Nous étudions les propriétés de fluorescence de nanocristaux de<br />CdSe individuels. Nous montrons expérimentalement que le<br />clignotement de fluorescence de ces nanosources rend leur<br />fluorescence non ergodique, et génère un phénomène de<br />vieillissement statistique.<br /><br />Nous montrons que l'observation par microscopie défocalisée de<br />nanocristaux de CdSe individuels permet de mesurer leur position<br />et leur orientation tridimensionnelle.<br /><br />Nous prouvons expérimentalement que l'interaction d'un nanocristal<br />avec une interface diélectrique modifie son diagramme de<br />rayonnement ainsi que la durée de vie radiative de son état<br />excité. Ces modifications d'émission spontanée sont ensuite<br />utilisées pour mesurer le rendement quantique de l'état allumé<br />d'un nanocristal de CdSe.<br /><br />Enfin, nous montrons que l'excitation impulsionnelle d'un<br />nanocristal permet de réaliser une source de photons uniques<br />déclenchée, en vue d'applications en traitement quantique de<br />l'information.

Ce travail a été effectué sur une expérience de déflexion d'un jet moléculaire par un champ électrique intense et inhomogène. Cette expérience permet de mesurer la polarisabilité et le dipôle électrique de molécules en phase gazeuse. Durant mon travail de thèse, la mise en place et la calibration d'un nouveau système de détection sensible en position, couplé à un spectromètre de masse à temps de vol, ont été réalisées. Une série d'expériences sur des molécules de benzène disubstitué a ensuite été réalisée. Ces mesures ont permis de mieux comprendre les profils de déflexion observés et l'interaction de molécules polaires isolées avec le champ électrique. En particulier, l'importance de la symétrie et du couplage rotation-vibration sur la déflexion du jet a été étudiée et analysée en détail.

Le microscope de photodétachement, construit au laboratoire Aimé Cotton au milieu des années 90, permet de visualiser les images d'interférences obtenues à partir d'électrons détachés d'ions négatifs par excitation laser, en présence d'un champ électrique uniforme. Après détachement, dans une première approximation, l'électron et l'espèce neutre précédemment liés n'interagissent plus : on a une source d'électrons libres. Or, selon les équations de la mécanique classique, un électron libre d'énergie cinétique donnée placé dans un champ électrique uniforme a deux trajectoires paraboliques différentes pour arriver en un même point. Quantiquement parlant, l'onde de matière électronique se divise et suit les deux chemins possibles. Du fait de la cohérence de l'onde électronique émise par photodétachement, les deux demi-ondes interfèrent. Les images d'interférences enregistrées sont très sensibles à l'énergie cinétique des électrons qui les composent. On peut ainsi mesurer cette énergie par comparaison entre les images expérimentales et celles prédites par le modèle théorique de l'électron libre, et faire de la spectroscopie de très haute résolution. L'étude quantitative des images a été utilisée pour tester la validité du modèle de l'électron libre pour le détachement de Si- et OH-, en recherchant d'éventuels effets d'interaction entre l'électron détaché et l'espèce neutre. L'anion Si- a permis de valider le modèle pour un atome plus lourd que ceux précédemment utilisés. L'anion moléculaire OH- a été choisi notamment pour examiner l'effet d'un potentiel dipolaire sur les interférences. Les résultats obtenus n'ont pas mis en évidence de modification des images, et ont donc validé cette méthode pour la mesure des énergies de détachement d'anions diatomiques. Ces travaux ont permis de proposer de nouvelles mesures des affinités électroniques de Si et de OH, avec une meilleure précision.

Les mécanismes adhésifs jouent un rôle crucial en biologie. Les cadhérines classiques constituent une des principales familles de molécules d‟adhésion cellulaire dépendante du calcium. Ces glycoprotéines transmembranaires sont impliquées dans des interactions principalement homophiles. Ces interactions régulent des voies de signalisation impliquées dans de nombreux phénomènes biologiques. Cette thèse porte sur l‟étude comparative des dynamiques d‟interactions des cadhérines E- et -11, prototypes respectivement des cadhérines classiques de type I et II. Le ciblage d‟acides aminés particuliers de l‟interface adhésive nous a permis de montrer que pour les cadhérines de type I, l‟échange de brin beta avec le Trp2 ont un rôle clé ; pour les types II un mécanisme différent intervient. Nous avons aussi développé une chimie innovante pour contrôler l‟immobilisation orientée et covalente de protéines. Enfin une revue décrit une étude de l‟activation de voies de signalisation par engagement des cadhérines.

Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.

