A Musca domestica é a principal praga em aviários comerciais e o uso de inseticidas químicos vêm gerando resistência nessas moscas. Portanto, cada vez mais, estudos envolvendo a interação patógeno-hospedeiro visando o controle microbiano dessa mosca são importantes. Foram feitos isolamentos de fungos no aviário, estudos de esporulação e enzimas extracelulares, os processos de infecção, análise da resposta inflamatória e identificação dos hemócitos das larvas de Musca domestica, além de bioensaios e controle no aviário com Metarhizium anisopliae. Nenhum fungo entomopatogênico foi isolado no aviário. Os fungos Paecilomyces sp e Metarhizium anisopliae esporularam melhor no meio ágar batata maltose enquanto que Beauveria bassiana, o melhor resultado foi obtido com agar batata com 0,1% de glicose. Nos ensaios enzimáticos, protease foi a enzima mais produzida por Metarhizium anisopliae e Paecilomyces sp, e caseinases por Beauveria bassiana. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as etapas de infecção do Metarhizium anisopliae em larvas de Musca domestica ao passo que a resposta imunológica durante as etapas de infecção demonstraram um pico de hemócitos em 48 horas após o início da infecção nessas larvas, os hemócitos identificados foram plasmatócitos, granulócitos, oenocitóides, prohemócitos além de fragmentos celulares como trombocitóides. Nos bioensaios o fungo mais virulento para larvas de 3º instar de Musca domestica foi o Metarhizium anisopliae CG 46 que após confirmação da patogenicidade foi produzido em arroz cozido e aplicado no aviário, seguido da aplicação do produto comercial Metarril WP. O Metarril não obteve um controle positivo das moscas, enquanto o fungo Metarhizium anisopliae CG 312 mostrou um discreto controle. / Musca domestica is the major pest in commercial poultry and the constant use of chemical pesticides has induced the development of resistance in these flies. Therefore, studies involving host-pathogen interaction aimed at microbial control of these flies are important. Isolations were made of fungi in the aviary studies of sporulation and extracellular enzymes, the process of infection, analysis of the inflammatory response and identification of hemocytes from larvae of Musca domestica as well as bioassays and control in the aviary with Metarhizium anisopliae. No entomopathogenic fungus was isolated in cages. The medium potato maltose agar resulted in higher sporulation for Paecilomyces sp Metarhizium anisopliae and while in Beauveria bassiana the best result for esporulation was obtained with potato agar with 0.1% glucose. In the enzyme activity assays the strains Metarhizium anisopliae and Paecilomyces sp, showed the best activity for protease and Beauveria bassiana for caseinase. The scanning electron microscopy showed the stages of infection by Metarhizium anisopliae on larvae of Musca domestica while the immune response during the early stages of infection showed a peak in hemocytes 48 hours after the onset of infection in these larvae. The fungus most virulent for larvae of 3rd instar Musca domestica in bioassays was Metarhizium anisopliae CG 46. After confirmation of the pathogenicity the fungus was multiplied in cooked rice and applied in the aviary, followed by application of the commercial product Metarril WP. The Metarril did not produced a positive control of the flies, while the fungus Metarhizium anisopliae CG 312 showed a slight control.

A Musca domestica é a principal praga em aviários comerciais e o uso de inseticidas químicos vêm gerando resistência nessas moscas. Portanto, cada vez mais, estudos envolvendo a interação patógeno-hospedeiro visando o controle microbiano dessa mosca são importantes. Foram feitos isolamentos de fungos no aviário, estudos de esporulação e enzimas extracelulares, os processos de infecção, análise da resposta inflamatória e identificação dos hemócitos das larvas de Musca domestica, além de bioensaios e controle no aviário com Metarhizium anisopliae. Nenhum fungo entomopatogênico foi isolado no aviário. Os fungos Paecilomyces sp e Metarhizium anisopliae esporularam melhor no meio ágar batata maltose enquanto que Beauveria bassiana, o melhor resultado foi obtido com agar batata com 0,1% de glicose. Nos ensaios enzimáticos, protease foi a enzima mais produzida por Metarhizium anisopliae e Paecilomyces sp, e caseinases por Beauveria bassiana. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as etapas de infecção do Metarhizium anisopliae em larvas de Musca domestica ao passo que a resposta imunológica durante as etapas de infecção demonstraram um pico de hemócitos em 48 horas após o início da infecção nessas larvas, os hemócitos identificados foram plasmatócitos, granulócitos, oenocitóides, prohemócitos além de fragmentos celulares como trombocitóides. Nos bioensaios o fungo mais virulento para larvas de 3º instar de Musca domestica foi o Metarhizium anisopliae CG 46 que após confirmação da patogenicidade foi produzido em arroz cozido e aplicado no aviário, seguido da aplicação do produto comercial Metarril WP. O Metarril não obteve um controle positivo das moscas, enquanto o fungo Metarhizium anisopliae CG 312 mostrou um discreto controle. / Musca domestica is the major pest in commercial poultry and the constant use of chemical pesticides has induced the development of resistance in these flies. Therefore, studies involving host-pathogen interaction aimed at microbial control of these flies are important. Isolations were made of fungi in the aviary studies of sporulation and extracellular enzymes, the process of infection, analysis of the inflammatory response and identification of hemocytes from larvae of Musca domestica as well as bioassays and control in the aviary with Metarhizium anisopliae. No entomopathogenic fungus was isolated in cages. The medium potato maltose agar resulted in higher sporulation for Paecilomyces sp Metarhizium anisopliae and while in Beauveria bassiana the best result for esporulation was obtained with potato agar with 0.1% glucose. In the enzyme activity assays the strains Metarhizium anisopliae and Paecilomyces sp, showed the best activity for protease and Beauveria bassiana for caseinase. The scanning electron microscopy showed the stages of infection by Metarhizium anisopliae on larvae of Musca domestica while the immune response during the early stages of infection showed a peak in hemocytes 48 hours after the onset of infection in these larvae. The fungus most virulent for larvae of 3rd instar Musca domestica in bioassays was Metarhizium anisopliae CG 46. After confirmation of the pathogenicity the fungus was multiplied in cooked rice and applied in the aviary, followed by application of the commercial product Metarril WP. The Metarril did not produced a positive control of the flies, while the fungus Metarhizium anisopliae CG 312 showed a slight control.

A Musca domestica é a principal praga em aviários comerciais e o uso de inseticidas químicos vêm gerando resistência nessas moscas. Portanto, cada vez mais, estudos envolvendo a interação patógeno-hospedeiro visando o controle microbiano dessa mosca são importantes. Foram feitos isolamentos de fungos no aviário, estudos de esporulação e enzimas extracelulares, os processos de infecção, análise da resposta inflamatória e identificação dos hemócitos das larvas de Musca domestica, além de bioensaios e controle no aviário com Metarhizium anisopliae. Nenhum fungo entomopatogênico foi isolado no aviário. Os fungos Paecilomyces sp e Metarhizium anisopliae esporularam melhor no meio ágar batata maltose enquanto que Beauveria bassiana, o melhor resultado foi obtido com agar batata com 0,1% de glicose. Nos ensaios enzimáticos, protease foi a enzima mais produzida por Metarhizium anisopliae e Paecilomyces sp, e caseinases por Beauveria bassiana. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as etapas de infecção do Metarhizium anisopliae em larvas de Musca domestica ao passo que a resposta imunológica durante as etapas de infecção demonstraram um pico de hemócitos em 48 horas após o início da infecção nessas larvas, os hemócitos identificados foram plasmatócitos, granulócitos, oenocitóides, prohemócitos além de fragmentos celulares como trombocitóides. Nos bioensaios o fungo mais virulento para larvas de 3º instar de Musca domestica foi o Metarhizium anisopliae CG 46 que após confirmação da patogenicidade foi produzido em arroz cozido e aplicado no aviário, seguido da aplicação do produto comercial Metarril WP. O Metarril não obteve um controle positivo das moscas, enquanto o fungo Metarhizium anisopliae CG 312 mostrou um discreto controle. / Musca domestica is the major pest in commercial poultry and the constant use of chemical pesticides has induced the development of resistance in these flies. Therefore, studies involving host-pathogen interaction aimed at microbial control of these flies are important. Isolations were made of fungi in the aviary studies of sporulation and extracellular enzymes, the process of infection, analysis of the inflammatory response and identification of hemocytes from larvae of Musca domestica as well as bioassays and control in the aviary with Metarhizium anisopliae. No entomopathogenic fungus was isolated in cages. The medium potato maltose agar resulted in higher sporulation for Paecilomyces sp Metarhizium anisopliae and while in Beauveria bassiana the best result for esporulation was obtained with potato agar with 0.1% glucose. In the enzyme activity assays the strains Metarhizium anisopliae and Paecilomyces sp, showed the best activity for protease and Beauveria bassiana for caseinase. The scanning electron microscopy showed the stages of infection by Metarhizium anisopliae on larvae of Musca domestica while the immune response during the early stages of infection showed a peak in hemocytes 48 hours after the onset of infection in these larvae. The fungus most virulent for larvae of 3rd instar Musca domestica in bioassays was Metarhizium anisopliae CG 46. After confirmation of the pathogenicity the fungus was multiplied in cooked rice and applied in the aviary, followed by application of the commercial product Metarril WP. The Metarril did not produced a positive control of the flies, while the fungus Metarhizium anisopliae CG 312 showed a slight control.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-09-05T17:16:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Elisabeth Korte Stein - 2017.pdf: 1890648 bytes, checksum: 23075cfcc3f4fb866b17fa8be2766d80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-15T15:14:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Elisabeth Korte Stein - 2017.pdf: 1890648 bytes, checksum: 23075cfcc3f4fb866b17fa8be2766d80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T15:14:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Elisabeth Korte Stein - 2017.pdf: 1890648 bytes, checksum: 23075cfcc3f4fb866b17fa8be2766d80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Musca domestica is considered one of the most harmful pests to the egg industry due to its high reproductive capacity and great potential of acting as a mechanical vector of many pathogenicagens to the egg-laying hens. Currently, the society is interested in alternative methods for pest control, once the constant and indiscriminate use of chemical products has caused intoxication to humans and domestic animals. Also, the irregular use of chemicals has selected resistant fly populations, accumulated chemical residues in the environment and food, and eliminated insects important to the natural control of flies. In order to develop alternative methods to control M. domestica, this study investigated Bacillus thuringiensis strains able to act as promising biological control agents. Twenty two strains of B. thuringiensis were tested in a screening assay for selecting the most virulent ones; one third of them were virulent to M. domestica larva, and two of them were selected for the next tests. Bioassays were conducted with the strains S601 and S599 to determine the larval treatment efficiency; they showed efficiency to control larva of M. domestica in all concentrations tested. The current study also characterized the hemocytes from hemolymph of larva of M. domestica by their identification and quantification; also, we evaluated the effect of the strain S599 of B. thuringiensis infection to the total hemocytes counts, and number and size of hemocyte types, using optical microscopy. Collections were made at the times of 12, 24, 48 and 72 hrs. Five hemocyte types were found: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, oenocytoids and spherulocytes, in which plasmatocytes were found in superior number. Prohemocytes were the smallest cells observed, and oenocytoids were the biggest ones. The treatment of M. domestica larva with B. thuringiensis did not change morpholigical characteristics of hemocytes, as well as it did not modify the counts of hemocyte types. The total number of hemocytes in the hemolymph, however, increased significantly 48 hours after the larval treatment. B. thuringiensis strains selected in the current study are promising agents for biological control of M. domestica. / Musca domestica é considerada umas das pragas mais prejudiciais à produção intensiva de aves poedeiras devido seu alto poder reprodutivo e elevado potencial de agir como vetor mecânico de vários agentes causadores de doenças. Atualmente a sociedade vem procurando novas formas de controle de pragas, já que o uso constante e indiscriminado de produtos químicos tem levado a casos de intoxicação em humanos e animais, além de selecionar populações cada vez mais resistentes, deixar resíduos no ambiente e nos alimentos e prejudicar insetos importantes para o equilíbrio biológico. No intuito de desenvolver outra forma de controle para M. domestica, o presente trabalho selecionou estirpes de Bacillus thuringiensis promissoras para atuarem como agentes de biocontrole de M. domestica. Dessa forma, no teste seletivo foram testadas 22 estirpes de B. thuringiensis, onde duas mostraram-se virulentas para larvas da mosca. Bioensaios para determinação de eficácia do tratamento larval foram realizados e as estirpes testadas (S601 e S599) mostraram-se promissoras para o controle de larvas de M. domestica em todas as concentrações testadas (20; 15; 10; 5; 1; 0,5; 0,25; 0,125mg/g). Em outra etapa, o estudo caracterizou os hemócitos da hemolinfa de larvas de M. domestica por identificação e quantificação dos tipos celulares presentes na hemolinfa, estudou ainda o efeito do tratamento com a estirpe S599 de B. thuringiensis na contagem total das células, contagem diferencial celular e no tamanho das células, utilizando-se para esta finalidade a microscopia ótica. Realizou-se coletas nos tempos de 12, 24, 48 e 72 hrs. Foram encontrados cinco tipos celulares: pró-hemócitos, plasmatócitos, granulócitos, oenocitoides e esferulócitos, sendo os plasmatócitos as células em maior número, os pró-hemócitos as menores células encontradas e os oenocitoides as maiores células encontradas. O tratamento com B. thuringiensis não alterou as características morfológicas dos hemócitos, assim como não alterou a contagem diferencial das células; no entanto, o número total de hemócitos na hemolinfa aumentou significativamente 48 horas após tratamento das larvas. As estirpes de B. thuringiensis selecionadas são possíveis agentes de biocontrole de M. domestica.

A study of the nutritional requirements of adult house flies has shown that liquid diets of natural and purified products are capable of supporting continued oogenesis. Chemically defined liquid diets containing nine 1-amino acids fed to newly emerged female flies were necessary for ovarian maturation and oviposition. Water, salts and carbohydrate were the other basic dietary requirements for this process and for survival. The addition of cholesterol to this synthetic diet also influenced fecundity. For the maturation and oviposition of more than one ovarian cycle the synthetic diet had to be supplemented with the amino acid 1-methionine, certain B-vitamins and nucleic acid bases. Flies fed diets deficient in these supplements showed a lower fecundity and survival. A dry synthetic diet was developed which supported egg production. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and α-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

O intestino dos insetos representa uma interface pouco protegida dos agentes externos. A identificação dos mecanismos moleculares envolvidos nos processos fisiológico-digestivos permite encontrar alvos potenciais para o controle de insetos. As moléculas envolvidas na absorção de nutrientes, tamponamento e geração de fluxos de água no intestino médio do inseto-modelo Musca domestica (Diptera Cyclorrhapha) foram identificadas. Para isso, foi feita uma análise da expressão gênica ao longo do intestino médio, a identificação e anotação de proteínas por bioinformática, a confirmação da localização apical das proteínas por análise proteômica de membranas microvilares purificadas e a determinação do papel de algumas das proteínas através de experimentos in vivo utilizando diferentes dietas, corantes e inibidores. A acidificação da região média é consequência da atividade anidrase carbônica que gera prótons que são bombeados por uma H+ V-ATPase apical acompanhados por cloreto transportado por um simporter K+Cl-. O K+ é recuperado por um canal de K+ e a homeostase dos cátions mantida pela Na+/K+-ATPase basolateral. O bicarbonato é eliminado basolateralmente em troca por cloreto por um antiporter. A acidificação é regulada diretamente por um antiporter Na+/H+ e indiretamente por uma proteína envolvida na homeostase do cobre. O muco protetor da região média é tamponado com bicarbonato gerado por uma anidrase carbônica com âncora de GPI e transportado por um antiporter Na+HCO3-/H+Cl-. O excesso de ácido é eliminado por um antiporter Na+/H+ situado na membrana basolateral. A alcalinização da região posterior ocorre pelo transporte apical de NH3 que sequestra os prótons luminais gerando amônio, junto à remoção de prótons em simporte com aminoácidos e peptídeos. A acidificação intracelular, consequência da entrada de aminoácidos com prótons, é regulada por uma H+ V-ATPase basolateral. A geração de fluxos de água é consequência da atividade conjunta de simporters NKCC e KCC ajudados pelas aquaporinas. A inibição dos simporters com inibidores específicos mostrou que o contrafluxo de água está envolvido na reciclagem da enzima tripsina. Por último, o principal lugar de absorção nutrientes no intestino médio é a região posterior, a exceção do cobre que é absorvido na região média. / The gut of insects is a less protected interphase against external agents. The identification of the molecular mechanisms involved in physiological-digestive processes allows one to find potential targets for insect control. The molecules involved in nutrient absorption, buffering and fluid fluxes in the midgut of the insect-model M. domestica (Diptera Cyclorrhapha) were identified. For this, gene expression along the midgut was analyzed; proteins were identified and annotated by bioinformatics; apical localization of proteins was confirmed by proteomics of purified microvillar membranes; the role of proteins was confirmed by in vivo experiments using different diets, dyes and inhibitors. Middle midgut acidification occurs by the action of an apical H+ V-ATPase with protons coming from carbonic anhydrase activity accompanied by chloride transported with potassium by a K+Cl- symporter. Potassium is recovered by a potassium channel, and cation homeostasis maintained by a basolateral Na+/K+-ATPase. Acidification is directly regulated by a Na+/H+ antiporter and indirectly by a copper homeostasis protein. Mucus protecting epithelium is neutralized with bicarbonate generated by a GPI-ancored carbonic anhydrase and transported by a Na+HCO3-/H+Cl- antiporter. Intracellular acidification is avoided by a basolateral Na+/H+ antiporter. Posterior midgut alkalization occurs by the action of an apical ammonia transporter and proton amino acid (and peptide) symporters. Intracellular acid is eliminated by a basolateral H+ V-ATPase. Fluid fluxes are generated by K+Cl- and Na+Cl-Cl- symporters helped by aquaporins. Inhibition of these symporters showed that the countercurrent flux of water allows trypsin recycling. Finally, posterior midgut is the main location of nutrient absorption, except for copper which is absorbed in the middle midgut.

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and α-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações β 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.

O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações β 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.