Com o objetivo de desenvolver a quantificação das hifas externas e da sua atividade aos 30, 60 e 90 dias após o plantio (DAP), foram conduzidos dois experimentos em casa de vegetação utilizando-se Zea Mays inoculado e não inoculado com Glomus etunicatume doses crescentes de fosforo (0, 25, 50 e 75 mg de P/kg de solo). O micélio extramatrical foi extraído do solo através da técnica da membrana de filtração e quantificado pela técnica da grade de filtração. A proporção de hifas ativas foi determinada pelo método de coloração enzimática por Iodonitrotetrazólio (INT). Tanto a técnica de extração quanto o método de coloração por INT não apresentaram resultados promissores quando utilizados em solos argilosos. As limitações da quantificação da atividade e do método de extração de hifas externas de fungos micorrízicos vesículo-arbusculares através da técnica da membrana de filtração e do método de coloração enzimático por INT são discutidas. Observou-se que aos 30 e 60 DAP houve um aumento do micélio externo total e uma atividade com a elevação das doses de P aplicadas ao solo / not available

Com o objetivo de desenvolver a quantificação das hifas externas e da sua atividade aos 30, 60 e 90 dias após o plantio (DAP), foram conduzidos dois experimentos em casa de vegetação utilizando-se Zea Mays inoculado e não inoculado com Glomus etunicatume doses crescentes de fosforo (0, 25, 50 e 75 mg de P/kg de solo). O micélio extramatrical foi extraído do solo através da técnica da membrana de filtração e quantificado pela técnica da grade de filtração. A proporção de hifas ativas foi determinada pelo método de coloração enzimática por Iodonitrotetrazólio (INT). Tanto a técnica de extração quanto o método de coloração por INT não apresentaram resultados promissores quando utilizados em solos argilosos. As limitações da quantificação da atividade e do método de extração de hifas externas de fungos micorrízicos vesículo-arbusculares através da técnica da membrana de filtração e do método de coloração enzimático por INT são discutidas. Observou-se que aos 30 e 60 DAP houve um aumento do micélio externo total e uma atividade com a elevação das doses de P aplicadas ao solo / not available

Tese de mestrado integrado. Engenharia Química. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T17:06:16Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 183969 bytes, checksum: 54f3ae2567e427aa5cdc5063341ebea0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T17:06:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 183969 bytes, checksum: 54f3ae2567e427aa5cdc5063341ebea0 (MD5) Previous issue date: 2003-12-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da produção micelial de Agaricus blazei em meio líquido com diferentes composições, para uso em produção de semente-inóculo e composto miceliado. Observou-se que a taxa de crescimento micelial dos isolados AB51, LF e SO em meio BDA e em composto comercial foi semelhante. Quando esses isolados foram cultivados em meio de cultura líquido, à base de batata, acrescido de glicose, também não foi observada diferença entre o crescimento dos isolados. Porém, quando esse meio foi acrescido de sacarose (açúcar comercial não refinado), o isolado SO foi o que produziu maior massa micelial seca. Ao cultivar o isolado LF em meios de cultura à base de farelos de arroz, farinha de mandioca e,ou fubá, observou-se que nos meios que continham o farelo de arroz, houve maior produção de massa micelial seca. O inóculo líquido, preparado com a mistura de 2% de farelo de arroz e 2% de farinha de mandioca, foi muito eficiente na produção de semente-inóculo à base de grãos de arroz, permitindo uma colonização uniforme do substrato, quando comparado ao inóculo sólido, devido a uma melhor distribuição do micélio fúngico. Entretanto, ao utilizar o inóculo líquido para a inoculação do composto comercial pasteurizado ou esterilizado, mesmo nos casos em que o fungo foi cultivado em meio contendo extrato do composto, não houve crescimento micelial. Pode-se concluir que a produção de pré-inóculo utilizando meio líquido enriquecido com farelos de arroz e,ou farinha de mandioca é uma técnica viável e promissora para a produção de inóculo-semente, por favorecer o crescimento micelial e também pelo baixo custo desses substratos. / The objective of this work was to evaluate the viability of mycelial production of Agaricus blazei in liquid culture with different compositions to be used both as pre- inoculum and as inoculum for compost. The mycelial growth rate of isolates AB51, LF, and SO in PDA and in commercial compost was similar. When these isolates were cultivated in potato dextrose broth (PD), no difference was observed among isolates. However, when commercial sugar (sucrose) was added to the medium, isolate SO produced the highest mycelial dry mass. When isolate LF was grown in culture media based on rice bran, cassava flour and,or corn bran, the highest mycelial dry mass was observed when rice bran was present. The liquid inoculum prepared with a mixture of 2% rice bran and 2% cassava flour was more efficient than solid culture for the production of inoculum/spawn based on rice grains, allowing xa uniform colonization of substrate due to a better distribution of the fungal mycelium through the pores spaces between the grains. However, when the liquid inoculum was used to inoculate commercial compost, either pasteurized or sterilized, no mycelial growth was observed, even in cases when the mycelium was cultivated in medium containing compost extract. The production of pre-inoculum using liquid medium, enriched with rice bran and,or cassava flour, is a viable and promising technique for inoculum/spawn production, not only by improving mycelial growth but also because of the low cost of substrates.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-01-20T14:43:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-20T14:44:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-20T14:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the important systemic mycosis in Latin America, with high incidence in Brazil, Argentina, Colombia and Venezuela. The disease has been attributed to the thermodimorphic fungus Paracoccidioides sp.. During the infective process, we can highlight the role of the cell wall, which is a dynamic structure, vital for growth, survival and morphogenesis of the fungus. In addition, this structure is constantly changing in response to environmental signals and different stages of the cycle of the fungus. The interest in the fungal cell wall occurs primarily by lack of this structure in mammalian cells; for this reason cell wall components are promising targets for antifungal drug design. In order to describe the profile of cell wall proteins (CWPs) of Paracoccidioides sp., it was used a proteomic approach coupling nanoscale liquid chromatography to multiplexed mass spectrometry (nanoUPLC-MSE) to identify the CWPs isolated from Paracoccidioides sp. yeast cells and mycelia. Among the identified proteins, it was found a transglycosylase orthologue to the Crh1p, which is a GPI anchored protein, known to be involved in attaching chitin to β-glucan. Adhesins previously described in Paracoccidioides sp. such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate, alcohol dehydrogenase, fructose-1,6-biphosphate aldose and some chaperones were also identified. Moreover, we identified formamidase that was previously described as localized in the fungus cell wall and may be involved in nitrogen metabolism besides contributing with antigenic properties. / Paracoccidioidomicose é uma importante micose sistêmica na América latina, com alta incidência no Brasil, Argentina, Colômbia e Venezuela. A doença é atribuída ao fungo termodimórfico Paracoccidioides spp.. Durante o processo infecioso podemos destacar o papel desempenhado pela parede celular, estrutura esta, vital para o crescimento, sobrevivência, e morfogênese do fungo, a qual está em constante mudança em resposta a sinais do ambiente. O interesse no estudo da parede celular de fungos ocorre principalmente pela ausência dessa estrutura nas células de mamíferos; por esse motivo os componentes da parede são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas. Para descrever o perfil das proteínas constituintes da parede celular (PPCs) de Paracoccidioides sp. nas formas leveduriforme e miceliana, foi utilizada uma abordagem proteômica combinando cromatografia líquida em nanoescala com espectrometria de massas multiplexada (nanoUPLC-MSE). Entre as proteínas identificadas foi encontrada uma transglicosidase, homologa a Crh1p, correspondendo a uma proteína GPI ancorada, conhecida por estar envolvida em ligar quitina à β-glucana. Adesinas anteriormente descritas em Paracoccidioides sp. como enolase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, álcool desidrogenase, frutose-1,6-bifosfato aldolase e algumas chaperonas também foram identificadas. Além disso, nós identificamos a formamidase que tem sido descrita como localizada na parede celular e pode estar envolvida no metabolismo de nitrogênio, além de contribuir com propriedades antigênicas.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada por Paracoccidioides spp., (P. brasiliensis e P. lutzii), geograficamente, limita-se a América Latina com as áreas endêmicas estendendo-se desde o México até a Argentina, constituindo uma das micoses sistêmicas de maior incidência na região, afetando principalmente trabalhadores rurais. O maior número de pacientes com PCM tem sido reportado principalmente no Brasil, Colômbia e Venezuela. A incidência real desta micose encontra-se subestimada no Brasil e pouco se conhece em relação a nova espécie descrita - P. lutzii. A maioria dos estudos em P. lutzii foram focados em genética, especiação e na geração de novos antígenos para melhorar a especificidade e sensibilidade dos testes sorológicos. Atualmente, as preparações antigênicas tradicionais, preparadas a partir de isolados de P. brasiliensis, são ineficientes. Raros são os trabalhos focados na biologia de P. lutzii e nos fatores de virulência que podem ser comparados com P. brasiliensis nos modelos experimentais. A nossa proposta de estudo foi avaliar alguns aspectos in vitro e in vivo relacionados com a patogenicidade e destacamos: a fagocitose e a morte intracelular de P. lutzii por macrófagos, peritoneais, de camundongos Knockouts (KO) e selvagens para PRRs (TLR2, TLR4 e Dectina) e ativadores intracelulares (MyD88 e NALP3). Paralelamente a este estudo, animais foram infectados com leveduras de P. lutzii e comparados com os modelos de infecção já estabelecidos com leveduras (Pb18) e conídios (ATCCPb60855) de P. brasiliensis. Nossos dados indicam que similar ao que ocorre com P. brasiliensis a fagocitose de P. lutzii depende de TLR2, TLR4 e Dectina- 1, resultados semelhantes também foram observadas na expressão de moléculas envolvidas na co-estimulação e a apresentação de antígenos (MHC II, CD80 e CD86). Contudo, a morte intracelular de leveduras de P. lutzii é claramente dependente de TLR4, e a produção de citocinas IL-6, MIP-2, IFN- e IL-12p40 são importantes para o controle das leveduras pelos macrófagos. No modelo experimental de P. lutzii, camundongos machos C57BL/6 (6-7 semanas) foram infectados intratraquealmente como 1x106 leveduras viáveis do isolado de P. lutzii Pb01. Encontramos duas fases da doença, a primeira de 0 hora até 2 a 4 semanas pós-infecção, e a segunda de 4 até 12 semanas. As leveduras parecem ser contidas na primeira semana de infecção e posteriormente não encontramos leveduras nos macerados de pulmão, diferente do modelo de BALB/c infetado com conídios de ATCC-Pb60855 no qual as UFC são recuperadas até a semana 16 pós-infeção. Como relação aos níveis de citocinas, encontramos que na lavagem broncoalveolar e macerado de pulmão um perfil misto Th1/Th2 porém, marcado por citocinas próinflamatórias no primeiro período e citocinas regulatórias tipo Th2 no segundo período (IL-12p70, IL-23, IL-10); similar ao descrito nos modelos de P. brasiliensis infectados tanto com conídios como com leveduras. No entanto, no primeiro período da doença, em camundongos C57BL/6, parece ter uma carga inflamatória maior que reflete nas citocinas que mantém seus níveis até o período crônico: TNF-alfa, MIP-2 e GM-CSF está última, regulada positivamente tanto em experimentos in vitro como in vivo. Também observamos que a partir das 48horas pós-infecção encontramos níveis aumentados de IL-12p70 até o período crônico onde junto com a IL-23 parecem ser as responsáveis pela diminuição da infecção no período tárdio. Esta é a primeira vez que se descreve um modelo experimental com P. lutzii (isolado Pb01) indicando o perfil imunopatológico com pequenas diferenças comparados ao P. brasiliensis porém, de importância na patogenicidade da doença auxiliando a compreender as diferentes formas da doença no modelo experimental / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides spp. (P. brasiliensis and P. lutzii), geographically, is limited to Latin America with endemic areas from Mexico to Argentina, as one of the systemic mycoses with the highest incidence in the region, mainly affecting rural workers. The largest number of patients with PCM has been mainly reported in Brazil, Colombia and Venezuela. The true incidence of this mycosis is underestimated in Brazil and little is known about the new species described - P. lutzii. Most studies in P. lutzii were focused on genetics, speciation and the generation of new antigens to improve the specificity and sensitivity of serological tests. Currently, traditional antigenic preparations, prepared with isolates of P. brasiliensis, are inefficient. There are few studies focused on P. lutzii biology and virulence factors that can be compared with P. brasiliensis in experimental models. Our study aimed to evaluate some in vitro and in vivo aspects related to pathogenicity: phagocytosis and intracellular killing of P. lutzii by peritoneal macrophages from knockouts (KO) for PRRs (TLR2, TLR4 and Dectin) and intracellular activators (MyD88 and NALP3). In addition, animals were infected with P. lutzii yeast and compared with the well-established models of infection with yeast cells (Pb18) and conidia (ATCC Pb60855) from P. brasiliensis. Our data indicate that similarly to what happens with the phagocytosis of P. brasiliensis, P. lutzii phagocytosis is dependent on TLR2, TLR4 and Dectin-1. Other molecules, involved in co-stimulation and presentation of antigens such as MHC II, CD80 and CD86 were also shown to participate in the P. lutzii-host interaction. However, intracellular killing of P. lutzii yeast cells was clearly dependent on TLR4, and the production of cytokines as IL-6, MIP-2, IFN- and IL-12p40 were important for the control of the yeast by macrophages. In the experimental model of P. lutzii, male C57BL/6 mice (6-7 weeks) were infected intratracheally with 1x106 viable yeasts of the isolate Pb01like. We found two phases of the disease, the first from the inoculation to 2 or 4 weeks after infection and the second from 4 to 12 weeks. Yeast appear to be contained within the first week of infection and subsequently are also absent from macerated lung, differently from the model of BALB/c mice infected with ATCC Pb60855 conidia in which CFUs were detected up to week 16 post-infection. We found a mixed Th1/Th2 pattern (IL-12p70, IL-23, IL-10) in bronchoalveolar lavage and lung, with the predominance of proinflammatory cytokines in the first phase and predominance of regulatory Th2 cytokines in the second phase, reproducing findings of P. brasiliensis infection models produced with both conidia and yeast. However, in the first period of the disease in C57BL/6 mice there was a higher inflammatory burden, reflected by the high cytokine levels (TNF-alpha, MIP-2 and GM-CSF), the latter in particular because it was positively regulated both in vitro and vivo), that persisted through the chronic period. We also observed that starting from 48 hours postinfection to the chronic period there were increased levels of IL-12p70, which together with IL-23 appeared to be responsible for the reduction of infection in the late period. This is the first time that an experimental model with P. lutzii (Pb01) is described, showing an immunological profile with only slight differences compared to the P. brasiliensis model. The present study details important aspects of the pathogenesis of the disease due to different species of Paracoccidioides and helps to understand the different forms of presentation in experimental models

Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal consumido tradicionalmente nos países asiáticos que apresenta diversos efeitos benéficos comprovados. Apesar de todos os estudos sobre seus compostos bioativos, a melhor forma de enriquecimento de meios de cultivo visando aumentar a produção destes compostos ainda se mantém incerta. Além disso, poucos trabalhos tratam dos efeitos sobre o desempenho de animais de produção. Para testar diferentes meios de cultivo de micélio de G. lucidum, foram testados resíduos agrícolas (fermentação em estado sólido) e diferentes açúcares e aminoácidos (em meios de cultura com ágar), para avaliar o crescimento do micélio de G. lucidum. O fornecimento de farinha com micélio de G. lucidum obtido por fermentação em meio sólido (grãos de trigo) para coelhos também foi avaliado. O micélio de G. lucidum desenvolveu-se bem nos resíduos agrícolas, destacando-se a casquinha de soja que apresentou maior taxa de crescimento e também maior concentração de β-glucanas. No experimento em placas, o G. lucidum também se desenvolveu bem, destacando-se os meios que continham celobiose e tirosina, que apesar de apresentarem menores taxas de crescimento e crescimento total em 10 dias, produziram micélios com maior concentração de β-glucanas e capacidade antioxidante em equivalentes trolox (TEAC), respectivamente. Os coelhos não apresentaram sinais de intolerância ao consumo de ração com diferentes concentrações farinha com micélio de G. lucidum. Todos os parâmetros de desempenho e avaliação de carcaça foram adequados à idade em que foram abatidos. A avaliação histológica dos órgãos apresentou alterações nas células renais (tubulares e glomerulares), apontando para uma possível lesão renal conforme aumentou a concentração de farinha com micélio na ração. A avaliação histomorfométrica resultou em maior altura de vilosidade de íleo e menor largura de vilosidade de jejuno na concentração 0,5%, e redução do diâmetro de cripta conforme o aumento da concentração de farinha com micélio. Estes resultados indicam a possibilidade de estudos mais aprofundados sobre os aspectos de utilização de celobiose e tirosina para produção de compostos bioativos, e sobre aspectos de toxicidade do micélio deste cogumelo para segurança no fornecimento para animais. / Ganoderma lucidum is a medicinal mushroom traditionally consumed in Asian countries that presents several beneficial effects already verified. Despite all studies about their bioactive compounds, the best cultivation media enrichment aiming to increase the production of these compounds is still uncertain. Besides, few studies are related to the performance of production animals. In order to test different cultivation media for G. lucidum mycelia, agricultural residues (solid state fermentation) and different sugars and aminoacids (in culture media with agar), were tested to evaluate G. lucidum mycelium growth. Supply of flour with G. lucidum mycelia obtained by solid state fermentation (wheat grain) for rabbits was also evaluated. Mycelium of G. lucidum developed very well in all agricultural residues, soybean hulls was the residue that presented higher growth rate and higher concentration of β-glucans. In the cultivation media experiment, G. lucidum also developed well, media that contained cellobiose and tyrosine, despite presenting lower growth rates and total growth within 10 days, produced mycelia with higher concentration of β-glucans and trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), respectively. Rabbits did not show any sign of intolerance to feed with different concentrations of flour with G. lucidum mycelium. All performance parameters and dressing percentages were adequate to the age at which they were slaughtered. Histological evaluation of organs presented alterations in renal cells (tubular and glomerulus), indicating a possible renal lesion according to the increase of flour with mycelium in feed. Histomorphometric evaluation showed increased vilous height in ileum and decreased vilous width of jejunus at 0.5% concentration, and decrease in crypt diameter according to the increase of concentration of flour with mycelium in feed. These results indicate the possibility of more studies regarding the aspects about cellobiose and tyrosine utilization for the production of bioactive compounds, and about toxicity of this mushroom mycelia, assuring the safety in supplying this product for animails.

Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal consumido tradicionalmente nos países asiáticos que apresenta diversos efeitos benéficos comprovados. Apesar de todos os estudos sobre seus compostos bioativos, a melhor forma de enriquecimento de meios de cultivo visando aumentar a produção destes compostos ainda se mantém incerta. Além disso, poucos trabalhos tratam dos efeitos sobre o desempenho de animais de produção. Para testar diferentes meios de cultivo de micélio de G. lucidum, foram testados resíduos agrícolas (fermentação em estado sólido) e diferentes açúcares e aminoácidos (em meios de cultura com ágar), para avaliar o crescimento do micélio de G. lucidum. O fornecimento de farinha com micélio de G. lucidum obtido por fermentação em meio sólido (grãos de trigo) para coelhos também foi avaliado. O micélio de G. lucidum desenvolveu-se bem nos resíduos agrícolas, destacando-se a casquinha de soja que apresentou maior taxa de crescimento e também maior concentração de β-glucanas. No experimento em placas, o G. lucidum também se desenvolveu bem, destacando-se os meios que continham celobiose e tirosina, que apesar de apresentarem menores taxas de crescimento e crescimento total em 10 dias, produziram micélios com maior concentração de β-glucanas e capacidade antioxidante em equivalentes trolox (TEAC), respectivamente. Os coelhos não apresentaram sinais de intolerância ao consumo de ração com diferentes concentrações farinha com micélio de G. lucidum. Todos os parâmetros de desempenho e avaliação de carcaça foram adequados à idade em que foram abatidos. A avaliação histológica dos órgãos apresentou alterações nas células renais (tubulares e glomerulares), apontando para uma possível lesão renal conforme aumentou a concentração de farinha com micélio na ração. A avaliação histomorfométrica resultou em maior altura de vilosidade de íleo e menor largura de vilosidade de jejuno na concentração 0,5%, e redução do diâmetro de cripta conforme o aumento da concentração de farinha com micélio. Estes resultados indicam a possibilidade de estudos mais aprofundados sobre os aspectos de utilização de celobiose e tirosina para produção de compostos bioativos, e sobre aspectos de toxicidade do micélio deste cogumelo para segurança no fornecimento para animais. / Ganoderma lucidum is a medicinal mushroom traditionally consumed in Asian countries that presents several beneficial effects already verified. Despite all studies about their bioactive compounds, the best cultivation media enrichment aiming to increase the production of these compounds is still uncertain. Besides, few studies are related to the performance of production animals. In order to test different cultivation media for G. lucidum mycelia, agricultural residues (solid state fermentation) and different sugars and aminoacids (in culture media with agar), were tested to evaluate G. lucidum mycelium growth. Supply of flour with G. lucidum mycelia obtained by solid state fermentation (wheat grain) for rabbits was also evaluated. Mycelium of G. lucidum developed very well in all agricultural residues, soybean hulls was the residue that presented higher growth rate and higher concentration of β-glucans. In the cultivation media experiment, G. lucidum also developed well, media that contained cellobiose and tyrosine, despite presenting lower growth rates and total growth within 10 days, produced mycelia with higher concentration of β-glucans and trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), respectively. Rabbits did not show any sign of intolerance to feed with different concentrations of flour with G. lucidum mycelium. All performance parameters and dressing percentages were adequate to the age at which they were slaughtered. Histological evaluation of organs presented alterations in renal cells (tubular and glomerulus), indicating a possible renal lesion according to the increase of flour with mycelium in feed. Histomorphometric evaluation showed increased vilous height in ileum and decreased vilous width of jejunus at 0.5% concentration, and decrease in crypt diameter according to the increase of concentration of flour with mycelium in feed. These results indicate the possibility of more studies regarding the aspects about cellobiose and tyrosine utilization for the production of bioactive compounds, and about toxicity of this mushroom mycelia, assuring the safety in supplying this product for animails.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada por Paracoccidioides spp., (P. brasiliensis e P. lutzii), geograficamente, limita-se a América Latina com as áreas endêmicas estendendo-se desde o México até a Argentina, constituindo uma das micoses sistêmicas de maior incidência na região, afetando principalmente trabalhadores rurais. O maior número de pacientes com PCM tem sido reportado principalmente no Brasil, Colômbia e Venezuela. A incidência real desta micose encontra-se subestimada no Brasil e pouco se conhece em relação a nova espécie descrita - P. lutzii. A maioria dos estudos em P. lutzii foram focados em genética, especiação e na geração de novos antígenos para melhorar a especificidade e sensibilidade dos testes sorológicos. Atualmente, as preparações antigênicas tradicionais, preparadas a partir de isolados de P. brasiliensis, são ineficientes. Raros são os trabalhos focados na biologia de P. lutzii e nos fatores de virulência que podem ser comparados com P. brasiliensis nos modelos experimentais. A nossa proposta de estudo foi avaliar alguns aspectos in vitro e in vivo relacionados com a patogenicidade e destacamos: a fagocitose e a morte intracelular de P. lutzii por macrófagos, peritoneais, de camundongos Knockouts (KO) e selvagens para PRRs (TLR2, TLR4 e Dectina) e ativadores intracelulares (MyD88 e NALP3). Paralelamente a este estudo, animais foram infectados com leveduras de P. lutzii e comparados com os modelos de infecção já estabelecidos com leveduras (Pb18) e conídios (ATCCPb60855) de P. brasiliensis. Nossos dados indicam que similar ao que ocorre com P. brasiliensis a fagocitose de P. lutzii depende de TLR2, TLR4 e Dectina- 1, resultados semelhantes também foram observadas na expressão de moléculas envolvidas na co-estimulação e a apresentação de antígenos (MHC II, CD80 e CD86). Contudo, a morte intracelular de leveduras de P. lutzii é claramente dependente de TLR4, e a produção de citocinas IL-6, MIP-2, IFN- e IL-12p40 são importantes para o controle das leveduras pelos macrófagos. No modelo experimental de P. lutzii, camundongos machos C57BL/6 (6-7 semanas) foram infectados intratraquealmente como 1x106 leveduras viáveis do isolado de P. lutzii Pb01. Encontramos duas fases da doença, a primeira de 0 hora até 2 a 4 semanas pós-infecção, e a segunda de 4 até 12 semanas. As leveduras parecem ser contidas na primeira semana de infecção e posteriormente não encontramos leveduras nos macerados de pulmão, diferente do modelo de BALB/c infetado com conídios de ATCC-Pb60855 no qual as UFC são recuperadas até a semana 16 pós-infeção. Como relação aos níveis de citocinas, encontramos que na lavagem broncoalveolar e macerado de pulmão um perfil misto Th1/Th2 porém, marcado por citocinas próinflamatórias no primeiro período e citocinas regulatórias tipo Th2 no segundo período (IL-12p70, IL-23, IL-10); similar ao descrito nos modelos de P. brasiliensis infectados tanto com conídios como com leveduras. No entanto, no primeiro período da doença, em camundongos C57BL/6, parece ter uma carga inflamatória maior que reflete nas citocinas que mantém seus níveis até o período crônico: TNF-alfa, MIP-2 e GM-CSF está última, regulada positivamente tanto em experimentos in vitro como in vivo. Também observamos que a partir das 48horas pós-infecção encontramos níveis aumentados de IL-12p70 até o período crônico onde junto com a IL-23 parecem ser as responsáveis pela diminuição da infecção no período tárdio. Esta é a primeira vez que se descreve um modelo experimental com P. lutzii (isolado Pb01) indicando o perfil imunopatológico com pequenas diferenças comparados ao P. brasiliensis porém, de importância na patogenicidade da doença auxiliando a compreender as diferentes formas da doença no modelo experimental / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides spp. (P. brasiliensis and P. lutzii), geographically, is limited to Latin America with endemic areas from Mexico to Argentina, as one of the systemic mycoses with the highest incidence in the region, mainly affecting rural workers. The largest number of patients with PCM has been mainly reported in Brazil, Colombia and Venezuela. The true incidence of this mycosis is underestimated in Brazil and little is known about the new species described - P. lutzii. Most studies in P. lutzii were focused on genetics, speciation and the generation of new antigens to improve the specificity and sensitivity of serological tests. Currently, traditional antigenic preparations, prepared with isolates of P. brasiliensis, are inefficient. There are few studies focused on P. lutzii biology and virulence factors that can be compared with P. brasiliensis in experimental models. Our study aimed to evaluate some in vitro and in vivo aspects related to pathogenicity: phagocytosis and intracellular killing of P. lutzii by peritoneal macrophages from knockouts (KO) for PRRs (TLR2, TLR4 and Dectin) and intracellular activators (MyD88 and NALP3). In addition, animals were infected with P. lutzii yeast and compared with the well-established models of infection with yeast cells (Pb18) and conidia (ATCC Pb60855) from P. brasiliensis. Our data indicate that similarly to what happens with the phagocytosis of P. brasiliensis, P. lutzii phagocytosis is dependent on TLR2, TLR4 and Dectin-1. Other molecules, involved in co-stimulation and presentation of antigens such as MHC II, CD80 and CD86 were also shown to participate in the P. lutzii-host interaction. However, intracellular killing of P. lutzii yeast cells was clearly dependent on TLR4, and the production of cytokines as IL-6, MIP-2, IFN- and IL-12p40 were important for the control of the yeast by macrophages. In the experimental model of P. lutzii, male C57BL/6 mice (6-7 weeks) were infected intratracheally with 1x106 viable yeasts of the isolate Pb01like. We found two phases of the disease, the first from the inoculation to 2 or 4 weeks after infection and the second from 4 to 12 weeks. Yeast appear to be contained within the first week of infection and subsequently are also absent from macerated lung, differently from the model of BALB/c mice infected with ATCC Pb60855 conidia in which CFUs were detected up to week 16 post-infection. We found a mixed Th1/Th2 pattern (IL-12p70, IL-23, IL-10) in bronchoalveolar lavage and lung, with the predominance of proinflammatory cytokines in the first phase and predominance of regulatory Th2 cytokines in the second phase, reproducing findings of P. brasiliensis infection models produced with both conidia and yeast. However, in the first period of the disease in C57BL/6 mice there was a higher inflammatory burden, reflected by the high cytokine levels (TNF-alpha, MIP-2 and GM-CSF), the latter in particular because it was positively regulated both in vitro and vivo), that persisted through the chronic period. We also observed that starting from 48 hours postinfection to the chronic period there were increased levels of IL-12p70, which together with IL-23 appeared to be responsible for the reduction of infection in the late period. This is the first time that an experimental model with P. lutzii (Pb01) is described, showing an immunological profile with only slight differences compared to the P. brasiliensis model. The present study details important aspects of the pathogenesis of the disease due to different species of Paracoccidioides and helps to understand the different forms of presentation in experimental models

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:44:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV07MA022.pdf: 293867 bytes, checksum: 7be800f613b76704595bb5911a0eeab8 (MD5) Previous issue date: 2007-02-26 / The apple culture has great social and economic importance for the South region of Brazil and in the 2003/04 crop season produced approximately 970,000 tons. During the 1995/96 crop season, a diferente symptom from the mosto f symptoms observed in apple fruit and branches were evidenced in Rio Grande do Sul and Santa Catarina orchards. After etiological studies, it was determined the occurrence of fungus Cryptosporiopsis perrennans. This pathogen can cause rota round of 15% on storage apples and for the time been there is few studies about the patogen and the epidemiology of disease. The purpose of this work was to study the development and the production of C. perennans spores over diferente cultures medium with and without fungicides, and to determinethe effect of temperature and humidity periods over the Bull s eye roto n Fuji apple. The experiments carriedout were the following: a) evaluatoon of the effect of potato-dextrose-agar (PDA), malt extract (MEM) and V8 juice (V8) médium on the development and production of spores by 9 isolates of C. perennans; b) evaluation of sensibility in vitro of C. perennans to six diferente concentrations of the fungicides captan, cooper hidroxide, dithianon, mancozev and trifloxistrobin diluted in PDA; c) evaluation of incidence and severity of the Bull eye s rot when Fuji apples inoculated with C. perennans had been submited to diferente combinations of humidity and temperature periods. The results showedthat the medium AEM and V8 promoted better stimulus to mycelium growth and that five C. perennans isolates produced more spores when cultivated in V8 and four isolates in MEM. The diferente fungicides tested were eficiente to control C. perennans micelial growth, however the most promising results were obtained the fungicides dithianon and mancozeb. Higher incidence and severity of the Bull eye s roto n Fuji apples were obteined with 20 hours of incubation at 22°C / A cultura da macieira tem grande importância sócio-econômica para a região sul do Brasil tendo atingido no ciclo 2003/04 aproximadamente 970.000 toneladas. Nos ciclos vegetativos de 1995 e 1996, um sintoma diferente daqueles relatados até então no Brasil em frutos e ramos da macieira foi constatado em pomares do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina. Após o estudo de sua etiologia, identificou-se a ocorrência do fungo Cryptosporiopsis perennans. Este patógeno pode causa podridões ao redor de 15% das maçãs no armazenamento e, no presente, há poucos estudos que contribuam ao conhecimento do patógeno ou à epidemiologia da doença. Este trabalho visou estudar o crescimento micelial e a produção de conídios de isolados de C. perennans em meios de cultura com e sem fungicidas e determinar o efeito de temperaturas e períodos de umidade na infecção de maçãs Fuji . As ações conduzidas foram: a) determinação os efeitos dos meios de cultura batata-dextrose-ágar (BDA), ágar-extrato-de-malte (AEM) e ágar-sucoV8 (V8) no crescimento micelial e produção de conídios de nove isolados de C. perennans; b) avaliação a sensibilidade in vitro de C. perennans a seis concentrações dos fungicidas captan, hidróxido de cobre, dithianon, mancozeb e trifloxistrobin incorporados ao meio de cultura BDA; c) avaliação da incidência e severidade da podridão olho-de-boi em maçãs Fuji inoculadas com C. perennans e submetidas a diferentes combinações de períodos de umidade e temperatura. Os resultados mostraram que o maior estímulo ao crescimento do micélio do patógeno foi induzido pelos meios de cultura AEM e V8 e que cinco dos nove isolados avaliados produziram maior quantidade de conídios quando cultivados em suco V8 e quatro em AEM. Todos os fungicidas apresentaram-se eficientes para o controle do crescimento micelial de C. perennans quando comparados a testemunha, porém os resultados mais promissores foram obtidos com os fungicidas dithianon e mancozeb. A temperatura e período de incubação que proporcionaram maior índice de incidência e severidade da podridão olho-de-boi em frutos de maçã cv. Fuji, foram de 22°C com 20 horas de incubação