Certaines protéines qui interagissent avec l'ADN sont capables de trouver rapidement une séquence spécifique de quelques paires de bases. Pour expliquer ce phénomène connu des biologistes depuis longtemps, plusieurs mécanismes de localisation appelés diffusion facilitée ont été proposés. Tous supposent une association initiale à de l'ADN non spécifique, suivie d'une translocation le long de l'ADN jusqu'au site de reconnaissance. Le mécanisme qui sous-tend cette translocation est toujours discuté. Il pourrait impliquer une diffusion linéaire (sliding) et/ou une série de sauts (jumping). <br />Pour élucider ce mécanisme, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour visualiser l'interaction non spécifique de l'enzyme de restriction EcoRV. Dans nos expériences in vitro, l'ADN est étiré au dessus d'une surface et les enzymes sont couplées à des fluorophores. Nous avons ainsi visualisé les processus de sliding et de jumping et mesuré le coefficient de diffusion 1D des enzymes (D1 ~ 0,01 µm2.s-1) ainsi que le nombre de saut par interaction (~ 20). Un modèle simple a permis à partir des résultats expérimentaux de caractériser la diffusion facilitée d'EcoRV.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les glycosidases sont des enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques. Entre autres, elles sont responsables de la dégradation des déchets polysaccharidiques de nos cellules. Lorsqu'une modification génétique touche un gène qui code pour une de ces enzymes, des pathologies graves regroupées sous l'appellation de " maladies lysosomales " peuvent être déclenchées. L'objectif de ce projet a été de proposer une méthode de synthèse efficace de molécules potentiellement actives spécifiquement sur l'une ou l'autre de ces maladies. Les molécules ciblées sont des inhibiteurs de glycosidases de la famille des aminocyclitols, utilisés dans une stratégie thérapeutique émergente " par molécules chaperonnes ". La méthode de synthèse développée s'appuie sur une étape enzymatique clé utilisant les aldolases comme catalyseurs et répondant aux contraintes environnementales actuelles de la chimie verte. Nous avons atteint nos objectifs grâce à l'utilisation de trois aldolases différentes, produites et purifiées pour la première fois au sein de notre laboratoire. Il s'agit de la fuculose-1-phosphate aldolase F1PA, de la rhamnulose-1-phosphate aldolase R1PA et de la nouvellement découverte fructose-6-phosphate aldolase FSA. La formation d'une quarantaine de nitrocyclitols, de stéréochimies définies, précurseurs des aminocyclitols correspondant, a ainsi été réalisée avec de très bons rendements de synthèse.

Cette thèse de doctorat porte sur ma recherche doctorale sur la diffusion moléculaire sur des surfaces de matériaux carbonés. Ces travaux de recherche ont été effectuées sous forme d'études de spectroscopie neutronique et d'hélium. Des modèles théoriques ont été développés pour l'analyse et l'interprétation des données expérimentales.Dans une première partie, la méthode de croissance épitaxiale d'une couche de graphène sur une surface (111) d'un cristal de nickel est décrite. Basés sur des études de spectroscopie à écho de spin d'hélium, des modèles d'adsorption et de diffusion d'eau et de benzène sur la surface de graphène sont ensuite élaborés. L'objectif est de décrire précisément la structure de l'adsorbât et la diffusion moléculaire sur la surface.Dans une deuxième partie des études portant sur la diffusion d'hydrogène moléculaire adsorbé dans un aérogel de carbone, dans un carbone poreux, et dans un graphite exfolié sont présentés. Les résultats expérimentaux de spectroscopie neutronique temps-de-vol nous permettent d'établir le rapport entre la mobilité des molécules d'hydrogène et les propriétés spécifiques aux matériaux de carbone. / This thesis presents my PhD work about molecular diffusion on surfaces of carbon materials. The main research has been undertaken in the form of neutron and helium spectroscopy studies and theoretical models have been developed for an interpretation of experimental data.In the first part, the growth procedure of an epitaxial graphene layer on the (111) surface of a nickel crystal is described and the adsorption and diffusion of water and of benzene on the graphene surface are discussed. Results from helium spin-echo spectroscopy studies are presented with the aspiration to obtain a detailed qualitative and quantitative description of the structure of the adsorbate and the molecular diffusion on the surface.In the following chapters, the diffusion of molecular hydrogen adsorbed in carbon aerogel, in a novel porous carbon D-96-7, and in exfoliated graphite is discussed, based on results from neutron time-of-flight spectroscopy. The aim is a detailed understanding of the connection between porosity, surface chemistry, and the molecular diffusion.

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle. / The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration.