Les microARN, ARN courts non codants, jouent un rôle primordial dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes. Une modification d'expression de ces ARN peut donc contribuer à la tumorogenèse et au développement tumoral par dérégulation de l'expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Nous avons souhaité mettre en évidence des signatures spécifiques (i) du phénotype d'invasion des méningiomes et (ii) du phénotype d'aggressivité des gliomes par étude des oligodendrogliomes (gliomes de bas grade) et glioblastomes (gliomes de haut grade). (i) Les profils d'expression des microARN dans des méningiomes invasifs montrent des différences par rapport à ceux des méningiomes non invasifs ; confirmant l'intérêt de ces explorations moléculaires pour une application diagnostique directe. (ii) Dans le cas des gliomes, plusieurs miARN ont été détectés et validés et constituent des signatures spécifiques des gliomes en comparaison aux échantillons contrôles. Certains permettent également une distinction aisée des oligodendrogliomes et glioblastomes. Des études génomiques et épigénétiques ont été menées pour rationaliser, du point de vue de la physiopathologie des cellules, les différences d'expression des miARN entre les différents tissus. Au niveau du protéome, des dérégulations d'expression de cibles des miARN identifiés ont été mises en évidence comme celles de MDH1, SIRT1, STAT3 ou PTBP1, protéines clés de la physiologie cellulaire et nous avons pu décrire des voies moléculaires pertinentes du développement tumoral des gliomes.

Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique. Un diagnostic précoce améliore les chances de survie. Le diagnostic repose essentiellement sur les examens d'imagerie comme l'échographie, la tomodensitométrie et l'IRM. Ces examens sont parfois associés à la biopsie et sont couteux et parfois invasifs. De plus, l'imagerie n'est pas capable de faire la distinction entre les tumeurs bénignes et les tumeurs malignes et entre les sous-types histologiques de carcinome à cellules claires qui est le plus fréquent. Il n'existe pas dans le cancer rénal de marqueur comme la PSA dans le cancer de la prostate ou la Foetoprotéine et l'HCG dans le cancer du testicule. Le but de cette étude est concentré sur la recherche des marqueurs mARNs ou miARNs dans les liquides biologiques (sérum, plasma, urine) pour le cancer du rein à cellules claires. Nous avons montré que les petits ARNs dans le sérum et les urines et l'intégrité des ARNs dans les urines étaient des outils diagnostiques dans le cancer du rein à cellules claires. Si ces petits ARNs circulants sont validés, on peut éventuellement imaginer l'intérêt pratique en clinique comme la détection des petits ARNs circulants dans l'urine pour prédire le cancer, la classification de la tumeur pour aider le clinicien, la prédiction d'une récidive ou d'une progression soit après néphrectomie soit au cours d'un traitement médical

Les sarcomes sont des tumeurs malignes des tissus conjonctifs, représentant moins de 1%des tumeurs malignes de l'adulte, mais près de 8% de l'ensemble des cancers pédiatriques. Enraison de leur rareté, de leur grande variété histologique et de leur potentiel évolutifhétérogène, les sarcomes sont des pathologies difficiles à traiter, tant sur le plan diagnostique,pronostique que thérapeutique. Ces dernières années, l'avènement de techniques d'analyse pangénomiques par biologie moléculaire a permis d'améliorer la prise en charge clinique des sarcomes, mais les microARN sont des biomarqueurs émergents encore peu utilisés. au cours de c e travail de thèse, nous avons cjhoisi d'étudier la valeur des profils d'expression des micrfoARN dans les rhabdomyosarcomes et les ostéosarcomes. Les données brutes des profils d'expression ont été obtenues à l'aidre d'une technologie à moyen débit basée sur des réactions de PCR quantitative. Nous avons tout d'abord développé une méthodologie d'ananlyse permettant d'obtenir des données d'expression précises, reproductibles et à forte valeur ajoutée, à partir de matériel biologique hétérogène.. Dans un second temps, nous avons montré que les profils d'expression de microARN permettent d'améliorer la prise en charge clinique des deuc types de sarcomes étudiés : il est possible d'affiner la classification nosologique des rhabdomyosarcomes, et de prédire la réponse des ostéosarcomes à la chimiothérapie néo-adjuvante. La recherche de nouvelles applications cliniques liées aux profils d'expression des micorARN doit donc être poursuivie, et peut désormais l'être grâce à l'outil robuste que nous avons développé au cours de cette thèse.

La voie de signalisation des androgènes, à travers le récepteur aux androgènes (AR), joue un rôle important dans le développement et la fonction de la prostate, ainsi que dans l'initiation et la progression du cancer de la prostate. La découverte de nouveaux effecteurs de la signalisation androgènes-AR permettra une meilleure compréhension de ces mécanismes. MiR-135a a été identifié comme un gène cible de la voie de signalisation androgènes-AR. Après stimulation androgénique, AR active directement la transcription du gène miR-135a2, en se fixant sur un élément de réponse aux androgènes dans la région promotrice.Une surexpression de miR-135a inhibe la migration et l'invasion de cellules prostatiques cancéreuses, en régulant négativement l'expression des protéines ROCK1 et ROCK2, deux gènes cibles de miR-135a nouvellement identifiés.De plus, miR-135a cible et régule négativement l'expression du facteur de transcription FOXN3, capable de moduler l'activité transcriptionnelle de AR et la prolifération cellulaire dépendante des androgènes.L'étude fonctionnelle de miR-135a suggère donc qu'il puisse être impliqué dans la progression du cancer de la prostate, en régulant la formation des métastases et la signalisation androgénique. L'expression de miR-135a, dans le tissu tumoral par rapport au tissu sain adjacent, de prostatectomies de patients, est inversement corrélée aux paramètres d'agressivité de la maladie, suggérant qu'il puisse être utilisé comme marqueur de pronostic du cancer de la prostate.Ces résultats font de miR-135a un nouvel effecteur de la voie de signalisation de AR, pouvant contribuer à la progression du cancer de la prostate.

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un virus oncogène responsable des lymphomes T chez les poulets. L´infection par ce virus est divisée en une phase lytique dépendante de l´expression du gène très précoce ICP4 et une phase latente, caractérisée par l´expression de l’ARN long non codant LAT localisé en antisens. Nous avons montré que l’expression différentielle des miARN du cluster mdv1-miR-M8-M10 était directement corrélée à l’épissage alternatif de l’intron 1 du LAT et plus particulièrement à la biogenèse par le splicéosome du premier mirtron viral. La présence du mirtron mdv1-miR-M6 au milieu du cluster est associée à une cinétique d’expression des miARN. En parallèle, nous avons identifié deux promoteurs alternatifs de type Sp1, quatre signaux poly-A et trois exons associés à la régulation de la transcription du transcrit ICP4. Nous avons prédits cinq isoformes potentielles pour la protéine ICP4 et avons pu observer par immunodétection que la protéine était exprimée principalement dans le cytoplasme des cellules infectées en phase lytique ou de réactivation. / The Marek disease virus (MDV) is an oncogenic herpesvirus responsible of T-cell lymphoma in chicken. MDV infections are divided into a lytic phase, depending on the expression of immediate early gene like ICP4, and a latent phase characterized by the expression of the long non-coding RNA LAT localized in antisense. In this study, we have shown the differential expression of the cluster of miRNA mdv1-miR-M8-M10 was directly correlated with the alternative splicing of LAT’s intron 1 and more specifically with the first viral mirtron biogenesis by the spliceosome. The location of the mirtron mdv1-miR-M6 inside of the cluster is associated with a two-step biogenesis of the miARN of the cluster. On the other hand, we have identified a dual promoter that responded to Sp1, four poly-A signals and three exons that are responsible of transcriptional regulation of ICP4 transcript. We also have predicted five potential isoproteines for ICP4 and were able to observe by immunodetection that ICP4 was mainly expressed in the cytoplasm of infected cells during the lytic phase or the reactivation one.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie autoimmune rare qui se caractérise par une fibrose cutanée et parfois pulmonaire. Nous avons tout d’abord évalué le rôle de BAFF, une cytokine impliquée dans le développement des lymphocytes B (LB), dans la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris. Nous avons démontré que BAFF était augmenté en réponse à la bléomycine et que les souris BAFF-/- ou traitées par le BAFF-R-Ig sont protégées de la fibrose pulmonaire. Ensuite, nous avons évalué si les LB et BAFF pouvaient moduler la production de collagène par des fibroblastes de peau isolés de patients atteints de ScS. Nous avons démontré que les LB augmentent la production de collagène et de cytokines impliquées dans la fibrose cutanée et l’ajout de BAFF augmente cet effet des LB sur les fibroblastes. Enfin, nous avons étudié la régulation de l’expression de BAFF par les microARNs. Nos résultats montrent que les miR-30a*, d* et e* ciblent directement l’ARNm de BAFF. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare autoimmune disease characterized by skin fibrosis and occasionally pulmonary fibrosis. We first assessed the role of BAFF, a cytokine involved in B cell maturation, in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. We showed that BAFF was increased in response to bleomycin and that BAFF-/- mice or BAFF-R-Igtreated mice are protected from pulmonary fibrosis. Then, we assessed whether B cells and BAFF could regulate collagen production by skin fibroblasts isolated from SSc patients. We demonstrated that B cells increase collagen production and cytokines involved in skin fibrosis. The addition of BAFF increases the effect of B cells on fibroblasts. Lastly, we studied the regulation of BAFF expression by microRNAs. Our results show that miR-30a*, d* and e* directly target the BAFF mRNA.

La Bruton tyrosine kinase ou Btk est une protéine dont le rôle dans la maturation des lymphocytes B est connu depuis plusieurs années. Par contre, son rôle dans le contrôle de l’immunité innée est moins établi. Nous avons montré que, en réponse à la voie des Toll like Receptors ou TLRs, Btk régule la stabilité de l’ARN messager du TNF-α par l’intermédiairede la protéine TTP ou Tristétraproline. Par ailleurs, nous avons montré que l’expression d’un microARN, le miR-346, régulait négativement la protéine Btk et donc la synthèse de TNF-α. L’amplification de l’expression de ce miR-346 par transfection permet d’avoir un effet anti-TNF-α et anti-Btk interessant notamment dans le modèle cellulaire de la polyarthrite rhumatoïde. Enfin, nous avons montré que, en réponse au TLRs, la modulation de l’expression du TNF-α en fonction de l’état de méthylation de l’ADN et d’acétylation des histones dépendait directement de l’expression du couple miR-346 et Btk. Btk est donc une protéine charnière dans le contrôle de l’inflammation par les mécanismes épigénétiques que sont les miARNs, la méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones. Sur le plan thérapeutique, l’inhibition de cette protéine par ces différents mécanismes de régulation semble donc être très interessante, à la fois dans les maladies inflammatoires et néoplasiques. / Bruton tyrosine kinase, or Btk, is a protein whose role in the maturation of B cells has been known for several years. However, its role in the control of innate immunity is less established. We have shown that, in response to Toll like Receptors pathway or TLRs, Btk regulates the stability of the mRNA of TNF-α via the TTP or Tristetraprolin protein. Furthermore, we showed that the expression of microRNA, the miR-346, negatively regulated the Btk protein and thus the synthesis of TNF-α. Upregulation of miR-346 by transfection act as an anti-TNF-α and anti-Btk drugs, especially in the cellular model of rheumatoid arthritis.Finally, we showed that, in response to TLRs, the modulation of the expression of TNF-α according to the state of DNA methylation and histone acetylation depended directly on crosstalk beetween miR-346 and Btk. Btk is a key protein in the control of inflammation by epigenetic mechanisms such as miRNAs, DNA methylation and histone acetylation. As therapeutic interest, inhibition of Btk by those different regulatory mechanisms seems to be very interesting, both in inflammatory and neoplastic diseases.

Le Myélome Multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération de plasmocytes tumoraux médullaires. MYC occupe un rôle central dans l'oncogenèse du MM car son activation est responsable de la progression du stade précurseur de MGUS en MM symptomatique. Dans ce travail, nous rapportons que l’expression de LIN28B est corrélée à celle de MYC et est associée à un mauvais pronostic dans le MM. Nous montrons que l'axe LIN28B/let-7 module l'expression de l’ARNm de MYC, lui-même cible de let-7. De plus, la perturbation de l'axe LIN28B/let-7 induit une régulation la prolifération des lignées cellulaires de MM in vitro et in vivo. L'analyse par séquençage d’ARN de modèles de KO par utilisation de la technologie CRISPR a montré que l'axe LIN28B/let-7 régule les voies de signalisation de MYC et du cycle cellulaire dans MM. Nous avons de plus établi une preuve de principe thérapeutique de la possibilité de cibler MYC par l’emploi de LNA-GapmeR contenant une séquence analogue à let-7b. Dans un modèle de xénogreffe murin, nous montrons que des niveaux élevés d'expression de let-7, par administration de LNA-GapmeR let-7b, répriment la croissance tumorale en régulant l’expression de MYC. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme de ciblage thérapeutique de MYC via l'axe LIN28B/let-7 dans MM. Nous nous sommes ensuite intéressés à évaluer de nouvelles formes de biomarqueurs moléculaires dans le MM par étude des miARN contenus dans les exosomes circulants. Nous avons examiné le rôle pronostique des miARN exosomaux dans une cohorte de 156 échantillons de patients uniformément traités pour un MM au diagnostic. Après analyse du profil de miARN exosomaux par séquençage de nouvelle génération, nous avons utilisé technique de qRT-PCR pour étudier la corrélation entre le niveau d’expression de 22 miARN et la survie sans progression (SSP) et la survie globale (SG). Deux miARN, à savoir let-7b et miR-18a, étaient significativement associés à la SSP et SG en analyse univariée, et étaient statistiquement significatifs après ajustement pour le système international de stratification du risque (ISS) et les marqueurs cytogénétique en analyse multivariée. Nos résultats confirment le niveau d’expression des miARN let-7b et miR-18a au sein des exosomes circulants permettent d’améliorer la stratification du risque chez les patients atteints de MM. Enfin, pour mieux comprendre le programme oncogénique piloté par MYC, nous avons étudié l’efficacité thérapeutique d’une librairie de petites sur des lignées cellulaires avec une forte expression de MYC, dans le MM. Les résultats ont permis d’identifier les rocaglates, une famille de composés inhibant l’initiation de la traduction, comme étant les plus actifs. L’étude du profil transcriptionnel par séquençage de l’ARN de lignées cellulaires de MM traitées par CMLD010509 ou DMSO a révélé l’activation d’un programme de transcription et l’inhibition d’un programme traductionnel, caractéristique de l’inactivation de HSF1 secondaire à l’inhibition de la traduction. Le profile traductionnel était étudié par spectrométrie de masse quantitative, permettant d’identifier un ensemble de protéines, tels que MYC, MDM2, CCND1, MAF et MCL-1, spécifiquement affectées par l’inhibition de la traduction liée au composé CMLD010509 dans le MM. Nous avons confirmé l’efficacité thérapeutique des rocaglates dans plusieurs modèles murins de MM. Ces résultats démontrent la possibilité de cibler le programme de traduction oncogénique lié à MYC dans MM. / MYC is a major oncogenic driver of Multiple Myeloma (MM) and yet almost no therapeutic agents exist that target MYC in MM. Here we report that the let-7 biogenesis inhibitor LIN28B correlates with MYC expression in MM and is associated with adverse outcome. We also demonstrate that the LIN28B/let-7 axis modulates the expression of MYC, itself a let-7 target. Further, perturbation of the axis regulates the proliferation of MM cells in vivo in a xenograft tumor model. RNA-sequencing and gene set enrichment analyses of CRISPR-engineered cells suggested that the LIN28/let-7 axis regulates MYC and cell cycle pathways in MM. We provide proof of principle for therapeutic regulation of MYC through let-7 with an LNA-GapmeR (locked nucleic acid-GapmeR) containing a let-7b mimic in vivo, demonstrating that high levels of let-7 expression repress tumor growth by regulating MYC expression. These findings reveal a novel mechanism of therapeutic targeting of MYC through the LIN28B/let-7 axis in MM. We next sought to establish new biomarkers in MM, enable to capture the molecular alterations of the disease. For this purpose, we examined the prognostic significance of circulating exosomal microRNAs (miRNAs) in a cohort of 156 patients with newly diagnosed MM, uniformly treated and followed. Circulating exosomal miRNAs were isolated and used to perform small RNA sequencing analysis on 10 samples and a qRT-PCR array on 156 samples. We studied the relationship between miRNA levels and patient outcomes including progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). We identified miRNAs as the most predominant small RNAs present in exosomes isolated from the serum of MM patients and healthy controls by small RNA sequencing of circulating exosomes and used a qRT-PCR assay to measure the expression of 22 exosomal miRNAs. Two of them, namely let-7b and miR-18a, were significantly associated with both PFS and OS in the univariate analysis, and were still statistically significant after adjusting for the International Staging System (ISS), and adverse cytogenetics in the multivariate analysis. Our findings support the use of circulating exosomal let-7b and miR-18a improves the identification of patients with newly diagnosed MM with poor outcomes. Finally, to better understand the oncogenic program driven by MYC and investigate its potential as a therapeutic target, we screened a chemically diverse small molecule library for anti-MM activity in cell lines with high expression of MYC. The most potent hits identified were rocaglate-scaffold inhibitors of translation initiation. Expression profiling of MM cells revealed reversion of the oncogenic MYC-driven transcriptional program by CMLD010509, the most promising rocaglate. Proteome-wide, reversion correlated with selective depletion of short-lived proteins that are key to MM growth and survival, most notably MYC, MDM2, CCND1, MAF, and MCL-1. The efficacy of CMLD010509 in several mouse models of MM confirmed the therapeutic relevance of these findings in vivo and supports the feasibility of targeting the oncogenic MYC-driven translation program in MM with rocaglates.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne causée par l‘apparition du chromosome Philadelphie dans la cellule souche hématopoïétique (CSH), conduisant à l‘expression de la protéine de fusion BCR-ABL1. L‘activité tyrosine kinase dérégulée de cette oncoprotéine provoque l‘activation de plusieurs voies de signalisation critiques dans la leucémogenèse. Si les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant BCR-ABL1 représentent des traitements dans l'ensemble très efficaces, plusieurs études montrent que les cellules leucémiques les plus immatures de la moelle osseuse y sont insensibles. Cette thèse propose de compléter les connaissances relatives aux effets de BCR-ABL1 dans la cellule, et plus généralement aux propriétés des CSH de LMC. Notre intérêt s‘est focalisé sur le rôle potentiel des microARN. Dans un premier travail, nous nous sommes intéressés à l‘effet de l‘activité BCR-ABL1 sur le protéome et sur l‘expression des microARN dans la lignée cellulaire K562. Les résultats montrent que BCR-ABL1 régule l'expression d'un microARN fréquemment surexprimé dans les cancers, miR-21. Cet effet dépend du facteur de transcription STAT5, cible bien connue de l'activité kinase de BCR-ABL1. Dans une seconde partie, nous avons montré que dans la moelle osseuse des patients LMC, la fraction cellulaire enrichie en cellules souches (les cellules CD34+CD38low) exprime quatre microARN particuliers: mir-10a, mir-150, miR-155 et miR-146a. Deux de ces microARN (miR-150 et miR-155) sont trouvés spécifiquement dans les cellules des patients, et pas dans celles des individus sains. / In chronic myeloid leukemia (CML), the activity of the constitutively active tyrosine kinase BCR-ABL1 drives the activation of the PI3K/AKT, JAK/STAT, and RAS/RAF/MEK/ERK pathways. Among other consequences, activated or inhibited transcription factors induce important modifications of the CML cells gene expression pattern that could impact cell cycle control, apoptosis and genetic instability, leading to the expansion of the oncogene-transformed cells and to the acquisition of potentially harmful de novo mutations. However, indirect BCR-ABL1-dependant regulations might also occur, for instance through the action of microRNAs (miRNAs). Among the ~2000 miRNAs reported in humans, numerous species are up- or down-regulated in various cancer models. In the context of CML however, there is no clear consensus regarding the role of specific miRNAs, despite several studies. The first aim of this thesis was to study the effects of a clinically relevant concentration of imatinib, a tyrosine-kinase inhibitor (TKI) that blocks BCR-ABL1, on the CML cell line K562: both the microRNA expression profile and the cells proteome were analyzed. Using microarray hybridization, RT-qPCR experiments and a functional assay, we identified miR-21 as one of the most significantly down-regulated microRNA in cells that were treated with imatinib. In parallel, a semi-quantitative proteomic approach identified the tumor suppressor programmed cell death protein 4 (PDCD4) as the most over-expressed protein in imatinib-treated cells. We showed that miR-21 can bind to PDCD4 3'UTR and decrease its expression. The STAT5 - miR-21 - PDCD4 pathway was conserved in CML primary CD34+ cells, and to some extent in acute myeloid leukemia (AML) models as well; the known functions of miR-21 and PDCD4 suggest that their regulation by BCR-ABL1 could participate in the antileukemic response triggered by tyrosine kinase inhibitors. In the second part of this manuscript, we was interested in the immature stem cells population that cannot be eliminated by TKI. The underlying mechanisms of this resistance are not fully understood. The TKI-resistant CML stem cells reside in the CD34+/CD38low subpopulation, that can be sorted from the mononuclear cells fraction using FACS. In this project, we propose to describe the microRNA repertoire of the CML CD34+/CD38low cells to highlight the potential role of microRNA in the resistance mechanisms by identifying some of their targets, using bioinformatic and experimental approaches. This combination of miRNome and functional analysis would allow to increase the knowledge of the biology of the TKI-resistant CML stem cells. Our results have shown that the cellular fraction enriched in stem cells (CD34+CD38low) expressed specifically four microRNA: miR-10a, miR-146, miR-150 and miR-155. It is also interested to notice that only two of them, miR-150 and miR-155, are highly expressed in CML-patient CD34+CD38low cells compared to normal cells.

Mon travail de thèse a consisté à caractériser une sous-population de lymphocytes T régulateurs naturels de phénotype CD8+CD25+.<p>Nous avons purifié les CD8+CD25+ nTregs et vérifié par cytométrie de flux leur expression en FOXP3 et CTLA-4. Puis nous avons pu montrer que ces cellules possèdent des propriétés suppressives dans un test d’inhibition de la prolifération de lymphocytes T activés allogéniquement. Les lymphocytes CD8+CD25+ nTregs expriment les gènes FOXP3, CTLA-4, GARP et CCL-4 et les cytokines IL-10 et TGF-β. Par contre, les gènes CD28, ICOS, FOXO1 et Helios sont sous-exprimés dans les nTregs CD8+CD25+ par rapport aux lymphocytes T CD8+CD25-. <p>Nous avons établi une signature micro-ARN qui comprend 10 micro-ARNs différentiellement exprimés :7 micro-ARNs sous-exprimés "miR-9, -24, -31, -155, -210, -335 et -449 " et 3 micro-ARNs surexprimés " miR-214, -205 et -509". De plus, nous avons pu explorer la relevance biologique de cette signature micro-ARN en montrant dans un premier temps que les miRs "-31, -24, -210, -335" ciblent spécifiquement la région 3'UTR de FOXP3, de même les miR-9 et miR-155 ciblent la région 3'UTR de CTLA-4, et les miR-24, et -335 ciblent la région 3'UTR de GARP. Ceci a été fait par des expériences de co-transfections suivies d'une mesure de l'activité rapportrice luciférase. De plus, nous avons pu démontrer par des expériences de transduction lentivirale ex vivo, de cellules T primaires, que des micro-ARNs de la signature régulent l’expression de FOXP3, CTLA-4 et GARP dans les Tregs naturels CD8+CD25+ humains. <p>Cette étude montre l'importance des micro-ARNs dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes impliqués dans la fonction régulatrice des lymphocytes T régulateurs.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished