Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cosso_RicardoGuanaes_D.pdf: 2036557 bytes, checksum: 4baea263070c7b8441be632ff20678be (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Oxigênio singlete molecular (1O2) gerado por decomposição térmica do 3,3-(1,4-naphthylidene) dipropionate endoperoxide (NDPO2), inibiu a respiração de mitocôndrias isoladas de fígado de rato sustentada por substratos dependentes de NADH ou por succinato, mas não por N,N,N,N-tetramehyl-p-phenylene-diamine (TMPD)/ascorbato. Nesta última condição, as mitocôndrias tratadas com NDPO2 exibiram uma diminuição do potencial elétrico transmembrânico (DY) de maneira dependente do tempo de exposição ao NDPO2. Este processo foi sensível aos inibidores da transição de permeabilidade mitochondrial (TPM) como EGTA, ditiotreitol, ADP e ciclosporina A. A presença de óxido de deutério (D2O), que aumenta a meia vida do 1O2, aumentou significativamente a permeabilização promovida por NDPO2. Além disso, a permeabilização mitocondrial induzida por NDPO2 foi acompanhada por oxidação tiólica de proteínas de membrana sensível à DTT ou ADP. Estes resultados indicam que a TPM induzida por oxigênio singlete gerado quimicamente é mediada por oxidação de tióis de proteínas de membrana. Verificou-se ainda neste trabalho que mitocôndrias isoladas de fígado de camundongos hipercolesterolêmicos por inativação do gene do receptor de LDL, apresentaram controle respiratório e razão ADP/O similares às mitocôndrias isoladas a partir de camundongos controles, mas exibiram maior suscetibilidade a desenvolver TPM induzida por Ca2+. Esta maior susceptibilidade à TPM parece ser conseqüência do estado mais oxidado de NADP mitocondrial nos camundongos hipercolesterolêmicos / Abstract: Pure singlet molecular oxygen (1O2) generated by thermal decomposition of the 3,3-(1,4-naphthylidene) dipropionate endoperoxide (NDPO2), inhibited respiration of isolated rat liver mitochondria supported by NADH-linked substrates or succinate, but not by N,N,N,N-tetramehyl-p-phenylene-diamine (TMPD)/ascorbate. Under the latter condition, mitochondria treated with 2.7mM NDPO2 exhibited a decrease in transmembrane potential (DY) in manner dependent on NDPO2 exposure time. This process was sensitive to the mitochondrial permeability transition (MPT) inhibitors EGTA, dithiothreitol, ADP, and cyclosporin A. The presence of deuterium oxide (D2O), that increases 1O2 lifetime, significantly enhanced NDPO2-promoted mitochondrial permeabilization. In addition, NDPO2-induced mitochondrial permeabilization was accompanied by DTT or ADP-sensitive membrane protein thiol oxidation. Taken together, these results provide evidence that mitochondrial permeability transition induced by chemically generated singlet oxygen is mediated by the oxidation of membrane protein thiols. In this work it was also observed that liver mitochondria isolated from hypercholesterolemic LDL receptor knock out mice present respiratory control and ADP/O ratio comparable to control mitochondria, but exhibit higher susceptibility to develop Ca2+ induced MPT. This higher susceptibility to develop MPT seems to be the consequence of a more oxidized state of mitochondrial NADP / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Felix Guillermo Reyes Reyes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-15T09:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valim_MariaFilomenaClaretFernandesdeAguiar_M.pdf: 3211749 bytes, checksum: e5d04d853abf2ab93d1198eddc9cd677 (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: Neste estudo foi realizada a avaliação do efeito, na respiração mitocondrial, dos seguintes corantes orgânicos sintéticos artificiais, de uso permitido em alimentos no Brasil: Eritrosina, Ponceau 4R, Vermelho 40, Amarelo Crepúsculo, Amarelo de Tartrazina, Azul de Indigotina, Azul Brilhante e Amaranto, assim como dos corantes: Laranja GGN, Escarlate GN e Vermelho Sólido E. Utilizando-se mitocôndrias isoladas de fígado e de rim de ratos Wistar, verificou-se que estes corantes inibiam a respiração mitocondrial comprovada pelo decréscimo da velocidade de consumo de oxigênio no estado III, desacoplado. Após a verificação deste efeito "in vitro", foi selecionado o corante Eritrosina, para a avaliação "in vivo" de seu efeito na função respiratória mitocondrial. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar, machos e fêmeas, submeti dos durante noventa dias, a diferentes ingestões hídricas contendo Eritrosina nas concentrações de, aproximadamente, 0, 100, 500 e 1000 mg de corante par kg de peso corpóreo medi o das ratos de cada grupo. Não foram verificadas diferenças significativas, a nível de 5%, no ganho de peso dos animais, nem efeitos na sua função respiratória mitocondrial hepática. Ao termino do estudo de 90 dias, foi procedida uma avaliação anatomo-histológica dos sistemas digestivo, respiratório, urinário e linfóide, sendo os tecidos fixados e preparados histologicamente segundo técnicas de rotina. O exame anatômico dos órgãos não demonstrou alteração significativa, com exceção da dilatação do ceco dos animais que ingeriram Eritrosina, independente da dose. A observação dos órgãos ao Microscópio Óptico não revelou ocorrência de anomalias. Com exceção do baço, não foi verificada diferença estatisticamente significativa, à nivel de 5%., no peso relativo dos órgãos estudados: fígado, rins e bexiga / Abstract: Eleven organic synthetic dyes currently or formerly permitted as food colors in Brasil were tested to determine their effect on mitochondrial respiratory function using mitochondria isolated from rat liver and kidney. It was verified that these dyes inhibit the mitochondrial respiration by afecting the oxygen uptake rate on state III, in the presence of both a-ketoglutarate and succinate. Erythrosine was selected to investigate this effect, "in vivo". For this purpose, the compound was administrated, on the water, to Wistar rats, male and female, during ninety days at dose levels of , approximately, 0, 100, 500 and 1000 mg/ kg b. w. No significative difference was observed on body weight gain and no effect was found on the hepatic mitochondrial respiratory function of the animals. At the end of the sub-chronic study macroscopic examination of the following animals systems was performed; digestive, respiratory, urinary and 1infoid. The only abnormality observed was enlargement of the caecum of those animals submitted to ingestion of Erythrosine, The organs were also submitted to histological examination according to routine procedures, and their observation at the Optic Microscope revealled no tissular abnormalities. With exception of the spleen of the male rats , no significative difference, at 5% level , was found on the relative organs weight studied (liver, kidneys and bladder) / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Quivo S. Tahin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T10:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalcanti_TerezaCristinaSamico_M.pdf: 6606881 bytes, checksum: a5182587efdd3d6cb98c36cf42acc2d0 (MD5) Previous issue date: 1986 / Resumo: Ratas Sprague-Dawley virgens de 50-60 dias de idade, quando inoculadas i.p. com 20 mg/ml de DMBA e alimentadas com dietas semi-sintéticas e isocalóricas, contendo 12% de lipídios, provenientes do óleo de semente de girassol (rica em AGPI n-6) ou do óleo de sardinha (rica em AGPI n-3), não apresentaram diferenças importantes no ganho de peso corpóreo nos tempos de 30 ou 63 dias. O tecido mamário das ratas alimentadas com a dieta óleo de semente de girassol, apresentou alterações histológicas mais severas do que o das alimentadas com a dieta óleo de sardinha, após o tratamento com o DMBA nos tempos estudados. A atividade específica da ATPase mitocondrial do tecido mamário dos animais controle e tratados com o DMBA, apresentou alterações mais significativas naqueles animais alimentados com a dieta óleo de semente de girassol, quando comparada com os que se alimentaram com a dieta óleo de sardinha nos tempos estudados. No grupo óleo de semente de girassol, as atividades especificas da ATPase foram de 17,2¿+ ou ¿' 6,4 e 40,3 ' + ou ¿' 12,0 unidades de atividade ATPásica (p<0,01), respectivamente aos dias 30 ou 63 de experimento para as ratas controles e de 33,1 : 21,4 e 70,0: 19,2 unidades especifica de AT Pase (p< 0,01), respectivamente após os 30 ou 63 dias de experimento com DMBA. Neste grupo dietário, o tratamento com o DMBA causou aumento na atividade específicas da ATPase de 92% (p<0,01) e 88% (p<0,01), respectivamente após 30 ou 63 dias. No grupo de óleo de sardinha, as atividades específicas da ATPase foram de 37,6¿ + o0u ¿' 9,2 e 50,3 '+ ou ¿' 25,8 unidades de ATPase especifica (N.S.) para as ratas controles e de 40,2 '+ ou ¿' 16,0 e 59,2 '+ ou ¿' 15,3 unidades específicas de atividade ATPásica (p<0,01) para as ratas tratadas com DMBA, respectivamente após 30 ou 63 dias. Neste grupo dietário o DMBA também causou o aumento na atividade ATp.ásica, porém não foi estatistidaIrente' significante. Quanto a incorporação dos ácidos graxos pelos lipídios das mitocôndrias, ressaltamos que nos animais controles não foi detectado alterações importantes na incorporação dos AGS totais e AGMI totais frente às duas dietas e ao tempo de experimento; que os AGPI n-6 foram mais incorporados pelos animais alimentados com a dieta óleo de semente de girassol, quando comparados com os que se alimentaram com a dieta óleo de sardinha nos tempos estudados, o mesmo acontecendo com os AGPI n-3. O tratamento com o DMBA,diminui a incorporação pelos lipídios das mitocôndrias dos AGS totais, aumentou a incorporação dos AGMI totais naqueles animais alimentados com a dieta óleo de semente de girassol, aumentou a incorporação dos AGPI n-6, principalmente do ácido linoléico e eicosatrienóico, sem contudo aumentar a incorporação do ácido araquidônico nos animais alimentados com a dieta óleo de semente de girassol, ocorrendo o efeito contrário nos animais alimentados com a dieta óleo de sardinha e aumentou a incorporação dos AGPI n-3 pelos lipídios mitocondriais dos animais alimentados com a dieta óleo de sardinha, quando comparados com os que se alimentaram com a dieta óleo de semente de girassol nos tempos estudados / Abstract: Female virgin rats Sprague-Dawley (50-60 days old), were injected, i.p., with 20 mg/ml of 7,12-dimethylbenzenanthracene (DMBA) and fed semipurified and isocaloric diets, containing 12% of sunflower seed oil (rich in AGPI n-6) or 12% of sardine oil (rich in AGPI n-3), during 30 or 63 days. During the experimental time alI groups of rat, present few alterations on the gain of body weights. Rats fed sunflower seed oil showed, more severe histological alterations in the mammary tissues after DMBA treatment in comparasion to controls and to sardine oil. ATPase activity mammary mitochondria were a1ter in function of time, diet and DMBA treatment , after 30 or 63 days, respectively. ATPase of control animaIs of sunflower seed oil diet were 17,2 i 6,4 and 40,3 i 2,0 units of ATPase activity (p<0,01), and after DMBA tre atment we found 33,1 i 21,4 and 70,0 i 19,2 units of ATPase activity (p<0,01) after 30 or 63 days, respectivelYi the specificNP ase of control animaIs fed ardine oil, were 37,6 i 9,2 and 50,3 -98-f 25,8 units of specific ATPase (N.S.), and after DMBA treatment, were 40,2 f 16,0 and 59,2 f 15,3 units of ATPase (p<0,01)." In sun flower seed oil group, after 30 or 63 days of DMBA treatment we bbserved an increase of 92% (p<0,01) and 88% (p<0,01), respective ly in comparisionto controls. In sardine oil group the alterations caused by DMBA treatment after 30 or 63 days in comparasion of controls group was not significant. There was not impoEtant alterations on total saturated fatty acid (SFA), and total monounsaturated fatty acid (MUFA) contents on mammary mitochondriaI lipids of two diets group. The total n-6 polyunsaturated fatty acid (PUFA) and n-3 fatty acids of mitochondrial lipids sunflower seed oil were higher than sardine oil group in function of time. DMBA treatment cause an increase in the SFA contents, and on the n-6 PUFA contents in sunflower seed oil group, mainly increasing linoleic acid and eicosatrienoic acid but noarachildonic acid. However, in the sardine oil group it was observed the reversal event, increasing n-3 PUFA after DMBA treatment / Mestrado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T11:27:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_IoneSalgado_D.pdf: 3252459 bytes, checksum: 4d405ba9de2a48bb0a70e0f913975223 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Mitocôndrias acop1adas isoladas de folhas brancas de repolho (Brassica oleracea L. varo capitata) apresentaram-se incapazes e captar 'Ca POT. 2+¿ quando energizadas por respiração, em contraste com mitocôndrias isoladas de coleoptiles ou raízes de milho (Zea mays L.) que apresentaram a habilidade de captar 'Ca POT. 2+¿ do meio, embora com uma atividade muito menor do que mitocôndrias de fígado de rato. A curva de velocidade inicial de captação de 'Ca POT. 2+¿ ou ejeção de H+ por mitocôndria de coleoptiles de milho em função da concentração de 'Ca POT. 2+¿ mostrou ser sigmoidal e sugeriu uma estequiometria de 2H+/'Ca POT. 2+¿ como ocorrem em mitocôndrias animais. Na presença de baixas concentrações de 'Ca POT. 2+¿ livre no meio de incubação as mitocôndrias de coleoptiles ou raízes de milho foram capazes de captar o íon atingindo uma concentração de ¿steady state" na faixa de 2 'mu¿M e de manter este equilíbrio por vários minutos. Perturbação deste equilíbrio pela adição de 'Ca POT. 2+¿ ou EGTA foi seguida pela captação ou liberação de 'Ca POT. 2+¿, respectivamente, até que o equilíbrio fosse novamente atingido com a concentração livre de 'Ca POT. 2+¿ extramitocondria1 original. A concentração de 'Ca POT. 2+¿ extramitocondrial na qual o "steady state" era atingido mostrou ser dependente do conteúdo de 'Ca POT. 2+¿ intramitocondrial e da presença de 'Mg POT. 2+¿ no meio de reação. Os resultados indicam que mitocôndrias de coleoptiles ou raízes de milho, assim como mitocôndrias animais, têm a habilidade de tamponar o 'Ca POT. 2+¿ externo e talvez estejam envolvidas na manutenção a homeostase do 'Ca POT. 2+¿ na célula / Abstract: Coupled mitochondria isolated from the white leaves of cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) were inactivein respiration-coupled 'Ca POT. 2+¿ accumulation, in contrast to mitochondria isolated from etiolated corn (Zea mays L.) which showed the ability to take up 'Ca POT. 2+¿ from the medium, although with a much lower activity than liver mitochondria. Abstract: The rate of 'Ca POT. 2+¿ uptake or H+ ejection by corn mitochondria plotted versus 'Ca POT. 2+¿ concetration showed a sigmoidal curve and the H+/'Ca POT. 2+¿ ratio was very close to 2.0 as occurs in animal mitochondria. The addition of corn coleoptile or root mitochondria to a medium containing a low free 'Ca POT. 2+¿ concentration resulted in 'Ca POT. 2+¿ uptake with a decrease in free 'Ca POT. 2+¿ concentration until a steady state of about 2.0 'mu¿M was reached and maintained constant for several minutes. Perturbation of this steady state by the addition of 'Ca POT. 2+¿ or EGTA was followed by 'Ca POT. 2+¿ uptake or release, respectively, until the steady state was attained at the original extramitochondrial free 'Ca POT. 2+¿ concentratlon. The steay state free 'Ca POT. 2+¿ concentration was dependent of the intramitochondrial 'Ca POT. 2+¿ content and external 'Mg POT. 2+¿.These results indicate that corn but not cabbage mitochondria, as some animal mitochondria, have the ability to buffer external 'Ca POT. 2+¿ and may be involved in the maintenance of 'Ca POT. 2+¿ homeostasis in the cell / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Q. S. Tahin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T14:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pimentel_EdsonRosa_M.pdf: 2822903 bytes, checksum: 6a6c7fc98ef4735656cfee3755fa3d0a (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: A preparação da particula 'F IND. 1¿ dos anfíbios estudados, foi possível a partir de preparação das mitocôndrias hepáticas solubilização da partícula 'F IND. 1¿ e purificação através de uma coluna de afinidade obtivemos uma purificação de 14-15 vezes e uma recuperação de 70-80%. O rompimento das mitocôndrias e consequente solubilização das partículas 'F IND. 1¿ foram acompanhadas através de microscopia eletrônica. Estudos sobre efeito do pH sobre a atividade enzimática, mostraram que a atividade da enzima se mantém mais ou menos constante em valores de pH entre 7,6 e 9,0. A ação inibitória de baixas temperaturas foi verificada, chegando a enzima a perder 70 a 80% de sua atividade quando deixada à temperatura a '4GRAUS¿C durante 1 hora. A importância do 'Mg POT. 2+¿ ficou tembém evidenciada para a partícula 'F IND. 1¿ de mitocôndrias hepáticas dos anfíbios estudados, sendo que a concentração de 'Mg POT. 2+¿ que melhor favoreceu a atividade enzimática foi 6mM, enquanto concentração de ATP mais favorável dói 8mM. Experimentos em que se analisou a variação da atividade específica da 'F IND. 1¿ em função de variadas proporções ATP/Mg, mostraram que a proporção ATP/Mg que proporciona maior atividade específica entre 1 e 2, enquanto ATP ou 'Mg IND. 2+¿ livre no meio de incubação causava inibição das atividades enzimática ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: A preparation of the 'F IND. 1¿ particle of various amphibians, was possible beginning with hepatic mitochondria, solubilizing and purifying the 'F IND. 1¿ particle by passing it through on affinity column (AH- sepharose ¿4B). Considering the affinity column step, we obtained a purification of 14-15 times and a possible recuperation of 70-80% for a single purification process. The rupture of the mitochondria and solubilization of the 'F IND. 1¿ particles were observed with the electron microscope. Comparing the enzymatic and the pH, the enzymatic activity was found to maintain constant for the interval of pH 7,6 to 9,0. the inhibiting effect of low temperature was investigated, attaining a loss of enzymatic activity of 70 to 80% when kept at a temperature of '4 GRAUS¿C for 1 hour. The presence of 'Mg POT. 2+¿ was also shown to be important for the activity of the 'F IND. 1¿ particle of amphibian hepatic mitochondria. The most favorable concentration of 'Mg POT. 2+¿ was established to be 6mM, while the most favorable concentration of ATP was 8mM. Experiments analising the specific activity of 'F IND. 1¿ in relation to various proportions of ATP/ Mg demonstrated greater specific activity between 1 and 2, while ATP or free 'Mg POT. 2+¿ in the incubation medium inhibited enzymatic activity ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Biologia Celular e Molecular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T18:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valle_ValderezGarciaRodrigues_M.pdf: 2841589 bytes, checksum: 9ef7f58d4f8f66dce35b175b05e4397a (MD5) Previous issue date: 1986 / Resumo: Este trabalho descreve experimentos mostrando que safranina, em concentrações geralmente empregadas para monitorar o potencial elétrico da membrana mitocondrial, causa efeitos indesejáveis sobre o transporte de 'CA POT. ++' por mitocôndrias de fígado. Nossas observações indicam que: (i) Safranina potencializa a descarga espontânea de 'CA POT. ++' mitocondrial induzida por fosfato ou acetoacetato. A liberação de 'CA POT. ++' é paralelamente acompanhada pela potencialização da liberação do estado respiratório - 4 ' e pela potencialização do aumento de volume mitocondrial, indicando uma ação generalizada do corante sobre a membrana mitocondrial. (ii) O efluxo do 'CA POT. ++ ' mitocondrial induzido por hidroperóxido é estimulado na presença de safranina mesmo na presença de estabilizadores de membrana como 'MG POT. ++' e ATP. Conclui-se que o uso de safranina para indicar mudanças no potencial elétrico de membrana durante o transporte de 'CA POT. ++' por mitocôndrias deve ser evitado ou devem ser tomados cuidados especiais. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: This work describes experiments showing that safranine, at the concentrations usually employed as a probe of mitochondrial membrane potential, causes significant undesirable side effects on 'CA POT. ++' transport by liver mitochondria. The major observations are: (i) safranine potentiates the spontaneous 'CA POT. ++' release from liver mitochondria induced by phosphate or acetoacetate. This is paralelled by potentiation of the release of state -4 -respiration and of the rate of mitochondrial swelling, indicating a generalized effect of the dye on the mitochondrial membrane; (ii) The efflux of mitochondrial 'CA POT. ++induced by hidroperoxide is stimulated in the presence of safranina even if membrane stabilizers such as 'MG POT. ++' and ATP are present. It is concluded that the use of safranine to monitor the changes in membrane potential during 'CA POT. 2+' transport by mitochondria should be avoided or special care be taken. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Fisiologia e Biofisica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Lucia Pereira da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T12:24:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_DeniseVazde_D.pdf: 4866200 bytes, checksum: 168aa5c20312bef638bfa207ebc599b4 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Neste trabalho, apresentamos evidências experimentais suficientes para propor o envolvimento direto do carreador ADP/ATP no processo de abertura do poro dependente de Ca2+, responsável pelo fenômeno de transição de permeabilidade da membrana mitocondrial interna. Comparando a proteção conferida pelo ADP ¿ substrato do carreador ADP/ATP, ditiotreitol ¿ redutor de grupamentos sulfidrila e butil hidroxitolueno - sequestrador de radicais livres, mostramos que o ADP sempre foi o mais efetivo contra o dano mitocondrial, quando presente no meio de reação desde o inicio. Esta proteção conferida pelo ADP parece ser contra os efeitos específicos do Ca2+ sobre a membrana, independente do agente liberador utilizado ser um oxidante ou fosfato inorgânico. Esses resultados descartaram a possibilidade de um ataque de radicais de oxigênio aos lipídeos ou proteínas da membrana como o evento primário que dispara a permeabilização mitocondrial. Quando pré-incubamos mitocôndrias desenergizadas com Ca2+, mostramos uma diminuição no conteúdo de translocases ativas na membrana, sensível à presença de ciclosporina A. Estes dados indicaram um envolvimento direto do carreador ADP/ATP na abertura do poro dependente de Ca2+. Nossos resultados descartaram também a oxidação de grupos tiólicos desta proteína como a responsável por sua inativação. Nos experimentos com partículas sub-mitocondriais, demonstramos pela primeira vez a abertura do poro dependente de Ca2+, sensível à ciclosporina A também na membrana invertida das partículas, o que descarta definitivamente a interação da ciclofilina com o carreador ADP/ATP como o mecanismo responsável pela abertura do poro dependente de Ca2+. Esses experimentos também forneceram evidências da existência de dois sítios de ligação para Ca2+ na membrana, com efeitos opostos sobre sua abertura. Os resultados apresentados neste trabalho, no seu conjunto, nos permitiram apresentar a nossa hipótese para o mecanismo molecular de abertura do poro dependente de Ca2+, modulado pelo carreador ADP/ATP. Sugerimos que a ligação do Ca2+ ao carreador, quando este está no estado conformacional "c" induz a dissociação da estrutura dimérica funcional desta proteína, transformando gradativamente o próprio carreador ADP/ATP no poro dependente de Ca2+. Palavras Chave: transição de permeabilidade, poro dependente de Ca2+, carreador ADP/ATP, ciclosporina A, permeabilização da membrana mitocondrial interna / Abstract: In this work we presented sufficient experimental evidences to propose the direct involvement of the ADP/ATP carrier in the permeabilization processes of the inner mitochondrial membrane. Comparing the protection conferred by ADP - a subtrate of the ADP/ATP carrier, dithiothreitol - a disulfide reductant and butylhydroperoxide - a radical scavenger, it was found that ADP was always the most effective against the mitochondrial damage, when present in the incubation medium from the beginning. Our results also indicate that the protection of ADP is against the specific Ca2+ effect in the membrane, independently an pyridine nucleotide oxidant t-butylhydroperoxide or inorganic phosphate were used and discard the possibility of an attack of oxygen radicals on lipids or proteins of the mitochondrial membrane as the primary event that triggers the permeability transition of the inner mitochondrial membrane. Experiments where deenergized mitochondria were preincubated with Ca2+ showed a decrease on the content of active ADP/ATP carrier, indicating a direct involvement of this protein in the formation of an unspecific Ca2+ dependent pore. They also discard the -SH oxidation as a cause of the carrier inactivation. Our experiments with submitochondrial particles provide good evidence for then existence of two binding sites for Ca2+ in the mitochondrial membrane. These resulte also discard cyclophilin as mediator of the pore opening. Key Words: permeability transition, pore Ca2+-dependent, ADP/ATP carrier, cyclosporin A, mitochondrial inner membrane / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências

Tese (livre docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T06:50:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vercesi_AnibalEugenio_LD.pdf: 5473068 bytes, checksum: 2c97f9e65b464b7c1c4350b615bdeed9 (MD5) Previous issue date: 1982 / Resumo: O efluxo de 'CA POT. 2+' mitocondrial é estimulado pelo estado oxidado de NADP mitocondrial. Em mitocondria não energizada uma completa oxidação de NAD e NADP pode ser induzida por oxaloacetato ou acetoacetato enquanto que em mitocondria energizada estes substratos oxidam exclusivamente NAD. Esta diferença deve-se ao efeito do potencial protônico de membrana gerado pela respiração ou hidrólise de ATP sobre a constante de equilíbrio da reação catalizada pela enzima NAD(P)-transidrogenase. No último caso o efluxo de 'CA POT. 2+' não é estimulado pelos referidos oxidantes. O efluxo de 'CA POT. 2+' mitocondrial induzido por 'NADP POT. +' é necessariamente associado ao efluxo de 'MG POT. 2+' e nucleotídeos de adenina endógenos mediado pelo transportador especifico uma vez que "bongkrekato", inibidor especifico deste transportador, inibe tanto o efluxo de nucleotídeos de adenina como de 'CA POT. 2+'. A diminuição no título de grupamentos -SH de membrana mitocondrial que acompanha a oxidação de NADP, bem como a similaridade entre as características do efluxo de 'CA POT. 2+' induzida por 'NADP POT. +' e diamida (oxidante de grupos -SH) indicam o envolvimento destes no mecanismo. Ambos, oxidação de NADP e diamida induzem aumento de pequena amplitude no volume mitocondrial que também é sensível a "bongkrekato". Estes resultados indicam que o efluxo de 'CA POT. 2+' mitocondrial induzido por 'NADP POT. +' está associado a alterações conformacionais da mitocondria resultantes da oxidação de grupamentos -SH da membrana em equilíbrio de óxido-redução com NADP através do sistema enzimático glutationa redutase/glutationa peroxidase / Abstract: Mitochondrial 'CA POT. 2+' -efflux is stimulated by the oxidized state of mitochondrial NADP. In deenergized mitochondria either oxaloacetate or acetoacetate can induce a full oxidation of both NAD and NADP whereas in energized mitochondria these substrates oxidize NAD only. This difference is due to the effect of the membrane pH gradiente generated by respiration or ATP hydrolysis on the energy-linked NAD(P)-transhydrogenase reaction. When mitochondria are energized 'CA POT. 2+' efflux is not stimulated by oxaloacetate or acetoacetate. The mitochondrial 'CA POT. 2+' efflux induced by 'NADP POT. +' is associated to the efflux of 'MG POT. 2+' and adenine nucleotides through the adenine nucleotides translocase since the specific inhibition of this enzyme by bongkrekate blocks both adenine nucleotides and 'CA POT. 2+' efflux. The decrease in the titer of membrane bound -SH groups following NADP oxidation as well as the similarity between the characteristics of 'CA POT. 2+' efflux induced by 'NADP POT. +' and diamide (-SH oxidant) indicates the participation of thiol groups in this rnechanism. Both, NADP oxidation and diamide induce bongkrekate-sensitive low amplitude mitochondrial swelling. These results indicate that the 'NADP POT. +' -induced 'CA POT. 2+' efflux from mitochondria is correlated to mitochondrial configuration transition induced by the oxidation of membrane bound -SH groups in redox equilibrium with mitochondrial NADP through the reactions catalyzed by the enzymes glutathione reductase and glutathione peroxidase / Tese (livre docencia) - Univer / Livre Docente em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T20:50:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RicardodeSouza_M.pdf: 4223365 bytes, checksum: 82e5b44995fcdb536317d9e0845feb37 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Mitocôndrias do fígado de rato quando acumulam 'CA POT. 2+¿ na presença de um prooxidante como diamida ou t-butilhidroperóxido apresentam um inchamento de grande amplitude e colapso do potencial de menbrana ('delta¿'psi¿). trifluoperazina, um neuroléptico da classe dos fenotiazínicos, em concentrações (15 ¿ 45 'um¿M) as quais não inibem a respiração ou o influxo de 'CA POT. 2+¿ para a mitocôndria, protege significativamente esta organela contra os efeitos deletérios do cátion mais um prooxidante. Em contraste a isto, em concentrações mais altas do que que 100 'um¿M a droga potencializa estes efeitos deletérios do cálcio e prooxidantes e tem efeito de danificar per se a membrana mitocondrial interna. É proposto que a proteção conferida pela droga é mediada por mudanças na estrutura tridimensional de proteínas de menbrana e que isto acarrete diminuição da produção de agregados protéicos, interligados por pontes dissulfeto, que ocorrem quando suspensões mitocondriais acumulam cálcio sob condições de estresse oxidativo. É proposto também que estes agregados estejam relacionados com o fenômeno de lipoperoxidação, pois é observado que a droga protege contra os efeitos deletérios induzidos pelo complexo citrato-'FE POT. 2+¿. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Isolated rat liver mitochondria undrego extensive swelling and disruption of membrane potencial when they accumulate 'CA POT. 2+¿ in the presence of a prooxidant such as diamide or t-butylhydroperoxide. The phenothiazinic drug trifluoperazine, at concentrations (15-45 'mu¿M) which do not inhibit either respiration or the influx of 'CA POT. 2+¿ into mitochondria, significantly protects mitochondria against the deleterious effects of 'CA POT. 2+¿ and prooxidants and presents a damaging effect per se on the inner mitochondrial membrane. It is prosed that the protection conferred by the drug is mediated by changes in membrane proteins structure that decrease the production of protein thiol cross-linking that occurs when mitochondria accumulate calcium under oxidant stress conditions. It is also proposed that the protein aggregates are correlated with the lipid peroxidation, because it is observed that the drug protects against the deleterious effects induced by citrate-'FE POT. 2+¿ complex. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-29T18:03:39Z No. of bitstreams: 1 publico-39-.pdf: 435579 bytes, checksum: 128efa8faf3057e58d047183c5a9e336 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-29T18:11:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 publico-39-.pdf: 435579 bytes, checksum: 128efa8faf3057e58d047183c5a9e336 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T18:11:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 publico-39-.pdf: 435579 bytes, checksum: 128efa8faf3057e58d047183c5a9e336 (MD5) Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As doenças mitocondriais são o resultado de mutações herdadas ou espontâneas do DNA mitocondrial (DNAmt) ou DNA nuclear (DNAn) levando à função anormal do sistema de fosforilação oxidativa. Um dos defeitos no DNAn mais freqüentemente descritos neste grupo de doenças são as deficiências isoladas do Complexo I, que é o maior complexo enzimático da cadeia respiratória com 42 subunidades (7 codificadas pelo DNAmt). Propõe-se que a subunidade de 39kDa (CI-39kDa) apresente estreita correlação com a atividade enzimática do complexo I. Sendo assim, poderíamos interrogar se a diminuição da expressão de CI-39kDa, detectada por Western blotting, poderia ser utilizada como um método diagnóstico para as deficiências do Complexo I, além deste método ter como vantagem a utilização de pequena porção de tecido congelado obtido por biópsia. Este trabalho teve como objetivo avaliar a freqüência da diminuição da proteína mitocondrial CI-39kDa no músculo esquelético de pacientes com suspeita de doença mitocondrial, e verificar se mutações conhecidas em genes codificadores de subunidades do Complexo I estariam associadas à diminuição da expressão desta proteína. As proteínas foram obtidas através do lisado de músculo esquelético de 56 pacientes e 21 controles. As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida denaturante, transferidas para membrana PVDF, que foi incubada com um anticorpo anti-CI-39kDa e SDH-Fp (succinato desidrogenase-fração flavoproteína). As bandas foram obtidas por autoradiografia e quantificadas por densitometria. A diminuição da expressão da proteína CI-39kDa, encontrada nos casos com diagnóstico possível e provável para doença mitocondrial, foi de 6%. O estudo por seqüenciamento mostrou somente uma alteração suspeita: mutação de sentido ainda não descrita em NDUFV2. Nossos resultados mostraram que: (1) a freqüência da diminuição da expressão de CI-39kDa foi baixa nos casos estudados com suspeita de doença mitocondrial; (2) a avaliação molecular desses casos mostrou que mutações em genes codificados pelo DNAmt, e mutações conhecidas em genes nucleares para subunidades do complexo I, não foram a causa do defeito destes pacientes; (3) a alteração de NDUFV2 pode ser a causa de uma disfunção do complexo I, a qual deverá ser melhor investigada para confirmar a sua patogenicidade. A ampliação deste estudo poderá confirmar a utilidade deste método para o diagnóstico das deficiências do Complexo I. / Mitochondrial diseases are caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) or nuclear DNA (nDNA), leading to abnormal function of the oxidative phosphorylation. One of the most frequent nDNA defects described in this group of diseases are Complex I deficiency. Complex I is the largest enzymatic complex of the respiratory chain, contains 42 subunits (7 are mtDNA encoded). It is proposed that a 39kDa subunit (CI-39kDa) expression closely correlates with the enzymatic activity of complex I. Thus we could hypothesize that a decrease in the expression of CI-39kDa, detected by Western blotting, would be a good diagnostic method for complex I deficiencies, considering the requirement of low amounts of frozen biopsied tissue as a good advantage of this method. The aim of this study was to evaluate the frequency of decreased expression of the CI- 39kDa in skeletal muscle of patients with a suspicion for mitochondrial disease and to verify whether known mutations in Complex I subunit genes are associated with a decrease in the expression of this protein. Total proteins were obtained by skeletal muscle lysates of 56 patients and 21 controls. Proteins were electrophoresed through a denaturing polyacrylamide gel, transferred to a PVDF membrane and incubated with antibodies against CI-39kDa and SDH-Fp (succinate dehydrogenase-flavoprotein subunit). After autoradiography the bands were quantified by densitometry. A decreased expression of CI-39kDa was found in 6 % of the cases with a possible or probable diagnosis of mitochondrial disease. Sequencing studies demonstrated only one abnormality: a not yet described missense mutation in NDUFV2. Our results show that: (1) the frequency of a decreased expression in CI-39kDa was low in the studied cases with a suspicion of mitochondrial disease; (2) molecular studies of these cases showed that mutations in mtDNA encoded genes and known mutations in nuclear encoded genes for complex I subunits were not the cause of the defects observed in these patients; (3) the mutation in NDUFV2 can be the cause of a complex I defect, but further investigations are still needed to confirm its pathogenicity. Confirmation of the utility of this method for the diagnosis of complex I deficiency will probably be achieved by a continuation of this study.