 bytes, checksum: bef7dce7cab9c3b56900a9c2d14f4a49 (MD5) Previous issue date: 2014-04-08 / The human papillomavirus (HPV) is a major etiologic factor in the development of cervical cancer, DNA virus primarily infects the epithelium and may induce benign and malignant lesions of the mucous membranes and skin. Carcinogenesis is a multistep process that involves both changes genetic and epigenetic. The two changes epigenetic most studied are DNA methylation and histone acetylation. DNA methylation may be related development to cancer, and their presence or absence can affect the prognosis. The objective of this study was to evaluate the prognosis of patients with cervical cancer in stages I and II through the verification of HPV high and low risk, and the presence and absence of genes methylated and unmethylated RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT. We analyzed 129 records and samples of paraffin embedded biopsies of patients with cervical cancer in stages I and II. Detection of HPV - DNA was performed by PCR for HPV DNA of low and high oncogenic risk and MSP-PCR to detect the genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT. The calculation of survival used the Kaplan-Meier method and the log-hank test to compare means of survival between the prognostic factors for cervical cancer. The overall survival at 60 months of patients with the presence of RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT methylated or not were: 100%, 90.0%, 85.7%, 92.5%, respectively, and survival free of disease were 100%, 85.7%, 100%, 100%, respectively. The presence and absence of genes did not affect the overall and disease-free survival. The prevalence of HPV of low risk patients was 45% (58/129) and the high-risk HPV was 76% (98/129). Regarding the analysis to evaluate the existence of statistical relationships between the presence and absence of genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT with variables clinical and HPV, it was found that there were no significant differences in the presence and the absence of genes the methylated or not in relation to the distribution of variables. The study demonstrated that the absence and presence of genes methylated or not, RARβ, TIMP3, CDH1 and MGMT, did not influence the prognosis of patients suffering from cervical cancer in stages I and II. / O papilomavírus humano (HPV) é um importante fator etiológico no desenvolvimento do câncer cervical, o DNA viral infecta principalmente o epitélio e pode induzir lesões benignas e malignas das membranas de mucosa e pele. A carcinogênese é um processo de múltiplas etapas que envolvem tanto mudanças genéticas quanto epigenéticas. As duas mudanças epigenéticas mais estudadas são a metilação do DNA e acetilação das histonas. A metilação do DNA pode estar relacionada com o desenvolvimento do câncer, e a sua presença e ausência pode afetar no prognóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar o prognóstico das pacientes portadoras de câncer cervical nos estádios I e II por meio da verificação de HPV de baixo e alto risco e da presença e ausência dos genes metilados e não metilados RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT. Foram analisados 129 prontuários e amostras de biópsias parafinizadas das pacientes portadoras de câncer cervical nos estádios I e II. A detecção do DNA – HPV foi realizada por PCR para detectar o DNA do HPV de baixo e alto risco oncogênico e a MSP-PCR para detectar os genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT. O cálculo de sobrevida utilizou-se o método de Kaplan-Meier e o teste de log-hank para comparação das médias de sobrevida entre os fatores prognósticos para câncer cervical. As sobrevidas globais aos 60 meses das pacientes com a presença de RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT metilado ou não foram de: 100%, 90,0%, 85,7%, 92,5%, respectivamente, e as sobrevidas livre de doença foram de 100%, 85,7%, 100%, 100%, respectivamente. A presença e ausência dos genes não interferiram nas sobrevidas global e livre de doença. A prevalência de HPV de baixo risco das pacientes foi de 45 % (58/129) e o HPV de alto risco foi de 76 % (98/129). Em relação as análises para avaliar a existência de relações estatísticas entre a presença e a ausência dos genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT com as variáveis clínicas e do HPV, verificou-se que não houveram diferenças significativas com a presença e a ausência dos genes metilados ou não em relação com as distribuições das variáveis. O estudo demonstrou que a ausência e presença dos genes metilados ou não, RARβ, TIMP3, CDH1 e MGMT, não influenciaram no prognóstico das pacientes portadoras do câncer cervical nos estádios I e II.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-16T14:51:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-16T14:51:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-16T14:51:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-11-25 / Introduction: The colloid goiter (CG) is a heterogeneous disorder and represents the main cause of benign thyroid nodule. Prevalent in geographical areas with iodine deficiency, in most cases carried out expectant conduct or surgically. Classified according to the morphological and functional characteristics, it may present as diffuse or nodular, toxic or nontoxic (with or without functional autonomy). Can reach large volume and compression of neck structures or even turn into malignant disease. Dependent on environmental and genetic factors, with iodine deficiency being the main determinant for the impact on incidence, other environmental and hereditary factors are listed, but little is known about the molecular pathogenesis. Objectives: To map the Epigenetic alterations of the five different surgical parts of CG from patients submitted to total thyroidectomy in Manaus, Amazonas, to analyze, compare and describe the specific pattern for this population. Methods: Five specimens of CG with histopathological confirmation were obtained from the “Normal Thyroid Tissue Bank and with Goiter” from the UFAM. Were used to identify the global methylation patterns of DNA and histone 3 in trimethylated lysine 4, 9 and 27 (H3K4me3, H3K9me3 and H3K27me3). Was used an ELISA type specific immunoassay method, with the results compared between the patients, between the different region of the gland in the same individual and between the individuals. Results: there was no evidence there were significant differences (5%) in the mean global DNA methylation patterns between the patients (p = 0.114) or between the thyroid regions (p = 0.843) considered similar. The mean pan-methylation patterns of histones H3K4me3, H3K9me3 and H3K27me3 are significantly different among patients (p <1%), although there were no significant differences between parts in the same individual (p> 5%). Conclusion: The results of the analyzes of this study revealed that CG parts obeyed a pattern of distribution of significant DNA hypermethylation between patients and parts of CG, differing only among patients the pattern of histone methylation. As these findings are more common in cancer, we may suggest that at the epigenetic level CG may have some common etiologic factor that leads to this tissue response or that responds by phenotypic expressions and malignant transformation. There are now no efficient markers that accurately detect the risk of CG malignancy, much less the possibility of defining its tissue progression, it is very likely that multiple genes will participate in this process. Therefore, the findings found in these patients may make way for the future application of the CG epigenetic study, which may imply the viability of new therapeutic or preventive forms of progression, since the methylation status can be reversed, but other studies in the population are needed to understand better those finding. / Introdução: O bócio coloide (BC) constitui numa desordem heterogênea e representa a principal causa de nódulo benigno da tireoide. Prevalente em áreas geográficas com deficiência de iodo, sendo, na maioria dos casos, conduzido de forma expectante ou cirúrgica. Classificado de acordo com as características morfológicas e funcionais, pode se apresentar difuso ou nodular, tóxico ou atóxico (com ou sem autonomia funcional), podendo alcançar grandes volumes e ocasionar compressão de estruturas do pescoço, ou, não muito raramente, sofrer transformação maligna. Dependente de fatores ambientais e genéticos, com a deficiência de iodo sendo o principal fator determinante para o impacto na incidência, outros fatores ambientais e hereditários são arrolados, porém pouco se conhece da patogênese molecular. Objetivos: mapear as alterações epigenéticas de diferentes regiões de 05 espécies cirúrgicas de BC de pacientes submetidos a tireoidectomia total em Manaus, Amazonas, com o objetivo de analisar, comparar e descrever o padrão específico para esta população. Metodologia: Foram utilizados 05 espécimes de BC com confirmação histopatológica, provenientes do “Banco de Tecidos de Tireoide Normal e com Bócio” da UFAM, e para identificar os padrões de metilação global do DNA e da histona 3 na lisina trimetiladas 4, 9 e 27 (H3K4me3, H3K9me3 e H3K27me3) foram utilizados método de imunoensaio específico do tipo ELISA, com os resultados comparados entre as pacientes, entre as diferentes regiões da glândula num mesmo indivíduo e entre os indivíduos. Resultados: não houveram evidências de que existam diferenças significativas (ao nível de 5%) dos padrões médios de metilação global do DNA entre os pacientes (p = 0,114), ou entre as regiões da tireoide (p = 0,843), sendo, portanto, consideradas similares. Os padrões médios de pan-metilação das histonas H3K4me3, H3K9me3 e H3K27me3 são significativamente diferentes entre os pacientes (p < 1%), apesar de não apresentar diferenças significativas entre as regiões num mesmo indivíduo, (p > 5%). Conclusão: Os resultados das análises deste estudo, revelou que os espécimes de BC obedeceram a um padrão de distribuição de hipermetilação do DNA significativa entre os pacientes e as regiões do BC, diferindo somente entre os pacientes o padrão de metilação das histonas. Como estes achados são mais comuns no câncer, podemos sugerir que em nível epigenético, o BC possa ter algum fator etiológico comum que leve a esta resposta tecidual ou que responda pelas expressões fenotípicas e transformação maligna. Como, até o momento, não existem marcadores eficientes que detecte com precisão a existência de risco de malignização do BC, muito menos a possibilidade de definir sua progressão tecidual, é muito provável que participem múltiplos genes neste processo. Portanto, os achados encontrados nestas pacientes podem abrir caminho na aplicação futura do estudo epigenético do BC, podendo implicar na viabilização de novas formas terapêuticas ou preventivas da progressão, uma vez que, o status de metilação pode ser revertido, porém outros estudos ampliados na população em questão são necessários para entender melhor estes achados.

Submitted by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-09-29T15:10:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Livia Gusmao.pdf: 1628245 bytes, checksum: 42849e5f87bd042f59660a228ded7164 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-09-29T15:10:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Livia Gusmao.pdf: 1628245 bytes, checksum: 42849e5f87bd042f59660a228ded7164 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-29T15:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Livia Gusmao.pdf: 1628245 bytes, checksum: 42849e5f87bd042f59660a228ded7164 (MD5) Previous issue date: 2013 / Hospital Icaraí / O líquen escleroso vulvar está envolvido em uma das vias da carcinogênse da vulva ligada à neoplasia intraepitelial vulvar diferenciada. A metilação da região promotora do DNA é a principal alteração epigenética pela qual um gene é inativado em seres humanos. A metilação do gene P16INK4a, que é um supressor de tumor e atua como inibidor da cinase dependente da ciclina, tem sido descrita como um evento precoce na carcinogênese vulvar. A metilação do gene TIMP-2, que atua como regulador de metaloproteinases, tem sido descrito como marcador de matriz extracelular. Esta pesquisa tem como objetivo estudar a presença da metilação dos genes P16INK4a e TIMP-2 no líquen escleroso vulvar e avaliar a associação das variáveis idade, doença de tireóide, tabagismo, uso de hormônio e prurido vulvar com a metilação dos referidos genes. Trata-se de um estudo transversal, onde foram analisadas 32 amostras obtidas por biópsia de pacientes com líquen escleroso vulvar. As amostras foram submetidas à extração do DNA por meio da técnica do fenol:clorofórmio e à avaliação da metilação dos genes P16INK4a e TIMP-2 pela modificação química do DNA pelo método do bissulfito. O DNA modificado foi submetido à PCR e a visualização do produto pelo gel de poliacrilamida. O estudo da associação de cada uma das variáveis com a metilação de ambos genes não mostrou significado estatístico. Notou-se que 39% (11/28) das amostras exibiram metilação somente para o gene TIMP-2, e nenhuma para o gene P16INK4a isoladamente, enquanto 32% (9/28) apresentaram metilação em ambos genes de forma simultânea. A análise da associação da metilação entre ambos genes mostrou significado estatístico (p=0,0292). Esses resultados sugerem que a associação da metilação entre os genes P16INK4a e TIMP-2 possa promover instabilidade genômica, podendo funcionar como marcador na evolução da doença. Estudos futuros sobre alterações moleculares da matriz extracelular, que por precederem as alterações morfológicas, talvez possam funcionar como sinalizador, individualizando as pacientes com maior risco de evolução do líquen escleroso vulvar para a NIV diferenciada e/ou câncer de vulva / The vulvar lichen sclerosus is involved in one of the pathways of vulvar carcinogenesis linked to differentiated vulvar intraepithelial neoplasia. The methylation of the promoter region of the DNA is the main epigenetic modification in humans in which a gene is inactivated. Methylation of P16INK4a gene, which is a tumor suppressor and acts as an inhibitor of cyclin-dependent kinase, has been described as an early event in carcinogenesis vulva. Methylation of TIMP-2 gene, which acts as a regulator of metalloproteinases, has been described as a marker of extracellular matrix. This research aims to study the presence of methylation of the P16INK4a gene and TIMP-2 in vulvar lichen sclerosus and evaluate the association of age, thyroid disease, smoking, hormone use and vulvar itching with methylation of these genes. It is a cross-sectional study, which analyzed 32 samples obtained by biopsy from patients with vulvar lichen sclerosus. The samples were subjected to DNA extraction by using the technique of phenol: chloroform and evaluation of methylation of the p16INK4a gene and TIMP-2 by chemical modification of DNA by the method of bisulfite. The modified DNA was subjected to PCR and visualization of the product by polyacrylamide gel electrophoresis. The association of each variable in the methylation of both genes showed no statistical significance. It was noted that 39% (11/28) samples showed methylation only to TIMP-2 gene, and none only for the P16INK4a gene, while 32% (9/28) exhibited methylation on both genes simultaneously. The analysis of the association between methylation of both genes showed statistical significance (p = 0.0292). These results suggest that the association between methylation of the P16INK4a gene and TIMP-2 can promote genomic instability, which can act as a marker in the evolution of the disease. Future studies on the molecular alterations of the extracellular matrix, which precede morphological changes, maybe they can function as a signal, separating the patients with higher risk of evolution of vulvar lichen sclerosus to differentiated VIN and / or cancer of the vulva

Orientador: Fabio Tebaldi Silveira Nogueira / Banca:?? / Resumo: A metilação do DNA está relacionada à regulação gênica, memória celular, silenciamento de elementos transponíveis, imprinting genômico e repressão de pseudoelementos provenientes de sequências duplicadas. Os padrões de metilação são estabelecidos, mantidos e traduzidos em estados funcionais apropriados da maquinaria de metilação do DNA, a qual inclui uma família classificada em três grupos de enzimas do tipo metiltransferases: DNMT1, DNMT3 e DNMT2. A DNA metiltransferase 2 (DNMT2) foi identificada na busca de novos candidatos à uma segunda DNA metiltransferase. Esta enzima não possui função biológica definida, porém, é capaz de metilar tanto DNA quanto RNA, em especial RNA transportadores (tRNAs). A DNMT2 está localizada tanto no núcleo quanto no citoplasma em células humanas, sendo capaz de migrar do núcleo para o citoplasma em resposta a estresses celulares. É provável que a enzima metile o tRNA no citoplasma, possivelmente para protegê-lo contra clivagens em situações de estresse. Quando estas clivagens ocorrem de forma específica, pequenos fragmentos de RNA são gerados (denominados tRFs), fato observado em diversas espécies, incluindo Arabidopsis thaliana. Aparentemente, estes fragmentos de RNA fazem parte de uma nova via de interferência por RNA (RNAi). Contudo, seu papel biológico ainda não foi definido. O objetivo deste trabalho foi determinar a função da enzima DNMT2 de plantas durante o desenvolvimento e em resposta a estresses, além de estabelecer seu possível papel na proteção de tRNAs. Até o momento, foi demonstrado que a enzima AtDNMT2 possuí localização, tanto nuclear quanto citoplasmática e também pode ser visualizada em estruturas que aparentam ser citoesqueletos. Foi possível determinar que AtDNMT2 não atua na proteção do tRNA AspGTC durante estresse oxidativo, porém é positivamente regulada durante diferentes tipos de estresse. A planta mutante dnmt2 não possui... / Abstract: DNA methylation is associated with genetic regulation, cell memory, silencing of transposable elements, genomic imprinting and repression of pseudo-elements coming from duplicate sequences. Methylation patterns are established, kept and translated via an appropriate functional DNA methylation machinery, which includes a family of proteins classified into three methyltransferase enzyme groups: DNMT1, DNMT3 e DNMT2. DNA methyltransferase 2 (DNMT2) was first identified by searching for novel DNA methyltransferase candidates. DNMT2 is highly conserved in different kingdoms and does not have a biological function well defined so far; however, it has been shown that DNMT2 can methylate both DNA and RNA in animal cells, most specifically transfer RNA (tRNA). In human cells, DNMT2 is localized both in the nucleus and in the cytoplasm, being capable to migrate from nucleus to cytoplasm under stress conditions. In the cytoplasm, DNMT2 methylates tRNAs, possibly to protect against cleavage events that occur under stress conditions. When these cleavages occur in a specific pattern, small RNA fragment emerges (tRFs). tRFs are found in several species, including Arabidopsis thaliana. It seems that these tRNA fragments are part of a new RNAi pathway. However, its biological role has not been reveal yet. The aim of this work is to evaluate the possible role(s) of DNMT2 in plant development and stress response and also establish its possible role in tRNA protection. So far we demonstrated that AtDNMT2 has both nuclear and cytoplasmic cellular localization and can also be visualized in what seen to be the cytoskeleton. We determined that AtDNMT2 does not play role in tRNA AspGTC protection under oxidative stress, though AtDNMT2 is up regulated in different stresses. The mutant plant Atdnmt2 does not have obvious phenotype, what makes harder to understand its biological role, leading us to deeper molecular studies. In this context, the present work reveals... / Doutor

A depressão é uma doença com alta incidência na população mundial e os antidepressivos atualmente disponíveis não são completamente eficazes. Esses fármacos apresentam uma latência de 2-4 semanas para induzir uma melhora significativa dos sintomas e cerca de 45% dos pacientes não respondem ao tratamento, cujo mecanismo é baseado na facilitação da neurotransmissão monoaminérgica no SNC. Por outro lado, recentemente tem sido demonstrado que a ketamina, antagonista do receptor de glutamato do tipo NMDA induz um efeito antidepressivo rápido e sustentado em animais e pacientes. No entanto, o uso dessa droga para o tratamento da depressão possui diversas limitações e, assim, o entendimento dos mecanismos subjacentes à sua ação antidepressiva pode contribuir para o desenvolvimento de novas e melhores alternativas terapêuticas. Estes mecanismos parecem ser mais complicados do que simplesmente o bloqueio do receptor NMDA, dado que tal bloqueio com o antagonista MK-801, por exemplo, induz efeito tipo-antidepressivo no teste do nado forçado (FST) por até 3 horas, mas sem reproduzir os efeitos prolongados da ketamina. Por isso, a cascata de eventos neuroquímicos iniciada após a administração de ketamina que culmina com a regulação da expressão gênica e síntese de proteínas relacionadas aos processos de plasticidade neural têm sido alvo de grande investigação a fim de se compreender o mecanismo de ação subjacente ao efeito antidepressivo rápido e sustentado dessa droga. A expressão desses genes pode ser modulada por mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA, um processo realizado por DNA metiltransferases (DNMTs), que também tem apresentado grande relevância para a neurobiologia da depressão. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da administração de antagonistas do receptor NMDA, ketamina e MK-801, em doses e protocolos de tratamento que promovam efeito tipo-antidepressivo no FST, sobre a metilação do DNA em estruturas encefálicas importantes para a neurobiologia da depressão, em animais submetidos ou não ao estresse de nado forçado. Para tanto, primeiramente, foram delineados protocolos experimentais para análise do efeito tipo-antidepressivo destas drogas: Em ratos, administração sistêmica aguda de S(+)-ketamina 10 mg/Kg ou MK-801 0,025 mg/Kg 23 horas após a sessão pré-teste e 1 hora ou 7 dias antes da sessão teste do FST, permitiu a análise de um efeito tipo-antidepressivo rápido e sustentado induzido pela ketamina e apenas rápido pelo MK-801. Em seguida, utilizando estes protocolos, avaliou-se os efeitos do estresse do pré-teste do FST e do tratamento com tais antagonistas do receptor NMDA sobre os níveis de metilação global do DNA e expressão de DNMT3a e DNMT3b no córtex frontal, hipocampo ventral e dorsal dos animais. Foram encontradas alterações nas quantificações realizadas, sugerindo que o estresse e o tratamento podem induzir efeitos importantes sobre a metilação do DNA nas estruturas analisadas. Além disso, o tratamento com ketamina ou MK-801 parecem induzir efeitos diferenciais em algumas regiões, o que poderia estar associado aos efeitos também distintos que apresentam sobre a ação antidepressiva / Although depression presents a high incidence in the world population, currently available antidepressants exhibit a latency of 2-4 weeks to induce a significant improvement of symptoms and around 45% of patients do not respond to these drugs. On the other hand, it has been recently shown that ketamine, a NMDA receptor antagonist, induces a rapid and sustained antidepressant effect in animals and patients. However, the use of this drug for depression treatment has several limitations and, thus, the understanding of the mechanisms underlying its antidepressant action could present a significant importance for the development of new and better therapeutic alternatives. These mechanisms appear to be more complex than the initial blockade of the NMDA receptor, since such blockade by MK-801, for example, reduces the immobility time of mice submitted the forced swimming test (FST) for up to 3 hours, without reproducing the sustained effects of ketamine. Therefore, the cascade of neurochemical events that are initiated after ketamine administration that culminate in the regulation of gene expression and syntehsis of proteins related to neuronal plasticity has been the focus of intense investigation. These genes, in turn, can be modulated by epigenetic mechanisms such as DNA methylation, a process performed by DNA methyltransferase (DNMTs), which has also shown a high relevance to the neurobiology of depression and its treatment. Based on that, the present study aimed at investigating the effects induced by ketamine and MK-801, at doses and treatment protocols that promote antidepressant-like effect in the FST, upon DNA methylation in brain structures of animals submitted or not to the forced swim stress. The first experimental protocols were designed for the analysis of acute and sustained drug-induced antidepressant-like effects: In rats, acute systemic administration of S(+)-Ketamine 10 mg/Kg or MK-801 0.025 mg/Kg 23 hours after the pretest session and 1 hour or 7 days before the test session of FST was investigated. Based on these protocols, the effects of stress (FST) and of treatment with NMDA receptor antagonists were investigated on global DNA methylation levels and DNMT3a and Dnmt3b expression in the rat frontal cortex, ventral and dorsal hippocampus. Both, stress and treatment, induced changes in DNA methylation and DNMT3 expression in some of the brain regions analised. In addition, treatment with MK-801 and ketamine seem to induce differential effects in some areas, which could also be associated with different effects that they present on antidepressant action.

Gliomas s~ao tumores heterog^eneos, o que contribui para seu alto grau de mortalidade, apesar de avan¸cos na classifica¸c~ao e tratamento. Desde 2016, a incorpora¸c~ao do estado dos genes IDH e da integridade dos cromossomos 1p e 19q na classifica¸c~ao de gliomas fornece aplica¸c~oes cl´?nicas importantes para o diagn´ostico e tratamento deste tumor; entretanto, a procura por assinaturas moleculares que possam refinar ainda mais os subtipos de glioma em subgrupos mais homog^eneos ´e um esfor¸co cont´?nuo. Este estudo utilizou o maior n´umero de amostras de gliomas adultos (n=932) at´e a atualidade, variando dos graus II ao IV, a fim de definir subgrupos de glioma utilizando assinaturas de metila¸c~ao do DNA, indepentemente de grau e histologia. No total, 7 subtipos foram identificados: Classiclike, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, PA-like, Codels, G-CIMP-low and G-CIMP-high. A maior parte dos subgrupos com IDH tipo selvagem, isto ´e, Classic-like, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, possuem padr~ao de baixa metila¸c~ao do DNA e um pior risco progn´ostico; caracter´?sticas cl´?nicas t´?picas de glioblastomas, o tipo mais agressivo de gliomas. Uma descoberta interessante foi a identifica¸c~ao do subgrupo PA-like dentre gliomas com IDH tipo selvagem, o qual compartilha aspectos gen^omicos similares a astrocitoma piloc´?tico, um glioma pedi´atrico benigno com bom quadro cl´?nico entre gliomas com IDH tipo selvagem. Codels, os quais abragem pacientes com muta¸c~ao em IDH e codele¸c~ao dos cromossomos 1p e 19, possuem o melhor progn´ostico dentre os gliomas difusos em adultos. Uma descoberta importante em rela¸c~ao a gliomas com muta¸c~ao em IDH, por´em sem codele¸c~ao dos cromossomos 1p e 19q, foi a estratifica¸c~ao de gliomas com fen´otipo metilador de ilhas CpG (G-CIMP) em G-CIMP-low, com n´?veis mais baixos de metila¸c~ao do DNA e pior quadro cl´?nico, e G-CIMP-high, com n´?veis mais altos de metila¸c~ao do DNA e melhor risco progn´ostico. Curiosamente, o grau de metila¸c~ao do DNA (-low e -high) estava associado com altera¸c~oes distintas em elementos regulat´orios e modifica¸c~oes de histona aberrantes na regi~ao promotora de genes do ciclo celular. Estes achados consolidaram a import^ancia cl´?nica da epigen´etica, particularmente da metila¸c~ao do DNA, em gliomas, como tamb´em levantou a possibilidade de que a sobrevida m´edia ruim de G-CIMP-low pode ser associada a elementos regulat´orios. Al´em disso, a hip´otese de que enhancers ativos podem agir na regula¸c~ao g^enica de G-CIMP-low fornece mais evid^encias de que elementos regulat´orios podem levar `a maior agressividade e prolifera¸c~ao de G-CIMP-low. Este estudo visa 1) identificar e caracterizar subtipos de gliomas difusos em adultos baseados na metila¸c~ao do DNA, e 2) avaliar a associa¸c~ao entre modifica¸c~oes de histona com um subtipo mais agressivo de G-CIMP / Gliomas are heterogeneous tumors which contribute to their high mortality despite advancements in classification and treatment. As of 2016, the incorporation of IDH status and the integrity of chromosomes 1p and 19q to glioma classification have provided important clinical application for diagnostics and treatment; however, the search for molecular signatures that further refine glioma subtypes into more homogeneous subgroups is an ongoing effort. This study used the largest sample cohort (n=932) of adult gliomas to date, ranging from grades II to IV, in order to define gliomas subgroups using DNA methylation signatures, independent of histopathological grading. In total, 7 subtypes were identified: Classic-like, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, PA-like, Codels, G-CIMP-low and G-CIMP-high. Most IDH -wildtype subgroups, e.g. Classic-like, Mesenchymal-like and LGm6-GBM, had low DNA methylation pattern and a poor outcome, typical of glioblastomas, the most aggressive phenotype of gliomas. An interesting finding was the identification of the PA-like subgroup within IDH -wildtype samples, which shared similar genomic features with pilocytic astrocytoma, a rare pediatric benign glioma, with a good overall survival (OS) among IDH -wildtype gliomas. Codels, which comprise IDH mutant gliomas with codeletion of chromosomes 1p/19q have the best OS across all adult gliomas. An important finding regarding IDH mutant gliomas with no codeletion of chromosomes 1p/19q, was the further segregation of the Glioma-CpG Island Methylator Phenotype (G-CIMP) into G-CIMP-low, with lower levels of DNA methylation and worse OS, and G-CIMP-high, characterized by higher DNA methylation profile and better OS. Interestingly, the degree of G-CIMP methylation (-low and -high) was associated with distinct alterations in regulatory elements and aberrant histone modifications at promoter regions of cell cycle genes. These findings consolidated the clinical importance of epigenetics, particularly DNA methylation, in gliomas, as well as the possibility that aggressive OS in G-CIMP-low may be driven by regulatory elements. Moreover, our results suggest that active enhancers that might be acting in gene regulation in G-CIMP-low provide more evidence of the regulatory elements that might be driving aggressiveness and proliferation in G-CIMP-low. This study aims 1) to identify and characterize adult diffuse glioma DNA methylation subtypes, and 2) evaluate the association of histone modifications with a more aggressive G-CIMP subtype

Os tumores de glândula mamária, à semelhança do que ocorre na espécie humana, são as neoplasias que mais comumente acometem as fêmeas caninas, sendo os cães apontados como importante modelo de estudo desta doença. Com cerca da metade dos tumores mamários caninos considerados malignos, um problema crucial no manejo deste tipo de neoplasia é a busca por fatores prognósticos que auxiliem na escolha do tratamento adjuvante e na predição do curso clínico da doença, uma vez que neoplasias de baixo grau de malignidade , podem apresentar curso agressivo, contrariando os indicadores prognósticos clínicos usuais. Este trabalho teve por objetivo estudar alterações genéticas e epigenéticas em neoplasias mamárias de fêmeas caninas, buscando também avaliar seu valor prognóstico de sobrevida. Para tanto, neoplasias mamárias espontâneas de cães foram colhidas e classificadas de acordo com o tipo e grau histológico, além do imunofenótipo, obtido da marcação de ER&alpha;, PR, HER2 e Ki67. O padrão de metilação global do DNA e o perfil de expressão gênica dos marcadores tumorais BRCA1, BRCA2, ERR&alpha;, ERR&beta;, ERR&gamma;, FGFR2 e GATA3 foram correlacionados com aqueles parâmetros. Para o estudo do padrão de metilação global do DNA foram utilizados 109 fragmentos de tecido mamário neoplásico, conservados em parafina, oriundos do arquivo do Hospital Veterinário da Universidade Metropolitana de Santos. Para imunofenotipagem e estudo imunoistoquímico da expressão de BRCA1, BRCA2, ERR&alpha;, ERR&beta;, ERR&gamma;, FGFR2 e GATA3 foram colhidos em estudo prospectivo 78 fragmentos de tecido mamário neoplásico e não neoplásico, provenientes de 70 fêmeas da espécie canina com diagnóstico clínico de neoplasia mamária e que foram submetidas a tratamento cirúrgico. O material assim obtido foi conservado em nitrogênio líquido, para os estudos de expressão de RNAm por qPCR e em blocos de parafina, para os estudos histopatológicos e imunoistoquímicos. O estadiamento clínico mostrou-se fator prognóstico importante, assim como diâmetro tumoral, grau histológico do tumor, uso de quimioterapia adjuvante e recorrência. Os estudos epigenéticos demonstraram que o padrão de metilação do DNA independe do tipo histológico do tumor e de seu grau histológico, guardando correlação apenas com o grau de malignidade dos tumores; no entanto, este marcador demonstrou-se interessante previsor de recidiva tumoral, com diferença estatística significativa entre os animais que apresentaram recidiva e aqueles que não a apresentaram. Nos estudos de imunofenotipagem, foi possível observar por meio da técnica de imunoistoquímica que, tanto a expressão de ER&alpha; quanto de PR nas fêmeas caninas guardam, à semelhança da mulher, relação com o estado reprodutivo e hormonal das pacientes. Também foi observado que os marcadores ER&alpha;, PR e HER2 em sua maioria se correlacionam com o tipo e grau histológico quando transformados em variável categórica; porém, não apresentam valor prognóstico de sobrevida. No entanto, Ki67 demonstrou forte correlação com tipo e grau histológico dos tumores, com a presença de linfonodos positivos e metástase pulmonar, apresentando-se como fator prognóstico independente nas neoplasias mamárias caninas. Na busca por candidatos a marcadores tumorais, observou-se que, em sua maioria, os marcadores BRCA1, BRCA2, ERR&alpha;, ERR&beta;, ERR&gamma;, FGFR2 e GATA3 não apresentaram correlação com tipo e grau histológico do tumor; porém, FGFR2 mostrou-se fator prognóstico de sobrevida para as fêmeas caninas portadoras de neoplasia. A finalidade de estudos integrados que correlacionem aspectos clínicos, morfológicos e moleculares das neoplasias é avançar em seu conhecimento e obter novas perspectivas para o sucesso no tratamento destas doenças. Esperamos que, com este trabalho, tenhamos contribuído para atingir estes objetivos. / Tumors of the mammary gland, similar to what occurs in the human species, are the most common cancers that affect the female dogs, being this species pointed out as an important model for the study of this disease. With about half of canine mammary tumors considered malignant, a crucial issue in the management of this type of cancer is the search for prognostic factors that assist in the choice of adjuvant therapy and in predicting the clinical course of the disease, since low-grade neoplasms malignancy can present aggressive course, contrary to the usual clinical prognostic indicators. This work aimed to study genetic and epigenetic changes in mammary tumors in female dogs, seeking also to evaluate its prognostic value for survival. For this purpose , spontaneous mammary tumors of dogs were collected and classified according to the histological type and grade, plus the immunophenotype obtained by evaluating ER&alpha;, PR , HER2 and Ki67 . The pattern of global DNA methylation and gene expression of tumor markers BRCA1, BRCA2, ERR&alpha;, ERR&beta;, ERR&gamma;, FGFR2 and GATA3 profile were correlated with those parameters . Pattern of DNA global methylation was studied in 109 formalin-fixed paraffin-embedded neoplastic mammary tissue, obtained from the archives of the Veterinary School Hospital of the Universidade Metropolitana de Santos. Immunophenotyping and immunohistochemical study of the expression of BRCA1, BRCA2, ERR&alpha;, ERR&beta;, ERR&gamma;, FGFR2 and GATA3 were performed in a prospective study with 78 fragments of neoplastic and non-neoplastic mammary tissue from 70 female dogs, with clinical diagnosis of mammary cancer and that underwent surgical treatment. The material was stored in liquid nitrogen for studies of mRNA expression by qPCR and in paraffin for histopathological and immunohistochemical studies. Clinical staging was an important prognostic factor, as well as tumor size, histological and tumor grade, use of adjuvant chemotherapy and recurrence. Epigenetic studies have shown that the pattern of DNA methylation is independent of the histological and tumor grade, keeping, however, correlation with the degree of malignancy of the tumors and interesting predictor value for tumor recurrence. Immunophenotyping studies showed that both ER&alpha; and PR expression, like in women, presented correlation with reproductive and hormonal status of the patients. It was also observed that ER&alpha;, PR and HER2 tumor markers mostly correlate with histological type and grade when considered a categorical variable, but they have not shown any prognostic survival value. However Ki67 showed strong correlation with histological type and grade of the tumors, the presence of positive lymph nodes and lung metastasis, and can be considered an independent prognostic factor in canine mammary tumors. In search for candidates for tumor markers, we found that, mostly BRCA1, BRCA2, ERR&alpha;, ERR&beta;, ERR&gamma;, FGFR2 and GATA3 markers showed no correlation with histological type and grade of the tumor, although FGFR2 showed prognostic survival value for female dogs affected by breast cancer. The purpose of integrated studies correlating clinical, morphological and molecular aspects of cancer is to gain further knowledge and to glimpse new perspectives for success in treating these diseases. We hope that with this work, we have contributed to achieve these goals.

O linfoma não-Hodgkin (LNH) é bastante prevalente em cães e atualmente é aceito como modelo comparativo da doença em humanos. Padrões aberrantes de metilação de DNA parecem exercer um papel chave no desenvolvimento de tumores hematopoiéticos nos seres humanos, constituem um mecanismo especial de controle transcricional e podem ser influenciados por alterações genéticas e ambientais. Os efeitos da metilação global do DNA têm sido raramente investigados em cães, principalmente em processos neoplásicos. O objetivo do presente estudo foi quantificar a metilação global do DNA em leucócitos sanguíneos de cães portadores de LNH, comparando com a metilação global do DNA de leucócitos sanguíneos de cães sadios e identificar genes diferentemente metilados nas mesmas amostras. Para isto, utilizou-se o DNA obtido da capa leucocitária de amostras de sangue venoso periférico de 10 cães sadios e 9 cães com LNH multicêntrico. Para imunofenotipagem dos linfomas, aplicou-se o painel imunocitoquímico de anticorpos anti-CD79a, anti-PAX5 e anti-CD3. O índice de proliferação celular foi obtido por meio da contagem de núcleos positivos para Ki-67. A metilação global do DNA dos leucócitos foi quantificada pelo método High Performance Liquid Chromatography (HPLC) e visualmente (por escores) em amostras submetidas a imunocitoquímica (ICQ) com o anticorpo anti-5-metil citosina (5MetCyt). Para a identificação de genes diferentemente metilados entre ambos os grupos avaliados, utilizou-se a técnica de beadchip com o ensaio Infinium Methylation EPIC BeadChip humano (850K). Como resultados, em ambos os métodos (HPLC e ICQ), os leucócitos sanguíneos de cães portadores de LNH apresentaram metilação global do DNA significantemente inferior à dos cães sadios (HPLC: p= 0,027 / ICQ: p= 0,015). Das 853.307 ilhas CpGs investigadas no microarranjo, houve hibridização de 34.574 sondas nas amostras caninas. Desse total, observou-se diferença significante em nível de metilação de 606 sondas, e por meio da análise das similaridades homólogas e ortólogas, identificou-se 550 genes diferentemente metilados entre os dois grupos. Nosso estudo foi pioneiro em sugerir que cães com LNH apresentam hipometilação global do DNA de leucócitos circulantes quando comparados a cães sadios. Apesar de termos usado amostras caninas em um ensaio desenvolvido especificamente para o DNA humano (Infinium Methylation EPIC BeadChip) foi possível a identificação de genes diferentemente metilados e possíveis novos alvos com potencial preventivo ou terapêutico. Futuros estudos epidemiológicos são necessários para correlacionar o padrão de metilação de leucócitos com o risco de desenvolver linfomas e utilizá-lo como biomarcador / Non-Hodgkin\'s lymphoma is quite prevalent in dogs and it is currently accepted as a comparative model for the disease in humans. Aberrant patterns of DNA methylation appear to play a key role in the development of hematopoietic tumors in humans, constitute a special mechanism of transcriptional control and may be influenced by genetic and environmental variations. The effects of methylation have been rarely investigated in dogs, especially in neoplastic processes. The aim of the current study is to quantify the global DNA methylation of blood from dogs bearing non-Hodgkin\'s lymphoma, comparing them with the methylation content and pattern of healthy dogs and identify differently methylated genes in the same samples. For this, the DNA obtained from the buffy coat of peripheral venous blood samples from 10 healthy dogs and 9 dogs with multicentric non-Hodgkin\'s lymphoma were used. For immunophenotyping of lymphomas, the immunocytochemical panel of anti-CD79a, anti-PAX5 and anti-CD3 antibodies were applied. The cell proliferation index was performed by counting positive nuclei with anti-Ki-67. The global methylation of leukocyte DNA was quantified by the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method and visually (by scoring) in samples subjected to immunocytochemistry (ICQ) with the anti-5-methyl cytosine antibody (5MetCyt). For the identification of differently methylated genes between both groups, the bead chip technique was used with the Infinium Methylation EPIC BeadChip human assay (850K). As a result, in both methods (HPLC and ICQ), dogs with non-Hodgkin\'s lymphoma had a lower amount of methylation than healthy dogs (HPLC: p = 0.027 / ICQ: p = 0.015). Of the 853,307 CpGs investigated in the microarray, there were 34,574 probes hybridized in the canine samples. From this total, significant difference was observed in the methylation level of 606 probes and through the homologous and orthologous similarities, 550 differently methylated genes were identified between the two groups. Our study was a pioneer in suggesting that dogs bearing non-Hodgkin\'s lymphoma presented DNA global hypomethylation of circulating leukocytes when compared to healthy dogs. Although we used canine samples in an assay developed specifically for human DNA (Infinium Methylation EPIC BeadChip) it was possible to identify differently methylated genes and possible new targets with preventive or therapeutic potential. Future epidemiological studies are needed to correlate the methylation pattern of leukocytes with the risk of developing lymphomas and to use it as a biomarker

A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse. / Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress.