Orientador: Benedito de Oliveira Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T05:29:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valente_RichardHemmi_M.pdf: 3746690 bytes, checksum: b9cf26d655ff09edd9111b030c9a6161 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A crotoxina, isolada e cristalizada em 1938 por Slotta e Fraenkel-Conrat a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus mostrou ser um complexo resultante da interação quaternária de duas sub-unidades representadas por uma proteína ácida com massa molecular de 9 kDa denominada crotapotina e um componente básico, com massa molecular de 14,5 kDa que foi identificado como sendo uma fosfolipase A2 (PLA2 ). Esta última é considerada o principal componente responsável pelo desencadeamento dos efeitos farmacológicos induzidos pelo complexo crotoxina. Estudos mais recentes demonstraram a ocorrência de várias isoformas de PLA2, presentes em diferentes lotes de veneno coletados de várias serpentes, sendo tais isoformas decorrentes da expressão de diferentes RNAs mensageiros. As PLA2 (EC 3.1.1.4.) são enzimas que catalisam especificamente a reação de hidrólise da ligação acil-ester na posição sn-2 de fosfoglicerídeos numa reação dependente de álcio, liberando quantidades equimolares de ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. Já foi demonstrado que trações puras de PLA2 apresentam efeitos inibitórios marcantes sobre várias funções mitocondriais, reduzindo as atividades da NADH oxidase, das succinato e NADH-desidrogenase e da capacidade de fosforilação. Além disso, as PLA2 podem modificar a microviscosidade da fase lipídica da bicamada hidrofóbica de membranas, afetando a atividade funcional de enzimas ligadas à membrana, e, através desse mecanismo, regular vários processos metabólicos. No presente trabalho purificamos e caracterizamos, a partir da crotoxina, três isoformas de PLA2 (F1, F2 e F3) com elevado grau de pureza. As isoformas apresentaram massa molecular aparente com valor igual a 15 kDa e alta homologia seqüencial dos 20 resíduos N-terminais em comparação a isoformas já descritas na literatura. o efeito de cada isoforma de PLA2 purificada sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato foi determinado através de consumo de oxigênio durante o estado respiratório 4 e de inchamento mitocondrial. FI apresentou um estímulo dose dependente do consumo de oxigênio enquanto F2 e F3 causaram estímulo apenas em baixas concentrações e inibição em quantidades maiores. Esses efeitos foram completamente abolidos quando soro albumina bovina a 0,1% ou EGTA a 0,5mM estavam presentes no meio de incubação. Usando-se o inchamento mitocondrial como um parâmetro comparativo, todas as isoformas apresentaram o mesmo comportamento com intensidades diferentes, levando à permeabilização da membrana mitocondrial. Neste caso, a adição de EGTA preveniu o inchamento enquanto a soro albumina bovina foi ineficiente, indicando que o microambiente lipídico foi realmente afetado. Esses resultados sugerem que ácidos graxos livres liberados pela ação das isoformas são diretamente responsáveis pelos efeitos observados nos experimentos de consumo de oxigênio. A proteção oferecida pela CSA contra o inchamento causado pelas isoformas, principalmente quando estas estavam presentes em baixas concentrações, sugere que a ligação da CSA a um sítio da membrana mitocondrial protege esta última contra o ataque das PLA2. Já a pequena proteção oferecida pelo CAT, bem como o prevalecimento do pequeno efeito protetor do CAT quando utilizamos simultaneamente CSA e CAT, sugerem que a ligação do CAT ao seu sítio no carreador ADP/ATP impede a proteção conferida pela CSA / Abstract: Crotoxin, isolated and cristalized in 1938 by Slotta and Fraenkel-Conrat from Crotalus durissus terrificus venom showed to be a complex resultant from the quaternary association between two sub-units: an acidic protein with a molecular mass of 9 kDa named crotapotin and a basic component, with a molecular mass of 14.5 kDa which was identified as a phospholipase A2 (PLA2). This last one is considered to be the main component responsible for the pharmacological effects induced by the crotoxin complex. Recent studies have demonstrated the existence of several PLA2 isoforms which were present in different venom batches collected from several snakes. These isoforms result from the expression of different menssager RNAs. The PLA2 (EC 3.1.1.4) are enzimes that specifically catalyse the hydrolysis of the acyl-ester bond at the sn-2 position of phosphoglycerides in a calcium dependent reaction, producing equimolar amounts of ftee fatty acids and Iysophospholipids. It has already been demonstrated that purified PLA2 fractions show marked inhibitory effects on several mitochondrial features, decreasing NADH-oxidase, succinate and NADH-dehydrogenase activities and phosphorylation capacity. It is also known that PLA2 can modify the microviscosity of the lipid phase of the hydrophobic membrane bilayer, affecting the functional activity of membrane-bound enzymes, and through this mechanism regulate various metabolic processes. In the present work, we have purified and characterized, from crotoxin, three PLA2 isoforms (F1, F2 and F3) with high degree of purity. The isoforms presented an apparent molecular mass of 15 kDa and a high degree of homology regarding the 20 N terminal aminoacid residues when compared to other isoforms already described in the literature. The effect of each purified phospholipase A2 isoform on isolated rat liver mitochondria was determined through mitochondrial swelling and Oz consumption during respiratory state 4. FI showed a dose-dependent stimulation of O2 consumption while F2 and F3 caused stimulation only at low doses and inhibition at higher amounts. These effects were completely suppressed by the presence of 0.1% bovine serum albumin or 0.5mM EGTA in the incubation medium. Taking the mitochondrial swelling as a comparative parameter, alI of them presented the same behaviour at different intensities, leading to permeabilization of the mitochondrial membrane. In this case, addition of EGTA prevented it whereas bovine serum albumin was ineffective, indicating that the lipid microenvironrnent was actualIy,affected. These results suggest that free fatty acids must be directly responsible for the observed effects induced by hospholipase A2 isoforms on oxygen consumption experiments. The protection confered by cyclosporin-A on swelling induced by the isoforms, mainly when they were present in low concentrations, suggests that cyclosporin-A binding to a mitochondrial membrane site protects the membrane against the phospholipase A2 attack. On the other hand, the smalI protection confered by CAT, as well as the prevailment of the small protective CAT effect when we used both CSA and CAT, suggest that the CAT binding to the ADP/ ATP carrier inhibits the protection confered by CSA / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Lucia Pereira da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T11:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_ArmindoAntonio_M.pdf: 5893539 bytes, checksum: 3fb5538dc100f360ca6bd135dcc1b6ad (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Neste trabalho estudamos o papel dos íons de ferro na peroxidação lipídica induzida por FeSO4 em mitocôndrias isoladas de fígado de rato (MFR). Na literatura aparecem duas teorias distintas para explicar o papel dos íons de ferro na iniciação da peroxidação lipídica. A primeira propõe que o ferro é o catalisador das reações de Haber-Weiss e de Fenton que produzem o radical hidroxila (OR) que atacaria os ácidos graxos polinsaturados das membranas. Uma segunda hipótese contesta a primeira, por considerar que o 'OH é muito reativo para difundir-se dos sítios onde é formado até a parte hidrofóbica da membrana, onde estão os ácidos graxos passíveis de ataque. Neste caso, a proposta é que a peroxidação lipídica seria induzida por complexos radicalares fonnados por Fe2+, Fe3+ e O2. Estas espécies teriam reatividade suficiente para abstrair átomos de hidrogênio das pontes metilênicas entre as duplas ligações dos ácidos graxos polinsaturados. Nossos resultados. mostram que a peroxidação lipídica induzida por FeSO4 causa alterações na fluidez das membranas mitocôndriais e é dependente de uma relação Fe2+/Fe3+ equimolar para atingir seu efeito máximo. Fatores que levem a um aumento na velocidade de oxidação do Fe2+ a Fe3+ pelo O2 contribuem para um aumento significativo da lipoperoxidação. Entre esses estão a presença de H2O2, o vazamento de elétrons quando as mitocôndrias estão energizadas, e íons como Pi presentes no meio de reação. Os experimentos em que a peroxidação lipídica foi inibida pelo sequestrador de radicais butilhidroxitolueno (BHT) permitem afirmar que a iniciação do processo peroxidativo depende da geração de uma espécie radicalar além da presença de FeSO4. O fato do manitol, conhecido sequestrador do radical hidroxila, não ter apresentado efeito inibitório sobre essa peroxidação, somado à observação anterior, permite descartar a hipótese de ser o radical hidroxila o iniciador do processo. Os resultados aqui apresentados, corroboram a hipótese de que complexos radicalares de valências mistas de ferro e 02 seriam os iniciadores da peroxidação lipídica induzida por FeSO4 em mitocôndrias isoladas, nas condições por nós estudadas / Abstract: Here we have studied the role of iron ions on the mitochondrial lipid peroxidation induced by FeSO4 in isolated rat liver mitochondria. There are two hypothesis to explain the role of iron ions on the initiation of this peroxidative process. The first one suggests that iron catalyses Haber Weiss and Fenton reactions generating the hydroxyl radical (OR). This later would attack the polly saturated fatty acids of the membrane phospholipids. The second explanation discards a direct participation of OIL as it is a very reactive species to difuse from its generating site to the hydrophobic part of the membrane, where are situated the fatty acids. In this case, the proposal is that the peroxidative process would be initiated by complexes of Fe2+ and Fe3+ and O2. These species would be reactive enough to react with the hydrogen from the methylenic bridges between the polly saturated fatty acid double bonds. Our results show that the FeS04-induced lipid peroxidation causes alterations on the mitochondrial membrane fluidity and the maximum effect is reached when an equimolar Fe2+/Fe3+ relation is achieved. Conditions favouring an increase on the Fe2+ to Fe3+ oxidation by O2 contribute to a significant increase on lipid peroxidation. Among these are the presence of H2O2, the electron leak occuring when energized mitochondria were used and phosphate ions in the reaction medium. The experiments showing that the peroxidation is inhibited by butylhydroxytoluene (BHT), a known radical scavenger, lead to the conclusion that to initiate the peroxidative process a radical should be generated besides the presence of FeSO4. As mannitol was found unable to inhibit this process and it is known that mannitol scavenges OH, the hypothesis that hydroxil is the radical species needed to initiate this process can be discarded by our results. Moreover, our data support the proposal that complexes of iron mixed valences and O2 would be the real initiators of the lipid peroxidation induced by FeSO4 in isolated mitochondria / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T23:51:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Catisti_Rosana_D.pdf: 27879026 bytes, checksum: 9ca11d6622077883543ad498337004ef (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O íon cálcio exerce papel essencial no controle de uma série de funções celulares, porém seu excesso pode desencadear tanto a morte celular programada (apoptose) quanto a acidental (necrose). Para avaliarmos os efeitos de ácido araquidônico (AA) na homeostase intracelular de cálcio, utilizamos dois modelos experimentais: mitocôndrias isoladas de fígado de rato e tripanossomatídeos. Comparamos a capacidade de abertura do poro de transição de permeabilidade, utilizando-se concentrações de AA e de carbonil cianeto p-trifluorometoxifenil-hidrazone (FCCP) capazes de causar, de modo similar, a dissipação do potencial elétrico transmembrana (? ?) em mitocôndrias de fígado de rato, na presença de cálcio e do substrato respiratório succinato. O efeito protonofórico de AA e FCCP foi muito pouco modificado por carboxiatractilosídeo. A abertura do poro de transição de permeabilidade, induzida por AA ou FCCP, mostrou ser sensível a catalase, EGTA, ADP, ditiotreitol, ciclosporina A, rotenona e por substratos respiratórios. Isto indica que a condição de estresse oxidativo associada ao estado oxidado dos nucleotídeos de piridina leva à oxidação de tióis das proteínas de membrana, abrindo o poro. Investigamos também o mecanismo de ação de AA na mobilização intracelular de cálcio, em formas tripomastigotas procíclicas de Trypanosoma brucei, promastigotas de Leishmania donovani e amastigotas de Trypanosoma cruzi. Verificamos que o influxo de cálcio é estimulado pela melitina, e bloqueado pelo inibidor da fosfolipase A2 ácido 3-(4-octadecil)-benzoilacrílico (OBAA). AA induz o influxo de cálcio, num mecanismo sensível a LaCb. Entretanto, melitina e AA induzem um aumento na [Ca2+]iem T. brucei, quando incubados em meio livre de Ca2+, indicando mobilização de Ca2+ de organelas intracelulares. Essa hipótese foi sugerida pelos experimentos mostrando que AA promove liberação de Ca2+de acidocalcisomas nestas células. Os resultados mostrando mudanças no potencial de membrana mitocondrial, liberação de alaranjado de acridina e Ca2+ dos acidocalcisomas, e transporte de Ca2+ através da membrana plasmática, sugerem que, em adição à possível estimulação nos processos mediados por canais de Ca2+,AA, na faixa de concentração aqui utilizada, tem outros efeitos não específicos em membranas de tripanossomatídeos / Abstract: Calcium ions play essential role in the control of many cellular functions, however the excess may act as a trigger for both programmed (apoptosis) or accidental cell death (necrosis). To evaluate the role of arachidonic acid (AA) in intracellular calcium homeostases, we used two experimental models: isolated rat liver mitochondria and trypanosomatids. We have compared the PTP opening ability of AA with that of carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (FCCP) at concentrations that cause similar quantitative dissipation of the membrane potential (? ?) in Ca2+-Ioaded rat liver mitochondria respiring on succinate. The protonophoric effects of AA and FCCP were only slightly modified by carboxyatractyloside and were followed by PTP opening, sensitive to catalase, EGTA, ADP, dithiothreitol, cyclosporin A, rotenone or NAD(P)H-linked substrates. These results indicate that a condition of oxidative stress associated with the oxidized state of PN underlies membrane protein thiol oxidation and PTP opening. We also studied the AA induced-calcium mobilization in Trypanosoma brucei procyclic trypomastigotes, Leishmania donovani promastigotes and Trypanosoma cruzi amastigotes. We verified that Ca2+influx was also stimulated in a dose-dependent manner (50-400 nM) by the amphiphilic peptide melittin. This effect was blocked by the phosphqlipase A2 inhibitor 3-(4-octadecyl)-benzoylacrylic acid. The unsaturated fatty acid AA, in the range of 10-75 µM, induced Ca2+entry by a mechanism sensitive to LaCb. However, both melittin and AA induced increase in [Ca2+]i in T. brucei procyclic trypomastigotes incubated in Ca2+-free medium implying Ca2+ mobilization trom intracellular stores. This hypothesis was supported by experiments showing that AA promoted Ca2+release from the acidocalcisomes of these cells. The results showing changes in mitochondrial membrane potential, release of acridine orange and Ca2+from the acidocalcisomes and Ca2+release across the plasma membrane suggest that in addition to the stimulation of a Ca2+channel mediated process, AA, in the range of concentrations used here, have other nonspecific effects on the trypanosomatids membranes / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Luis Eduardo Soares Netto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T21:34:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Demasi_AnaPaulaDias_D.pdf: 6119509 bytes, checksum: c2567938716903e44d3454768d871456 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Tiorredoxina peroxidase citoplasmática I (cTPxI) é uma enzima antioxidante de Saccharomyces cerevisiae pertencente à família das peroxirredoxinas, conservada desde bactérias até humanos, capaz de reduzir hidroperóxidos às custas de um substrato contendo tio!. Nossos estudos a respeito de sua função em leveduras demonstraram que CTPX1 é altamente expresso em células expostas a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio. Resultados posteriores revelaram que cTPxI é essencial para a defesa antioxidante de células com deficiências respiratórias, demonstrado pela elevada sensibilidade ao H2O2 de células mutantes em CTPX1 (l1ctpxI) com disfunções mitocondriais. Além disso, mostramos que a remoção de DNA mitocondrial ou a deleção do gene COXI0, necessário para a montagem de cito cromo c oxidase, induzem a formação de HzOz. Independentemente de como e onde a função mitocondrial é perturbada, a produção endógena de EROs parece ser necessária para o aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo de células Dctpxl Este fenômeno foi demonstrado por testes de viabilidade e por determinações dos níveis de grupos sulfidrila protéica e não protéica. Em acordo, a expressão de CTPX1 é bastante elevada nas condições em que a proteína correspondente é essencial para a defesa antioxidante. Finalmente, obtivemos evidências de que cTPxI especificamente protege células com deficiência respiratória contra EROs, uma vez que deleções de genes que codificam outras peroxidases não promoveram alterações de sensibilidade de células com mitocôndrias funcionalmente defeituosas ao H2O2. Portanto, cTPxI parece ser especialmente importante na proteção de células expostas simultaneamente a fontes de EROs endógenas e exógenas. Deficiências respiratórias são freqüentemente associadas ao processo de envelhecimento, doenças neurodegenerativas e câncer em células humanas. De acordo com nossos resultados, peroxirredoxinas, especialmente aquelas que apresentam elevada similaridade a cTPxI de levedura, poderiam exercer papel decisivo no destino, sobrevivência ou morte, de células afetadas por estas desordens / Abstract: Cytosolic thioredoxin peroxidase I (cTPxI) is a Saccharomyces cerevisiae antioxidant enzyme that belongs to peroxiredoxins family, conserved from bacteria to humans, able to reduce hydroperoxides in the presence of a thiol substrate. Our study concerning its role in yeast cells demonstrated that CTPXI is highly expressed in cells exposed to different H2O2 concentrations. Further results revealed that cTPx I is essential for the antioxidant defense of respiratory deficient cells, demonstrated by high sensitivity to H2O2 of ctpxI mutant cells with dysfunctional mitochondria. In addition, we have shown that lack of mitochondrial DNA or COX10 deletion, gene required for cytochrome c oxidase assembly, lead to H2O2 increased generation. Regardless where or how mitochondrial function is perturbed, endogenous ROS production seems to be necessary to increase sensitivity of ctpxI cells to oxidative stress. This phenomenon was demonstrated by viability tests and by sulfhydryl content determinations. Accordingly, C1PX1 expression was high in conditions where the corresponding protein was essential to antioxidant defense. Finally, we have obtained evidences suggesting that cTPxI specifically protects respiratory deficient cells against ROS, since deletion of genes encoding other peroxidases did not alter the sensitivity of cells with mitochondrial dysfunction to HzOz. Therefore, cTPxI seems to be remarkably important in the protection of cells exposed simultaneously to ROS generated by endogenous and exogenous sources. Respiratory deficiencies are frequently associated with cancer, neurodegenerative diseases and aging in human cells. Our results suggest that peroxiredoxins, specially those with high similarity to yeast cTPxI, could exert decisive role in the destiny, survival or death, of cells affected by these disorders / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fortes_Fabiane_D.pdf: 6319841 bytes, checksum: 144a21dcedbb62affbf54b8f2970a375 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O dano oxidativo induzido por Ca2+e agentes prooxidantes em mitocôndrias é mediado pelo ataque de espécies reativas de oxigênio geradas pela própria mitocôndria. Estas espécies reativas de oxigênio atacam os grupos tióis de proteínas de membrana promovendo oxidação e ligações cruzadas que conduzem à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). A TPM em mamíferos caracteriza-se por uma permeabilização não específica e dependente de ea2+que ocorre na membrana mitocondrial interna e é inibida por concentrações submicromolares de ciclosporina A (CsA). No presente estudo foi evidenciado que apesar de mitocôndrias isoladas de tubérculo de batata (Solanum tuberosum) não apresentarem captação e acúmulo significativo de Ca2+, sofrem permeabilização da membrana interna quando tratadas com Ca2+(> 0,2 mM). Esta permeabilização foi potencializada pela adição de diamida, um oxidante de grupos tiólicos que estabelece uma condição de estresse oxidativo devido à oxidação de nucleotídeos de piridina. Esta permeabilização foi inibida pela acidificação do pH do meio de reação, Mg2+ e pelos antioxidantes catalase e ditiotreitol, mas não foi prevenida por inibidores clássicos da TPM de mamíferos como: ADP, bongkrekato e CsA. A ausência de inibição da permeabilização mitocondrial de batata pela CsA contrasta com seu efeito inibitório sobre a atividade da enzima peptidilprolil cis-trans isomerase, que está relacionada com a proteína ciclofilina, um sítio de ligação para CsA. O mersalil, um reagente tiólico monofuncional induz um extenso inchamento insensível à CsA, mesmo na presença de baixas concentrações de Ca2+(> 0,01 mM). Com o objetivo de realizar um estudo comparativo utilizando mitocôndrias vegetais capazes de captar e acumular Ca2+presente no meio extramitocondrial, foram utilizadas mitocôndrias isoladas de batata doce (Impomoea batatas), as quais são capazes de captar Ca2+por um mecanismo eletroforético sensível ao vermelho de rutênio, o que caracteriza a presença de um sistema ativo de captação de Ca2+.O acúmulo de altas concentrações de Ca2+ por mitocôndrias isoladas de batata doce conduziu a uma permeabilização de membrana mitocondrial interna, demonstrada por inchamento da organela e por um lento efluxo de Ca2+. Esta permeabilização induzida por Ca2+também foi estimulada por diamida e inibida parcialmente por catalase. Assim como ocorreu com Solanum tuberosum, o bongkrekato não apresentou efeito inibitório sobre a permeabilização mitocondrial induzida por Ca2+, bem como a CsA não foi capaz de inibir o inchamento mitocondrial e o e fluxo de Ca2+em mitocôndrias de batata doce. Também na batata doce a atividade da enzima peptidilprolil cis-trans isomerase de mitocôndrias foi inibida por CsA. Considerando os resultados aqui apresentados, podemos concluir que foi identificada e caracterizada uma condição de transição de permeabilidade de membrana induzida por Ca2+e espécies reativas de oxigênio, insensível à CsA, em mitocôndrias isoladas de batata e de batata doce. É possível sugerir ainda que a possível existência de um sistema ativo de transporte de Ca2+nestes vegetais não está relacionada com a insensibilidade da transição de permeabilidade destas mitocôndrias vegetais a CsA / Abstract: Oxidative damage of mammalian mitochondria induced by Ca2+ and prooxidants is mediated by the atlack of mitochondria-generated reactive oxygen species on membrane proteins thiols, promoting oxidation and cross-linkage that leads to the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPT). In mammalian mitochondria, 1 / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Angelica Zaninelli Schreiber, Anibal E. Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:29:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalheiro_RenataAlves_M.pdf: 4268889 bytes, checksum: 5376f92a4294a0902998a087e75a9a41 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Nos últimos 15 anos, as infecções sistêmicas por patógenos fiíngicos oportunistas vêm aumentando assustadoramente. Entretanto, as alternativas terapêuticas continuam restritas. Em busca de novos alvos para alternativas terapêuticas, este trabalho busca conhecer melhor o metabolismo de algumas leveduras. Assim, foram estabelecidas curvas de crescimento para Candida albicans ATCC 90028, Candida krusei ATCC 6258, Cândida parapsilosis ATCC 22019 e Cryptococcus neoformans ATCC 90112, e determinados os tempos para início da fase exponencial, metabolicamente mais ativa. Para os estudos, necessita-se de células permeáveis a íons, assim, avaliou-se a produção de esferoplastos, com a determinação dos tempos de contato com a enzima específica para cada espécie. Avaliando mitocôndrias in situ e isoladas de C. albicans ATCC 90028, testes bioquímicos apontaram a presença de uma proteína desacopladora, confirmada por munodetecção. Foi também possível sugerir a presença desta proteína em Candida krusei ATCC 6258. Pode-se relatar a presença de vacúolo ácido nas células de Candida albicans ATCC 90028 e sugerir sua presença nas células de Candida krusei ATCC 6258. A cepa de C. albicans ATCC 90028 também possui um P-type W ATPase sensível a ortovanadato e insensível a bafilomicina e não possui trocador ea2+j W, por sua vez, C. krusei possui um P-type W ATPase insensível a bafilomicina, sensível a ortovanadato e um trocador Ca2+1'Ir. Características como uma cadeia alternativa para a transferência de elétrons, de oxidase alternativa e proteínas desacopladoras, são potencias alvos para estudos de alternativas terapêuticas para tratamento de infecções por estes agentes. Maior aprofundamento dos estudos aqui iniciados, poderão trazer grandes contn"buições para um melhor conhecimento do metabolismo destes agentes infecciosos / Abstract: In the last 15 years, opportunistic systemic fungal are increasing. However, the therapeutical alternatives are still restricted. In search of new targets for therapeutical drugs, this work proposes to understand better the metabolism of some yeasts. Growth curves of Candida albicans ATCC 90028, Candida krusei ATCC 6258, Candida parapsilosis ATCC 22019 and Cryptococcus neoformans ATCC 90112 was performed and the middle of the exponential phase of growth was determinated. For metabolic studies, is necessary to obtain permeable cells, withouth cell wa11. In order to have spheroplasts, the time of contact with the specific enzyme for each specie was evaluated. Biochemical tests, evaluating in situ and isolated C. albicans ATCC 90028 mitochondria showed the existence of an uncoupling protein, confumed by imunodetection. It was also possible to suggest the presence of this protein in Candida krusei ATCC 6258. Also can be related an acid vacuole in Candida albicans ATCC 90028 and suggest its presence in C. krusei ATCC 6258 cells. C.albicans ATCC 90028 strain also possess a P-type W ATPase sensible to orthovanadate and insensible to bafilomycin and does not have an Ca2+ Ilr exchanger, in turn, C. krusei A TCC 6258 possess a P-type W ATPase insensible to bafilomicin, sensible to ortovanadate and a ea2+1lr exchanger. Characteristics as an alterna tive chain to electrons transference, alternative oxidase and uncoupling proteins are potential targets to alternative therapeutic studies for treatment of infections caused by these agents. More studies in addition to these initiated here, will be of great contnoution for a better knowledge of these infectious agents / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T15:15:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lessinger_AnaClaudia_D.pdf: 7453771 bytes, checksum: 40294f52141b92e9aa0fda0a4579fe88 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador : Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T18:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Siqueira_SuselyFerraz_D.pdf: 5841222 bytes, checksum: ce87f22a7b14048934c4bb496dc6dcc3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T01:15:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coelho_JorgeLuizCavalcante_M.pdf: 3191844 bytes, checksum: 75e8bdd0512d82d89489430cd6cd04a5 (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Medidas simultâneas da captação de 'Ca POT. 2+¿, consumo de oxigênio, efluxo de 'Mg POT. 2+¿ endógeno e aumento de volume em mitocôndrias cardíacas e hepáticas, energizadas por succinato na presença de rotenona, mostraram que mitocôndria cardíaca é mais resistente ao desacoplamento induzido por 'Ca POT. 2+¿ e fosfato, que mitocôndria hepática. A extensão do efluxo de 'Mg POT. 2+¿ e entumescimento mitocondrial, induzidos pelo acúmulo de 'Ca POT. 2+¿, são também muito menos pronunciados em mitocôndrias cardíacas. O desacoplamento e aumento de volume em mitocôndria hepática, foi demonstrado ser resultado da perda de 'Mg POT. 2+¿ ligado a membrana, em conseqüência da reciclagem de 'Ca POT. 2+¿ induzida por fosfato através da membrana. 'Mg POT. 2+¿ exógeno protege a mitocondria hepática contra o efeito deletério do 'Ca POT. 2+¿, através da inibição do efluxo de 'Ca POT. 2+¿ insensível à vermelho de rutênio induzido por fosfato. Este último não induz reciclagem de 'Ca POT. 2+¿ em mitocôndria cardíaca. Por outro lado, quando mitocôndria cardíaca é energizada com substratos-dependentes de NAD ou com succinato na ausência de rotenona, comporta-se como mitocôndria hepática quanto as alterações induzidas pelo movimento da 'Ca POT. 2+¿. Neste caso, a reciclagem de 'Ca POT. 2+¿ é conseqüência do estado mais oxidado dos nucleotídoes de piridina mitocondrial / Abstract: Parallel measurements of 'Ca POT. 2+¿ uptake, oxygen consumption, endogenous 'Mg POT. 2+¿ efflux and swelling in rotenone poisoned rat liver and rat heart mitochondria, showed that heart mitochondria is much more resistant to uncoupling by 'Ca POT. 2+¿ in the presence of phosphate than rat liver mitochondria. The extents of 'Mg POT. 2+¿ efflux and swelling induced by 'Ca POT. 2+¿ accumulation are also much less pronounced in heart mitochondria. Uncoupling and swelling in liver mitochondria seems to be a result of the loss of membrane bound 'Mg POT 2+¿ as a consequence of 'Ca POT. 2+¿ recycling across the membrane induced by phosphate. Exogenous 'Mg POT 2+¿ protects liver mitochondria against the deleterious effects of 'Ca POT. 2+¿ by inhibiting a ruthenium red-insensitive 'Ca POT. 2+¿ efflux induced by phosphate. Phosphate does not induce recycling of 'Ca POT. 2+¿ in heart mitochondria. On the other hand when respiring on NAD-linked substrates or with succinate in the absence of rotenone heart mitochondria behave like liver mitochondria with respect to the alterations caused by 'Ca POT. 2+¿ movements. In this case the recycling of 'Ca POT. 2+¿ is a consequence of the more oxidized state of mitochondrial Pyridine Nucleotides / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Lucia Pereira da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nepomuceno_MariadeFatima_D.pdf: 6284886 bytes, checksum: c85da90c368d47232e46f8882bc4484f (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: É geralmente aceito que o processo de peroxidação lipídica causa distúrbios nas funções mitocondriais (Vladimirov et alii, 1980) e que tal processo é desencadeado pelo ataque de espécies ativas de oxigênio aos lipídeos de membrana (Bindoli, 1988; Carbonera e Azzone, 1988). A geração de espécies ativas na mitocondria a nível de cadeia respiratória, leva a formação da espécie ativa de oxigênio mais agressiva, o radical hidroxila, de vida extremamente curta e que reage praticamente com todos os compostos orgânicos, oxidando grupos sulfidrílicos, degradandoDNA e causando peroxidação lipídica(Halliwell e Gutteridge, 1988). Por outro lado, o aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial, conhecido como transição de permeabilidade, pode ser induzido por vários agentes, entre eles Ca2+ e Pi ou Ca2+ e hidroperóxidos, sendo que estes últimos podem conduzir a um aumento na geração de espécies ativas causando danos à membrana mitocondrial interna devido ao ataque dessas espécies aos lipídios e proteínas componentes de membrana. Neste trabalho estudamos o possível envolvimento do processo de peroxidação lipídica com alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial interna e subseqüente liberação de íons e moléculas de baixa massa molecular. Nossos resultados mostraram claramente a independência entre esses mecanismos, pois em condições onde a transição de permeabilidade foi prevenida pela presença de inibidores específicos, mesmo assim foi possível observar ocorrência de peroxidação lipídica. Embora ambos os processos mostrassem ser dependentes de Ca2+, nossos resultados mostraram que a transição de permeabilidade pode ser revertida pela simples remoção do íon pelo quelante EGTA porém a peroxidação lipídica, uma vez iniciada, não sofreu interrupção com a remoção do Ca2+.Também a trifluoperazina e a ciclosporina A, conhecidos inibidores da transição de permeabilidade não impediram ou bloquearam ocorrência de peroxidação lipídica. Por outro lado, alterações na fluidez de membrana só foram detectada quando o processo oxidativo foi provocado por FeSO4 , um clássico indutor da peroxidação lipídica. E interessante ressaltar que este modelo oxidativo mostrou-se ineficaz na indução de transição de permeabilidade, mesmo observando-se a formação de altos níveis de TBARS. Este conjunto de resultados permitiu-nos descartar uma correlação direta entre a peroxidação lipídica e a transição de permeabilidade. o mecanimo do processo peroxidativo parece ocorrer após a transição de permeabilidade (decorrente da abertura de um poro protéico dependente de Ca2+) em situação onde a geração de espécies ativas de oxigênio supera a capacidade dos mecanismos de defesa / Abstract: It is generally accepted that lipid peroxidation leads to mitochondrial disfunction (Vladimirov et alii, 1980) and that this process is triggered by oxygen reactive species on membrane lipids (Bindoli, 1988;Carbonera e Azzone, 1988). The generation of such reactive species, at the level of respiratory chain, leads to formation of radicals among which the hydroxyl radical, a short-lived but extremely reactive one. This radical reacts with nearly all organic compounds, oxidizing sulphydryl groups, breaking DNA and casing lipid peroxidation ( Halliwell and Gutteridge, 1988). On the other hand, mitochondrial permeabilization can be induced by several agents, as Ca2+ and inorganic phosphate (Pi) Of Ca2+ and hydroperoxides. This later condition would increase the generation of oxygen reactive species, leading to damage at the mitochondrial inner membrane level, due to the attack of these species to lipids and proteins of this membrane. We studied the involvement of the lipid peroxidation process with alterations on the mitochondrial inner membrane permeability and, as consequence, the release of ions and low molecular mass compounds, Our results clearly showed that these two processes are independent. Since under conditions where the permeability transition process was. Prevented by specific inhibitors, it was observed the occurrence of lipid peroxidation. Although both processes were dependent on the presence of Ca2+, our reults showed that the permeability transition could be reverted by Ca2+ Chelation with EGTA, but the lipoperoxidation, once initiated , was not stopped by EGTA addition. Two other drugs, cyclosporin A and trifluoperazine, well known permeability transition inhibitors were inefficient in preventing or stopping the lipid peroxidation process. On the other hand, membrane fluidity alteratians evaluated by changes an the sparameter arder, were only detected when the oxidative process was greater, as that induced by a FeS04. lnterestingly this condition did not Ied to permeability transition, even when very high levels of TBARS were observed. These data allowed to discard any direct correlation between lipid peroxidation and permeability transition. The first process seems to occur after the later one, and is probably consequence of the opening of a Ca2+ dependent pore, under conditions where the generation of oxygen reactive species exceeds the capacity of the antiaxidant endogenous systems / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas