Les facteurs de transcription pionniers possèdent l’unique faculté de reconnaître leurs sites de liaison dans la chromatine compactée, classiquement inaccessibles aux facteurs de transcription et d’en stimuler le remodelage. Parmi ceux-ci, le pionnier Pax7 permet le déploiement d’un répertoire d’enhancers nécessaires à l’implantation du destin des cellules mélanotropes. Pax7 lie rapidement ses enhancers, mais leur ouverture et leur activation sont plus lentes, suggérant une action pionnière en plusieurs étapes. La cascade d'événements permettant le remodelage de la chromatine suite à la liaison de Pax7 est jusqu’à maintenant inconnue. Pour caractériser et différencier les étapes, nous avons étudié le recrutement de coactivateurs aux enhancers et l’évolution de l’environnement chromatinien. Une première phase de l’action pionnière de Pax7 coïncide avec son recrutement et celui du facteur coopérant Tpit. L'activation des enhancers, mise en évidence par le dépôt de la marque H3K27Ac et le recrutement de p300, ainsi que le remodelage de la chromatine par le complexe SWI/SNF a lieu dans la seconde étape du processus. Néanmoins, Pax7 entraîne dès son recrutement une déstabilisation de la structure de la chromatine, mise en évidence par la perte de la marque répressive H3K9me2 et le recrutement de LSD1, une déméthylase de H3K9me2. En bloquant le cycle cellulaire en G1, nous montrons que la seconde étape est dépendante du cycle cellulaire, suggérant une implication de la machinerie de réplication ou de la réorganisation générale de la chromatine au cours de la mitose. / Pioneer transcription factors possess the unique faculty to recognize their binding sites in compacted chromatin, classically inaccessible to transcription factors and to initiate chromatin remodeling. Among these, pioneer factor Pax7 opens a new enhancer repertoire required for melanotrope fate specification. Pax7 binds rapidly to its enhancers, but their opening is a longer process involving multiple steps. The cascade of events leading to chromatin remodeling following Pax7 binding is until now unknown. To characterize and differentiate these steps, we studied coactivator recruitment and the changes of chromatin environment at these sites. A first step of Pax7 action coincides with its recruitment together with Tpit, a nonpioneer factor. Enhancer activation, highlighted by the deposition of the H3K27Ac mark and by recruitment of the coactivator p300, as well as chromatin remodeling by the SWI/SNF complex happen in the second step of this process. Nevertheless, upon recruitment, Pax7 immediately leads to a chromatin destabilization, highlighted by the loss of the repressive mark H3K9me2 ascribed to the demethylase LSD1. By blocking the cell cycle in G1, we show that the second step is dependent on cell cycle progression, suggesting an implication of the replication machinery and/or of chromatin assembly/disassembly at mitosis.

Die mitotische Spindel ist ideal für die Erforschung der Selbstorganisation und Plastizität molekularer Kollektive im Zytoplasma. Die Geometrie der Spindel ist entscheidend für die korrekte Chromosomentrennung, muss sich aber an die Zellgröße anpassen. Es ist unbekannt, ob und wie Zellen während ihrer Differenzierung die Spindelarchitektur anpassen, was insbesondere während der Gehirnentwicklung relevant ist. Wir untersuchten dies mit Maus-Embryonalstammzellen, die in frühe neuronale Vorläuferzellen differenziert wurden. Wir entwickelten ein automatisiertes Mikroskopieprotokoll um einen umfassenden Datensatz von mitotischen Zellen zu generieren. Außerdem entwickelten wir Spindle3D, ein Werkzeug zur dreidimensionalen Analyse von Spindeln. Überraschenderweise waren die Spindelvolumina in differenzierenden Zellen bis zu 24% kleiner als in pluripotenten Zellen. Während die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikrotubuli unverändert blieb, verschob sich in sich differenzierenden Zellen die Nukleation von Mikrotubuli zugunsten der astralen Population. Diese Veränderung der Spindelarchitektur basierte auf der differenzierungsbedingten Verdünnung des Zytoplasmas. Dies aktivierte CPAP, ein Protein, das die Zentrosomenreifung reguliert, was zur Superskalierung des perizentriolären Materials und verstärkte Rekrutierung von gamma-Tubulin an den Zentrosomen und somit zur Umlagerung von Mikrotubuli innerhalb der Spindel führte. Diese Veränderungen der mitotischen Architektur konnten durch externe osmotische Einwirkung in undifferenzierten Zellen nachgestellt werden. Insgesamt verbinden unsere Ergebnisse zelltypspezifische zytoplasmatische Materialeigenschaften mit der Spindelarchitektur. / The mitotic spindle provides an excellent system in which to study the plasticity of molecular collectives. To segregate chromosomes accurately, the spindle’s geometry must be adaptive to changes in cell size. It is unknown whether and how differentiating cells adjust spindle architecture, specifically during brain development when spindle defects have severe pathological consequences. Using murine embryonic stem cells, we recapitulated the transition from pluripotency to early neural cell identities in vitro. Aiming at a systematic exploration of spindle and cell morphology throughout this process, we developed an automated microscopy protocol and Spindle3D, a morphometric tool for the analysis of spindles in confocal images. Intriguingly, in cells with comparable cell volume, spindle volumes were up to 24% smaller in cells undergoing differentiation. While microtubule growth speed remained equal, we measured increased nucleation of astral microtubules at the expense of the spindle bulk in differentiating cells. The shift in spindle architecture was explained by the differentiation-driven cytoplasmic dilution. This activated the centrosomal regulator CPAP, causing the superscaling of the pericentriolar material and the concomitant increased recruitment of gamma-tubulin to the centrosomes, redistributing microtubule numbers within the spindle. Mimicking the dilution effect by osmotic challenge reproduced the same mitotic architecture in undifferentiated cells. Collectively, our results link cell state-specific cytoplasmic material properties to spindle architecture.

The kinesin-14 Kar3 from Saccharomyces cerevisiae (Sc) is a C-terminal motor that forms a heterodimer with the kinesin-accessory protein Vik1. Although Vik1 possesses a typical kinesin motor domain (MD) fold, it lacks a nucleotide-binding site. However, it binds microtubules with affinities that can be regulated Kar3’s nucleotide state. This implies intermolecular communication between its subunits. This thesis aimed to understand this communication by studying the structures and functions of Kar3Vik1 orthologs. First, we biochemically characterized Kar3 from Ashbya gossypii (Ag) and determined the crystal structure of its MD. It was shown that the active site features of the AgKar3MD are similar to that of the ScKar3 R598A mutant, and that the β1 lobe at the edge of the MD was unique in structure and amino acid content. These results may provide a rationale for the unique enzymatic properties of this motor that could be relevant to its interaction with AgVik1 and function in Ashbya gossypii. We also determined the crystal structures of Kar3 and Vik1 orthologs from Candida glabrata (Cg). While the CgKar3MD structure was very similar to that of ScKar3MD, crystals of CgVik1 captured three novel conformations of the Vik1 motor homology domain (MHD). We observed that when the N-terminal neck helix docks against the MHD core in two unique positions, the C-terminus resembling neck mimics of kinesin-14 motors also docks against the neck-core junction. However, when the neck is non-helical and disengaged from the MHD, the C-terminus is undocked and disordered. To assess the functional importance of these N- and C-terminal segments of Vik1 MHD, we created CgKar3Vik1 constructs whose Vik1 subunit contained either a point mutation or complete truncation of the C-terminus (neck mimic), and analyzed their biophysical properties. All mutants showed defective ATPase activity and microtubule-gliding ability. Characterization of the mutations in CgVik1MHD by molecular dynamics simulations showed that residues Ile578 and Asn580 are not only involved in stabilizing interactions between the neck and neck mimic but they also influence and respond to conformational changes of the neck. These observations implicate the N- and C-termini of Vik1 as a key element of Kar3Vik1 function and communication. / Thesis (Ph.D, Biochemistry) -- Queen's University, 2013-07-23 10:31:52.885

Symmetric cell division in gram-negative bacteria is essential for generating two equal-sized daughter cells, each containing cellular material crucial for growth and future replication. The Min system, comprised of proteins MinC, MinD and MinE, is particularly important for this process since its deletion leads to minicells incapable of further replication. This thesis focuses on the interactions involving MinE that are important for allowing cell division at the mid-cell and for directing the dynamic localization of MinD that is observed in vivo. Previous experiments have shown that the MinE protein contains an N-terminal region that is required to stimulate MinD-catalyzed ATP hydrolysis in the Min protein interaction cycle. However, MinD-binding residues in MinE identified by in vitro MinD ATPase assays were subsequently found to be buried in the hydrophobic dimeric interface in the MinE structure, raising the possibility that these residues are not directly involved in the interaction. To address this issue, the ability of N-terminal MinE peptides to stimulate MinD activity was studied to determine the role of these residues in MinD activation. Our results implied that MinE likely undergoes a change in conformation or oligomerization state before binding MinD. In addition we performed circular dichroism spectroscopy of MinE. The data suggest that direct interactions between MinE and the lipid membrane can lead to conformational changes in MinE. Using NMR spectroscopy in an attempt to observe this structure change, different membrane-mimetic environments were tested. However the results strongly suggest that structural studies on the membrane-bound state of MinE will pose significant challenges. Taken together, the results in this thesis open the door for further exploration of the interactions involving MinE in order to gain a better understanding of the dynamic localization patterns formed by these proteins in vivo.

Le cycle cellulaire est hautement régulé par la phosphorylation réversible de plusieurs effecteurs. La kinase dépendante des cyclines Cdk1 déclenche la mitose en induisant le bris de l’enveloppe nucléaire, la condensation des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. Chez les animaux métazoaires, ces évènements sont contrés par la protéine phosphatase PP2A-B55, qui déphosphoryle plusieurs substrats de Cdk1. La kinase Greatwall (Gwl) est activée par le complexe cycline B-Cdk1 en début de mitose et induit ensuite l’inhibition de PP2A-B55 via Endos/Arpp19. Toutefois, les mécanismes moléculaires qui régulent Gwl sont encore peu connus. Nous avons montré que Gwl a une activité s’opposant à PP2A-B55, qui collabore avec la kinase Polo pour assurer l’attachement du centrosome au noyau et la progression du cycle cellulaire dans le syncytium de l’embryon de la drosophile. Ensuite, nous avons trouvé dans des cellules de drosophile que Gwl est localisée au noyau pendant l’interphase, mais qu’elle se relocalise au cytoplasme dès la prophase, avant le bris de l’enveloppe nucléaire. Nous avons montré que cette translocation de Gwl est cruciale pour sa fonction et qu’elle dépend de la phosphorylation de plusieurs résidus de la région centrale de Gwl par les kinases Polo et Cdk1. Cette région centrale contient également deux séquences de localisation nucléaire (respectivement NLS1 et NLS2). De plus, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de Gwl par la kinase Polo promeut sa liaison avec la protéine 14-3-3ε, ce qui favorise la rétention cytoplasmique de Gwl. Le rôle de Cdk1 dans cette translocation reste quant à lui inconnu. De plus, nous avons montré que le complexe cycline B-Cdk1 entre dans le noyau avant que Gwl ne soit transportée dans le cytoplasme. Cdk1 pourrait donc activer Gwl et phosphoryler ses substrats nucléaires, à l’abri de PP2A-B55 qui est largement cytoplasmique. Gwl est ensuite exclue du noyau et relocalisée dans le cytoplasme afin d’induire l’inhibition de PP2A-B55. Cela permet de synchroniser les événements de phosphorylation se produisant dans le noyau et dans le cytoplasme. Fait intéressant, un mécanisme de régulation de la localisation de Gwl similaire à cela a été découvert chez l’humain et chez la levure, suggérant que ce mécanisme est conservé entre différentes espèces. / Reversible phosphorylation of proteins, triggered by cyclically activated kinases and phosphatases, is a key mechanism to control cell cycle progression. CyclinB-Cdk1 is a crucial kinase phosphorylating a large number of substrates to trigger mitotic entry. However, in metazoans, it is counteracted mainly by a Protein Phosphatase 2A carrying the B55 regulatory subunit (PP2A-B55). On the other hand, the Greatwall (Gwl) kinase is activated by CyclinB-Cdk1 upon mitotic entry and subsequently induces the inhibition of PP2A-B55 by Endos/Arpp19, thus promoting mitotic entry and maintenance. Nonetheless, the regulatory mechanisms of Gwl are less clear. We demonstrated that in Drosophila syncytial embryos, PP2A-B55 is negatively regulated by Gwl, but collaborates with Polo kinase to ensure both nucleus attachment of centrosome and faithful cell cycle progression. Later, we discovered that in Drosophila, the subcellular localization of Gwl changes dramatically throughout the cell cycle. Gwl is nuclear in interphase but suddenly becomes mostly cytoplasmic in prophase before nuclear envelope breakdown. Such translocation is important for Gwl’s function and requires the phosphorylation of Gwl by both Polo kinase and Cdk1 in the region containing two Nuclear Localization Signals (NLSs). Phosphorylation of Gwl by Polo likely promotes its association with14-3-3ε thereby promoting Gwl cytoplasmic retention, whereas Cdk1’s role in this translocation remains elusive. Moreover, I found that most cyclin B is imported into the nucleus before Gwl translocates to the cytoplasm. Therefore, Cdk1 can activate Gwl and phosphorylate its nuclear substrates without the perturbation of PP2A-B55 which is largely cytoplasmic. Subsequently, Gwl translocates into cytoplasm to mediate the inhibition of PP2A-B55 so that the phosphorylation events can be synchronized between the nucleus and the cytoplasm. Interestingly, similar spatial regulation of Gwl was also uncovered in mammal cells and in yeast, implying a conserved regulatory mechanism across species.

La mitose est une phase importante du cycle cellulaire. Les mécanismes de surveillance s'assurent de l'ordre et de l'exécution correcte des événements du cycle cellulaire dont les erreurs peuvent conduire à l'aneuploïdie. Pendant la mitose, la séparation des chromatides sœurs est régulée par le point de contrôle du fuseau mitotique qui s'assure que tous les chromosomes sont correctement alignés sur la plaque métaphasique. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par l'activation et l'inactivation du complexe cycline B/Cdk1. Cette fine régulation fait intervenir de nombreuses kinases et phosphatases. Dans ce projet nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux AGC kinases : RSK2 et Greatwall (Gwl).Au cours de cette étude nous nous sommes proposés d'analyser l'implication de RSK2, substrat majeur de la MAPK, dans le point de contrôle du fuseau mitotique. Nos résultats montrent que RSK2 est essentielle pour l'activité du point de contrôle du fuseau mitotique dans les extraits d'œufs de xénope ainsi que pour la localisation des autres protéines de ce mécanisme de surveillance localisées aux kinétochores. Nous montrons également que RSK2 participe au point de contrôle dans les cellules humaines. En effet, RSK2 est nécessaire à la localisation aux kinétochores de Mad1, Mad2 et Cenp-E, protéines essentielles à l'activité de ce checkpoint. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par le complexe cycline B/Cdk1 et des phosphatases. Gwl est une nouvelle kinase essentielle à l'entrée en mitose et au maintien de l'état mitotique dans les extraits d'œufs de xénope. En effet, nos résultats montrent que Gwl maintient l'état mitotique indépendamment du complexe cycline B/Cdk1, en régulant négativement PP2A, une phosphatase responsable de la déphoshorylation des substrats mitotiques. / Mitosis is an important phase of cell cycle. The Spindle Assembly Checkpoint (SAC) verifies the orders and the events correct execution of the cell cycle, as errors may lead to aneuploidy. During the mitosis, the checkpoint delays the anaphase onset until all chromosomes are correctly attached to the spindle‘s microtubules. Entry and Exit of mitosis are regulated by the activation and inactivation of cyclin B/Cdk1. A lot of kinases and phosphatases are involved in this fine regulation. In this project, we are particularly focusing on two AGC kinases: RSK2 and Greatwall (Gwl).In this study, we analyzed RSK2, a major substrates of MAPK, involvement in SAC. Our results show that RSK2 is essential to the activation of SAC in xenopus egg extracts and for the localization at the kinétochores of the others SAC components. We also show that RSK2 participate in the maintenance of the SAC in human cells. Indeed, RSK2 is necessary for Mad1, Mad2 and Cenp-E localization, essential proteins for SAC activation.Entry and exit of mitosis are regulated by cyclin B/Cdk1 complex and phosphatases. Gwl is a new kinase essential to the entry into mitosis and maintenance of the mitotic state in xenopus egg extracts. Indeed, our results showed that Gwl maintains the mitotic state independently of cyclin B/Cdk1 but with the negative regulation of PP2A, which dephosphorylate the mitotic substrates

Little is known about the generation of Leishmania morphology and the function of morphology in trypanosomatids, despite every species having characteristic cell shapes and undergoing changes in morphology between life cycle stages. To address this I analysed morphogenesis of the cell body and flagellum through the cell cycle of the Leishmania insect (promastigote) life cycle stage using a novel method for determining cell cycle stage from cell size and DNA content. This showed cell body morphology is generated by growth and then remodelling of cell shape around mitosis and cytokinesis. Mathematical modelling of flagellum growth indicated flagellum length continues to increase over multiple cell cycles and does not reach a defined length. I also observed little link between the cell cycle and flagellum length regulation during differentiation to the mammalian macrophage-inhabiting (amastigote) life cycle stage. Analysis of motility showed the diverse flagellar lengths of promastigote Leishmania cells bestow different swimming abilities, and the capacity of Leishmania promastigotes for highly directional swimming differs sharply from trypomastigote Trypanosoma brucei. This difference did not arise from altered flagellar beating therefore appeared to be linked to morphology. Together these indicate the mechanisms of cell body morphogenesis, flagellum length regulation, life cycle stage differentiation and the swimming abilities of the cells the morphogenetic processes generate differ significantly between Leishmania and T. brucei. These insights motivated the programming of automated micrograph analysis tools based on a new DNA staining method to support similar future morphometric analyses. This is the first comprehensive comparison of morphogenesis and function of morphology in a promastigote and a trypomastigote and, by considering these new insights in the context of existing molecular biology and the morphological diversity across many trypanosomatid species, give insight into basic Leishmania biology, the shared molecular mechanisms underlying morphogenesis and the potential functions of the diverse morphologies which are seen in different trypanosomatid species and life cycle stages.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes that constitute a large part of the phytoplankton. They are major contributors to the global photosynthesis and primary production and they possess an important role in conservation of marine ecosystems. Dinoflagellates are distincted from other eukaryotes by their unique biology and nuclear organization. During mitosis, their nuclear envelope stays intact and chromosome segregation is done by a mitotic spindle that passed through the nucleus inside several specialized cytoplasmic channels. In addition, the chromosomes are permanently condensed and are not thought to have histones. Lingulodinium polyedrum is a marine photosynthetic dinoflagellate widely used to study the control mechanisms of circadian rhythms, because many aspects of its physiology (bioluminescence, mitosis, photosynthesis and vertical migration) are circadian. The discovery of cell cycle regulators is essential for understanding the mechanism and the circadian control over the cell cycle. A previously study identified the M-phase cyclin, LpCyc1, the first dinoflagellate cell cycle regulator to be discovered. The present study presents the characterization of the LpCyc1, with respect to expression levels and phosphorylation patterns. These elements act together to ensure the synchronization of the LpCyc1 activity (and the mitosis) within the day. This study also presents the creation and the development of the transcriptome, a major tool for the upcoming studies of Lingulodinium polyedrum. With this tool, we identified the Lingulodinium polyedrum M-CDK, LpCdk1. The LpCdk1 has all the domains of a classic M-CDK, a substrate binding site, an ATP binding site, an activation loop and a cyclin binding interface. vi With the Lingulodinium polyedrum transcriptome, we also made a census of all the conserved proteins normally found in the cell cycle control of yeast. The identification of these proteins had provided a rough shape of L. polyedrum cell cycle. This kind of analysis is the first to be made with Lingulodinium polyedrum and could be expanded to other metabolic processes.

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common primary brain tumor. Studies have shown that targeting the DNA damage response can sensitize cancer cells to DNA damaging agents. Ataxia telangiectasia mutated (ATM) is involved in signaling DNA double strand breaks. Our group has previously shown that ATM inhibitors (ATMi) sensitize GBM cells and tumors to ionizing radiation. This effect is greater when the tumor suppressor p53 is mutated. The goals of this work include validation of a new ATM inhibitor, AZ32, and elucidation of how ATMi and p53 status interact to promote cell death after radiation. We propose that ATMi and radiation induce mitotic catastrophe in p53 mutants by overriding cell cycle arrest. We tested this hypothesis in human colon carcinoma and glioma cells that differ only in p53 status. We found that AZ32 effectively inhibits phosphorylation of ATM targets. In addition, AZ32 significantly sensitizes glioma cells to ionizing radiation. While HCT116 colon carcinoma cells fail to arrest the cell cycle after radiation, their response to ATMi differs from that in gliomas. Indeed, wild type HCT116 cells were more sensitive than p53 mutants to ionizing radiation in the presence of ATMi. In contrast, ATMi significantly radiosensitized glioma cells in which p53 is knocked down. Live cell imaging confirmed that radiation and ATMi preferentially induce mitotic catastrophe in p53-deficient cells. We conclude that p53-deficient cells rely on ATM signaling for G2/M cell cycle arrest. We propose a model of G2/M arrest whereby ATM and p53-dependent signaling pathways converge to ultimately inhibit Cdc25 phosphatases.

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer. / An interesting feature of Bcl-xL protein is the presence of an unstructured loop domain between its α1 and α2 helices, a domain not essential for its anti-apoptotic function and absent in CED-9, ortholog protein in Caenorhabditis elegans. Within this domain, Bcl-xL undergoes dynamic phosphorylation and dephosphorylation at Ser49 and Ser62 during G2 and mitosis in human cancer cells. When these residues are mutated and proteins expressed in cancer cells, cells harbor mitotic defects, including chromosome mis-attachment, lagging, bridging and mis-segregation, events associated with chromosome instability and aneuploidy. To further analyze the effects of Bcl-xL Ser49 and Ser62 in normal cells, the present studies were performed in normal human diploid cells, and in vivo in Caenorhabditis elegans. First, we studied normal human diploid BJ foreskin fibroblast cells expressing Bcl-xL(wild type), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) and the dual (S49/62A) and (S49/62D) mutants. Cells expressing S49 and/or S62 phosphorylation mutants showed reduced kinetics of cell population doubling. These effects on cell population doubling kinetics correlated with early outbreak of senescence with no impact on the cell death rate. Senescent cells displayed typical senescence-associated phenotypes including high-level of senescence-associated β-galactosidase activity, interleukin-6 secretion, tumor suppressor p53 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21Waf1/Cip1 activation as well as γH2A.X-associated nuclear chromatin foci. Fluorescence in situ hybridization analysis and Giemsa-banded karyotypes revealed that the expression of Bcl-xL phosphorylation mutants in normal diploid BJ cells provoked chromosome instability and aneuploidy. These findings suggest that dynamic Bcl-xL Ser49 and Ser62 phosphorylation/ dephosphorylation cycles are important in the maintenance of chromosome integrity during mitosis in normal cells. Second, we undertook experiments in Caenorhabditis elegans to understand the importance of Bcl-xL Ser49 and Ser62 in vivo. Transgenic worms carrying single-site S49A, S62A, S49D, S62D and dual-site S49/62A mutants were generated and their effects were analyzed in germlines of young adult worms. Worms expressing Bcl-xL variants showed decreased egg-laying and hatching, variations in the length of their mitotic regions and transition zones, chromosomal abnormalities at their diplotene stages, and increased germline apoptosis. Some of these transgenic strains, particularly the Ser to Ala variants, also showed slight modulations of lifespan compared to their controls. The in vivo observations confirmed the importance of Ser49 and Ser62 within the loop domain of Bcl-xL in maintaining chromosome stability. These studies could impact future strategies aiming to develop and identify compounds that could target not only the anti-apoptotic domain of Bcl-xL protein, but also its mitotic domain for cancer therapy.