Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Perez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:00:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thomazella_DanielaPauladeToledo_D.pdf: 8858146 bytes, checksum: ff76b44d2d16f8e757475d68e4fb6c8b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Moniliophihora perniciosa e Monüiophthora roreri são basidiomicetos fitopatogênicos. causadores de duas das mais devastadoras doenças fúngicas do cacaueiro: a Vassoura de bruxa e a Frosty Pod Rot (Momlíase), respectivamente. Apesar do grande impacto socioeconómico dessas doenças, aspectos importantes relacionados ao metabolismo destes patógenos ainda não são suficientemente compreendidos O estudo do metabolismo mitocondrial é particularmente relevante, pois compreende processos celulares vitais para a sobrevivência do organismo, como a regulação da produção de energia (ATP) e a manutenção do balanço redox da célula. Este trabalho teve como objetivo entender a importância da enzima mitocondrial oxidase alternativa (AOX) no metabolismo e desenvolvimento dos fungos M. perniciosa e M roreri- A AOX é uma oxidase terminal capaz de realizar o transporte de elétrons mitocondrial, catalisando a redução do oxigênio a água, de maneira desacoplada da síntese de ATP. Em M. perniciosa, a expressão do gene aox (Mp-aox) mostrou-se bastante relacionada ao ciclo de vida hemibiotrófico deste fungo. Níveis de expressão relativamente elevados deste gene foram observados no micélio biotrófico cultivado in vitro. De acordo, grande sensibilidade à inibição da via alternativa também foi verificada nesta fase micelial, sugerindo que a AOX tem participação no desenvolvimento deste primeiro estágio de M. perniciosa. Curiosamente, a inibição in vitro da cadeia respiratória principal retardou a transição da fase biotrófica para a necrotrófíca. Além disso, o uso combinado de inibidores da via principal e da AOX resultou em total inibição do desenvolvimento do fungo in vitro como também preveniu o estabelecimento da doença em plântulas de cacau. Com base nesses dados, o presente trabalho sugere um modelo no qual a participação diferencial das vias de transporte de elétrons (principal e alternativa) regula o desenvolvimento do micélio biotrófico e a transição de fase de M. perniciosa. Este é o primeiro trabalho em que se apresentam fortes evidências para uma função da AOX no desenvolvimento in planta e ciclo de vida de um fungo fítopatogênico. Como em M. perniciosa, o gene aox de M. roreri (Mr-aox) foi induzido em resposta ao fungicida azoxistrobina (inibidor do complexo III), sugerindo que a AOX tem participação na proteção do patògeno contra o estresse oxidativo gerado pela inibição da via principal- Apesar da indução do gene Mr-aox, M. roreri mostrou-se consideravelmente sensível ao fungicida. Deste modo, é possível que a ativação da AOX em M. roreri não seja suficiente para contornar os efeitos tóxicos da azoxistrobina e, consequentemente, que este fungo seja mais suscetível ao estresse oxidativo gerado pelo inibidor. Finalmente, a adição conjunta da azoxistrobina com um inibidor da AOX inibiu completamente o desenvolvimento in vitro de M. roreri. Com base nos resultados apresentados, sugere-se que a AOX tenha uma função relevante no metabolismo destes patógenos e que a inibição conjunta das vias principal e alternativa seja uma estratégia em potencial para o controle das doenças Vassoura de bruxa e Frosty PodRot. / Abstract: Moniliophthora perniciosa and Moniliophthora roreri are phytopathogenic basidiomycetes, which cause two of the most devastating fungal diseases of cacao: the Witches' Broom and Frosty Pod Rot diseases, respectively. Despite the great socioeconomic impact of the diseases, important aspects of the metabolism of these pathogens are not sufficiently understood. The mitochondrial metabolism is particularly important since it is associated with many cellular processes of crucial importance for the organism survival, such as the regulation of energy production (ATP) and the maintenance of the cellular redox balance. This study aimed to understand the importance of the mitochondrial enzyme alternative oxidase (AOX) in the metabolism and development of the cacao pathogens M perniciosa and M. roreri. AOX is a non-phosporylating ubiquinol oxidase which catalyzes the reduction of molecular oxygen to water. In M. perniciosa, the expression of aox gene {Mp-aox) was closely related to the hemibiotrophic lifestyle of this fungus. High levels of Mp-aox transcripts were observed in the biotrophic mycelium and, accordingly, it showed an elevated sensitivity to AOX inhibitors, suggesting that AOX has a role in the development of the biotrophic phase. Interestingly, the in vitro inhibition of the cytochrome-dependent pathway prevented the transition from biotrophy to necrotrophy. Furthermore, the combined use of an inhibitor of the cytochrome pathway with an AOX inhibitor completely impaired the in vitro fungal growth as well as prevented the establishment of the disease in cacao seedlings. Based on these data, this study suggests a model in which the involvement of the different pathways of electron transfer (cytochrome and alternative routes) regulates the development of the biotrophic mycelium and the phase transition of M. perniciosa in planta. This is the first report presenting strong evidences for a role of AOX during the in pfanta development and life cycle of a phytopathogenic fijngus. Like M. perniciosa, the aox gene of M. roreri {Mr-aox) is up-regulated after exposure of the fungal mycelium to the fungicide azoxystrobin (a potent inhibitor of complex III}, suggesting that AOX plays a protective role against the deleterious oxidative stress produced by the compound. However, even with the increased expression of Mr-aox, M. roreri growth was highly sensitive to the fungicide. Therefore, it is possible that AOX activation was not enough to overcome the toxic effects of the cytochrome pathway inhibition and, consequently, M. roreri presented a high susceptibility to oxidative stress. Finally, the combined application of azoxystrobin and an AOX inhibitor completely impaired the in vitro development of M. roreri Thus., based on these results, we suggest that AOX has a role in the metabolism of these cacao pathogens and the concomitant inhibition of both cytochrome and alternative pathways may be an efficient strategy for the control of Witches' Broom and Frosty Pod Rot diseases. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T23:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_ClaudioTeodorode_D.pdf: 4471060 bytes, checksum: dd3735f8ba5c9ced50fdeab6a4bf2faa (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Diabetes melhtus tipo 2 é uma doença de etiologia multifatorial que resulta da confluência de pelo maios dois fenômenos distintos, resistência à ação e falência na produção de insulina. Evidências recentes tem sugerido que mecanismos comuns podem participar dos eventos que precipitam o desenvolvimento tanto da resistência à insulina quanto da falência da célula beta pancreática. A caracterização destes eventos pode abrir perspectivas para abordagens terapêuticas unificadas visando corrigir simultaneamente os dois mais importantes distúrbios que participam da gênese desta doença. A proteína co-ativador la do receptor ativado por prolíferador de peroxissoma, ou PGC-la, cumpre alguns requisitos que permitem sua inclusão numa lista de possíveis participantes nos mecanismos acima expostos. Para avaliar o papel desta proteína na produção e na ação periférica da insulina, utilizou-se um oligonucleotídeo antisense capaz de reduzir significativamente a expressão da PGC-la. Através deste método observou-se que a PGC- la responde a estímulos simpáticos que promovem a inibição da secreção de insulina. Tais estímulos induzem o aumento da expressão desta proteína que por sua vez leva a um aumento da expressão da proteína desacopladora-2 (UCP-2) em ilhotas pancreáticas. O desacoplamento da respiração mitocondrial deve favorecer a redução da produção de ATP decorrente do metabolismo da glicose e desta forma reduzir a secreção de insulina. Por outro lado, em um modelo animal de obesidade e diabetes induzido por dieta hiperüpídica observou-se um aumento da expressão da PGC-la em fígado e tecido adiposo. A inibição da expressão da PGC-la nestes animais promoveu restauração da homeostase da glicose, aumento da secreção de insulina, melhora na sinalização de insulina em tecidos periféricos e surpreendentemente, regressão da esteatose hepática induzida por dieta. Portanto, a proteína PGC-la surge como promissor alvo para abordagem terapêutica em diabetes mellitus e doenças afins / Abstract: Type 2 diabetes mellitus is a multifactorial disease that results from the confluence of at least two distinct events, insulin resistance and failure of the pancreatic beta cell. Recent evidences suggest that common mechanisms may participate in the events that precipitate the development of both insulin resistance and beta cell disarrangement. The characterization of such events may offer new perspectives for a unified therapeutic approach for diabetes. The protein PGC-la fulfills some of the requirements to be included in a list of potential candidates for playing a role in the genesis of both the main mechanisms involved in the development of diabetes. To evaluate the role of this protein in the production and action of insulin we employed an antisense oligonucleotide to PGC-la, which is capable of significantly reducing the expression of this protein. Through this approach it was observed that PGC-la responds to sympathetic stimuli mat inhibit insulin secretion. Such stimuli induce the expression of PGC-la and subsequently of the uncoupling protein-2 (UCP-2). Once induced UCP-2 favors a reduction of ATP production from glucose metabolism and therefore reduces insulin secretion. In addition, the expression of PGC-la was increased in liver and adipose tissue of an animal model of diet-induced obesity and diabetes. The inhibition of PGC-la promoted an increase of insulin secretion, an increase of peripheral insulin action, an improvement of insulin signal transduction and, surprisingly the reversal of diet-induced hepatic steatosis. Thus, PGC-la appears as an attractive potential target for therapeutics in diabetes and related diseases / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Jose Antonio Rocha Gontijo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T03:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bento_LedaMarciaAraujo_D.pdf: 18154421 bytes, checksum: cb3c676e5986d07c3462c4afdbcc4d15 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Estudos em animais demonstram que a acidose metabólica promove muitas mudanças morfológicas e bioquímicas nos rins, que estão intimamente associadas com a hipertrofia do órgão Confirmamos que a acidose metabólica crónica causada pela ingestão de cloreto de amónia (NH4Cl), promove a hipertrofia do órgão e também uma diminuição da reabsorção de água e sais pelos rins. Aventamos a hipótese que esses são processos que competem pela energia disponível pelas células tubulares Como a mitocòndria tem sido implicada em uma variedade de processos metabólicos, nós estudamos o comportamento das mitocôndrias isoladas de rins de ratos tratados com NH4Cl As mitocôndrias de rim de ratos (MRR) acidóticos apresentaram uma diminuição de aproximadamente 25% da eficiência da respiração, através do controle respiratório Usando o mesmo substrato (succinato), nós achamos a relação ADP/O significativamente menor nos animais acidóticos quando comparados aos controles Em concordância com esses resultados, o potencial transmembrana mitocondrial, apresentou o tempo de fosforilação aumentado nesses animais, determinado pelo método da safranina. Nenhuma diferença significativa foi observada no potencial em ambas as mitocôndrias. Interessantemente, na determinação do transporte de cálcio, verificamos uma captação inicial mais rápida e maior nas MRR acidóticos, quando comparadas aos controles, mantida equilibrada por mais tempo com a adição do inibidor do poro de transição de permeabilidade mitocondrial, a ciclosporina A (CsA). Não foi observada nenhuma diferença significativa na liberação do cálcio após adição de vermelho de Rutênio (RR) e cloreto de sódio (NaCl). Nós também analisamos todos esses parâmetros em mitocôndrias de fígado de rato, para saber se esse efeito da acidose é particular do rim, ou outros órgãos também apresentam. Não verificamos alterações nas funções mitocondriais, induzidas pela acidose. durante dois dias de tratamento com NH4Cl, nessas mitocôndrias Para sabermos se essas alterações nas mitocôndrias renais estariam relacionadas à proteína desacopladora (UCP), utilizamos em nossos experimentos de controle respiratório inibidores da atividade dessas proteínas CAT, GDP e BSA Observamos indiretamente que a UCP esta ativada nas MRR acidóticos, respondendo o desacoplamento observado na situação de acidose nessas mitocôndrias / Abstract: Studies in animals have shown that metabolic acidosis causes several morphologic and biochemical changes in kidney, which are ultimately associated with organ hypertrophy We have previously shown that chronic metabolic acidosis caused by feeding NH4Cl lead to nephron hypertrophy and to a decreased water-salt reabsortion by the kidneys Since mitochondria have been implicated in a variety of metabolic disorders, we examined energy linked functions in isolated mitochondria from rat kidneys with chronic metabolic acidosis induced by NH4Cl Mitochondria from acidotic rats presented resting respiration supported by succinate oxidation 25% slower when compared to control mitochondria Using the same substrate we found an ADP/O ratio of 1,4 in control and 1,1 in isolated mitochondria from acidotic rats. Accordingly, the transient decrease in ?? that occurs during ADP phosphorylation was much larger in mitochondria from acidotic rat kidneys as evidenced by the safranine method No significant difference in ?? could be detected in both types of mitochondria using this method. Interestingly, determination of Ca2+ transport showed a faster rate of initial Ca2+ up take by mitochondria from acidotics and a lower concentration of extramitochondrial Ca2+ under steady state conditions (Ca2+ set point) by these mitochondria compared to control mitochondria In contrast, no significant differences could be detected in rates of Na+ or ruthenium red induced Ca2+ efflux. The data provided evidence that: succinate oxidation is inhibited in mitochondria isolated from acidotic rats while the Ca2+ influx pathway is activated in these mitochondria / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Alba R. M. Souza Brito / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T06:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_RangelWillians_M.pdf: 2463513 bytes, checksum: 90bd2dae3ec5cefb9c37861d828c29dd (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Em processos de ulcerogênese por isquemia-reperfusão há grande liberação de radicais livres causando peroxidaçâo lípidica e desestruíuração proteica pela oxidação de grupos -SH, o que altera funções da membrana e de enzimas e leva à disfunção celular e necrose tecidual. Ensaios fitoquímícos revelaram que infusos de Turnera diffusa e T. ulmifolia tem como compostos majoritários flavonas C- glicosiladas derivadas de luteonina e apigenina. A atividade antiulcerogênica destes infusos está comprovada, porém faltam estudos sobre o potencial antioxidante. Relacionando o potencial antioxidante de flavonóides e a atividade antíúlcera do extrato, mostramos in vitro que 50 pg/ml salina do extrato de T. ulmifolia e T diffusa protegem em 58 e 47% a oxidação de GSH proteico na mitocôndria oxidada por 10 uM Fe+2 e 200 uM ascorbato, respectivamente. E proteção de 12 e 50% em mitocôndria oxidada por 1,5 mM Pi e 10pM CaCb, demonstrando poder de manter grupos -SH intactos durante diferentes sistemas de danos à mitocôndria. O potencial de estabilizar a membrana foi corroborado com a diminuição na peroxidaçâo lípidica de 62 e 67% para 7. ulmifolia e T diffusa, respectivamente. Quando testados em úlcera por isquemia-reperfusão como modelo in vivo houve uma diminuição no índice de úlceras de 59 e 69%; com diminuição da peroxidaçâo lípidica de 50 e 51% e manutenção na [-SH] total de até 100% na mucosa gástrica para T. ulmifolia e T diffusa, quando comparadas à salina. / Abstract: Turnera ulmifolia L. and Turnera diffusa Wild are known in folk medicine for treatment of several gastric diseases. Other studies have previously reported anti-ulcer activity and this relationship with your majority composition to be flavonoids. Natural flavonoids are known for scavenging properties on oxygen radicals in vivo and in vitro. The oxyradicals generated during the proposed episodes of ischemia-reperfusion provoke severe changes in mitochondria-generated ROS, induce peroxidation of the membrane lipids and oxidation -SH compounds. Therefore, agents that inhibit the oxidation thiol groups, as well as lipid peroxidation, may be of high pharmacological potential. This work showed activity antioxidant when used mitochondria systems in vitro, both species tea plants exhibited effect to inhibit lipid peroxidation and oxidation thiois proteins compounds induced by FeC^/ascorbic acid, succuiate/rotenone or CaCyinorganic phosphate (Pi). Our experiments in vivo demonstrated effect anti-ulcer and antioxidant to both species in models ischaemia-reperfUsion-ulcer-induced after administration orally tea T. diffusa e T. ulmifolia inhibit lesion ulcer index when compared with control group. And in gastric mucosa exhibited effect to inhibit lipid peroxidation or oxidation -SH total compounds. In model ethanol/HCl-ulcer-induced Turnera ulmifolia show effect anti-ulcer partial dependent to compounds SH and Turnera diffusa demonstrated to be independent effect anti-ulcer to SH compounds. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T14:37:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degasperi_GiovannaRosa_D.pdf: 11126926 bytes, checksum: ac93e241fd745524d24266677f70d711 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A compreensão dos mecanismos de resposta imunológica do hospedeiro durante o desenvolvimento tumoral é fundamental para o estabelecimento de imunoterapias contra o câncer. Durante o desenvolvimento intraperitoneal do tumor de Walker 256, um modelo tumoral amplamente utilizado na oncologia experimental, foram avaliadas a bioenergética mitocondrial e a homeostase de Ca2+ em linfócitos esplênicos de animais portadores do tumor, bem como os processos de proliferação e morte linfocitária. Nos ratos portadores de tumor de Walker (TB), a proliferação linfocitária predominantemente do tipo TCD8+ e o aumento dos níveis de interleucina-2 indicaram a ocorrência de ativação linfocitária durante o desenvolvimento tumoral. O processo de ativação linfocitária acarretou produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio (EROs). Considerando que o tratamento in vitro com difenileno-iodônio inibiu a produção de EROs e aumentou os níveis da proteína cinase C fosforilada, sugere-se que a maior fonte de EROs nesta situação é a NADPH oxidase. A elevação da concentração citosólica de Ca2+ induziu acúmulo mitocondrial deste cátion. A elevação da concentração de Ca2+ intramitocondrial e a sensibilidade a oligomicina, bem como a diminuição da razão ATP/ADP, observadas em ratos TB são indicativos de estímulo do metabolismo energético. O aumento dos níveis de interferon-gama, mas não de interleucina-10, sugere que linfócitos ativados com alta demanda energética, foram capazes de deflagrar resposta imunológica do tipo Th-1 durante o desenvolvimento tumoral. Embora linfócitos ativados apresentaram mecanismos de defesa, como maior expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 e da proteína desacopladora UCP-2, observou-se que os mesmos são mais susceptíveis aos danos celulares causados pela indução de estresse oxidativo in vitro. Desta forma, linfócitos isolados de baço de ratos TB apresentaram elevada taxa de morte celular por necrose após o tratamento com tert-butil hidroperóxido, um indutor clássico de estresse oxidativo. Desferoxamina, um antioxidante e quelante de Fe2+, preveniu a ocorrência de necrose, indicando a participação de EROs no processo de morte celular. Contrariamente ao FK506, a ciclosporina A inibiu de maneira significativa à morte celular. FK506 e ciclosporina A são importantes antagonistas da via da calcineurina, entretanto somente a ciclosporina A previne a formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT). Desta forma, a indução de morte celular do tipo necrose em linfócitos ativados é via MPT. Considerando a ocorrência de linfopenia durante a quimioterapia associada ao estresse oxidativo, estes dados contribuem para a compreensão dos mecanismos que levam a linfopenia freqüentemente observada durante o tratamento quimioterápico em indivíduos portadores de tumor. Ainda, foi demonstrado que o influxo celular de Ca2+ exerce papel central no controle da resposta imunológica. A administração de verapamil, um inibidor de influxo de Ca2+ via canal tipo-L, preveniu a ativação linfocitária, bem como os mecanismos de defesa (níveis elevados de Bcl-2 e UCP-2), entre outros parâmetros estudados. Ainda, a administração de verapamil nos ratos TB contribuiu para o aparecimento de efeitos paraneoplásicos, a exemplo da anorexia e anemia. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que linfócitos do hospedeiro são capazes de exercer o processo de vigilância imunológica, envolvendo o influxo celular de Ca2+ e a participação mitocondrial com a ativação da fosforilação oxidativa, que contribui para a demanda energética requerida pelo processo de resposta imune durante o desenvolvimento tumoral / Abstract: The understanding of the mechanisms of host immune response during the tumoral development is essential to establish the immunotherapy against cancer. During the intraperitoneal development of Walker 256 tumor, the tumor model widely used in experimental oncology, the mitochondrial bioenergetics and Ca2+ homeostasis were evaluated in splenic lymphocytes from adult Wistar rats, as well as the processes of lymphocyte proliferation and death. In Walker 256 tumor bearing rats (TB) rats, the lymphocyte proliferation predominantly TCD8+ type and the increase in the levels of interleukin-2 indicated that the tumor development induces the process of lymphocyte activation. The process of lymphocyte activation induced reactive oxygen species (ROS) overproduction. Considering that the treatment of TB rats with diphenylene iodonium in vitro inhibited ROS overproduction and increased the levels of protein Kinase C phosphorylation, the NADPH oxidase was suggested as the main ROS source under this situation. The increase in cytosolic free Ca2+ concentration induced mitochondrial uptake of this cation. The increase in intramitochondrial Ca2+ concentration and in the sensitivity to oligomycin, as well as the decrease in ATP/ADP ratio, observed in TB rats, indicate a stimulation of the energetic metabolism. The increase in interferongamma, but not interleukin-10, suggests that the activated lymphocytes with high energy demand are able to promote the Th1-type immune response during the tumor development. Although the activated lymphocytes showed protective mechanisms, such as the higher levels of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and uncoupling protein UCP-2, it was observed that they are more susceptible to cellular damage caused by the induction of oxidative stress in vitro. Spleen lymphocytes isolated from TB rats presented an increase in necrotic cell death rate after treatment with tert-butyl hydroperoxide, a classical inductor of oxidative stress. Desferoxamine, an antioxidant and Fe2+ chelator, prevented the induction of cell death indicating the participation ROS in the process of cell death. However, cyclosporin A but not FK506 inhibited significantly the necrotic cell death. FK506 and cyclosporin A are important antagonists of calcineurin pathway, but only cyclosporin A inhibits the mitochondrial permeability transition (MPT). Therefore, it was suggested that the induction of necrotic cell death in activated lymphocytes is by MPT. Considering the processes of lymphopenia during the chemotherapy associated with oxidative stress, these data could help in the understanding of mechanisms that leads to lymphopenia frequently observed during the chemoterapic treatment of tumor bearing patients. Moreover, it was demonstrated that Ca2+ influx play a central rule in the control of immune response. The administration of verapamil, an inhibitor of Ca2+ influx through L-type Ca2+ channel, prevented the lymphocyte activation and the defense mechanisms (Bcl-2 and UCP-2) triggered by tumor development, between other parameters evaluated. Moreover, the administration of verapamil in TB rats contributes to the occurrence of paraneoplastic effects, such as anorexia and anemia. Together, these results suggest that lymphocytes are able to exert the immunologic vigilance process involving cell Ca2+ influx and participation of mitochondria through activated oxidative phosphorylation that sustains the energy demand required by immune response process during tumor development / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

A cisplatina ainda é um dos agentes quimioterápicos mais efetivos. No entanto, em elevadas doses pode ocorrer hepatotoxicidade. Alguns antioxidantes têm sido mostrado amenizar a hepatotoxicidade induzida pela cisplatina mas o mecanismo molecular envolvido não está bem esclarecido.No presente estudo nós investigamos moleculares subjacente ao efeito protetor da dimetiltiuouréia (DMTU), um conhecido eqüestrador de radical hidroxil, contra a lesão oxidativamitocondrial hepática induzida pela cisplatina em ratos. Ratos Wistar machos adultos ( 200 a 220g) foram divididos entre 4 grupos de 8 animais cada. O grupo controle foi tratado apenas com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de solução salina (1 ml/ 100g de peso). Ao grupo DMTU foi administrado apenas DMTU (500 mg/kg de peso, i.p., seguido de 125 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia até o sacrifício). Ao grupo cisplatina foi administrado uma injeção única de cisplatina (10 mg/kg de peso, i.p.). Ao grupo DMTU + cisplatina foi administrado DMTU (500mg/kg de peso, i.p.), pouco antes da injeção da cisplatina (10 mg/kg de peso, i.p.), seguido por injeções de DMTU (125 mg/kg de peso, i.p.) duas vezes ao dia até o sacrifício ( 72 horas após o tratamento). A hepatotoxicidade foi evidenciada no grupo cisplatina pelo aumento dos níveis séricos de alanina (ALT) e aspartato (AST)aminotransferases. O mecanismo de hepatotoxicidade induzido pela cisplatina mostrou-se envolvido na rigidez de membrana; na redução da razão glutationa reduzida em relação a glutationa oxidada (GSH/GSSG); na redução dos níveis de ATP, GSH e NADPH; na lipoperoxidação; na lesão oxidativa da cardiolipina e de proteínas com grupos fidrílicos. Mais ainda, a morte celular por apoptose foi também demonstrada e os achados fortemente sugerem a participação do xi mecanismo sinalizador mitocondrial neste processo; o DMTU não apresentou nenhum efeito direto sobre a mitocôndria e inibiu substancialmente a lesão mitocondrial induzida pela cisplatina, prevenindo a hepatotoxicidade. Todos os seguintes efeitos induzidos pela cisplatina foram previnidos pelo DMTU: (a) elevação dos níveis séricos de AST e ALT; (b) redução dos níveis de ATP hepático;(c)peroxidação lipídica;(d)oxidação da cardiolipina; (e)oxidação de proteínas sulfidrílicas; (f) rigidez da membrana mitocondrial; (g) oxidação de GSH; (h)oxidação de NADPH e (i) morte celular por apoptose. Os resultados mostraram o papel principal da mitocôndria e dos radicais hidroxilas na proteção do fígado saudável contra a lesão hepática induzida pela cisplatina, delineando um número de etapas que podem ser consideradas no desenvolvimento de futuros agentes citoprotetores / Cisplatin is still one of the most effective chemotherapeutic agents. However, at higher doses hepatotoxicity may occur. Some antioxidants have been shown to ameliorate cisplatin-induced hepatotoxicity but the involved molecular mechanism has not been clarified. In the present study we investigated the molecular mechanism underlying the protective effect of dimethylthiourea (DMTU), a known hydroxyl radical scavenger, against liver mitochondrial oxidative damage induced by cisplatin in rats.Adult male Wistar rats (200 to 220g) were divided into 4 groups of 8 animals each. The control group was treated only with an intraperitoneal (i.p.) injection of saline solution (1ml/100g body weight). The DMTU group was given only DMTU (500 mg/kg body weight, i.p, followed by 125 mg/Kg, i.p., twice a day until sacrifice). The cisplatin group was given a single injection of cisplatin (10 mg/kg body weight, i.p.). The DMTU+cisplatin group was given DMTU (500 mg/kg body weight, i.p.), just before the cisplatin injection (10 mg/kg body weight, i.p.), followed by injections of DMTU (125 mg/kg body weight, i.p.) twice a day until sacrifice (72 hours after the treatment). epatotoxicity was evidenced in the cisplatin group by the increased serum levels of alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferases. The mechanism of cisplatininduced hepatotoxicity was found to involve membrane rigidification; decreased GSH/GSSG ratio, ATP, GSH and NADPH levels; lipid peroxidation; oxidative damage of cardiolipin and protein sulfhydryl groups. Moreover, cell death by apoptosis was also demonstrated and the findings strongly suggest the participation of the mitochondrial signaling pathway in this process; DMTU did not present any direct effect on mitochondria and substantially inhibited cisplatin-induced mitochondrial injury, therefore preventing the hepatotoxicity. All the following cisplatin-induced xiv effects were prevented by DMTU: (a) elevation of AST and ALT serum levels; (b) decreased hepatic ATP levels; (c) lipid peroxidation; (d)cardiolipin oxidation; (e) sulfhydryl protein oxidation; (f) mitochondrial membrane rigidification; (g) GSH oxidation; (h) NADPH oxidation and (h) apoptotic cell death. Results show the central role of mitochondria and hydroxyl radicals in the protection of healthy liver against cisplatin-induced injury, highlighting a number of steps that might be considered in the development of novel cytoprotective agents.

O fator de transcrição A mitocondrial (TFAM) é um membro da subfamília HMGB que se liga a promotores do DNA mitocondrial (mtDNA). É um gene importante para a manutenção do mtDNA, pois regula o número de cópias e é essencial para inicialização da replicação e transcrição do mtDNA. Recentemente técnicas de edição gênica vêm sendo utilizada como uma ferramenta bastante eficaz na manipulação genômica. A nova tecnologia chamada de CRISPR/ Cas9 (Regulary interspaced clustered short palindromic repeats) utiliza um RNA guia (gRNA) curto que contém 20 nucleotídeos complementares a sequência de DNA. Quando o RNA guia se liga ao local alvo, a proteína Cas9 é recrutada para se ligar no local alvo e induzir a dupla quebra na cadeia de DNA. Neste contexto, este estudo propôs editar o gene TFAM pela tecnologia CRISPR Cas9, com o objetivo de gerar células Rho zero através do knock-out em fibroblastos bovinos. Os fibroblastos bovinos utilizados neste estudo foram derivados de uma biopsia de pele coletada de animais adultos. A sequência do gene foi obtida a partir do banco de dados GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) e esta foi inserida no site CRISPR direct (crispr.dbcls.jp) e no site rgenome (rgenome.net) a fim de desenhar o gRNA. O gRNA foi desenhado no exon 1 do gene TFAM bovino. Os fibroblastos foram cultivados e após as células atingirem 80% de confluência, estas foram eletrotransfectadas com Cas9 (Addgene 48668), gRNA, GFP e plasmídeo controle. Foi utilizado o kit Primary Mammalian Fibroblasts (VPI-1002) e a transfecção foi realizada no equipamento AMAXA Nucleofector 2B. Após a transfecção foi realizada a citometria de fluxo para avaliar a taxa de transfecção, e as células pós transfectadas foram plaqueadas em placas de 96 poços, pela técnica de sorting. O sorting separarou uma célula por poço de 96. Após 20 dias em cultura essas células foram tripsinizadas em placas de 6 poços e o DNA genômico foi extraído, utilizando o kit Qiamp DNA microkit-Qiagen. Para avaliar a frequência de mutações, foi realizada a digestão com a enzima T7 endonuclease, e após confirmado mutações, os clones foram enviados para analise de sequenciamento. Observamos uma taxa de transfecção eficiente de 51,3%. Obtivemos 40 clones com DNA extraído para analise, no qual 7 destes possuiam mutações no local de inserção da CRISPR Cas 9. Com isso, concluimos uma heterozigose mostrando que o desenho da CRISPR foi eficiente, gerando uma deleção do gene TFAM. / The mitochondrial transcription factor A (TFAM) is a member of HMGB subfamily that binds to promoters of mtDNA. It is a very important gene that maintains mtDNA, regulates the number of copies and is essential for the initiation of transcription mtDNA. Recently, gene edition techniques have been used as a very effective tool in genomic manipulation. The new technology called CRISPR/Cas9 (Regulary interspaced clustered short palindromic repeats) uses a short gRNA containing 20 nucleotides complementary to the DNA sequence. When gRNA binds to the target site, the Cas9 protein is recruited to bind in the chosen location and induce double strands breaks in DNA. In this context, this study proposed to edit the TFAM gene by CRISPR Cas9 technology aiming to generate Rho zero cell through the knock-out in bovine fibroblasts. Bovine fibroblasts used in this study were derived from a skin biopsy collected from an adult. The sequence obtained from the database GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) was inserted in the CRISPR direct site (crispr.dbcls.jp) and in the rgenome site (rgenome.net) to design the RNA guide. The gRNA was designed in the CRISPR direct site (crispr.dbcls.jp) for the Exon 1 of the gene TFAM bovine and after was performed the CRISPR cloning. The fibroblast were cultured and after reaching 80% of confluence, were electro-transfected with Cas9 (Addgene 48668) and control plasmids using the Nucleofector TM Kit for Primary Mammalian Fibroblasts (VPI-1002) and transfected with Cas 9 (Addgene 48668), GFP and control plasmid. Were used the Primary Mammalian Fibroblasts (VPI-1002) and the transfection was performed on the AMAXA Nucleofector 2B. Post transfected cells were analyzed by flow cytometry to evaluate the rate of transfection. The cells post transfected were further split into 1 cell/well (96- well plates for cell cloning). After days in culture these cells were trypsinized in 6-well plates and the genomic DNA was extracted using the Qiamp DNA microkit- Qiagen. To assess the mutation frequency, T7 endonuclease assay were performed and after confirmed the mutations, the clones were sent for sequencing analysis. We observed that the cells were efficiently transfected since they have a rate of 51,3% transfection. We obtained 40 clones with extracted for analysis, in which 7 of these had mutations at the insertion site of CRISPR/Cas 9. We concluded that until this moment the CRISPR design was efficient and that we obtained a deletion of the TFAM gene.

As mitocôndrias são organelas semiautonômicas, portadoras do próprio DNA, o mtDNA e responsáveis pela produção de energia celular na forma de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa. Atualmente, diferentes tipos de doenças, como distrofias musculares e diversos tipos de câncer, estão associadas à alteração nas moléculas de mtDNA. Na década de 70 um modelo a partir do cultivo celular com brometo de etídio (EtBr) foi desenvolvido com o objetivo de se criar uma linhagem celular depletada de cópias de mtDNA. Desde então os mais variados estudos foram realizados e diversos tipos celulares foram submetidos à depleção do mtDNA. Este projeto teve como objetivos criar um modelo de cultivo celular somático na espécie bovina com depleção de cópias de mtDNA para investigar a resposta da célula a esta condição; avaliar como as células depletadas se comportam na ausência de EtBr, além da utilização destas células no processo de reprogramação celular por indução gênica na tentativa de avaliar o efeito do numero de cópias de mtDNA na indução na espécie bovina. Para tanto foram desenvolvidos três experimentos; Experimento 1- Depleção de mtDNA a partir da utilização do brometo de etídeo; Experimento 2 Repleção do mtDNA; e Experimento 3 Utilização de células bovinas depletadas no sistema de reprogramação nuclear. Todos os experimentos foram avaliados quanto a quantidade de cópias de mtDNA e expressão gênica para os genes Bax, Bcl2 e Tfam. Ademais, os experimentos 1 e 2 foram avaliados quanto a viabilidade celular e apenas o experimento 1 foi avaliado quanto ao crescimento e morfologia celular. O experimento 1 foi avaliado durante o cultivo celular nos períodos D0, D4, D7, D10 e D13, com os grupos experimentais controle (EtBr-C) e tratado com 100 ng/mL de brometo de etídio (EtBr-T), quanto a núero de cópias do mtDNA, o grupo EtBr-T diferiu do grupo EtBr-C (P=0,0459), apresentando menor número de cópias de mtDNA; menor taxa crescimento celular (P<0,05), porém sem alteração na morfologia celular, e na expressão dos genes descritos acima. No experimento da repleção, não houve diferença no número de cópias de mtDNA, entre os grupos EtBr-T e EtBr-R, indicativo de que as células atingiram o estado rho 0 ou que necessitam de mais tempo para ativar a replicação do mtDNA; quanto a viabilidade celular, houve diferença entres os grupos, quanto a expressão gênica, com aumento do Bax e do Bcl-2 para o grupo EtBr-T; O grupo EtBr-R apresentou queda do Bcl-2; para o Tfam houve aumento para o grupo EtBr-T e uma queda para o grupo EtBr-R. Quanto ao experimento 3, não foi possível observar sinais de pluripotência, porém foi detectada uma queda na quantidade de mtDNA dos dois grupos tratados por EtBr (EtBr com e sem Stemcca) e o grupo controle com Stemcca. Para analise de expressão gênica, não houve diferenças entre os grupos em relação ao Tfam. Quanto ao Bax, os grupos controle com Stemcca, controle sem Stemcca e EtBr sem Stemcca não diferiram, e o ultimo também não apresentou diferença quando comparado ao grupo EtBr com Stemcca. Para o Bcl-2, os grupos controle sem Stemcca e EtBr com Stemcca não apresentaram diferenças entre si; o grupo controle sem Stemcca não apresentou diferença quando comparado aos grupos controle com Stemcca e EtBr sem Stemcca. Concluindo, este trabalho no nosso conhecimento, descreve pela primeira vez a produção de células bovinas Rho 0 e discute sobre a relação da função mitocondrial e o processo de reprogramação celular. / Mitochondria are semi autonomic organelles which present their own DNA (mtDNA); are in charge of cell energy production as ATP through oxidative phosphorylation. Currently, different types of diseases like muscular distrofy; different types of cancer are associated to alterations of mtDNA molecules. In the 70\'s a model based on cell culture with ethidium bromide (EtBr) was developed in order to create a cell line depleted of mtDNA. Since then, a variety of studies were realized; diverse cell types were submited to mtDNA depletion. This project had as objective creating a model of somatic cell culture in bovine species with depletion of mtDNA copies, in order to investigate cell response to this condition; to analyze depleted cell behavior in the absence of EtBr, besides using this depleteded cell in a reprogramming cell process by genic induction in order evaluate the effect of the number of mtDNA copies during induction in bovine species. Therefore three experiments were developed: Experiment-1 Depletion of mtDNA using ethidium bromide. Experiment-2 repletion of mtDNA; Experiment-3 usage of depleted bovine cells in reprogramming nuclear system. Cell experiments were analyzed according to the quantity of mtDNA copies; genic expression for Bax, BCl2; Tfam genes. Also, experiments 1; 2 were analyzed on cell viability; only experiment 1 was analyzed regarding cell morphology; growth. Experiment-1 was analyzed during cell culture on periods D0, D4, D7, D10, D13, with control experimental groups (EtBr-C),; treated with 100 ng/mL ethidium bromide (EtBr-T); relating to mtDNA quantification the EtBr-T group differed from EtBr-C (P=0,0459) presenting a smaller number of mtDNA copies; smaller growth rate (P<0,05); although there was no differences on cell morphology as there was also no difference related to genic expression of the previous stated genes. Repletion experiment showed no differences about the number of mtDNA copies between EtBr-T; EtBr-R groups, indicating this cells reached Rho0 state or that they need more time to activate mtDNA replication; about cell viability, there were no differences among the groups; relating to genic expression there was an increase of Bax; BCl-2 for EtBt-T group; EtBr-R group showed decrease of BCl-2; for Tfam there was an increase for EtBr-T group; a decrease for EtBr-R. Relating to Experiment-3 it was impossible to notice signs of pluripotency, but we could see a decrease in the amount of mtDNA in both groups treated with EtBr (EtBr with; without STEMCCA) as in control group with STEMCCA. Genic expression analysis didn\'t show differences related to Tfam. Regarding to BAX, both control groups (with; without STEMCCA); EtBr without STEMCCA didn\'t differ from each other,; the last one also didn\'t show any difference when compared to EtBt with STEMCCA group. For BCl-2, control group without STEMCCA; EtBr with STEMCCA didn\'t show differences among each other; control group without SEMCCA didn\'t show differences when compared to control group with STEMCCA; EtBr without STEMCCA. Concluding, this work, regarding our knowledge, describes for the first time, production of bovine Rho0 cells; debates about the relationship among mitochondrial function; the process of cell reprogramation.

A. fumigatus é um patógeno oportunista que causa infecções invasivas em hospedeiros imunocomprometidos. Estudos de respiração mitocondrial sugeriram a presença de componentes alternativos em sua cadeia respiratória envolvidos com processos de adaptação a ambientes adversos, como a proteína desacopladora (UCP). UCPs são proteínas mitocondriais cuja atividade dissipa o potencial de membrana gerado durante o transporte de elétrons. Um gene contendo características das três assinaturas moleculares das Proteínas Transferidoras de Energia foi clonado e sequenciado. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois íntrons que, após o splicing, codifica uma proteína contendo 341 aminoácidos, com uma massa molecular de 37 kDa e um pI de 10,02. A fim de se avaliar as propriedades bioenergéticas da UCP-like, essa sequência foi clonada no vetor pYES2 e leveduras S. cerevisiae foram transformadas. Esferoplastos foram preparados e o potencial elétrico transmembrana mitocondrial foi estimado. Os resultados mostraram que o potencial de membrana de esferoplastos de leveduras expressando a proteína UCP-like foi ligeiramente menor e que o decréscimo momentâneo do potencial associado com a fosforilação do ADP foi mais lento quando comparado com o controle, indicando desacoplamento da respiração. Além disso, esse comportamento dos esferoplastos recombinantes foi similar ao controle quando GDP foi adicionado ao meio de reação, sugerindo uma inibição da proteína por esse composto. Para sua caracterização funcional em sistemas reconstituídos, a sequência foi clonada no vetor pET SUMO. A expressão foi realizada em E. coli e a proteína recombinante, purificada por cromatografia em resina de níquel, foi analisada por Western blot com anticorpos anti-(His)6-tag e anti-UCP2 e por espectrometria de massas. A formação dos lipossomos foi confirmada através de medidas de distribuição de partícula por espalhamento de luz dinâmico, as quais sugeriram a formação de vesículas estáveis. Em adição, foi investigada a participação da UCP-like na proteção do A. fumigatus contra danos oxidativos. O nível de mRNA foi determinado por PCR em tempo real na presença de paraquat e menadiona. Em A. fumigatus, a presença dessas drogas pró-oxidantes resultou em um aumento no nível de mRNA desse gene, sugerindo que essa proteína possa também fazer parte de um sistema de defesa antioxidante do fungo. / A. fumigatus is an opportunistic pathogen that causes invasive infections in immunocompromised hosts. Mitochondrial respiration studies suggested the presence of alternative components on its respiration chain, which are involved with the adaptation to hostile environments, such as the uncoupling protein (UCP). UCPs are mitochondrial proteins whose activity dissipates the membrane potential generated during electron transport. A gene containing features of three molecular signatures of Energy Carrier Protein was cloned and sequenced. The alignment between the cDNA and genomic DNA sequences revealed the existence of two introns which after splicing encodes a 341 amino acids protein with a molecular mass of 37 kDa and a pI of 10.02. In order to study bioenergetics properties of UCP-like, the cDNA sequence was cloned into pYES2 vector and transformed in S. cerevisiae. Spheroplasts were prepared and the mitochondrial electrical transmembrane potential was estimated. The results showed that, compared with control cells, mitochondrial electrical transmembrane potential of transformant spheroplasts was slightly smaller and the transient potential decrease associated with ADP phosphorylation was longer, indicating uncoupling of respiration. Moreover, this behavior of recombinant spheroplasts was similar to control cells when GDP was added to the reaction medium, suggesting the inhibition of uncoupling protein. For its functional characterization in reconstituted systems, the cDNA sequence was cloned into pET SUMO vector. The expression was carried out in E. coli and the recombinant protein, purified by chromatography on a nickel-chelating resin, was analyzed by Western blot using anti- (His)6-tag or UCP2 antibodies and by mass spectrometry. Liposome formation was confirmed by light scattering, suggesting the formation of stable vesicles. In addition, the participation of UCP-like in A. fumigatus protection against oxidative damage was investigated. mRNA level was determined by real time PCR in the presence of paraquat and menadione. In A. fumigatus, the presence of these pro-oxidants drugs resulted in increased mRNA level of this gene, suggesting that this protein might also be part of an antioxidant defense system of this fungus.

O avanço na expectativa de vida da população elevou concomitantente as manifestações de doenças neurodegenerativas, sendo Alzheimer a mais frequente. As condições clínicas mais importantes relacionadas aos pacientes acometidos por tal neurodegeneração, são as placas ?-amilóides, os emaranhados neurofibrilares e a extensa perda neuronal, ocasionadas por fatores genéticos e/ou ambientais. A alimentação pode ser um fator desencadeador de demência, pois, a baixa ou longa exposição aos pesticidas incorporados aos alimentos promovem neurodegenerações em decorrência do estresse oxidativo gerado por tais produtos químicos, desenvolvidos para alterar o metabolismo em organismos não viáveis comercialmente na agricultura, denominados como pragas. Desta forma, um sistema de neuroproteção se faz necessário para minimizar e/ou reverter os danos desencadeados por agrotóxicos incorporados em alimentos rotineiramente consumidos. / The advancement in the life expectancy of the population concomitantly increased the manifestations of neurodegenerative diseases, with Alzheimer being the most frequent. The most important clinical conditions related to the patients affected by such neurodegeneration are ?-amyloid plaques, neurofibrillary tangles and extensive neuronal loss, caused by genetic and / or environmental factors. Feeding can be a trigger for dementia since the low or long exposure to pesticides incorporated into foods promote neurodegenerations due to the oxidative stress generated by such chemicals, designed to alter the metabolism in non-commercially viable organisms in agriculture, known as pests In this way, a neuroprotection system is necessary to minimize and / or reverse the damage caused by pesticides incorporated into routinely consumed foods.